CN109897890A - 一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法，属于生命科学领域。本发明以被检巴布亚企鹅个体粪便为DNA来源，粪便在裂解液中裂解后，以粪便裂解液作为模板，利用发明的巴布亚企鹅性染色体引物进行巢式PCR扩增，得到长度差异显著的CHD‑W/CHD‑Z片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判定被检企鹅性别。本发明具有对企鹅无损伤，准确性高并且操作简单等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法，属于生命科学领域。
背景技术
对于非平胸鸟类的性别鉴定，目前最准确的方法是分子鉴定法，该方法是利用位于性染色体上CHD基因(chromobox-helicase-DNA binding gene，染色体螺旋蛋白基因)的内含子长度差异来判定性别，即如果扩增的CHD片段在Z/W染色体上有足够的长度差异，则雌性鸟类的扩增结果通过电泳应显示两条带，雄性则显示1条带。关于这一方法，国外学者先后总结了几对较为通用的CHD基因扩增引物(P1/P2，P2/P8，2550F/2718R)，这些引物对于大多数非平胸目鸟类都可以扩增得到产物，然而其产物在雌雄个体间差异是否显著，则因物种不同而异。
巴布亚企鹅又称白眉企鹅，属于企鹅目，企鹅科。企鹅是单态鸟类，在其配对产卵前难以通过外形分辨雌雄。由于多数企鹅实行一夫一妻制，在执行珍稀动物保种计划或极地馆引种计划时，均希望按照一比一性比进行配对操作，因此，年幼企鹅的性别鉴定方法引起了人们的重视。前人总结的两对通用引物(P2/P8，2550F/2718R)已在多种企鹅中进行了可行性验证。然而，企鹅性别鉴定过程中，一般采用抽取血液或拔取多根羽毛以获得DNA样本，这两种方法对受检个体尤其是幼体会产生不良影响；同时，利用2550F/2718R引物进行扩增时，由于CHD-W与CHD-Z扩增产物之间的差异接近80bp(CHD-W扩增全长约为740bp)，这一结果导致企鹅性别鉴定时需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳才能清晰的区分性别。
发明内容
鉴于上述弊端，本发明的目的在于提供一种无损伤、准确性高且操作简单的巴布亚企鹅性别鉴定方法。
本发明的技术方案包括以下具体步骤：刚排出体外的新鲜企鹅粪便或保存于-20℃不超过3个月的新鲜企鹅粪便在裂解液中裂解，以粪便裂解液作为初始模板进行巢式PCR扩增，第二次PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判定被检企鹅性别。
本发明利用裂解液裂解微量粪便直接充当被检个体DNA模板，这一方法省略了提取DNA所需操作，同时解决了微量样品提取DNA的低得率问题。裂解液组分(体积百分比)为：6％-8％蛋白酶K(20mg/L)溶液，0.4％-0.6％吐温-20，10％10×Taq Buffer，其余为纯水，Taq Buffer为后续PCR扩增时所用Buffer。裂解液中蛋白酶K使细胞膜蛋白水解；吐温-20可促使细胞破碎，进而使DNA释放；虽然不同厂家生产的不同种Taq都配有经过优化的、组分不尽相同的Taq Buffer，但其主要组分均为Tris-Hcl、KCl或NaCl和DTT等，这些组分与商品化的细胞裂解液组分相似，可以为蛋白酶K水解作用提供必要的离子环境。同时，使用本发明所述Taq Buffer配制裂解液可在后续的PCR反应液中扣除模板中所含Taq Buffer，避免引入商品化裂解液时模板中各组分对PCR反应的干扰，以保证PCR扩增的高效性和准确性。
本发明利用裂解液裂解粪便的温度条件为：55℃维持20-30分钟后85℃维持15分钟。55℃为蛋白酶K最适反应温度，85℃则使蛋白酶K灭活以消除其对后续扩增的影响。
本发明放弃使用非平胸鸟类通用引物，利用巴布亚企鹅CHD基因序列设计新引物，使PCR产物长度缩短，在提高PCR扩增效率的同时，增加了CHD-W/CHD-Z长度差异与CHD-W长度之比，使扩增产物仅需普通琼脂糖凝胶电泳即可清晰分辨雌雄。巢式PCR第一次扩增引物的核苷酸序列是：
正向引物：SEQ ID NO.1：5`-GAACGTGGCAACAGAGTACTGA-3`；
反向引物：SEQ ID NO.2：5`-AGTTTAGGTTGGAAGGGACCTC-3`；
第二次扩增引物的核苷酸序列是：
正向引物：SEQ ID NO.3：5`-ATGGTGAGGATGCTAGACATC-3`；
反向引物：SEQ ID NO.4：5`-GACCTCTGAAGGTCATCTWGTC-3`；
本发明采用巢式PCR技术，第一次扩增以粪便裂解液为模板1，扩增出较长的目标片段。第二次扩增引物位于第一次扩增引物内侧，以第一次扩增得到的扩增产物为模板2，通过两次PCR使粪便中微量的消化道细胞目标基因得以充分扩增，同时通过两次扩增也增加了扩增特异性，减少非特异性产物出现。
