CN109182544A - 一种鉴定滩羊与非滩羊的8种snp位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定滩羊与非滩羊的8种SNP位点及其应用。本发明提供了检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测羊是否为滩羊或非滩羊中的应用；或，检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测羊是否为滩羊或非滩羊的产品中的应用；本发明为稳定滩羊品质，重树滩羊品牌形象，将滩羊打造成为全国驰名品牌，本发明通过重测序的手段探寻滩羊的特有变异和重要性状决定位点，并开发滩羊品种鉴定芯片，为今后滩羊的鉴定、保种、以及遗传育种提供支撑。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种鉴定滩羊与非滩羊的8种SNP位点及其应用。
背景技术
宁夏滩羊是我国优良地方种质资源之一，滩羊周岁内羔羊肉脂肪分布均匀，肉质细嫩，腥膻味小，是粗毛羊中羊肉品质较好的一种，是宁夏羊肉的代表，已享誉全国。滩羊年出栏量达600万头，因特有的风味和肉质深受市场推崇，由于市场需求的变化和肉用滩羊的持续选育工作，滩羊肉受到消费者青睐，形成了“盐池滩羊肉”的品牌。2016年盐池滩羊肉成功入选G20峰会食材，更是树立了其安全、健康的高品质形象。然而，由于最近出现的滩羊和其他羊类品种的杂交后代冒充滩羊销售，对滩羊品牌造成了巨大损害。为稳定滩羊品质，重树滩羊品牌形象，将滩羊打造成为全国驰名品牌，区分滩羊与非滩羊成为今后滩羊的鉴保种以及遗传育种的重要目标。
全基因组重测序是对基因组序列已知的个体在全基因组范围内进行测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。
发明内容
本发明一个目的是提供检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合的基因型的物质的用途。
本发明提供了检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测羊是否为滩羊或非滩羊中的应用；
或，检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测羊是否为滩羊或非滩羊的产品中的应用；
所述4个SNP位点组合为如下至少一种：
1)由SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点3_12248645、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点20_44865529和SNP位点6_94503480组成；
2)由SNP位点14_24812228、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
3)由SNP位点14_24807700、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
4)由SNP位点14_24803652、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369和SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480、SNP位点7_89505361组成。
本发明提供了检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合基因型的物质在区分或辅助区分待测羊为滩羊或非滩羊中的应用；
或，本发明提供了检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合基因型的物质在制备区分或辅助区分待测羊为滩羊或非滩羊的产品中的应用；
所述4个SNP位点组合为如下至少一种：
1)由SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点3_12248645、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点20_44865529和SNP位点6_94503480组成；
2)由SNP位点14_24812228、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
3)由SNP位点14_24807700、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
4)由SNP位点14_24803652、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369和SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480、SNP位点7_89505361组成。
上述应用中，所述检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合基因型的物质包括如下生物材料：
所述生物材料为如下1)-3)中任一种：
1)成套引物，所述成套引物包括扩增SNP位点的多重引物；
所述扩增SNP位点的多重引物由序列1所示的单链DNA分子至序列32所示的单链DNA分子组成；
2)含有1)的试剂；
3)含有1)或2)的试剂盒。
上述应用中，所述成套引物还包括单碱基延伸引物；
所述单碱基延伸引物由序列33所示的单链DNA分子至序列48所示的单链DNA分子组成；
所述检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合基因型的物质还包括记载如下标准的可读载体：
若待测羊的至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为滩羊；若待测羊至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的非滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为非滩羊。
上述检测待测羊基因组中的如下SNP位点组合基因型的物质也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测羊是否为滩羊或非滩羊的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测羊的基因组DNA中4个SNP位点组合中至少一种的基因型，按照如下标准判断：
若待测羊的至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为滩羊；若待测羊至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的非滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为非滩羊；
