CN104830992A

CN104830992A - 检测亚甲基四氢叶酸还原酶c677t多态性位点的引物、试剂盒及其pcr方法

Info

Publication number: CN104830992A
Application number: CN201510290659.XA
Authority: CN
Inventors: 高劲松; 张英杰; 李星颐; 陈志鹏; 魏潇; 魏奇
Original assignee: SHENYANG EUGENOM BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHENYANG EUGENOM BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: CN104830992B

Abstract

本发明公开了一种检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，其中包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No.17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQ No.14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No.16序列；试剂盒具有检测简单、快速、准确、廉价等优点，为科研和临床亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性分析提供了强有力的工具。

Description

检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法

技术领域

本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测亚甲基四氢叶酸还原酶多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，用于亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的快速检测。

背景技术

亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR）是细胞内叶酸平衡和代谢的关键酶，在嘌呤和胸腺嘧啶存在的条件下不可逆催化5-甲酸基四氢叶酸合成5-甲基四氢叶酸，后者参与DNA的合成与甲基化作用。MTHFR基因存在的C677T多态性，使得MTHFR的活性降低。在使用甲氨蝶呤抑制二氢叶酸还原酶的活性时，如果患者存在该变异，将造成严重的毒副反应。因此MTHFR基因多态性的检测对于个体化合理用药具有重要的指导意义。

缺血性脑卒中是老年人群中较为常见的一种脑血管疾病，其致残率和致死率高，特别是在合并有高血压、糖尿病等危险因素的情况下，其发病率更高，给社会和家庭带来巨大负担。近年来，我国缺血性脑卒中发病有年轻化趋势，青中年人群发病率明显增加。已有研究证实，同型半胱氨酸（Hcy）升高已经成为缺血性脑卒中的重要指标，而MTHFR 的677位点C→T的突变，使得MTHFR产生热不稳定性缺陷，Hcy升高，因此，MTHFR C677T多态性是青年缺血性脑卒中的独立危险因子，当个体携带有风险等位基因时，脑卒中的发病率将比普通人升高。当然，脑卒中等心脑血管疾病是遗传与环境因素相互作用的结果，通过改变饮食结构、运动方式、生活习惯，可以延迟甚至避免疾病的发生，因此MTHFR C677T多态性的检测能够提前预知个体罹患心脑血管疾病的危险程度，这对于脑卒中等心脑血管疾病的发病风险预测和早期预防具有重要意义。

目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法；PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP；PCR高分辨熔解曲线分析技术；PCR-Taqman MGB（Minor Groove Binder）探针法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。这些方法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。

如：1）直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测基因突变的灵敏度为20%（即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%）。同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易实施等缺点。

2）普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1;14(3):163-9, United States Patent 20120135406]。

3）芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。

4）PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低，但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高昂，普及受限，见[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]。

5）PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见 [J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8):2909-15；United States Patent 20090311679]，并且不能检测样本中的含量较少(≥1,000个中的1个)的等位基因或突变位点。

6）PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染，而且操作步骤多，费时费力。

7）等位基因特异性引物PCR扩增法(AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或SNP最简单快速的方法（Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Wallace R B., Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的效率将会下降10³-10^6.6倍 (Chen, X., and Sullivan, P F, The Pharmacogeonomics Journal 2003, 3, 77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关(Ayyadevara S, Thaden J J, Shmookler Reis R J., Anal Biochem 2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位基因变量的影响。为了增加AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克服，如报道的TaqMAMA方法，在3’倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准，会出现混乱的情况，见[J Virol Methods. 2008 Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb;83(2):311-20]。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了PCR的污染机会，而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是“全或无”式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩增，只是其得到的Ct（Cycle threshold）不同而已，因此就引入了ΔCt的概念，即ΔCt=野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要ΔCt值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，ΔCt值小于杂合子Ct值，判为杂合子，ΔCt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为ΔCt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见[中国专利CN101235415，CN101565742A]。

8）美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR（ Competitive allele specific Taqman PCR），用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见[Exp Mol Pathol. 2012 Jun;92(3):275-80； United States Patent 20100221717；CN102428190A]。有人采用锁核酸(LNA)( Plant Method 2007，3：2)或修饰的碱基(Anal Biochem.2005，340：287-294)的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并需对反应进行深度优化。

目前，国内已上市有注册证的亚甲基四氢叶酸还原酶基因检测试剂盒有如下两种：1、深圳奥萨制药有限公司的“亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C/T检测试剂盒(PCR-RFLP)”，国械注准20153400074；2、上海百傲科技有限公司的“MTHFR (C677T)基因检测试剂盒(PCR-芯片杂交法)”，国食药监械(准)字2012第3401329号。

厦门大学附属中山医院申请的“单管联合测定乙醛脱氢酶2 基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及测定方法”（申请号 201410067910.1），采用多重PCR扩增和焦磷酸测序的联合方法，定性检测两种基因的多态性位点；日本株式会社东芝在中国申请专利“用于鉴定亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因型的核酸引物和探针”（公开号CN101275165A），采用LAMP扩增的方法检测MTHFR基因具有单核苷酸多态性的C677T和A1298C位点；苏州旷远生物分子技术有限公司申请的“用于检测人MTHFR 基因多态性的引物、探针、荧光PCR 试剂盒和方法”（公告号CN 102808026 B），采用“等位基因特异PCR”原理，在实时荧光定量PCR 技术平台上检测亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR 基因c.665 与c.1286 两个多态性位点的核苷酸类型；郑州大学申请的“鉴定人MTHFR 基因多态性rs2274976 的试剂盒” （公告号CN 101812513 B），采用荧光定量PCR扩增，限制性内切酶对扩增产物进行酶切，酶切产物电泳等一系列的方法进行鉴定。

多重PCR和焦磷酸测序相结合，实验过程繁琐复杂，耗时长，不利于临床应用。环介导等温扩增方法（LAMP）一旦开盖容易形成气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重，因此在进行试剂盒的研发过程中采用实时浊度仪，不要把反应后的反应管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增方法。普通的荧光定量PCR技术对最为关键的位点特异性引物设计，也仅按照引物设计的一般原则进行，没有一个好特异引物的筛选客观指标，最为关键的是他们的结果判断，依然模糊，没有“全或无”的概念，这样非特异性的缺点还是无法克服。荧光定量PCR扩增后再进行酶切，需要开盖，大大增加了污染的可能性，同时，酶切和电泳都使得操作步骤繁琐，耗时长。