本发明中巢式PCR两次扩增反应体系除模板和引物不同外，其他组分均相同。下表为20μL反应体系，其中10×Taq Buffer比优化使用量减少0.1μL，是由于1μL模板中已经含有0.1μL 10×Taq Buffer的组分(同理，巢式PCR第二次扩增体系中10×Taq Buffer使用量也为1.9μL)。除上述模板和10×Taq Buffer的使用量外，两次巢式PCR扩增反应体系应按照生产厂家提供的最优体系配置以使PCR扩增效率最大化。
具体的，上述10×Taq Buffer为10×La Taq Buffer或10×EX Taq Buffer。
具体的，上述技术方案中所述10×Taq Buffer为10×La Taq Buffer时，反应体系的其余试剂用量为：浓度为5U/μL的La Taq 0.2μL，2.5mM each的dNTP Mixture 3.2μL，浓度为10μM的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4各1μL，纯水11.7μL。
具体的，上述技术方案中所述10×Taq Buffer为10×EX Taq Buffer时，反应体系的其余试剂用量为：浓度为5U/μL的La Taq 0.1μL，2.5mM each的dNTP Mixture 1.6μL，浓度为10μM的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4各0.8μL，纯水13.8μL。
具体的，巢式PCR第一次扩增反应程序为：94℃预变性60s；94℃变性25s，55-57℃退火25s，72℃延伸25s，28-34个循环；巢式PCR第二次扩增反应程序为：94℃预变性60s；94℃变性25s，54-56℃退火25s，72℃延伸25s，36-40个循环；72℃终延伸60s。
本发明利用2％浓度的琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。具体的，若被检个体巢式PCR扩增产物为两条带(W带385bp，Z带281bp)，表示该个体CHD基因为W/Z型，该个体判断为雌性；若被检个体PCR扩增产物为一条带(Z带281bp)，表示该个体CHD基因为Z/Z型，则判断性别为雄性。
发明有益效果
1.本发明利用巴布亚企鹅粪便中带有的少量消化道细胞作为DNA扩增模板，进行性别鉴定的方法，省略了提取DNA所需操作，同时解决了微量样品提取DNA的低得率问题；
2.本发明采用10×Taq Buffer配制裂解液，可在后续的PCR反应液中扣除模板中所含Taq Buffer，避免引入商品化裂解液时模板中各组分对PCR反应的干扰，以保证PCR扩增的高效性和准确性；
3.通过设计新引物以缩短产物长度，增加CHD-W/CHD-Z长度差异与CHD-W长度之比，使扩增结果仅需普通琼脂糖凝胶电泳即可清除分辨雌雄；
4.提供一种无损伤，准确性高并且操作简单的巴布亚企鹅性别鉴定的方法。
附图说明
图1为实施例1中利用本方法进行16只巴布亚企鹅性别鉴定结果，其中第1泳道和第18泳道为100bp Marker，第2到17泳道为被检个体扩增结果，个体编号从左至右依次为：031，034，038，062，072，0314，1035，1036，1041，1042，1103，1105，1987，1988，1994，1995。
图2为实施例2中利用本方法进行4只巴布亚企鹅性别鉴定结果，其中第1泳道为100bp Marker，第2到5泳道为被检个体扩增结果，个体编号从左至右依次为：056，062，071，075。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。
实施例1
2018年9月6日-9月7日，在大连圣亚海洋世界企鹅馆收集16只已知性别的巴布亚企鹅粪便。收集的粪便装于自封袋中，标注企鹅编号存于-20℃冰柜中，9月20日进行性别鉴定(上述粪便选择标准为刚排出体外的新鲜粪便或保存于-20℃不超过3个月的新鲜粪便)。
(1)裂解液的配置及粪便裂解
①由于本次实验选用宝日医生物技术有限公司出品的TaKaRa LA Taq(货号：RR02MA)作为PCR反应的多聚酶，所以裂解液使用与其相对应的10×LA Taq Buffer II(Mg2+Plus)配置，1mL裂解液按照表1配置。
表1粪便裂解液配方
| 试剂 | 体积(μL) |
| 蛋白酶K(20mg/L) | 80 |
| 10×LA Taq Buffer II(Mg<sup>2+</sup>Plus) | 100 |
| 吐温-20 | 5 |
| 纯水 | 815 |
将上述裂解液分装于16只200μL PCR管中，每管50μL。
②用灭菌牙签分别挑取粪便样品约10mg，装于上述16只200μL PCR管中。