所述4个SNP位点组合为如下至少一种：
1)由SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点3_12248645、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点20_44865529和SNP位点6_94503480组成；
2)由SNP位点14_24812228、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
3)由SNP位点14_24807700、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
4)由SNP位点14_24803652、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369和SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480、SNP位点7_89505361组成。
上述方法中，所述检测待测羊的基因组DNA中4个SNP位点组合中至少一种的基因型的方法为全基因组测序或包括如下步骤的方法：
1)用上述扩增SNP位点的多重引物扩增待测羊，得到扩增产物；
2)用上述单碱基延伸引物对所述扩增产物进行延伸，得到延伸产物；
3)检测延伸产物的4个SNP位点组合的基因型。
上述方法中，所述步骤1)和步骤2)之间还包括碱性磷酸酶处理的步骤。
本发明第3个目的是提供一种选育滩羊的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测羊的基因组DNA中4个SNP位点组合中至少一种的基因型；选取符合该SNP位点组合对应的滩羊SNP位点基因型的待测羊；
所述4个SNP位点组合为如下至少一种：
1)由SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点3_12248645、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点20_44865529和SNP位点6_94503480组成；
2)由SNP位点14_24812228、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
3)由SNP位点14_24807700、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
4)由SNP位点14_24803652、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369和SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480、SNP位点7_89505361组成。
本发明第4个目的是提供一种选育非滩羊的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测羊的基因组DNA中4个SNP位点组合中至少一种的基因型；选取符合该SNP位点组合对应的非滩羊SNP位点基因型的待测羊；
所述4个SNP位点组合为如下至少一种：
1)由SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点3_12248645、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点20_44865529和SNP位点6_94503480组成；
2)由SNP位点14_24812228、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
3)由SNP位点14_24807700、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
4)由SNP位点14_24803652、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369和SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480、SNP位点7_89505361组成。
SNP位点组合对应的滩羊SNP位点基因型和SNP位点组合对应的非滩羊SNP位点基因型均为实施例中表8中相对应的。
本发明为稳定滩羊品质，重树滩羊品牌形象，将滩羊打造成为全国驰名品牌，本发明通过重测序的手段探寻滩羊的特有变异和重要性状决定位点，并开发滩羊品种鉴定芯片，为今后滩羊的鉴定、保种、以及遗传育种提供支撑。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、鉴定滩羊和非滩羊的SNP位点组合的发现及检测方法的建立
一、鉴定滩羊和非滩羊的SNP位点的发现
提取50只滩羊(来自宁夏盐池县)和50只非滩羊(来自宁夏、内蒙等地)血液或耳组织的基因组DNA。将基因组DNA用Illumina Hiseq X10仪器进行全基因组重测序，然后通过R软件进行分析，得到滩羊和非滩羊有区别的25个SNP位点，用R编程分析删除call rate不好的位点，模型分析的16个位点如下：10_29432742、14_24803652、14_24807700、14_24812228、15_72453265、15_72476712、19_2161140、20_44865529、25_34435605、2_42344462、2_80645369、3_12248645、6_94503480、6_94540642、7_88811445、7_89505361。
16个SNP位点的物理位置是基于滩羊全基因组标准序列比对确定的，所述滩羊全基因组标准序列的版本号为Oar_v4.0(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000298735.2/)；具体如下：
10_29432742位于10号染色体第29432742位，其脱氧核苷酸为G或A；
14_24803652位于14号染色体第24803652位，其脱氧核苷酸为C或T；
14_24807700位于14号染色体第24807700位，其脱氧核苷酸为G或A；
14_24812228位于14号染色体第24812228位，其脱氧核苷酸为C或T；
15_72453265位于15号染色体第72453265位，其脱氧核苷酸为C或T；
15_72476712位于15号染色体第72476712位，其脱氧核苷酸为C或T；
19_2161140位于19号染色体第2161140位，其脱氧核苷酸为C或T；
20_44865529位于20号染色体第44865529位，其脱氧核苷酸为A或C；
25_34435605位于25号染色体第34435605位，其脱氧核苷酸为G或C；