因此，如何对MTHFR C677T多态性位点进行简单准确的检测，成为人们亟待解决的问题。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种检测MTHFR C677T多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，以至少解决以往试剂盒存在的结果判读复杂、检测仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等一个或多个问题。

本发明提供的方案具体为：一种检测MTHFR C677T多态性位点的引物，其特征在于，所述引物包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；

且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No.17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQ No.14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No.16序列。

本发明一方面还提供了一种检测MTHFR C677T多态性位点的试剂，其特征在于：所述试剂含有上述的引物。

本发明另一方面还提供了一种检测MTHFR C677T多态性位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒也含有上述的引物。

优选，所述试剂盒中还包括与所述引物配合使用的探针，其中，所述探针为Taqman探针，具有SEQ No.15序列。

进一步优选，所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、检测管家基因GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物、检测管家基因GAPDH的探针、阳性质控品和空白对照；

所述检测管家基因GAPDH的上游引物具有SEQ No.19序列；所述检测管家基因GAPDH的下游引物具有SEQ No.20序列；所述检测管家基因GAPDH的探针具有SEQ No.21序列。

进一步优选，所述突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于T型PCR反应管内；以及与所述野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于C型PCR反应管内。

进一步优选，所述T型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、1pm-20pm、1pm-20pm、0.05pm-5pm；以及所述C型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、 50nM-400nM、1pm-20pm、1pm-20pm、0.05pm-5pm。

更进一步优选，所述T型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2.5pm；以及所述C型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2.5pm。

本发明还提供了上述引物及试剂盒的PCR方法，其特征在于：PCR反应按两步扩增循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步扩增的循环数，所述第一步扩增的退火温度高于所述第二步扩增的退火温度。

优选，所述PCR反应的条件为：37℃ 2min，95℃ 2min 预变性；第一步扩增，95℃ 变性 5s，55℃~68℃ 退火 32s，循环10~15次；第二步，95℃ 变性 5s，50℃~65℃ 退火、延伸 32s，循环30~50次，收集荧光信号；进一步优选，所述PCR反应的条件为：37℃ 2min，95℃ 2min 预变性；第一步扩增，95℃ 变性 5s，63℃ 退火 32s，循环15次；第二步，95℃ 变性 5s，60℃ 退火、延伸 32s，循环40次，收集荧光信号。

本发明提供的检测MTHFR C677T多态性位点的引物及其试剂盒，能够大大增加等位基因特异性引物PCR区分不同等位基因位点的能力，使不同位点间的非特异性交叉扩增的可能性降到最低，能够做到真正“全或无”式的扩增，不仅有很好的特异性，也具有非常好的灵敏度，能检出1ng基因组DNA中的基因型分布情况。

本发明提供的检测MTHFR C677T多态性位点的引物及其试剂盒，具有以下优点：

1）通过对引物序列上的人为改变使检测结果真正做到对结果“全或无”判断，大大简化了结果判读的难度，降低了出错的可能，为科研和临床应用提供了便利。

2）Ｔaq酶与dNTPs的混合，保障了dNTPs的稳定性，使其可经受多次反复冻融的考验。

3）提前预配好可直接使用的缓冲液，使用者更加方便。

4）引物和探针提前包被在PCR反应管内，避免了操作者出现位点配错的可能，而且也节约了大量操作时间。

5）本发明中引物和试剂盒具有特异性好，检测的灵敏度高，检测速度快，整个过程能在1小时20分钟内完成。

6）试剂盒内仅用一条常规Taqman探针，别无其他诸如封闭探针，降低成本。

7）该试剂盒具有检测简单、快速、准确、价廉等优点。

附图说明

图1为设计野生型和突变型引物时的PCR扩增曲线图；

图2为T位点的PCR扩增曲线图；

图3为C位点的PCR扩增曲线图；

图4为CT位点的PCR扩增曲线图；

图5为管家基因GAPDH的PCR扩增曲线图。

具体实施方式

下面以具体的案例对本发明进行进一步解释，但并不用于限制本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用产品均为市购。

以下定义是本发明中相关术语的解释：

“等位基因”一般是指DNA区段，同源染色体上的相同物理位置上，控制相对性状的一对基因。在一些情况下，等位基因可以对应于特定物理基因座上的单核苷酸的替换。在其它情况中，等位基因可以对应于核苷酸(单个或多个)插入或缺失。

“等位基因特异性引物”是指与目标等位基因的序列互补，在PCR时能够延伸完成特异的PCR反应。等位基因特异性引物可以设计成能检测出靶序列中少至1个核苷酸差异十分特异的引物，该引物可以包含等位基因特异性核苷酸部分、3’端靶标特异性部分和尾巴。

“MGB基团”是指小沟结合剂。当与寡核苷酸的3’末端缀合时，MGB基团能够作为不可延伸的封闭部分发挥作用。MGB是能结合于双链DNA的小沟内的分子，通常采用DPI3（其合成方法参见美国专利号6,084,102；和6,727,356)。

“检测探针”是指：指示扩增的多种信号传导分子中的任意一种。例如，SYBR Green和其它DNA结合染料都是检测探针。一些检测探针可以是序列特异性的，例如Taqman探针(美国专利号5,538,848)，多种茎环分子信标(美国专利号6,103,476和5,925,517以及Tyagi and Kramer，Nature Biotechnology，1996，14：303-308)，无茎的或线性信标(WO99/21881)，PNA Molecular Beacons TM(美国专利号6,355,421和6,593,091)，线性PNA信标(Kubista等人，2001，SPIE4264：53-58)，非-FRET探针(美国专利号6,150,097)，Sunrise/Amplifluor探针(美国专利号6,548,250)，茎环和双链Scorpion TM探针(Solinas等人，2001，NucleicAcidsResearch29：E96和美国专利号6,589,743)，鼓起的环探针(美国专利号6,590,091)，假结探针(美国专利号6,589,250)，cyclicon(美国专利号6,383,752)，MGB Eclipse TM探针(Epoch Biosciences)，发夹探针(美国专利号6,596,490)，肽核酸(PNA)探针。检测探针可以包含荧光报告分子，例如，6-羧基荧光素(6-FAM)或四氯荧光素(TET)，和淬灭分子部分，例如四甲基若丹明(TAMRA)，Black Hole Quenche RS(Biosearch)，Iowa Black(IDT)，QSY猝灭剂(Molecular Probes)和Dabsyl和Dabcel磺酸盐/羧酸盐猝灭剂(Epoch)。

