CN104561289A - 基因缺失突变的检测方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因缺失突变的检测方法和装置。该方法包括:对待测样本和对照样本的外显子文库进行测序,得到待测样本和对照样本各自的测序数据;对测序数据以切分成窗口的形式分别计算待测样本和对照样本在各窗口的序列数,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第一序列数;对待测样本和对照样本各自在各窗口上的第一序列数进行均一化处理,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数;取对照样本在各窗口的第二序列数的中位数,将待测样本在各窗口的第二序列数与中位数相除,得到比值;若比值小于设定值,则窗口中存在基因缺失突变。该方法以对照样本间的中位数作为比较标准,相比平均值或标准差更容易区分假阳性,结果更准确。
Description
技术领域
本发明涉及基因突变检测领域,具体而言,涉及一种基因突变的检测方法和装置。
背景技术
基因突变的种类包括单核苷酸碱基突变、片段缺失突变或片段重复突变,现有技术中检测基因突变的方法也有很多,其中,能够检测片段的缺失突变检测方法包括多重连接探针扩增技术(MLPA)、荧光定量PCR、Sanger测序法和二代测序法。
MLPA的基本原理是将探针和靶序列DNA进行杂交,探针的特异化连接、PCR扩增、扩增产物通过毛细管电泳分离、数据收集,然后采用分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论;荧光定量PCR基本原理包括对待测样品和对照组的相应基因位置PCR产物进行定量分析,通过比较得出是否有插入或者重复的结论。Sanger测序法通过直接测序法得到缺失区域。然而,上述方法存在设计引物复杂、通量低、劳动强度大、成本高、不能适应大量样本检测需求等缺陷,因而应用受到限制。
随着高通量测序技术的发展,其通量大、准确率高的特点,使得第二代测序方法成为当前检测基因突变的热门手段。但面对高通量测序后得到的庞大的测序数据,如何从中分析找到基因突变位置成为难点,因此,急需提供一种利用高通量测测序方法来检测基因突变的检测方法,以提高检测的通量和准确度。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基因突变的检测方法和装置,以改善现有技术中检测方法复杂、通量低、准确度低的缺陷。
为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种基因缺失突变的检测方法,该方法包括以下步骤:步骤S1,对待测样本和对照样本的外显子文库进行测序,得到待测样本和对照样本各自的测序数据;步骤S2,对测序数据以切分成窗口的形式分别计算待测样本和对照样本在各窗口的序列数,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第一序列数;步骤S3,对待测样本和对照样本各自在各窗口上的第一序列数进行均一化处理,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数;步骤S4,取对照样本在各窗口的第二序列数的中位数,将待测样本在各窗口的第二序列数与中位数相除,得到比值;步骤S5,若比值小于设定值,则窗口中存在基因缺失突变。
进一步地,对照样本为一组不存在基因缺失的样本或与待测样本同批检测的其他样本。
进一步地,窗口为连续不相交的窗口。
进一步地,窗口的长度根据待测样本和对照样本的测序深度和预期检测的基因缺失突变的长度设置。
进一步地,在测序深度大于等于300×时,各窗口的长度为50~160bp,优选为50~100bp。
进一步地,步骤S3包括:对待测样本和对照样本各自的第一序列数的总和进行统计,得到各自的总第一序列数;分别将待测样本和对照样本在各窗口上的第一序列数按式(1)所示的公式
第二序列数=第一序列数*1000/总第一序列数………………………..(1)
进行均一化处理,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数。
进一步地,设定值小于等于0.6。
进一步地,在步骤S1之前,还包括分别制备待测样本和对照样本的外显子文库的步骤,分别制备待测样本和对照样本的外显子文库的步骤中采用液相捕获的方法进行制备。
进一步地,采用液相捕获的方法进行制备之前,还包括根据目标基因外显子区域设计液相捕获探针的步骤。
进一步地,制备待测样本的外显子文库和对照样本的外显子文库的步骤包括:分别对待测样本和对照样本的基因组DNA进行破碎处理,得到破碎DNA;对破碎DNA进行末端修复和加A处理,得到3’端带“A”的修复DNA;对修复DNA进行接头连接,得到带接头DNA;对带接头DNA进行PCR扩增,得到扩增DNA;用液相捕获探针与扩增DNA进行杂交,分别得到待测样本和对照样本的外显子文库。