2_42344462位于2号染色体第42344462位，其脱氧核苷酸为C或T；
2_80645369位于2号染色体第80645369位，其脱氧核苷酸为G或C；
3_12248645位于3号染色体第12248645位，其脱氧核苷酸为G或C；
6_94503480位于6号染色体第94503480位，其脱氧核苷酸为G或A；
6_94540642位于6号染色体第94540642位，其脱氧核苷酸为C或T；
7_88811445位于7号染色体第88811445位，其脱氧核苷酸为T或G；
7_89505361位于7号染色体第89505361位，其脱氧核苷酸为A或G；
二、鉴定滩羊和非滩羊的SNP位点模型构建
698只滩羊(红寺堡自繁羊、滩羊场收购羊等)和120只非滩羊(景玉龙羊场、朔牧自产羊等)血液或耳组织的基因组DNA，然后进行Sequenom检测。
其中，Sequenom检测具体操作步骤如下：
1.引物设计
使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物(表1)，并交由生物公司合成。
表1每个SNP的引物信息
2.DNA质检
待实验样本用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/μl，转移至96孔板，-20℃储存备用。
3.引物稀释
(1)每个SNP，有三条引物(表1)，将这三条引物的编号标记在引物合成管的管盖上。
(2)Forward PCR引物、Reverse PCR引物先离心空甩后加水，加水量与OD值相关(引物管和引物设计表均有标识)，每1OD加36μl水。加水后室温放置30min后震荡混匀备用。
(3)每个Well中多重SNP的Forward PCR引物、Reverse PCR引物混合时计算方法：每个SNP的Forward PCR引物、Reverse PCR引物各取2.5μl加水量(μl)＝500-重数×2.5×2(重数：well中SNP个数)
4.PCR扩增
PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μl。
(1)在一个新的2.0ml EP管中配制PCR master mix溶液，具体如下表2所示。
表2 PCR master mix溶液
| 体积(μl) | |
| 10×PCR Buffer | 0.5 |
| MgCl<sub>2</sub>(25mM) | 0.4 |
| dNTP mix(25mM) | 0.1 |
| HotStar Taq(5U/μl) | 0.2 |
| 水 | 1.8 |
| PCR primer mix | 1 |
| 总体积 | 4 |
PCR primer mix由表1中每个SNP位点的Forward PCR引物和Reverse PCR引物组成，且每条引物在最终反应体系PCR master mix溶液中的浓度均为0.0039μM。
(2)将配制好的PCR master mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为4μl，在384孔板的每个加样孔中加入PCR master mix液。该384孔板即为PCR反应板。
(3)取出已经制备好的DNA样品96孔板，使用8通道加样器，调节加样体积为1μl，加至相对应的384PCR反应板，贴上封口膜，震荡混匀后空甩。
(4)在兼容384孔板的PCR仪上设定PCR反应条件如下表3所示。
表3 PCR反应条件
5.PCR产物碱性磷酸酶处理
(1)在PCR反应结束后，384反应板取出并空甩。
(2)配制碱性磷酸酶处理反应液，SAP Mix，具体如下表4所示。
表4碱性磷酸酶处理反应液SAP Mix
| SAP Mix | 对每个反应(μl) |
| 水 | 1.53 |
| SAP Buffer(10x) | 0.17 |
| SAP酶(1.7U/μl) | 0.3 |
| 总体积 | 2 |
(3)将配制好的SAP Mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为2μl，将SAP Mix加入384孔PCR反应板。贴上封口膜，震荡混匀后空甩。反应体系总体积为7μl(其中PCR产物5μl，SAP混合液2μl)。
(4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件如下表5所示。
表5 PCR反应条件
| 温度(℃) | 时间(分钟) | 循环 |
| 37 | 40 | 1 |
| 85 | 5 | 1 |
| 4 | ∞ | 1 |
启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理反应。
6.单碱基延伸
(1)在碱性磷酸酶处理结束后，将384反应板取出后空甩，在进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。
(2)配制单碱基延伸反应液，EXTEND Mix，如下表6所示。(注意：Extend primerMix与Well数一定要对应正确)
表6单碱基延伸反应液EXTEND Mix
| EXTEND Mix | 对每个反应(μl) |
| Water | 0.619 |
| Extend primer Mix | 0.94 |
| iPLEX Buffer plus | 0.2 |
| iPLEX terminator | 0.2 |
| iPLEX enzyme | 0.041 |
| 总体积 | 2 |
上述Extend primer Mix由表1中每个SNP位点的单碱基延伸引物组成，且每条引物在最终反应体系EXTEND Mix中的浓度均为0.019μM。
(3)将配制好的EXTEND Mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为2μl，将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7μl及EXTEND Mix液2μl，总体系9μl。
(4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件，如下表7所示。
表7 PCR反应条件
启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
7.树脂纯化
将反应产物加16μl水进行稀释，稀释后使用树脂进行脱盐。
8.芯片点样
将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。
9.质谱检测
上机(Agena Bioscience公司的Sequenom-核酸质谱分析平台)进行质谱检测，并收集数据；获得16个位点的基因分型。
对上述分析的16个位点随机组合，采用机器学习种的随即森林模型，通过对训练集的学习，得到优化的位点组合模型。组合位点如下：
得到如下表1所示的4组SNP位点组合：
1)