“共用特异性引物”是指在PCR反应中与等位基因特异性引物配对的引物，它能同不同位点的等位基因特异性引物配对使用。

“热稳定性的聚合酶”是指对热稳定性的或热抗性的酶，主要指DNA聚合酶，该酶在PCR扩增时，在升高的温度条件下不会发生失活。

寡核苷酸的“Tm”或“熔解温度”是指一段DNA中50％的分子与互补序列杂交时的温度。Tm值可以使用熟知的公式来计算(见，Maniatis，T.等人：Molecular cloning，Cold Spring Harbor，N.Y.：1982)。

“灵敏度”是指能够被检出模板的最小量(拷贝数)。

“特异性”是指区分匹配模板和错配模板的能力。特异性经常表示为ΔCt＝Ct错配-Ct匹配。

“选择性”是指AS-PCR测定可用于测定混合物中的少数(通常是突变)等位基因而无来自多数(经常是野生型)等位基因的干扰的程度。选择性经常表示为比例或百分率。例如，能够在存在100个野生型模板的情况下检出1个突变模板的测定被称作具有1∶100或1％的选择性。

“Ct”值是指循环阈值，代表PCR扩增曲线由基线变为指数增长拐点时的循环数。

“德尔塔Ct”或“ΔCt”是指信号通过固定阈值时，两个不同样品或反应之间的循环数差异。ΔCt是达到指数扩增时，两个不同样品或反应之间的循环数差异。ΔCt可用于鉴定匹配引物与错配引物之间的特异性。

本发明涉及快速检测MTHFR C677T多态性位点的引物和试剂盒。具体地讲，本发明是基于Past-PCR（Perfect allele-specific Taqman PCR）方法的基础上，成功应用于MTHFR C677T多态性位点检测。所谓Past-PCR是由检测基因多态性位点或突变的高特异性AS-PCR方法和Taqman探针的荧光PCR技术结合而成，其仅用一条Taqman探针，在多数的情况下，这条探针为常规的Taqman探针，仅在部分基因中因富含AT碱基的特殊序列，采用Taqman-MGB或LNA等探针，除此之外无需任何额外的封闭探针或报告探针，Past-PCR方法将AS-PCR和Taqman荧光PCR两种方法完美结合，并使两者的优点得到了极度的发挥，具体表现在AS-PCR方法中，在不增加任何成本的情况下，靠引物设计和独特的验证方法成功消除了非特异性扩增，使得结果判断呈现出“全和无”方式，即有就有，没有就没有，使得结果的判断简单而准确，这是对过去的AS-PCR方法最大的改进，也是对AS-PCR方法为人所诟病的有效弥补，从而将AS-PCR方法的优点发挥到了极致，是该方法所能达到的最高境界。众所周知，Taqman荧光PCR具有密闭性检测无需反应完结后的处理，不仅节省了时间，而且减少了PCR产物污染的风险，探针的第二次识别靶序列保障了检测的特异性和可靠性，还可用于对基因的定量检测，达到了临床使用标准等优点。Past-PCR方法具有AS-PCR方法和Taqman荧光PCR方法的双重优点，并且是这两种方法结合在一起时，检测组份所能达到的最简化构成，因此，我们将其称作为完美的等位基因特异性Taqman PCR。

基于Past-PCR方法，发明了用于检测基因MTHFR C677T多态性位点的试剂盒，其基本组成为：(a)高度特异的等位基因特异性引物；(b)荧光检测探针；(c)与等位基因特异性引物配对的另一条特异性引物。

其中，本发明提供的检测MTHFR C677T多态性位点的引物，包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；

同时还提供了含有上述引物的检测试剂和试剂盒，以解决以往检测MTHFR C677T多态性位点存在操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等问题，实现了检测简单、快速、准确、廉价的理想要求，为科研和临床基因型和基因突变分析提供了强有力的工具。

优选，所述试剂盒中还包括与所述引物配合使用的探针，其中，所述探针为Taqman探针，具有SEQ No.15序列，整个试剂盒中仅使用一条探针，别无其他诸如封闭探针等，降低试剂盒的成本。

所述检测管家基因GAPDH的上游引物具有SEQ No.19序列；所述检测管家基因GAPDH的下游引物具有SEQ No.20序列；所述检测管家基因GAPDH的探针具有SEQ No.21序列；其中，将dNTPs和Taq酶混合，能够保障dNTPs的稳定性，使其可经受多次反复冻融的考验；检测管家基因GAPDH的上游引物、下游引物和探针是用于作为内参照，为防止检测时出现假阴性；阳性质控品为CT型人基因组DNA；空白对照为灭菌超纯水。

进一步优选，所述突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于T型PCR反应管内；以及与所述野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于C型PCR反应管内，按最佳的反应用量预先包被在PCR反应管中，每一个反应管中实际包被六条寡核甘酸，即一条针对等位基因的一种特异性上游引物、一条探针（通常为Taqman探针）、一条共用特异性下游引物、一条检测管家基因GAPDH的上游引物、一条检测管家基因GAPDH的下游引物和一条检测管家基因GAPDH的探针。这样为了检测一个位点不同的基因多态性，常需要分别包被两管或两管以上的PCR反应管，它们中探针、共用特异性下游引物、检测管家基因GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物和检测管家基因GAPDH的探针是一样的，不同的仅是鉴定等位基因不同型别的特异性上游引物，这样预先包被避免了操作者出现位点配错的可能，而且节约了大量操作时间。

进一步优选，所述T型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、1pm-20pm、1pm-20pm、0.05pm-5pm；以及所述C型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、1pm-20pm、1pm-20pm、0.05pm-5pm。最优为，所述T型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2.5pm；以及所述C型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2.5pm。