③将上述PCR管放入PCR仪中，按照55℃保持20分钟后，85℃保持15分钟设定并运行程序。
(2)巢式PCR扩增
①巢式PCR第一次扩增以上述完成裂解的粪便裂解液为模板1，按照表2在200μLPCR管中分别配制16个20μL PCR反应体系。
表2巢式PCR第一次扩增反应体系配方
| 试剂 | 体积(μL) |
| 模板1 | 1 |
| La Taq(5U/μL) | 0.2 |
| dNTP Mixture(2.5mM each) | 3.2 |
| 10×La Taq Buffer | 1.9 |
| SEQ ID NO.1正向引物(10μM) | 1 |
| SEQ ID NO.2反向引物(10μM) | 1 |
| 纯水 | 11.7 |
将上述配置好的反应液放置在PCR仪内，按照表3设置PCR反应程序并运行。
表3巢式PCR第一次扩增程序
②巢式PCR第二次扩增以上述第一次扩增产物为模板2，按照表4在200μL PCR管中分别配制16个20μLPCR反应体系。
表4巢式PCR第二次扩增反应液配方
| 试剂 | 体积(μL) |
| 模板2 | 1 |
| La Taq(5U/μL) | 0.2 |
| dNTP Mixture(2.5mM each) | 3.2 |
| 10×La Taq Buffer | 1.9 |
| SEQ ID NO.3正向引物(10μM) | 1 |
| SEQ ID NO.4反向引物(10μM) | 1 |
| 纯水 | 11.7 |
将上述配置好的反应液放置在PCR仪内，按照表5设置PCR反应程序并运行。
表5巢式PCR第二次扩增程序
(3)PCR产物的电泳检测及性别判定
用1×TBE Buffer(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：B040124-0010)配制2％琼脂糖凝胶，按照企鹅编号由小到大的顺序，分别取上述巢式PCR第二次扩增产物4μL进行电泳，使用TAKARA的100bp DNA Ladder(货号：3422A)作为Marker，电泳电压为200V，电泳22分钟。
本方法判定巴布亚企鹅性别的方法为：根据巢式PCR产物电泳结果，产物为两条带(281bp/385bp)的被检个体为雌性，一条带(281bp)的被检个体为雄性。图1为16只巴布亚企鹅性别鉴定电泳结果，其中第1泳道和第18泳道为100bp Marker，第2到17泳道为被检个扩增结果。个体编号和性别鉴定结果依次为：031-雄,034-雄,038-雄,062-雌,072-雌,0314-雄,1035-雌,1036-雌,1041-雌,1042-雌,1103-雄,1105-雄,1987-雌,1988-雄,1994-雌,1995-雌。所有鉴定结果与圣亚海洋世界实际记录结果一致。
实施例2
2019年3月12日，在大连圣亚海洋世界企鹅馆收集雌雄各两只巴布亚企鹅粪便。收集的粪便装于2ml塑料试管中，收集完成后立即进行性别鉴定。
(1)裂解液的配置及粪便裂解
①本实验选用宝日医生物技术有限公司出品的TaKaRa EX Taq(货号：RR001A)作为PCR反应的多聚酶，所以裂解液使用与其相对应的10×EX Taq Buffer II(Mg2+Plus)配置，200μL裂解液按照表6配置。
表6粪便裂解液配方
| 试剂 | 体积(μL) |
| 蛋白酶K(20mg/L) | 12 |
| 10×EX Taq Buffer II(Mg<sup>2+</sup>Plus) | 20 |
| 吐温-20 | 1.2 |
| 纯水 | 166.8 |
将上述裂解液分装于4只200μL PCR管中，每管50μL。
②用灭菌牙签分别挑取粪便样品约5mg，装于上述4只200μL PCR管中。
③将上述PCR管放入PCR仪中，按照55℃保持30分钟后，85℃保持15分钟设定并运行程序。
(2)巢式PCR扩增
①巢式PCR第一次扩增以上述完成裂解的粪便裂解液为模板1，按照表7在200μLPCR管中分别配制4个20μL PCR反应体系。
表7巢式PCR第一次扩增反应体系配方
| 试剂 | 体积(μL) |
| 模板1 | 1 |
| EX Taq(5U/μL) | 0.1 |
| dNTP Mixture(2.5mM each) | 1.6 |
| 10×EX Taq Buffer | 1.9 |
| SEQ ID NO.1正向引物(10μM) | 0.8 |
| SEQ ID NO.2反向引物(10μM) | 0.8 |
| 纯水 | 13.8 |
将上述配置好的反应液放置在PCR仪内，按照表8设置PCR反应程序并运行。
表8巢式PCR第一次扩增程序
②巢式PCR第二次扩增以上述第一次扩增产物为模板2，按照表9在200μL PCR管中分别配制4个20μLPCR反应体系。
表9巢式PCR第二次扩增反应液配方
将上述配置好的反应液放置在PCR仪内，按照表10设置PCR反应程序并运行。
表10巢式PCR第二次扩增程序