根据本发明的另一方面,提供了一种基因缺失突变检测的装置,该装置包括:检测模块:用于对待测样本和对照样本的外显子文库进行测序,得到待测样本和对照样本各自的测序数据;切分统计模块:用于对测序数据以切分成窗口的形式分别计算待测样本和对照样本在各窗口的序列数,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第一序列数;均一化模块:用于对待测样本和对照样本各自在各窗口上的单一序列数进行均一化处理,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数;计算模块:用于取对照样本在各窗口的第二序列数的中位数,将待测样本在各窗口的第二序列数与中位数相除,得到比值;确定模块:用于在比值小于设定值时,则确定窗口中存在基因缺失突变。
进一步地,均一化模块进一步包括:统计子模块:用于对待测样本和对照样本各自的第一序列数的总和进行统计,得到各自的总第一序列数;计算子模块:用于分别将待测样本和对照样本在各窗口上的第一序列数按照式(1)所示的公式
第二序列数=第一序列数*1000/总第一序列数………………………..(1)
进行均一化处理,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数。
进一步地,确定模块中的设定值小于等于0.6。
进一步地,在检测模块之前,装置还包括外显子文库制备模块:用于采用液相捕获方法对待测样本和对照样本的外显子文库进行制备。
进一步地,在外显子文库制备模块之前,装置还包括探针设计模块:用于根据目标外显子区域设计液相捕获探针。
应用本发明的技术方案,通过将待测样本和对照样本的测序数据以切分成窗口的形式进行序列数的计算,便于根据不同的测序数据的测序深度和目标缺失片段的大小来灵活切分窗口的大小,使检测的缺失片段的大小范围更广泛;并且,在确定某一窗口是否存在缺失突变时,根据待测样本在各窗口的第二序列数与一组对照样本在各窗口的第二序列数的中位数的比值进行确定,通过选取一组对照样本的中位数作为比较的标准,相比采用平均值和标准差作为比较的标准,更容易区分假阳性,使确定结果更准确。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1示出了根据本发明的一种典型的实施例中基因缺失突变的检测方法的流程图;
图2示出了根据本发明的一种典型的实施例中基因缺失突变的检测装置的结构示意图;以及
图3示出了根据本发明的一种典型的实施例中基因缺失突变的毛细管电泳的验证结果。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
针对现有技术中存在的当采用高通量测序方法检测基因突变时,无法准确确定突变位置的缺陷,本发明为了改善上述缺陷,在一种典型的实施方式中,如图1所示,提供了一种基因缺失突变的检测方法,该方法包括以下步骤:步骤S1,对待测样本和对照样本的外显子文库进行测序,得到待测样本和对照样本各自的测序数据;步骤S2,对测序数据以切分成窗口的形式分别计算待测样本和对照样本在各窗口的序列数,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第一序列数;步骤S3,对待测样本和对照样本各自在各窗口上的第一序列数进行均一化处理,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数;步骤S4,取对照样本在各窗口的第二序列数的中位数,将待测样本在各窗口的第二序列数与中位数相除,得到比值;步骤S5,若比值小于设定值,则窗口中存在基因缺失突变。
本发明的上述方法通过将待测样本和对照样本的测序数据以切分成窗口的形式进行序列数的计算,便于根据不同的测序数据的测序深度和目标缺失片段的大小来灵活切分窗口的大小,使检测的缺失片段的大小范围更广泛;并且,在确定某一窗口是否存在缺失突变时,根据待测样本在各窗口的第二序列数与一组对照样本在各窗口的第二序列数的中位数的比值进行确定,通过选取一组对照样本的中位数作为比较的标准,相比采用平均值和标准差作为比较的标准,更容易区分假阳性,使确定结果更准确。
而且,由于本发明的上述方法在判断待测样本是否存在缺失时,是以对照样本在各窗口的第二序列数的中位数作为比较的标准,相比平均值和标准差的计算,中位数的计算不容易受个别非正常的序列数的影响,因而判断结果更准确。基于上述优势,本发明的上述对照样本可以是一组正常的不存在基因缺失的样本,也可以是与待测样本同批检测的其他样本,这样,即提高了检测的准确性,又降低了检测成本。
在本发明的上述方法中,将测序数据切分窗口的形式可以根据检测的灵敏度和检测准确性之间的关系,进行适当权衡而设置。在本发明中,优选上述切分的窗口为连续不相交的窗口。将较长的外显子划分成为连续不相交的窗口,对于长度较短的外显子则将整个外显子划分到一个窗口中。当窗口设置为较小的值时,便于发现较小的缺失突变,但是不同样品间相同的窗口上测序序列数变化较大不方便比较。当窗口设置为较大的值时,不同样品间相同窗口上测序序列数变化较小,但是无法发现较小的缺失突变。