由于在等位基因特异性引物内引入了错配的碱基，使其在反应时的效率下降，不同的引物下降程度不同，通常要增加10至20个循环才能达到没有错配时的效果，保证检测的灵敏度，优选PCR反应按两步扩增循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步扩增的循环数，所述第一步扩增的退火温度高于第二步扩增的退火温度，第一步扩增使用较高退火温度，第二步扩增使用较低退火温度，目的是增加第一步扩增时引物退火时的特异性，从而保证Past-PCR检测高度特异性的目的；具体而言优选所述PCR反应的条件为：37℃ 2min，95℃ 2min 预变性；第一步扩增，95℃ 变性 5s，55℃~68℃ 退火 32s，循环10~15次；第二步，95℃ 变性 5s，50℃~65℃ 退火、延伸 32s，循环30~50次，收集荧光信号；更为优选PCR反应的条件为：37℃ 2min，95℃ 2min 预变性；第一步扩增，95℃ 变性 5s，63℃ 退火 32s，循环15次；第二步，95℃ 变性 5s，60℃ 退火、延伸 32s，循环40次，收集荧光信号。

具体的检测过程为：

1）将待检测样品分别放入预先分别包被有野生型特异引物、共用的下游引物、探针、检测管家基因GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物和检测管家基因GAPDH的探针以及突变型特异引物、共用的下游引物、探针、检测管家基因GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物和检测管家基因GAPDH的探针两组PCR反应管内，并加入PCR缓冲液、dNTPs和Taq酶混合液、灭菌超纯水和基因组DNA，盖紧管盖，在荧光定量PCR仪上进行反应，并收集荧光信号；

2）如果检测样本仅有突变型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为T型，即突变型纯合子；

如果检测样本仅有野生型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为C型，即野生型纯合子；

如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为CT型，即杂合子；

如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均无对数增长的扩增曲线，可能样本或操作存在问题，或者样本DNA浓度过低，应重新提取样本DNA进行试验。

下面详述检测过程中各组份介绍：

（一）等位基因特异性引物：

等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于基因的一个等位基因位点，但不互补于该基因的另一个等位基因位点。通常而言，等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分位于等位基因特异性引物的3’端的末位碱基。在某些情况下，等位基因特异性核苷酸部分也可位于等位基因特异性引物3’末端的其他碱基位置。

在一些情况下，等位基因特异性引物除3’末端互补于等位基因位点有所变化外，我们常常要在引物的其他位置引入错配的碱基，如在引物3’端倒数第二位或第三位引入碱基错配，或第二和第三位的连续错配；针对不同的SNP或突变位点，在引物3’端倒数第二位或第三位引入碱基错配的基础上，还可在引物的其它位点增加碱基错配来满足反应特异性的要求，越远离3’端，增加错配的碱基数越多，在5’端可达最多。等位基因特异性引物的长度主要依据其T_m值来决定，通常而言其T_m值比PCR循环的退火温度低大约5-20℃。

两条检测对应基因多态性的等位基因特异性上游引物，除3’端检测的位点其碱基不同外，其余序列尽可能相同，二条引物的T_m值也尽可能一致。

低T_m的等位基因特异性引物(ASP)有更高的特异性。一般情况下，等位基因特异性引物为短寡核苷酸，其长度是大约15-30，其T_m是大约40℃至60℃，比扩增过程中使用的PCR循环条件的退火/延伸温度低大约5℃至20℃。

由于等位基因特异性引物的设计和筛选十分重要，好的引物需要从众多待选的引物中选出，因此我们建立了一个筛选的方法，其等位基因特异性引物的具体筛选过程如下：

⑴设计外围引物及PCR扩增：首先在待检基因突变点或多态性位点的上下游，设计一对PCR扩增引物，然后用该对引物，对目的基因进行常规的PCR反应，其中扩增片段长度可在几十至数千碱基对，优选长度为200至500碱基对；

⑵克隆PCR产物：将扩增出的PCR产物，利用AT克隆的方法，重组到普通的T载体质粒中，得到重组质粒，其中得到的重组质粒可以进行测序验证，从而确保PCR产物的正确性；

⑶构建重组突变体：根据生物信息学所提供的信息，采用分子克隆技术，将突变体的序列，构建至上述得到的重组质粒中，将构建的重组突变体进行测序验证序列，从而确保其正确性；

⑷设计及筛选突变位点特异性引物：设计两条等位基因特异性引物，一条引物的3’端同突变序列互补，另一条引物的3’端同正常序列互补；然后分别用等位基因特异性引物和对应的常规PCR共同下游引物配对，以上述构建好的重组突变体作为反应模板，利用荧光定量PCR仪，对反应体系，进行筛选；其中，反应可采用荧光染料，如SYBR GREEN，也可采用特异性的Taqman荧光探针，按照所加样品量为0.1微克全基因组DNA的标准进行筛选，其具体的筛选内容如下：

（a）设定PCR反应条件：首先设定PCR反应的退火温度完全一致，具体温度为55℃～68℃，PCR循环次数为40次，PCR反应的酶和缓冲体系均优化后固定不变，此反应条件的设定是为了方便同时检测多种基因突变；

（b）特异性筛选：采用突变型的引物以野生型的重组质粒为模板，筛选出的引物其Ct大于40；

其中循环阈值的确定原因如下，突变型引物在野生型模板发生非特异性扩增比野生型引物在野生型模板发生特异性扩增多19个循环，按照临床实际检测时，所加样品量为0.1微克全基因组DNA的标准，我们通过下列公式，拷贝数=(DNA量ng×6.022×10²³)/(长度bp×10⁹×660)，其中全基因组DNA的长度为30亿对碱基，因此0.1微克全基因组DNA的拷贝数为：3.09×10⁴，反映在荧光定量PCR的Ct（定量循环阈值）大概为21，这样我们得到第二个筛选指标，即用突变型的引物，在野生型的重组质粒为模板时，所得的Ct 应该大于40，方能保证检测不会出现假阳性，两者的扩增效率相差为40-21=19个循环，即扩增效率相差19个循环以上，将成为我们判断等位基因特异性引物特异性好坏的客观指标。我们知道当引物3’端与模板错配时，延伸效率将下降10³-10^6.6倍，换算成反应循环数则下降约13至27个循环，这就是我们能筛选出理想引物的理论依据，因为不进行引物筛选，19-13=6个循环，势必产生假阳性，该引物的特异性就不好，而19-27=-8，不可能产生假阳性，有8个循环数的范围供我们对引物进行筛选。按照这一要求，我们设计一系列等位基因特异性引物，从长短上、从靠近3’端人为引入碱基错配上着手，加上其配对的下游引物，利用构建好的野生型和突变型重组质粒，分别进行荧光定量PCR反应的交叉筛选，即当用突变引物与野生型的模板进行扩增时，与用野生型引物同野生型模板的反应要多用19个循环数以上，反之亦然，那么这样的引物就具备高度的特异性。