15_72476712+2_80645369+3_12248645+7_88811445和10_29432742+19_2161140+20_44865529+6_94503480
2)
14_24812228+15_72476712+2_80645369+7_88811445和10_29432742+19_2161140+6_94503480+7_89505361
3)
14_24807700+15_72476712+2_80645369+7_88811445和10_29432742+19_2161140+6_94503480+7_89505361
4)
14_24803652+15_72476712+2_80645369+7_88811445和10_29432742+19_2161140+6_94503480+7_89505361；
每个组合8个SNP位点。
15_72476712为Oar_v4.0基因组中第15号染色体的第72476712位，其核苷酸为T或C，基因型为TC或TT或CC；
2_80645369为Oar_v4.0基因组中第2号染色体的第80645369位，其核苷酸为C或G，基因型为CG或CC或GG；
3_12248645为Oar_v4.0基因组中第3号染色体的第12248645位，其核苷酸为G或C，基因型为GC或GG或CC；
7_88811445为Oar_v4.0基因组中第7号染色体的第88811445位，其核苷酸为G或T，基因型为GG或GT或TT；
14_24812228为Oar_v4.0基因组中第14号染色体的第24812228位，其核苷酸为C或T，基因型为CT或CC或TT；
14_24807700为Oar_v4.0基因组中第14号染色体的第24807700位，其核苷酸为A或G，基因型为AG或AA或GG。
10_29432742为Oar_v4.0基因组中第10号染色体的第29432742位，其核苷酸为A或G，基因型为AG或AA或GG。
19_2161140为Oar_v4.0基因组中第19号染色体的第2161140位，其核苷酸为C或T，基因型为CC或CT或TT。
20_44865529为Oar_v4.0基因组中第20号染色体的第44865529位，其核苷酸为A或C，基因型为AC或AA或CC。
6_94503480为Oar_v4.0基因组中第6号染色体的第94503480位，其核苷酸为A或G，基因型为AG或AA或GG。
7_89505361为Oar_v4.0基因组中第7号染色体的第89505361位，其核苷酸为A或G，基因型为AG或AA或GG。
表8为鉴别滩羊与非滩羊SNP位点组合基因型
上述表8中，第一列为SNP位点组合的名称，每个组合由8个SNP位点组成，组合中每个SNP位点用+间隔，每个SNP位点的名称中下划线前面是染色体编号，下划线后面是该位点在染色体上的物理位置；第二列和第三列随机组合是对应的滩羊SNP位点组合基因型，第四列和第五列随机组合是对应的非滩羊SNP位点组合基因型，位置顺序与位点的位置顺序一致，每个位点的基因型用下划线间隔。
根据表8所示的结果，用如下标准判断：
若待测羊的至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为滩羊；若待测羊至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的非滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为非滩羊。
获得模型的鉴定准确率如下表9：
表9为鉴定滩羊和非滩羊的SNP位点结果
表9中，
第2列实际数量是总共滩羊和非滩羊数，包括没有检测到基因分型的羊；
第3列模型数量为所有检测到基因型的滩羊和非滩羊数量；
第4列鉴定滩羊为用本发明的方法鉴定的滩羊数量；
第5列鉴定非滩羊为用本发明的方法鉴定的非滩羊数量；
第6列准确率＝(鉴定滩羊(第4列)+鉴定非滩羊(第5列))/模型总数(第3列)
假阳性率＝假阳羊数目/非滩羊总数(假阳羊为本来是非滩羊鉴定出来的是滩羊)
假阴性率＝假阴羊数目/滩羊总数(假阴羊为本来是滩羊鉴定出来的是非滩羊)上述结果表明：
15_72476712+2_80645369+3_12248645+7_88811445和10_29432742+19_2161140+20_44865529+6_94503480组合有99.39％准确率鉴定出滩羊和非滩羊；
14_24812228+15_72476712+2_80645369+7_88811445和10_29432742+19_2161140+6_94503480+7_89505361组合有99.25％准确率鉴定出滩羊和非滩羊；
14_24807700+15_72476712+2_80645369+7_88811445和10_29432742+19_2161140+6_94503480+7_89505361组合有99.14％准确率鉴定出滩羊和非滩羊；
14_24803652+15_72476712+2_80645369+7_88811445和10_29432742+19_2161140+6_94503480+7_89505361组合有99.14％准确率鉴定出滩羊和非滩羊。
因此，可以用上述4个SNP位点组合15_72476712+2_80645369+3_12248645+7_88811445和10_29432742+19_2161140+20_44865529+6_94503480；
14_24812228+15_72476712+2_80645369+7_88811445和10_29432742+19_2161140+6_94503480+7_89505361
14_24807700+15_72476712+2_80645369+7_88811445和10_29432742+19_2161140+6_94503480+7_89505361；
14_24803652+15_72476712+2_80645369+7_88811445和10_29432742+19_2161140+6_94503480+7_89505361；
去鉴定或区分滩羊与非滩羊，方法如下：
1)用表1中的所有SNP的Forward PCR引物和Reverse PCR引物对待测羊的基因组DNA进行多重PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2)将上述PCR扩增产物碱性磷酸酶处理，得到处理后产物；
3)用表1中的所有SNP的单碱基延伸引物对上述处理后产物进行单碱基延伸，得到延伸产物；
质谱检测延伸产物的基因型，用如下标准判断：
若待测羊的至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为滩羊；若待测羊至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的非滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为非滩羊。
实施例2、盲测一验证4个SNP位点组合鉴定滩羊和非滩羊的准确率