上述实施例中,窗口的长度根据待测样本和对照样本的测序深度和预期检测的基因缺失突变的长度来设置。由于这种测序检测中,所有基因的长度和基因上的外显子的长度都是已知的,因此可以根据预期检测的突变长度来进行窗口大小设置。假如需要检测的突变片段较小,则设置一个较小的值,反之则可以设置窗口一个较大的值。窗口的长度越小检测灵敏度越高,相应地准确性相对下降。窗口的长度越大则准确性越高,灵敏度相对下降。
在本发明一种更优选的实施例中,在测序深度大于等于300×时,各窗口的长度为50~160bp。在测序深度大于等于300×时,将各窗口的长度控制在50~100bp更能兼顾检测灵敏度和检测准确性。
在本发明的上述方法中,步骤S3中主要是为了均化各窗口的序列数,使得待测样本和对照样本在各窗口的序列数不会因为测序深度的差异而导致比对结果的偏差,因而,本领域对数据进行均一化处理的操作均适用于本发明。在本发明中,优选对待测样本和对照样本在各窗口的第一序列数进行均一化处理的步骤包括:对待测样本和对照样本各自的第一序列数的总和进行统计,得到各自的总第一序列数;分别将待测样本和对照样本在各窗口上的第一序列数按照式(1)所示的公式
第二序列数=第一序列数*1000/总第一序列数………………………..(1)
进行均一化处理,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数。
上述实施例中,采用式(1)所列公式进行均一化处理的步骤,能够更有效地消除不同样本间因测序深度所带来的序列数统计的偏差,使得每个样本的每个窗口的序列数都相对均一。
在本发明的上述方法中,对于特定的窗口而言,可以统计出对照组样品中各个样品在标准化之后的测序序列数的中位值,并将该中位值与待检样品中该窗口的标准化测序序列数相比较。假如后者明显小于前者,则认为可能发生了缺失突变。在本发明中,优选当上述待测样本在各窗口的第二序列数与对照样本在对应窗口的第二序列数的中位数的比值小于0.6,则认为该窗口发生了缺失突变。0.6这一设定值能够相对准确地显示待测样本与对照样本在相同窗口上的序列数之间的差异,能更准确地确定待测样本在该窗口存在缺失突变的可能性。但本发明并不局限于0.6这一设定值,该设定值是用来确定待测样本的窗口的序列数与对照样本的对应窗口的序列数之间是否存在显著差异的确定标准,针对不同的测序数据,这一设定值可以相应的调整。
在本发明的上述方法中,在步骤S1之前,还包括制备待测样本和对照样本的外显子文库的步骤,制备待测样本和对照样本的外显子文库的步骤中采用液相捕获的方法进行制备。采用液相捕获的方法制备外显子文库捕获效率更高,且能够节约大量时间。
在本发明的上述方法中,采用液相捕获的方法进行制备之前,还包括根据目标外显子区域设计液相捕获探针的步骤。液相捕获探针可以采用本领域常规探针的设计方法进行设计,比如通过安捷伦公司官方手册方法进行液相探针定制、NimbleGen公司官方手册方法进行液相探针定制等。
在本发明一种具体的实施例中,上述制备待测样本和对照样本的外显子文库的步骤包括:对待测样本和对照样本的基因组DNA进行破碎处理,得到破碎DNA;对破碎DNA进行末端修复和加A处理,得到3’端带“A”的修复DNA;对修复DNA进行接头连接,得到带接头DNA;对带接头DNA进行PCR扩增,得到扩增DNA;用液相捕获探针与扩增DNA进行杂交,得到待测样本和对照样本的外显子文库。上述外显子文库制备中采用液相捕获的方法得到含有目标基因外显子区域的测序文库,获得外显子的效率高且省时。
在本发明的上述方法中,在得到待测样本和对照样本的外显子文库之后,以及对外显子文库进行测序之前,还包括对外显子文库进行变性处理的步骤。此处进行变性处理目的是便于高通量测序使用。
在本发明另一种典型的实施方式中,提供了一种基因缺失突变检测的装置,如图2所示,该装置包括:检测模块:用于对待测样本和对照样本的外显子文库进行测序,得到待测样本和对照样本的测序数据;切分统计模块:用于对测序数据以切分成窗口的形式分别计算待测样本和对照样本在各窗口的序列数,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第一序列数;均一化模块:用于对待测样本和对照样本各自在各窗口上的单一序列数进行均一化处理,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数;计算模块:用于取对照样本在各窗口的第二序列数的中位数,将待测样本在各窗口的第二序列数与中位数相除,得到比值;确定模块:用于在比值小于设定值时,则确定窗口中存在基因缺失突变。