（c）敏感性筛选：将筛选出的特异性引物用与重组突变型质粒作敏感性试验，将检测灵敏度小于10-1000个拷贝的特异性引物筛选出来，即为所需的突变特异性引物。

通过以上几方面的筛选，所得到的等位基因特异性引物将具备高度特异性和高度敏感的理想引物。

（二）检测探针：

在一些情况下，检测探针的T_m值大约为60℃至70℃，最佳为65℃，探针长度根据其T_m值决定。尽管有多种不同形式的探针可供选择，Taqman探针(Applied Biosystems，Foster City)常常是首选。在一些特殊的情况下，如检测序列中AT含量过高，可以采用提高T_m值的Taqman-MGB等类型的探针。

共用的特异性引物，在一些情况下，共用的特异性引物的T_m值大约为50℃至70℃，最佳为60℃，其长度由其T_m值决定，一般在15-25碱基之间。

（三）其他成分：

本发明使用的DNA聚合酶是Taq酶，及其突变体、衍生物或片段，也可是其他的耐热DNA聚合酶，在一些情况下，也可采用Hotstart Taq酶，以增加反应的特异和高效性。

本发明中所提供的针对MTHFR基因所提供的引物和试剂盒，主要是针对等位基因特异性引物PCR扩增法的缺点，利用分子克隆技术，事先分别构建含待检基因野生型和突变型的重组质粒，以此重组质粒为阳性模板，筛选确定特异地分别与3'末端突变位点或野生位点碱基互补的两条特异引物，一旦筛选出的特异引物序列，将是我们检测体系的关键元素。本发明的上述产品，可用于任何型号的荧光定量PCR仪，试剂成本同如今市面上的荧光定量PCR试剂相当，因此较好地克服了其他采用等位基因特异性引物PCR扩增法的不足。

本发明的优点在于：所述的试剂盒具有操作简单，成本低，结果判断简单容易，灵敏度高，本试剂盒检测基因突变灵敏度可以达到1%（即目的基因的突变基因DNA 模板数占野生型DNA模板数的1%）；而直接测序中检测基因突变的灵敏度为20%（即目的基因的突变基因DNA 模板数占野生型DNA 模板数的20%）；Taqman探针技术保障了试剂盒的检测为闭管反应，有效的避免了假阳性的产生，其检测特异性也充分得到保证，而且检测快速方便，整个检测过程只有 80 分钟，而直接测序则需要2 天的时间，而且是开管操作，PCR产物污染的可能性大增。

本发明中PCR（Past-PCR）的实施步骤：

1.阳性质粒的构建

在待检测的MTHFR C677T多态性位点的上下游设计一对PCR引物，其扩增片段的长度可在500bp的范围内，用gDNA为模板，采用常规PCR方法，扩增出这一片段，通过AT克隆的方式，将该片段克隆至测序的质粒中，通常用Invitrogen的pCR2.1 Topo T载体试剂盒，操作按说明书进行，也可用其他厂家的T载体试剂盒，甚至可用自己制备的T载体质粒。得到的阳性克隆，经测序验证，证明序列的正确性，然后采用Stratagene 公司的Quickchange试剂盒，设计对应位点的另一个基因型引物，通过Quickchange的方法，得到该突变型别的阳性克隆，操作按说明书进行，所得到的阳性质粒都必须经测序验证为正确方可进入下一步的使用。Taqman定量质粒，并用作模板以验证给定的测定法的灵敏性、线性动态范围、特异性。

2.等位基因特异性引物(ASP)的设计和筛选

在引物3’末端互补于对应的基因突变碱基位点，而在引物3’末端倒数第二位或第三位引入碱基错配，或第二和第三位的连续错配；针对不同的SNP或突变位点，在引物3’端倒数第二位或第三位引入碱基错配的基础上，还可在引物的其它位点增加碱基错配来满足反应特异性的要求，越远离3’端，增加错配的碱基数越多，在5’端可达最多的等位基因1特异性引物。

ASP的筛选是利用构建好的野生型和突变型重组质粒，分别进行荧光定量PCR反应的交叉筛选，即当用突变引物与野生型的模板进行扩增时，与用野生型引物同野生型模板的反应要多用19个循环数以上，反之亦然，那么这样的引物就具备高度的特异性。将筛选出的特异性引物用与对应的重组质粒作敏感性试验，检测灵敏度小于10-1000个拷贝的引物即达到检测的灵敏度要求，满足上述两个条件的引物就是我们选出的ASP引物，可进行下一步的检测。

3.扩增试剂准备及加入被检测样品

（1）从试剂盒中取出各组成成分，室温缓慢融化PCR缓冲液、dNTPs和Taq酶混合液、阳性质控品、空白对照，颠倒摇匀。每个反应管需加入PCR缓冲液、Taq酶（dNTPs）、灭菌超纯水和DNA样本。盖紧管盖，瞬时离心后转移到PCR扩增区。

（2）建议每次PCR反应均同时进行样本、阳性质控品、空白对照的分析，阳性质控品和空白对照的加样方法同样本加入方法。

4.反应条件

每个反应管中 (反应终体积的范围可在10-50μl，最佳在20-25μl反应体积)包含PCR缓冲液（10mM Tris-HCl pH8.3,50mM KCl, 0.1%Triton X-100，2.0mM MgCl₂），10-100ng DNA或1,000,000个拷贝的质粒DNA，50nM-400nM 一个共同的通用特异性Taqman探针，一个50nM-2uM共同的通用反向特异性下游引物，50nM-2uM不同等位基因特异性上游引物，1pm-20pm检测管家基因GAPDH的上游引物，1pm-20pm检测管家基因GAPDH的下游引物，0.05pm-5pm检测管家基因GAPDH的探针，再加上1.5单位Taq聚合酶，200μM dNTPs。

