CN111471757A - 基于kasp技术检测mthfr亚甲基四氢叶酸还原酶snp突变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，包括SNP突变标记点，所述方法包括如下步骤：步骤一：根据MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶的基因DNA序列和SNP突变标记点设计特异引物；步骤二，口腔上皮细胞样本采集和DNA纯化：步骤三，配制KASP反应体系：反应体系的成分包括5ulKASPMasterMixture、SNP突变标记点设计的0.3ul特异引物、2.5ul浓度为10‑25ng/ul的DNA，2.2ul无酶水，反应体系混匀后使为10ul；本发明可适用于中、高通量商业化基因检测应用，也可以应用少量位点重复实验，有很强灵活性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及基于竞争性等位基因特异性PCR技术检测亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法。
背景技术
MTHFR为5,10-methylenetetrahydrofolatereductase，亚甲基四氢叶酸还原酶，主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一个较低的水平。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过一碳单位代谢为嘌呤环的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷将导致机体多个基础生化过程的紊乱，包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等，并进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症。MTHFR基因的缺陷对孕妇人群会引起神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、妊娠期高血压疾病，自发性流产。与疾病相关的MTHFR基因SNP位点主要有两种：C677T(rs1801133)、A1298C(rs1801131)。
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异而引起的一种DNA序列多态性。它在生物遗传变异中广泛存在，据统计已知多态性中90％以上为SNP。SNP数量多、分布广泛、遗传稳定性好、二等位基因型等特点，适于快速、规模化筛查，易于基因分型，在基因突变检测中广泛应用。
适用于SNP检测的方法主要有聚丙烯凝胶酶切电泳、Taqman探针、SNP基因芯片和一代测序、竞争性等位基因PCR(KompetitiveAlleleSpecificPCR，KASP)。聚丙烯凝胶酶切电泳需要接触聚丙烯和核酸染料EB，对人体有潜在的伤害，并对环境可能造成污染。一代测序准确度高，但价格昂贵，不适合大批量样本检测，而Taqman探针适合做大量样本，但也价格昂贵。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，包括SNP突变标记点设计的特异引物序列，所述方法包括如下步骤：
步骤一：根据MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶的基因DNA序列和SNP突变标记点设计特异引物；
步骤二，口腔上皮细胞样本采集和DNA纯化，其包括如下几个操作次序：
基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，包括SNP突变标记点，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
步骤一：根据MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶的基因DNA序列和SNP突变标记点设计特异引物；
步骤二，口腔上皮细胞样本采集和DNA纯化，其包括如下几个操作次序：
A、一次性采样拭子头分别在口腔左右两侧内壁黏膜上下用力大幅度擦拭30次，刮取口腔上皮细胞，用剪刀把拭子头其杆上剪下至1.5ml离心管里；
B、加入400μl缓冲液GA；
C、加入20μlProteinaseK溶液，涡旋10sec混匀，56℃放置60min，其间每15min涡旋混匀数次；
D、加入400μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液转移至新的离心管中；
E、加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴；
F、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中；
G、向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中；
H、向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管；
I、重复操作步骤7；
J、12,000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR2室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
K、将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min；
L、核酸定量分析仪对DNA浓度及纯度检测；
步骤三，配制KASP反应体系：反应体系的成分包括5ulKASPMasterMixture、SNP突变标记点设计的0.3ul特异引物、2.5ul浓度为10-25ng/ul的DNA，2.2ul无酶水，反应体系混匀后使为10ul；
步骤四，将混匀后的溶液放入荧光定量PCR仪中，选择PCR程序设置：
a.在94摄氏度的温度下激活3-15分钟；
b.在94摄氏度的温度下工作2分钟；
c.在63摄氏度-55摄氏度的温度下退货和延伸1分钟；
d.降落PCR：b-c步骤10个循环，每个循环中C步骤温度每次下降0.8摄氏度；
e.在94摄氏度的温度下工作20秒；
f.在55摄氏度的温度下工作1分钟；
g.e.f步骤进行10～26个循环工作；
h.在116摄氏度的温度下工作20秒后读取荧光信号值；