本发明的上述装置,通过采用检测模块对待测样本和对照样本的外显子文库进行测序,得到待测样本和对照样本的测序数据之后;利用切分统计模块对待测样本和对照样本的测序数据以切分成窗口的形式计算各窗口的序列数,得到待测样本和对照样本在各窗口的第一序列数;接着执行均一化模块对待测样本和对照样本在各窗口上的单一序列数进行均一化处理,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数;然后执行计算模块取对照样本在各窗口的第二序列数的中位数,将待测样本在各窗口的第二序列数与中位数相除得到比值;最后执行确定模块在比值小于设定值时,则确定窗口中存在基因缺失突变。上述装置通过利用切分统计模块便于根据不同的测序数据的测序深度和目标缺失片段的大小来灵活切分窗口的大小,使检测的缺失片段的大小范围更广泛;并且,确定模块在确定某一窗口是否存在缺失突变时,根据待测样本在各窗口的第二序列与对照样本间的中位数的比值进行确定,通过采用对照样本间的中位数作为比较的标准,相比采用平均值和标准差作为比较的标准,更容易区分假阳性,使确定结果更准确。
由于本发明的上述装置中,在判断待测样本是否存在缺失时,是以对照样本在各窗口的第二序列数的中位数作为比较的标准,相比平均值和标准差的计算,中位数的计算不容易受个别非正常的序列数的影响,因而判断结果更准确。基于上述优势,本发明的上述对照样本可以是正常的不存在基因缺失的样本,也可以是与待测样本同批检测的其他样本,这样,即提高了检测的准确性,又降低了检测成本。
在本发明的上述装置中,上述均一化模块可以对本领域常用的均一化模块进行适当改进即可,任何能够将本发明的各窗口的序列数进行标准化处理的均一化模块均适用于本发明。在本发明中,上述均一化模块进一步包括:统计子模块:用于对待测样本和对照样本各自的第一序列数的总和进行统计,得到各自的总第一序列数;计算子模块:用于分别将待测样本和对照样本在各窗口上的第一序列数按照式(1)所示的公式
第二序列数=第一序列数*1000/总第一序列数………………………..(1)进行均一化处理,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数。
上述实施例中,均一化模块通过统计子模块对待测样本和对照样本各自的第一序列数的总和进行统计,得到各自的总第一序列数;然后利用计算子模块分别将待测样本和对照样本在各窗口上的第一序列数按照式(1)所示的公式进行均一化处理,得到待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数。这种均一化模块能够有效降低各样本间的测序深度差异对结果的影响。
在上述装置中,确定模块中的设定值是用来确定待测样本的窗口的序列数与对照样本的对应窗口的序列数之间是否存在显著差异的确定标准,针对不同的测序数据,这一设定值可以相应的调整。在本发明一种优选的实施例中,上述确定模块中的设定值小于等于0.6。0.6这一设定值能够相对准确地显示待测样本与对照样本在相同窗口上的序列数之间的差异,能更准确地确定待测样本在该窗口存在缺失突变的可能性。
在上述装置中,在检测模块之前,上述装置还包括外显子文库制备模块:用于采用液相捕获方法对待测样本和对照样本的外显子文库进行制备。上述外显子文库制备模块采用液相捕获的方法得到含有目标基因外显子区域的测序文库所获得的文库中外显子的捕获效率高且省时。
在上述装置中,在外显子文库制备模块之前,装置还包括探针设计模块:用于根据目标外显子区域设计液相捕获探针。探针设计模块的设计原理是设计和目标区域互补的小片段,抓取目标区域序列。可以采用本领域常用的探针设计模块,比如通过安捷伦公司官方手册方法进行液相探针定制、NimbleGen公司官方手册方法进行液相探针定制。
需要说明的是,采用高通量测序能够测得样本中存在的各种可能的突变,包括插入缺失、SNP以及大片段缺失等,而本发明主要用于检测目标基因的外显子上是否存在缺失突变。本发明的方法和装置检测得到的缺失突变主要是从统计学的角度来推断其发生缺失突变的可能性的高低,至于是否与疾病发生有直接或间接的关系,还有待其他检测结果的多方面的验证,因而本方法和装置仅适用于科研和学术基础研究之用,而不适用于临床上疾病的诊断。
下面结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。
需要说明的是,以下实施例以MSH2基因为例来详细说明本发明的方法,所用的试剂或药品及仪器,如无特殊标注,均来自于美国安捷伦公司。本实施例招募1名MSH2基因突变携带者和10名正常人,签署书面知情同意书。依据自行设计口腔拭子提取方法进行口腔拭子样本提取,依据安捷伦的说明书进行芯片制备和杂交,依据Illumina的说明书进行测序。具体步骤如下:
实验一芯片设计
参考序列为NCBI build 37/hg19(来自www.ncbi.nlm.nih.gov)的MLH1、MSH2基因组外显子序列及前后10bp,由美国安捷伦Agilent公司设计完成。
实验二DNA提取