(3)PCR产物的电泳检测及性别判定
用1×TBE Buffer配制2％琼脂糖凝胶，分别取上述巢式PCR第二次扩增产物5μL进行电泳，使用TAKARA的100bp DNA Ladder作为Marker，电泳电压为200V，电泳35分钟。
图2为四只巴布亚企鹅粪便扩增产物电泳图谱，其中第1泳道为100bp Marker，第2-5泳道为扩增产物。根据本发明性别判定原则，四只被捡企鹅性别分别为056-雌性、062-雌性、071-雄性、075-雄性。判定结果与实际完全一致。
SEQUENCE LISTING
<110> 辽宁省海洋水产科学研究院 大连圣亚旅游控股股份有限公司
<120> 一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法
<130> 2019
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaacgtggca acagagtact ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agtttaggtt ggaagggacc tc 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggtgagga tgctagacat c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gacctctgaa ggtcatctwg tc 22
Claims (9)
1.一种无损伤巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以被检巴布亚企鹅个体粪便为DNA来源，粪便在裂解液中裂解，所用裂解液组分体积百分比为6％-8％蛋白酶K，0.4％-0.6％吐温-20，10％的10×Taq Buffer，余量为纯水；
(2)以粪便裂解液作为模板1进行巢式PCR第一次扩增，再以第一次扩增得到扩增产物为模板2进行巢式PCR第二次扩增，得到特异性扩增产物；
(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果判定被检企鹅性别，若被检个体巢式PCR扩增产物为两条带则判断为雌性，一条带则判断性别为雄性；
步骤(2)中所述的巢式PCR第一次扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；
步骤(2)中所述的巢式PCR第二次扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
2.根据权利要求1所述的巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述的企鹅粪便为刚排出体外的新鲜粪便或保存于-20℃不超过3个月的新鲜粪便。
3.根据权利要求1所述的巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述的企鹅粪便的用量为2-20mg。
4.根据权利要求1所述的巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中所述的企鹅粪便裂解的裂解条件为55℃维持20-30分钟后85℃维持15分钟。
5.根据权利要求1所述的巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的巢式PCR第一次扩增反应的反应体系为20μL，反应液组分中模板1体积为1μL，10×Taq Buffer体积为1.9μL。
6.根据权利要求1所述的巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的巢式PCR第一次扩增反应程序为：94℃预变性60s；94℃变性25s，55-57℃退火25s，72℃延伸25s，28-34个循环。
7.根据权利要求1所述的巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的巢式PCR第二次扩增反应的反应体系为20μL，反应液组分中模板2体积为1μL，10×Taq Buffer体积为1.9μL。
8.根据权利要求1所述的巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的巢式PCR第二次扩增反应程序如下：94℃预变性60s；94℃变性25s，54-56℃退火25s，72℃延伸25s，36-40个循环；72℃终延伸60s。
9.根据权利要求5或7所述的巴布亚企鹅性别鉴定方法，其特征在于：所述10×TaqBuffer为10×La Taq Buffer或10×EX Taq Buffer。
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