样本：576只滩羊和非滩羊
实验方法：用实施例1构建的鉴定或区分滩羊与非滩羊的方法检测每个样本的基因型，得到各个个体的4个SNP位点组合的基因分型信息。将鉴定结果与专家给出的真实结果进行比对，检验鉴定准确率，假阳率及假阴率。基于第一次盲测的结果，通过机器学习的方法优化训练集来优化模型。根据优化之后的模型再次对样品进行盲测，并进行准确率，假阳性率及假阴性率的评估。
实验结果：第一次盲测共鉴定出419份滩羊样本和151份非滩羊样本，与专家给定的样本实际品种进行对比，计算得出鉴定准确率为79.65％，假阳率为40.33％，假阴率为11.05％。对第一次盲测结果进行优化，将鉴定准确率提高到86.14％，假阳率为12.43％，假阴率为14.55％。
实施例3、盲测二验证4个SNP位点组合鉴定滩羊和非滩羊的准确率
样本：768只滩羊和非滩羊
实验方法：利用盲测一优化后的训练集，对768份样品用实施例1构建的鉴定或区分滩羊与非滩羊的方法检测每个样本的基因型，得到各个个体的4个SNP位点组合的基因分型信息，进行第二次盲测，将鉴定结果与专家给定的结果进行比对，计算鉴定准确率，假阳率及假阴率。
实验结果：768份样品得到基因分型有679份，盲测共鉴定出503份滩羊样本和176份非滩羊样本，与专家给定的样本实际品种进行对比，计算得出鉴定准确率为68.5％，假阳率为27.5％，假阴率为4.0％。
序列表
<110>北京康普森生物技术有限公司
<120> 一种鉴定滩羊与非滩羊的8种SNP位点及其应用
<130> 1
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgttggatg cccaattttc ctctgtggtg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgttggatg tggcttgtat gtgatgtcag 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acgttggatg ctgatggctt ttccaacctg 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgttggatg tttgaacctg tgtcttcccc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acgttggatg taaagaaacg gtgccgtgag 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acgttggatg aaaggaacca gagagcaagg 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgttggatg tctggcatga tgttcagaag 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgttggatg tctgacacct agtgtaccag 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acgttggatg tgcactgttc acccagatcc 30
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgttggatg agaggagctg aagccaaag 29
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgttggatg aagtactgaa gccaaggtgc 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acgttggatg tctgaatgta agccttgcgg 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acgttggatg tggagtgact gaacacggac 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acgttggatg acctagaggg agaagacctg 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acgttggatg agaagtgaat gggaatgcgg 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acgttggatg ggttacattg tctgctccac 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acgttggatg ctgatcctca ggaaggttag 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
acgttggatg tttgccctcc ttgacccatc 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acgttggatg caggaaaact gaagacagcc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
acgttggatg ccttccacta ccagcagcat 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
acgttggatg ttgaggaatg gcgtgtgttg 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
acgttggatg acccctccct gatgagaaac 30
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
acgttggatg tgcggaagac cagcgagag 29
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
acgttggatg ggaattcagc gggcacaac 29
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acgttggatg acgtctctac ccactttctg 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acgttggatg tttcgggaac agtaactgtg 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
acgttggatg gattagggca actggttctg 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