1)处理材料:将在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml离心管中,用剪刀将棉签部分剪下。
2)加入细胞裂解液和蛋白酶K,56℃放置60min消化细胞。
3)加入缓冲液,70℃放置10min,挤压去除拭子,将裂解液转入新的离心管。
4)加入无水乙醇,析出DNA。
5)将溶液加入吸附柱离心,倒掉收集管中的废液。
6)加入缓冲液,离心,倒掉收集管中的废液。
7)加入漂洗液,离心,倒掉收集管中的废液。重复1次。
8)干燥柱子基质。
9)向吸附柱中加入洗脱缓冲液洗脱DNA。
10)DNA产物保存在-20℃。
实验三文库制备
步骤一:DNA破碎
1)gDNA质检,保证DNA质量合格(无降解;A260/A280在1.8-2.0之间)。用Qubit检测样本gDNA的浓度。
2)按照表1参数设置covaris,具体操作如下:
表1:
设置 | 数值 |
工作系数(Duty Factor) | 10% |
功率峰值(PIP) | 175 |
每个脉冲周期数 | 200 |
处理时间 | 360sec |
温度 | 4℃~8℃ |
A.在covaris水缸中加入去离子水,水位达到刻度“12”;
B.检查水位是否能没过样品管玻璃部分;
C.将冷却温度设为2-5℃,冷却至5℃;可选地,加入乙二醇(ethylene glycol)至总体积的20%,防止结冰。
D.按下控制板上的“Degas”按钮,使用之前“Degas”操作至少30min。
E.在1.5ml EP管中,用1X Low TE Buffer将3ug gDNA稀释到130ul;将Covaris microTube装到covaris上;用锥形枪头小心地吸取130ul DNA样本,加入到Covaris microTube管中。(小心操作,不要使管子底部出现气泡)
3)按照表1设置的Covaris参数进行DNA破碎,破碎产物的主峰在150-200bp。
4)用锥形枪头小心地将破碎后的DNA样本吸到一个新的1.5ml EP管中。
步骤二:用Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本
1)将AMPure XP bead在室温放置至少30min;然后充分混匀AMPure XP bead悬浮液,直至悬浮液颜色均一(不要冷冻)。
2)在1.5ml新管中加入180ul混匀的AMPure XP bead悬浮液和破碎的DNA文库(~130ul)。涡旋混匀,室温放置5min。
3)将管子放在磁力架上,静置大约3-5min至溶液变澄清。
4)在磁力架上小心地吸除管中的上清,枪头不要碰到磁珠。
5)在磁力架上,在每个管中分加500ul 70%乙醇。用新鲜现配的乙醇可以获得更好的效果。
6)静置1min让磁珠沉降后,吸除乙醇。
7)重复步骤5)、6)一次。
8)在加热块(head block)上37℃加热5min,或加热至管中残留的乙醇完全蒸发。注:不要加热到磁珠表面出现裂纹。磁珠过干会导致洗脱的效率显著下降。
9)加入50ul无RNA酶水,在涡旋仪上混匀,室温放置2min。
10)将PE管放在磁力架上,静置大约2-3min至溶液变澄清。
11)吸取大约50ul上清到一个新的1.5ml管中。此步结束后可以丢弃磁珠。如果不进行后续步骤,将样本保存在-20℃冰箱。
步骤三:末端修复
1)使用SureSelect Library Prep Kit,ILM.试剂盒,在冰上配制反应液。
2)在PCR管(或排管、PCR板)里按下表2所示配方配制反应混合液,混匀。
3)在每个PCR管(或孔)中加入52ul反应液mix。
4)在每个PCR管(或孔)中加入48ul DNA样本,用枪吹吸混匀。
5)然后置于PCR仪上,20℃温浴30min,不要热盖。
表2:
步骤四:用Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本(具体操作同步骤二)
步骤五:DNA片段末端加A
1)使用SureSelect Library Prep Kit,ILM.试剂盒,按下表3配方在冰上配制反应液。
表3:
2)置于PCR仪上,37℃温浴30min。如果使用热盖,确保热盖温度不超过50℃。
步骤六:用Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本(具体纯化操作同步骤二)
步骤七:连接带有特异标签的接头
1)按表4所示配方配制末端加接头反应液;
表4:
2)置于PCR仪上,20℃温浴15min。不要使用热盖。如果不进行后续步骤,将样本保存在-20℃冰箱。
步骤八:用Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本(同步骤二)
步骤九:扩增连上接头的文库
1)连接了接头的文库,只用其中的1/3进行扩增,剩余样本保存在-20℃冰箱。
2)按照表5所示配方配制PCR反应液:
表5:
注:所加的DNA文库的量也可以是250ng(用bioanalyzer DNA1000chip定量)。
3)放入PCR仪,按下表6设置PCR反应程序进行反应。
表6:
步骤十:用Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本(同步骤二)
实验四液相捕获
步骤一:文库杂交
本部分包含了如下步骤:将制备好的文库与杂交试剂、封闭试剂(blocking agent)和SureSelect捕获探针文库进行混合反应。每个DNA文库必须单独地进行杂交和捕获,然后再通过PCR反应引入index。
每个文库做一次杂交和一次捕获,不要在本步进行样本混池。杂交反应要求750ng DNA起始量,最大体积不能超过3.4ul,具体如下:
1)在室温下按照如下表7所示配方配制杂交缓冲液。
表7:
2)在PCR板上制备用于目标捕获的SureSelect捕获文库混合物(Capture library mix);保持管子放置在冰上。对于每个样本,根据目标区域的大小(Mb),参照下表8所示比例加入适量的SureSelect捕获文库(Capture Library)。并参照下表8用无RNA酶水稀释SureSelectRNase Block。同时按照表8配制足够所有样本反应的稀释液,要留有富余量。参照下表8加入SureSelect RNase Block稀释液,用枪吹吸混匀。
表8:SureSelect Capture Library Mix配方
3)按照表9配制足够所有样本反应的SureSelect Block Mix。
表9:SureSelect Block Mix
4)在另一个PCR板上,处理制备好的文库,以用于目标捕获。
a.将样品分为A、B两排,在B排上的每个孔中,分别加入3.4ul 221ng/ul文库。
b.在B排上的每个孔中,分别加入5.6ul SureSelect Block Mix。用枪上下吹吸混匀。
c.用盖将每个样品的孔封严,放入PCR仪,
d.按照表10中的程序进行反应;
表10:
步骤 | 温度 | 时间 |
1 | 95℃ | 5min |
2 | 65℃ | 恒温 |
5)在65℃温浴的过程中,用105℃热盖。
6)保持PCR板在65℃的条件下,在96孔板的A排的每个孔中加入40ul杂交缓冲液,加入的孔数与该96孔板上B排的文库数相同。注:要保证进行步骤10之前,PCR板在65℃温浴至少5min。
7)加入步骤2配制的capture library mix到PCR上:
a.保持PCR板在65℃的条件下,在上述96孔板上的C排上的孔中加入7ul capture librarymix。
b.用排盖将口封上,确保封口严实。
c.65℃温浴2min。
8)保持PCR板在65℃的条件下,用排枪从A排吸取13ul杂交缓冲液,加入到C排的capture library mix中。
9)保持PCR板在65℃的条件下,用排枪从B排吸取全部的文库混合液,加入到C排的杂交溶液中。用枪缓慢地上下吹吸8-10次,充分混匀。此时杂交混合液的体积大概是27-29ul,取决于前步温浴时蒸发造成的体积损失大小。
10)用排盖或双层粘膜(double adhesive film)封口,确保所有孔封口严实。
注:使用新的排盖或封口膜,使用过的在加热过程中其完整性会下降。如果使用排管,在第一次使用之前要通过预实验检查蒸发的情况,确保蒸发的体积不要超过3-4ul。
11)杂交混合液在65℃温浴24h,用105℃热盖。
步骤二:准备磁珠
本步使用到SureSelect Target Enrichment Kit Box#1的试剂:SureSelect Bind Buffer和SureSelect Wash 2。
1)在水浴锅或加热块上65℃预热SureSelect Wash 2,在Step 3使用。
2)磁珠在保存的时候会沉降,涡旋剧烈震荡,让Dynabeads MyOne Streptavidin T1重新悬浮。
3)对每个杂交反应,取50ul Dynabeads MyOne Streptavidin T1到1.5ml离心管中。
4)冲洗磁珠:
a.加入200ul SureSelect Binding Buffer,votex震荡5s。
b.将管子放在磁力架上,至溶液变澄清后吸除上清。
c.重复步骤a-b两遍,总共冲洗3次。
5)用200ul SureSelect Binding Buffer重新悬浮磁珠。
步骤三:捕获和洗脱
本步使用到SureSelect Target Enrichment Kit Box#1的试剂:SureSelect Wash 1和SureSelectWash 2。
1)经过24小时的温浴之后,估计(用枪估计)并记录剩余的杂交混合液的体积。
2)保持PCR板在65℃的条件下,将杂交混合液直接加到bead溶液里,颠倒混匀3-5次。
注:如果在温浴杂交24h之后,发生过度的蒸发,剩下的体积不到20ul,将会影响后续的捕获效果。