步骤五：数据收集，得到基因分型数据。荧光定量PCR仪器在读取完荧光信号后，数据下载到连接仪器的电脑中。数据在电脑中归集后自动分析。
作为本发明进一步限制地，所述SNP突变标记点为C677T、A1298C。
作为本发明进一步限制地，以基因组DNA为模板，采用所述SNP突变标记点引物序列进行KASP反应，待反应完成后，将扩增的产物借助荧光信号采集仪器，包括但不限于荧光定量PCR仪获取对应的产物荧光信号值，最终完成基因分型。
作为本发明进一步限制地，所述标记引物序列在检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变中应用。
本发明所达到的有益效果是：
本发明改进了SNP检测的方法，通过设计特异引物，使用KASP方法检测SNP突变位点，KASP基因分型方法是通过PCR反应后搜集荧光信号，收据分析后实现对突变位点的检测，检测过程DNA样本需求低，操作简便，成本低，检测结果可靠,无需电泳，减少了实验操作过程对人体潜在的伤害和对环境造成污染；该方法可适用于中、高通量商业化基因检测应用，也可以应用少量位点重复实验，有很强灵活性。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1-2是本发明的数据在电脑中归集后自动分析一示意图；
图3-4是本发明的数据在电脑中归集后自动分析二示意图；
图5-6是本发明数据在电脑中归集后自动分析三示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-6，本发明提供的技术方案：实现上述目的，本发明提供如下技术方案：利用本发明针对MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP位点设计的特异引物，通过KASP方法检测SNP突变位点，实现基因分型，实现对MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶基因缺陷的筛查。
包括以下步骤：
步骤一：
根据MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶的基因DNA序列，SNP突变标记点为：C677T(rs1801133)、A1298C，设计特异引物。所述KASP分子标记MTHFR的引物序列如表1SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5和SEQID6所示。
表1标记引物序列表
步骤二，口腔上皮细胞样本采集和DNA纯化：
1、一次性采样拭子头分别在口腔左右两侧内壁黏膜上下用力大幅度擦拭30次(力度以面颊向外凸起为准)，刮取口腔上皮细胞，用剪刀把拭子头其杆上剪下至1.5ml离心管里；
2、加入400μl缓冲液GA；
3、加入20μlProteinaseK溶液，涡旋10sec混匀，56℃放置60min，其间每15min涡旋混匀数次；
4、加入400μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液转移至新的离心管中。
5、加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
6、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中(吸附柱CR2放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
7、向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
8、向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管。
9、重复操作步骤7。
10、12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
11、将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
12、核酸定量分析仪对DNA浓度及纯度检测。
步骤三，配制KASP反应体系：反应体系的成分包括5ulKASPMasterMixture、SNP突变标记点设计的的0.3ul特异引物、2.5ul浓度为10-25ng/ul的DNA，
2.2ul无酶水，反应体系混匀后使为10ul。
步骤四，将混匀后的溶液放入荧光定量PCR仪中，选择PCR程序设置：
a.在94摄氏度的温度下激活3-15分钟；
b.在94摄氏度的温度下工作2分钟；
c.在63摄氏度-55摄氏度的温度下退货和延伸1分钟；
d.降落PCR：b-c步骤10个循环，每个循环中C步骤温度每次下降0.8摄氏度；
e.在94摄氏度的温度下工作20秒；
f.在55摄氏度的温度下工作1分钟；
g.e_f步骤进行10～26个循环工作；
h.在116摄氏度的温度下工作20秒后读取荧光信号值；
步骤五：数据收集，得到基因分型数据。荧光定量PCR仪器在读取完荧光信号后，数据下载到连接仪器的电脑中，数据在电脑中归集后自动分析。
具体还包括下列的实施例：
实施例一：
一种基于竞争性等位基因特异性PCR技术检测亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，包括以下步骤：
步骤一：
根据MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶的基因DNA序列，SNP突变标记点为：C677T(rs1801133)、A1298C，设计特异引物。所述KASP分子标记MTHFR的引物序列如表1SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5和SEQID6所示。
表1标记引物序列表
步骤二，口腔上皮细胞样本采集和DNA纯化：实施例中利用天根生化科技有限公司(北京)的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行DNA纯化
1.一次性采样拭子头分别在口腔左右两侧内壁黏膜上下用力大幅度擦拭30次(力度以面颊向外凸起为准)，刮取口腔上皮细胞，用剪刀把拭子头其杆上剪下至1.5ml离心管里。
2.加入400μl缓冲液GA
3.加入20μlProteinaseK溶液，涡旋10sec混匀，56℃放置60min，其间每15min涡旋混匀数次。
4.加入400μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液转移至新的离心管中。