acgttggatg cgaaagaagt cctgaagctg 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acgttggatg acagtcagac atacctgagc 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
acgttggatg gcatcatttc acggcgctat 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
acgttggatg ttctctccca ggacactttc 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
acgttggatg gagaacgtga tggtccgcta 30
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
atgtgatgtc agaagagctg 20
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ggccacctgg caagtttagg aata 24
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
acgtgtccct tcctatc 17
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
agaagttagc ttgctagtct c 21
<210> 37
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
catggctggg tgacgg 16
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cctttaagcc ttgcggtgta cg 22
<210> 39
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gcctagaggc tgctcc 16
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cactcgtgaa tcatcctttt 20
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ggcaagcccc tttgcctccc ct 22
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ccacagtggc cactagaa 18
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ttgttgccca gacctgt 17
<210> 44
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
cacaacgcgt catcg 15
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gacagtaact gtgaaagaaa gttc 24
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ggcacctggt tctggaccaa gaccct 26
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
acaaagttgt attcatttgt tat 23
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ttcggaagtt tttcacccac tc 22
Claims (10)
1.检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测羊是否为滩羊或非滩羊中的应用；
或，检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测羊是否为滩羊或非滩羊的产品中的应用；
所述4个SNP位点组合为如下至少一种：
1)由SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点3_12248645、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点20_44865529和SNP位点6_94503480组成；
2)由SNP位点14_24812228、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
3)由SNP位点14_24807700、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
4)由SNP位点14_24803652、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369和SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480、SNP位点7_89505361组成。
2.检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合基因型的物质在区分或辅助区分待测羊为滩羊或非滩羊中的应用；
或，检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合基因型的物质在制备区分或辅助区分待测羊为滩羊或非滩羊的产品中的应用；
所述4个SNP位点组合为如下至少一种：
1)由SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点3_12248645、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点20_44865529和SNP位点6_94503480组成；
2)由SNP位点14_24812228、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
3)由SNP位点14_24807700、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
4)由SNP位点14_24803652、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369和SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480、SNP位点7_89505361组成。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合基因型的物质包括如下生物材料：