1）、循环条件设置

为使荧光曲线更加美观，建议从第二步开始收集荧光信号。

2）、仪器检测通道选择

荧光信号采集温度设为60℃，具体设置方法请参照相应仪器使用说明书。

3）、检测类型设定：空白对照设为“NTC”，阳性质控品和待检样本设为“Unknown”。

5.结果分析

如果检测样本仅有突变型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为T型，即突变型纯合子；如果检测样本仅有野生型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为C型，即野生型纯合子；如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为CT型，即杂合子；由于本方法结果是“全或无”，结果极易判断，哪一个管有反应，哪一个管就是阳性。

具体实施例

下面以对MTHFR C677T多态性位点突变检测的情形为例，具体对本发明作进一步详细的说明。

实施例1：针对MTHFR C677T多态性位点检测的野生型和突变型阳性质粒的制备

首先我们从基因库中调出MTHFR C677T多态性位点前后的基因序列，并将多态性位点用双下划线标记，在MTHFR C677T多态性位点的上下游适当位置（用黑体字和下划线标示），设计一对克隆引物，扩增片段为274bp，突变位点包含其内，基因序列显示如下，SEQ No.1：

caagatcagagcccccaaagcagaggactctctctgcccagtccctgtggtctcttcatccctcgccttgaacaggtggagg ccagcctctcctgactgtcatc cctattggcaggttaccccaaaggccaccccgaagcagggagctttgaggctgacctgaagcacttgaaggagaaggtgtctgcgggag c cgatttcatcatcacgcagcttttctttgaggctgacacattcttccgctttgtgaaggcatgcaccgacatgggcatcacttgccccatcgtccccgggatctttcccatccaggtgaggggcccaggagagcccataag ctccctccaccccactctcac cgcaccgtcctcgcacaggctgggggctctgggtggagtgctgagttcgctgagttcttcccag

实验步骤如下：

1）提取基因组DNA

用国内天根公司或Qiagen公司的基因组DNA提取试剂盒，提取基因组DNA，具体操作步骤按说明书进行。制备好的DNA标本，经紫外分光光度计测定浓度，将其浓度调整到50ng/μl，保存于-20℃，或直接进行下面的反应。

2）AT克隆获得阳性质粒

首先在突变点上下游设计克隆引物，见表1：

表1. MTHFR C677T多态性位点野生型克隆引物

在12.5μl 的2×PCR Master Mix (Fermentas) 的PCR扩增体系，加入10μM上游引物和10μM下游引物，以及基因组DNA50ng，加水至总体积25μl，PCR反应条件设定为95℃预变性3min，95℃变性10s，60℃退火及延伸30s，总共35个循环，反应结束后取15μl反应产物，进行浓度2.5%的凝胶电泳，电泳结束后观察，条带与预测的大小相符，表明扩增成功。采用美国Life公司的pCR2.0 TOPO T载体，按其操作说明，通过TA克隆的方式，获得MTHFR C677T多态性位点野生型阳性质粒，具体的基因序列如下，其中多态性位点显示为C型，说明为野生型，测序证明所获质粒正确。

SEQNo.4：ccagcctctcctgactgtcatccctattggcaggttaccccaaaggccaccccgaagcagggagctttgaggctgacctgaagcacttgaaggagaaggtgtctgcgggag c cgatttcatcatcacgcagcttttctttgaggctgacacattcttccgctttgtgaaggcatgcaccgacatgggcatcacttgccccatcgtccccgggatctttcccatccaggtgaggggcccaggagagcccataagctccctccaccccactctcac

3）快速突变法获得突变质粒

然后，采用产生快速突变的方法（Quickchange, QC），设计突变引物，引物序列见表2.

表2. 获得MTHFR C677T多态性位点突变型克隆引物

按照（Stratagene公司）Quickchange 试剂盒的反应条件和步骤，完成突变体的构建，所得到的重组质粒，具体的基因序列如下，经测序验证其中多态性位点显示为T型，为突变型，然后将突变型与野生型质粒分别置-20℃保存备用。

SEQ No.7：ccagcctctcctgactgtcatccctattggcaggttaccccaaaggccaccccgaagcagggagctttgaggctgacctgaagcacttgaaggagaaggtgtctgcgggag t cgatttcatcatcacgcagcttttctttgaggctgacacattcttccgctttgtgaaggcatgcaccgacatgggcatcacttgccccatcgtccccgggatctttcccatccaggtgaggggcccaggagagcccataagctccctccaccccac

tctcac

实施例2：等位基因特异性引物（ASP）的设计和特异性筛选

针对MTHFR C677T多态性位点，设计野生型和一系列突变特异型引物如下：

MHTFR基因的C677T-WT-F: aggagaaggtgtctgcgggtgc（SEQ No.8）

MHTFR基因的C677T-mut-F: aggagaaggtgtctgcgggtgt（SEQ No.9）

MHTFR基因的C677T-mut-F1: ggagaaggtgtctgcgggtgt（SEQ No.10）

MHTFR基因的C677T-mut-F2: gagaaggtgtctgcgggtgt（SEQ No.11）

MHTFR基因的C677T-mut-F3: aggagaaggtgtctgcgggact（SEQ No.12）

MHTFR基因的C677T-mut-F4: ggagaaggtgtctgcgggact（SEQ No.13）

MHTFR基因的C677T-mut-F5: gagaaggtgtctgcgggact（SEQ No.14）

同时设计合成Taqman 特异性探针：

SEQ No.15：FAM-cttgccccatcgtccccgggatc-BHQ1。

相关引物和探针在生工生物工程（上海）有限公司进行合成。

然后分别用上述7条引物与MHTFR基因的共同下游引物C677T-R: 5’- ggtgagagtggggtggagggag -3’（SEQ No.16）引物配对，加上Taqman 特异性探针，加入前述构建所得到的野生型重组质粒约3万个拷贝为模板，在荧光定量PCR仪上进行引物特异性筛选，反应条件设定为第一步95℃2min 预变性, 95℃5s， 63℃30s 共15个循环，不收集荧光信号，第二步95℃5s， 60℃30s 共40个循环，收集荧光信号，结果见图1。