3)将混合液放在nutator(摇摆机)上,室温混匀30min。
4)简短离心。
5)把管子放在磁力架上,静置至溶液澄清,吸除上清。
6)加入500ul SureSelect Wash 1,votex 5s让bead重新悬浮。
7)室温放置15min,其间用votex混匀几次。
8)简短离心。
9)把管子放在磁力架上,静置至溶液澄清,吸除上清。
10)冲洗bead
a.加入500ul经过65℃预热的SureSelect Wash 2,votex 5s让bead重新悬浮。
b.在水浴锅或加热块上65℃温浴10min,其间用votex混匀几次。
c.如果bead已经沉降,颠倒几下让其悬浮。
d.简短离心。
e.把管子放在磁力架上,静置至溶液澄清,吸除上清。
f.重复步骤a-e两遍,总共冲洗3次。确保所有的wash buffer被吸除。
g.加入30ul nuclease-free water,votex 5s让bead重新悬浮。
实验五:杂交后PCR扩增、引入标签(index)
本部分包含的实验步骤是:通过PCR扩增引入index、PCR产物纯化和文库质检。
步骤一:PCR扩增引入index
本步使用到的试剂:
·Herculase II Fusion DNA Polymerase(Agilent)
·SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box#2
·SureSelect Library Prep Kit,ILM
注:不要用Herculase II Fusion DNA Polymerase以外的PCR酶,其他酶的效果未经验证。
1)1个杂交配1个PCR反应,外加一个阴性对照(不加模板)。
2)将多个样品置于冰上,进行如下操作:
a.按下表11配方配制反应液混合物,混匀;
b.在每个PCR管(或孔)中加入35ul反应液mix。
c.从试剂盒“SureSelect Library Prep Kit,ILM”中取出PCR Primer Index 1through Index 16(clear caps),每个孔中加入1ul适当的index,用枪吹吸混匀。
对于将在同一个lane上进行测序的不同样本,采用不同的index primer。
e.用枪吹吸每个DNA样本,保证bead溶液混合均匀。
f.每个样本吸取14ul到对应的PCR管(或孔)中,上下吹吸混匀。
表11:Herculase II Master Mix配方
*取自Herculase II Fusion DNA Polymerase(Agilent)试剂盒。不要使用其他试剂盒的buffer和dNTP mix。
a取自试剂盒:SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box#2。
b使用SureSelect Library Prep Kit,ILM试剂盒中的16个primer中的1个。
3)将PCR管放入PCR仪进行扩增,扩增程序如下表12:
表12:
步骤二:用Agencourt AMPure XP磁珠纯化DNA样本(同实验三中的步骤二)
实验六高通量测序
步骤一:稀释文库、变性
1)准备变性用0.2N NaOH:200μL 0.1N NaOH加入到800μL纯水中配制0.2N NaOH溶液。
2)将文库稀释到2nM,根据各文库所需数据量pooling,获得浓度为2nM的文库稀释液。
3)取10μL 2nM文库稀释液加入等体积的10μL 0.2nM NaOH,吹吸混匀3次后,开始计时5min。期间震荡混匀,即震荡10s,离心,重复震荡离心操作两次。
4)变性5min后,向变性文库中加入970μL HT1,震荡混匀文库溶液,280*g
5)离心1min,获得20pM的变性文库。
6)将20pM的变性文库稀释到3pM用于上机。变性文库溶液450μL加入到2550μL预冷的HT1中,颠倒混匀数次,离心,获得3mL 3pM的变性文库。
步骤二:上机
1)准备试剂盒(Reagent Cartridge)、解冻、检查和加入次氯酸钠;准备测序芯片(flow cell):平衡到室温、打开、检查。
2).准备试剂盒(Reagent Cartridge):首先试剂盒(Reagent Cartridge)解冻,然后检查试剂盒(Reagent Cartridge)大的储层确定试剂是否完全解冻。
(1)试剂盒(Reagent Cartridge)解冻:试剂盒(Reagent Cartridge)可以在2-8℃,过夜解冻。在这个温度试剂最少18h才可完全解冻。在这个温度试剂可以保存一周。①从-15-25℃拿出试剂盒(Reagent Cartridge);②将试剂盒(Reagent Cartridge)放入可浸没试剂盒(ReagentCartridge)底部的室温的水浴中。注:水勿要到达试剂盒(Reagent Cartridge)的顶部。③试剂在室温水浴解冻约60min,至完全解冻。④从水浴中取出试剂盒(Reagent Cartridge),在工作台上轻敲,去除试剂盒(Reagent Cartridge)底部的水,使试剂盒(Reagent Cartridge)底部干燥。