所述生物材料为如下1)-3)中任一种：
1)成套引物，所述成套引物包括扩增SNP位点的多重引物；
所述扩增SNP位点的多重引物由序列1所示的单链DNA分子至序列32所示的单链DNA分子组成；
2)含有1)的试剂；
3)含有1)或2)的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述成套引物还包括单碱基延伸引物；
所述单碱基延伸引物由序列33所示的单链DNA分子至序列48所示的单链DNA分子组成；
所述检测待测羊基因组中的如下4个SNP位点组合基因型的物质还包括记载如下标准的可读载体：
若待测羊的至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为滩羊；若待测羊至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的非滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为非滩羊。
5.权利要求1-4任一中的所述检测待测羊基因组中的如下SNP位点组合基因型的物质。
6.一种鉴定或辅助鉴定待测羊是否为滩羊或非滩羊的方法，包括如下步骤：检测待测羊的基因组DNA中4个SNP位点组合中至少一种的基因型，按照如下标准判断：
若待测羊的至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为滩羊；若待测羊至少一个SNP位点组合的基因型符合表8所示的该SNP位点组合对应的非滩羊SNP位点基因型，则该待测羊为或候选为非滩羊；
所述4个SNP位点组合为如下至少一种：
1)由SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点3_12248645、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点20_44865529和SNP位点6_94503480组成；
2)由SNP位点14_24812228、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
3)由SNP位点14_24807700、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
4)由SNP位点14_24803652、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369和SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480、SNP位点7_89505361组成。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述检测待测羊的基因组DNA中4个SNP位点组合中至少一种的基因型的方法为全基因组测序或包括如下步骤的方法：
1)用权利要求3或4中的所述扩增SNP位点的多重引物扩增待测羊，得到扩增产物；
2)用权利要求3或4中的所述单碱基延伸引物对所述扩增产物进行延伸，得到延伸产物；
3)检测延伸产物的4个SNP位点组合的基因型。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤2)之间还包括碱性磷酸酶处理的步骤。
9.一种选育滩羊的方法，包括如下步骤：检测待测羊的基因组DNA中4个SNP位点组合中至少一种的基因型；选取符合该SNP位点组合对应的滩羊SNP位点基因型的待测羊；
所述4个SNP位点组合为如下至少一种：
1)由SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点3_12248645、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点20_44865529和SNP位点6_94503480组成；
2)由SNP位点14_24812228、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
3)由SNP位点14_24807700、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
4)由SNP位点14_24803652、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369和SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480、SNP位点7_89505361组成。
10.一种选育非滩羊的方法，包括如下步骤：检测待测羊的基因组DNA中4个SNP位点组合中至少一种的基因型；选取符合该SNP位点组合对应的非滩羊SNP位点基因型的待测羊；
所述4个SNP位点组合为如下至少一种：
1)由SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点3_12248645、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点20_44865529和SNP位点6_94503480组成；
2)由SNP位点14_24812228、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
3)由SNP位点14_24807700、SNP位点15_72476712、SNP位点2_80645369、SNP位点7_88811445、SNP位点10_29432742、SNP位点19_2161140、SNP位点6_94503480和SNP位点7_89505361组成；
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| CN102477464A (zh) * | 2010-11-30 | 2012-05-30 | 宁夏大学 | 滩羊二毛弯曲数性状检测试剂盒及使用方法 |
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Denomination of invention: Identification of eight SNP loci between Tan sheep and non Tan sheep and its application Effective date of registration: 20220629 Granted publication date: 20210928 Pledgee: Xiamen International Bank Co.,Ltd. Beijing Branch Pledgor: BEIJING COMPASS BIOTECHNOLOGY TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022990000388 |