其中，图1中1~7曲线分别代表C677T-WT-F、C677T-mut-F、C677T-mut-F1、C677T-mut-F2、C677T-mut-F3、C677T-mut-F4、C677T-mut-F5的PCR扩增曲线，从图1中我们看出1号野生型引物在8个循环产生扩增信号，2-6引物的特异性较差，分别在9-11个循环时产生非特异性扩增，同野生型引物（1号）扩增效率相差小于19个循环，第7号引物满足我们的要求，在40个循环时，仍然没有扩增，同野生型引物扩增效率相差大于19个循环。为了与突变引物有更好的可比性，我们参照第7号引物重新设计野生型的引物为：gagaaggtgtctgcgggacc（SEQ No.17）。

即最终设计筛选的引物：

野生型上游引物：gagaaggtgtctgcgggacc（SEQ No.17）

突变型上游引物：gagaaggtgtctgcgggact（SEQ No.14）

实施例3：ASP灵敏度筛选

再用突变型引物分别同MTHFR C677T多态性位点的共同下游引物SEQ No.16配对，用突变型重组质粒，按照10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10，0作梯度稀释，加上Taqman 特异性探针，在荧光定量PCR仪上进行灵敏度验证。突变特异型引物能检测出100个拷贝的突变体，因此这一引物就是按我们的方法筛选出检测MTHFR C677T多态性位点的最佳引物，见表3所示。

实施例4：预制的本发明PCR（Past-PCR）反应管

按照每个突变位点两个反应管的要求，即一管检测野生型位点，另一管检测突变位点，将适宜浓度的引物探针预先包被于0.2ML乳白色的PCR反应管中。

为了防止检测时出现假阴性，在每个反应管中均预先包被有检测管家基因GAPDH的上游引物、下游引物和探针，其中，GAPDH基因序列如下：

cctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatccctgcctctactggcgctgccaaggctgtgggcaaggtcatccctgagctgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacgtgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcgtcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacacccactcctccacctttgacgctggggctggcattgccctcaacg（SEQ No.18）

检测管家基因GAPDH的上游引物序列为：ggctgtgggcaaggtcatc（SEQ No.19）

检测管家基因GAPDH的下游引物序列为:ctccgacgcctgcttcaccac(SEQ No.20）

检测管家基因GAPDH的探针序列为：ccttccgtgtccccactgccaacgt(SEQ No.21)

其中，检测管家基因GAPDH的探针5’端用HEX荧光标记，3’端用BHQ标记，由于HEX和VIC属于同一通道检测，而许多仪器往往采用VIC标示，因此文中用VIC叙述。

PCR反应管中具体的细节见表3。

表3. 预制MTHFR C677T多态性位点Past-PCR反应管的组分和浓度

由于我们预先把突变型和野生型上游引物、探针、共同下游引物、检测管家基因GAPDH的上、下游引物和检测管家基因GAPDH的探针包被在编好号的不同反应管中，有效避免了使用者的操作误差，同时大大提高了操作效率，极大方便了在临床上的实际使用。

实施例5：标本的验证

采集正常人群的外周血或口腔脱落细胞标本，并用Qiagen公司的基因组DNA提取试剂盒，提取基因组DNA，具体操作步骤按说明书进行。制备好的DNA标本，经紫外分光光度计测定浓度，将其浓度调整到100ng/μl备用。

我们用筛选出的这个突变特异性引物，同时用野生型引物作对照，在同一个PCR反应板上，每两个反应管检测一个基因位点，其中一个是突变位点，另一个是野生型位点。每个反应管20μl反应体积中包含10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，0.1%Triton X-100，2.0mM MgCl₂，100ng人基因组DNA，100nM特异性Taqman探针，500nM共用特异性下游引物，500nM野生型特异性上游引物或突变型特异性上游引物，5pm检测管家基因GAPDH的上游引物，5pm检测管家基因GAPDH的下游引物，2.5pm检测管家基因GAPDH的探针，再加上1.5单位Taq DNA聚合酶，200μM dNTPs，其余为去离子水。

第一步PCR反应条件是：37℃ 2min，95℃2min预变性，然后95℃5s，63℃30s ，15个循环，此步不收集荧光；第二步PCR反应条件是：95℃5s，60℃30s，共40个循环，此步收集荧光。为了方便起见，我们将MTHFR C677T多态性正常位点认定为野生型（C位点），而容易引起MTHFR酶活性下降的位点则为突变型（T位点），如果对应的反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，就判断为对应的纯合基因型；如两管均在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，则为杂合型。

1、按照上述方法进行突变等位基因纯合子（T位点）检测，其具体基因序列为：

SEQ No.22：tctgcgggag t cgatttcatc

收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图2所示，其中，a曲线代表检测突变型PCR反应管中的扩增曲线，b曲线代表检测野生型PCR反应管中的扩增曲线。

2、按照上述方法进行野生等位基因纯合子（C位点）检测，其具体基因序列为：

SEQ No.23：tctgcgggag c cgatttcatc

收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图3所示，其中，c曲线代表检测野生型PCR反应管中的扩增曲线，d曲线代表检测突变型PCR反应管中的扩增曲线。