5.加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中(吸附柱CR2放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
7.向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
8.向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管。
9.重复操作步骤7。
10.12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
11.将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
12.核酸定量分析仪对DNA浓度及纯度检测。
步骤三，配制KASP反应体系：反应体系的成分包括5ulKASPMasterMixture、权利要求2所述的0.3ul特异引物、2.5ul浓度为10-25ng/ul的DNA，2.2ul无酶水。反应体系混匀后使为10ul；
步骤四，将混匀后的溶液放入荧光定量PCR仪中，选择PCR程序设置：
i.在94摄氏度的温度下激活3分钟；
j.在94摄氏度的温度下工作2分钟；
k.在63摄氏度-55摄氏度的温度下退货和延伸1分钟；
l.降落PCR：b-c步骤10个循环，每个循环中C步骤温度每次下降0.8摄氏度；
m.在94摄氏度的温度下工作20秒；
n.在55摄氏度的温度下工作1分钟；
o.e_f步骤进行26个循环工作；
p.在116摄氏度的温度下工作20秒后读取荧光信号值；
步骤五：数据收集，得到基因分型数据。参照《bio-radCF96XRealTimePCRsystem实验操作规程》读取荧光信号后，数据下载到连接仪器的电脑中,数据在电脑中归集后自动分析如图1-2所示。
实施例二：
一种基于竞争性等位基因特异性PCR技术检测亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，包括以下步骤：
步骤一：
根据MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶的基因DNA序列，SNP突变标记点为：C677T(rs1801133)、A1298C，设计特异引物。所述KASP分子标记MTHFR的引物序列如表1SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5和SEQID6所示。
表1标记引物序列表
步骤二，口腔上皮细胞样本采集和DNA纯化：实施例中利用天根生化科技有限公司(北京)的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行DNA纯化
1.一次性采样拭子头分别在口腔左右两侧内壁黏膜上下用力大幅度擦拭30次(力度以面颊向外凸起为准)，刮取口腔上皮细胞，用剪刀把拭子头其杆上剪下至1.5ml离心管里。
2.加入400μl缓冲液GA
3.加入20μlProteinaseK溶液，涡旋10sec混匀，56℃放置60min，其间每15min涡旋混匀数次。
4.加入400μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液转移至新的离心管中。
5.加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中(吸附柱CR2放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
7.向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
8.向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管。
9.重复操作步骤7。
10.12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
11.将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
12.核酸定量分析仪对DNA浓度及纯度检。
步骤三，配制KASP反应体系：反应体系的成分包括5ulKASPMasterMixture、权利要求2所述的0.3ul特异引物、2.5ul浓度为10-25ng/ul的DNA，2.2ul无酶水。反应体系混匀后使为10ul；
步骤四，将混匀后的溶液放入荧光定量PCR仪中，选择PCR程序设置：
a.在94摄氏度的温度下激活15分钟
b.在94摄氏度的温度下工作2分钟
c.在63摄氏度-55摄氏度的温度下退货和延伸1分钟
d.降落PCR：b-c步骤10个循环，每个循环中C步骤温度每次下降0.8摄氏度
e.在94摄氏度的温度下工作20秒
f.在55摄氏度的温度下工作1分钟
g.e_f步骤进行16个循环工作
h.在116摄氏度的温度下工作20秒后读取荧光信号值；
步骤五：数据收集，得到基因分型数据。参照《bio-radCF96XRealTimePCRsystem实验操作规程》读取荧光信号后，数据下载到连接仪器的电脑中。数据在电脑中归集后自动分析，如图3-4所示。
实施例三：
一种基于竞争性等位基因特异性PCR技术检测亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，包括以下步骤：
步骤一：
根据MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶的基因DNA序列，SNP突变标记点为：C677T(rs1801133)、A1298C，设计特异引物。所述KASP分子标记MTHFR的引物序列如表1SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5和SEQID6所示。
表1标记引物序列表
步骤二，口腔上皮细胞样本采集和DNA纯化：实施例中利用天根生化科技有限公司(北京)的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行DNA纯化
1.一次性采样拭子头分别在口腔左右两侧内壁黏膜上下用力大幅度擦拭30次(力度以面颊向外凸起为准)，刮取口腔上皮细胞，用剪刀把拭子头其杆上剪下至1.5ml离心管里。
2.加入400μl缓冲液GA
3.加入20μlProteinaseK溶液，涡旋10sec混匀，56℃放置60min，其间每15min涡旋混匀数次。
4.加入400μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液转移至新的离心管中。
5.加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中(吸附柱CR2放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
7.向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
8.向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管。
9.重复操作步骤7。
10.12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
11.将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
12.核酸定量分析仪对DNA浓度及纯度检测。
步骤三，配制KASP反应体系：反应体系的成分包括5ulKASPMasterMixture、权利要求2所述的0.3ul特异引物、2.5ul浓度为10-25ng/ul的DNA，2.2ul无酶水。反应体系混匀后使为10ul；
步骤四，将混匀后的溶液放入荧光定量PCR仪中，选择PCR程序设置：
a.在94摄氏度的温度下激活3分钟；
b.在94摄氏度的温度下工作2分钟；
c.在63摄氏度-55摄氏度的温度下退货和延伸1分钟；降落PCR：b-c步骤10个循环，每个循环中C步骤温度每次下降0.8摄氏度；
d.在94摄氏度的温度下工作20秒；
e.在55摄氏度的温度下工作1分钟；
f.e_f步骤进行16个循环工作；
g.在116摄氏度的温度下工作20秒后读取荧光信号值；
步骤五：数据收集，得到基因分型数据。参照《bio-rad CF96X Real TimePCRsystem实验操作规程》读取荧光信号后，数据下载到连接仪器的电脑中。数据在电脑中归集后自动分析如图5-6所示。
根据上述实施例所得出的数据结构比对后，实施例一，二，三所提供的一种基于竞争性等位基因特异性PCR技术检测亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法都可以基因分型，实施例三所使用的上机程序最短，消耗时间最低，成功率高，更加高效。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，包括SNP突变标记点，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
步骤一：根据MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶的基因DNA序列和SNP突变标记点设计特异引物；
步骤二，口腔上皮细胞样本采集和DNA纯化，其包括如下几个操作次序：A、一次性采样拭子头分别在口腔左右两侧内壁黏膜上下用力大幅度擦拭30次，刮取口腔上皮细胞，用剪刀把拭子头其杆上剪下至1.5ml离心管里；
B、加入400μl缓冲液GA；
C、加入20μlProteinaseK溶液，涡旋10sec混匀，56℃放置60min，其间每15min涡旋混匀数次；
D、加入400μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液转移至新的离心管中；
E、加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴；
F、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR2中，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中；
G、向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管中；
H、向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2放回收集管；
I、重复操作步骤7；
J、12,000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR2室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
K、将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min；
L、核酸定量分析仪对DNA浓度及纯度检测；
步骤三，配制KASP反应体系：反应体系的成分包括5ulKASPMasterMixture、SNP突变标记点设计的0.3ul特异引物、2.5ul浓度为10-25ng/ul的DNA，2.2ul无酶水，反应体系混匀后使为10ul；
步骤四，将混匀后的溶液放入荧光定量PCR仪中，选择PCR程序设置：
a.在94摄氏度的温度下激活3-15分钟；
b.在94摄氏度的温度下工作2分钟；
c.在63摄氏度-55摄氏度的温度下退货和延伸1分钟；
d.降落PCR：b-c步骤10个循环，每个循环中C步骤温度每次下降0.8摄氏度；
e.在94摄氏度的温度下工作20秒；
f.在55摄氏度的温度下工作1分钟；
g.e.f步骤进行10～26个循环工作；
h.在116摄氏度的温度下工作20秒后读取荧光信号值；
步骤五：数据收集，得到基因分型数据。荧光定量PCR仪器在读取完荧光信号后，数据下载到连接仪器的电脑中。数据在电脑中归集后自动分析。
2.根据权利要求1所述的基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，其特征在于：所述SNP突变标记点为C677T、A1298C设计的特异引物序列。
3.根据权利要求1所述的基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，其特征在于：以基因组DNA为模板，采用所述SNP突变标记点引物序列进行KASP反应，待反应完成后，将扩增的产物借助荧光信号采集仪器，包括但不限于荧光定量PCR仪获取对应的产物荧光信号值，最终完成基因分型。
4.根据权利要求1所述的基于KASP技术检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变的方法，其特征在于：所述标记引物序列在检测MTHFR亚甲基四氢叶酸还原酶SNP突变中应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20200731 |