3、按照上述方法进行杂合（CT型）检测，其具体基因序列为：

SEQ No.24：tctgcgggag ct cgatttcatc

收集到的FAM通道PCR扩增曲线图，如图4所示，其中，e曲线代表检测野生型PCR反应管中的扩增曲线，f曲线代表检测突变型PCR反应管中的扩增曲线。

同时，上述3个检测案例中，当VIC通道管家基因GAPDH有对数增长的扩增曲线，如图5所示，同时FAM通道有对数增长的扩增曲线，则此次实验结果有效。

因此，从上述的检测试验可见，本试剂盒的检测结果为“全或无”的结果，即若被检测样品为突变等位基因纯合子，两个PCR反应管中，仅有突变型PCR反应管在FAM通道和VIC通道均有对数增长的扩增曲线，而野生型PCR反应管在FAM通道毫无扩增曲线；若被检测样品为野生等位基因纯合子，两个PCR反应管中，仅有野生型PCR反应管在FAM通道和VIC通道均有对数增长的扩增曲线，而突变型PCR反应管在FAM通道毫无扩增曲线；若被检测样品为杂合子，两个PCR反应管在FAM通道和VIC通道均有对数增长的荧光信号。该试剂盒的检测结果判读简单，减少了以往试剂盒的检测结果需要进行ΔCt等一系列复杂计算的过程，降低错判率，同时还有效避免了以往试剂盒检测结果中存在假阴性假阳性现象的发生。此外本发明提供的试剂盒可用于任何型号的荧光定量PCR仪，检测仪器简单，成本低，为科研和临床亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点分型和基因突变分析提供了强有力的工具。

序列表

<110> 沈阳优吉诺生物科技有限公司

<120> 检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法

<130> 2015

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caagatcaga gcccccaaag cagaggactc tctctgccca gtccctgtgg tctcttcatc 60

cctcgccttg aacaggtgga ggccagcctc tcctgactgt catccctatt ggcaggttac 120

cccaaaggcc accccgaagc agggagcttt gaggctgacc tgaagcactt gaaggagaag 180

gtgtctgcgg gagccgattt catcatcacg cagcttttct ttgaggctga cacattcttc 240

cgctttgtga aggcatgcac cgacatgggc atcacttgcc ccatcgtccc cgggatcttt 300

cccatccagg tgaggggccc aggagagccc ataagctccc tccaccccac tctcaccgca 360

ccgtcctcgc acaggctggg ggctctgggt ggagtgctga gttcgctgag ttcttcccag 420

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccagcctctc ctgactgtca tc 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgagagtgg ggtggaggga g 21

<210> 4

<211> 274

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccagcctctc ctgactgtca tccctattgg caggttaccc caaaggccac cccgaagcag 60

ggagctttga ggctgacctg aagcacttga aggagaaggt gtctgcggga gccgatttca 120

tcatcacgca gcttttcttt gaggctgaca cattcttccg ctttgtgaag gcatgcaccg 180

acatgggcat cacttgcccc atcgtccccg ggatctttcc catccaggtg aggggcccag 240

gagagcccat aagctccctc caccccactc tcac 274

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtgtctgcg ggagtcgatt tcatcatcac g 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgtgatgatg aaatcgactc ccgcagacac c 31

<210> 7

<211> 268

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccagcctctc ctgactgtca tccctattgg caggttaccc caaaggccac cccgaagcag 60

ggagctttga ggctgacctg aagcacttga aggagaaggt gtctgcggga gtcgatttca 120

tcatcacgca gcttttcttt gaggctgaca cattcttccg ctttgtgaag gcatgcaccg 180

acatgggcat cacttgcccc atcgtccccg ggatctttcc catccaggtg aggggcccag 240

gagagcccat aagctccctc caccccac 268

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggagaaggt gtctgcgggt gc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aggagaaggt gtctgcgggt gt 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggagaaggtg tctgcgggtg t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gagaaggtgt ctgcgggtgt 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aggagaaggt gtctgcggga ct 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggagaaggtg tctgcgggac t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gagaaggtgt ctgcgggact 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cttgccccat cgtccccggg atc 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggtgagagtg gggtggaggg ag 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gagaaggtgt ctgcgggacc 20

<210> 18

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cctccgggaa actgtggcgt gatggccgcg gggctctcca gaacatcatc cctgcctcta 60

ctggcgctgc caaggctgtg ggcaaggtca tccctgagct gaacgggaag ctcactggca 120

tggccttccg tgtccccact gccaacgtgt cagtggtgga cctgacctgc cgtctagaaa 180

aacctgccaa atatgatgac atcaagaagg tggtgaagca ggcgtcggag ggccccctca 240

agggcatcct gggctacact gagcaccagg tggtctcctc tgacttcaac agcgacaccc 300

actcctccac ctttgacgct ggggctggca ttgccctcaa cg 342

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggctgtgggc aaggtcatc 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ctccgacgcc tgcttcacca c 21

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccttccgtgt ccccactgcc aacgt 25

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tctgcgggag tcgatttcat c 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tctgcgggag ccgatttcat c 21

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tctgcgggag ctcgatttca tc 22

Claims

1.一种检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的引物，其特征在于，所述引物包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；

2.一种检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的试剂，其特征在于：所述试剂含有权利要求1所述的引物。

3.一种检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的引物。

4.按照权利要求3所述检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括与权利要求1所述引物配合使用的探针，其中，所述探针为Taqman探针，具有SEQ No.15序列。

5.按照权利要求4所述检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、检测管家基因GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物、检测管家基因GAPDH的探针、阳性质控品和空白对照；

6.按照权利要求5所述检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的试剂盒，其特征在于：所述突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于T型PCR反应管内；以及与所述野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于C型PCR反应管内。

7.按照权利要求6所述检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的试剂盒，其特征在于：所述T型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、1pm-20pm、1pm-20pm、0.05pm-5pm；以及所述C型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、 50nM-400nM、1pm-20pm、1pm-20pm、0.05pm-5pm。

8.按照权利要求7所述检测亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点的试剂盒，其特征在于：所述T型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2.5pm；以及所述C型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、2.5pm。

9.一种权利要求1所述引物或权利要求3~8任一试剂盒的PCR方法，其特征在于：PCR反应按两步扩增循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步扩增的循环数，所述第一步扩增的退火温度高于所述第二步扩增的退火温度。

10.按照权利要求9所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：37℃ 2min，95℃ 2min 预变性；第一步扩增，95℃ 变性 5s，55℃~68℃ 退火 32s，循环10~15次；第二步，95℃ 变性5s，50℃~65℃ 退火、延伸 32s，循环30~50次，收集荧光信号；或所述PCR反应的条件为：37℃ 2min，95℃ 2min 预变性；第一步扩增，95℃ 变性 5s，63℃ 退火 32s，循环15次；第二步，95℃ 变性 5s，60℃ 退火、延伸 32s，循环40次，收集荧光信号。