(2)检查试剂盒(Reagent Cartridge):①颠倒试剂盒(Reagent Cartridge)5次混匀解冻的试剂。②检查试剂盒(Reagent Cartridge)底部的29、30、31和32储层,确保这些储层的试剂完全解冻。③在工作台上轻敲试剂盒(Reagent Cartridge)将试剂中的气泡赶出。
(3)放入新鲜的NaOCl:为了避免上一个运行对仪器的污染,在Reagent Cartridge放入Nextseq 500前,在Reagent Cartridge中加入稀释的NaOCl。Illumina推荐3%-6%的NaOCl稀释到0.03%-0.06%。注:配制的NaOCl在24h内使用。①制备2mL的0.03%-0.06%NaOCl,体积比为203%-6%的NaOCl 20μL和纯水1980μL。②颠倒混匀离心管数次;③用纸巾将28孔纸巾擦干净;④用干净的1mL枪头将28孔孔膜捅破;⑤向28号孔中加入2mL 0.03%-0.06%,
(4)准备测序芯片(flow cell):将测序芯片(flow cell)从2-8℃中取出,打开包装并将测序芯片(flow cell)擦拭干净,等待上机。
3)加入文库稀释液到试剂盒的10号孔中。
4)从软件界面选择序列开始测序程序设置步骤。
5)放入测序芯片(flow cell);
6)清空废料托盘,并放回。放入缓冲液盒,放入试剂盒。
7)审查运行参数和运行前检查结果。选择开始运行。
8)通过NCS软件和SAV软件监控运行过程。
实验七数据分析
步骤一:数据过滤
原始测序数据以fastq文件格式存储(文件名:*.fq),在进行下一步分析之前需要进行数据过滤,过滤方法如下:
(1)需要过滤掉含有接头序列的序列(reads);
(2)当单端测序序列中含有的N的含量超过该条序列长度比例的10%时,需要去除此对双端测序序列(paired reads);
(3)当单端测序序列中含有的低质量(Q<=5)碱基数超过该条read长度比例的50%时,需要去除此对双端测序序列(paired reads)。
步骤二:序列比对与质控
经过对测序数据的严格过滤,得到高质量的有效序列(Clean data)。有效序列通过BWA(Burrows-Wheeler Alignment tool)软件比对到NCBI build 37/hg19参考基因组上,比对结果经picard(http://broadinstitute.github.io/picard/)去除重复,并过滤掉错配碱基数目超过5的序列。
步骤三:窗口切分
通过分析比对结果文件我们可以得到待检样品和对照组样品测序结果的覆盖深度都达到了300X以上,由于测序深度较高,我们可以将窗口设置为比较小的值。经过多次测试之后我们选定窗口值为100bp。为了防止出现长度较短的窗口,长度小于160bp的外显子不做划分处理。
步骤四:对各窗口的序列进行均一化处理
使用GATK(The Genome Analysis Toolkit)工具的覆盖深度(depth of Coverage)模块计算待检样品和对照样品组在各个窗口上的测序序列数目,并将待检样品和对照样品组在各个窗口上的测序序列数目进行标准化,标准化的方法参考如下公式:
标准化后各窗口的序列数=各窗口的序列数*1000/所有窗口的序列总数
对于特定的窗口而言,可以统计出对照组样品中各个样品在标准化之后的测序序列数目的中位值,并将该中位值与待检样品中该窗口的标准化测序序列数目相比较。在后者明显小于前者的情况下,则认为后者可能发生了缺失突变。
步骤五:确定是否显著
公式为:标准化待检样品序列数/标准化的对照组序列数的中位数<0.6,通过对样本检测发现,样本1MSH2基因在1-7号外显子出现缺失(见下表13)。
表13:
实验八验证
为证明本发明结果的准确性,通过多重连接探针扩增技术(MLPA)检测分析阳性结果携带者外显子缺失结果,实验步骤如下:
1.DNA变性:98℃加热5分钟。
2.杂交:加入MLPA探针混合物和缓冲液于95℃孵育1分钟,然后于60℃杂交16个小时。
3.连接:加连接酶和缓冲液于54℃孵育15分钟,再于98℃加热5分钟使连接酶失活。
4.加引物:dNTP,聚合酶,然后开始PCR扩增。反应条件:95℃预变性1min后,95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸60s,完成35个循环,72℃总延伸20min,放置4℃保存。PCR产物要避光保存。
5.毛细管电泳:输出片段长度和峰面积,软件分析结果。
试验后将PCR产物进行毛细管电泳电泳,通过观察电泳条带,发现携带者在MSH2基因1-7号外显子出现缺失,具体验证结果见图3。
从以上的描述中,可以看出,本发明上述的实施例实现了预期技术效果:通过将待测样本和对照样本的测序数据以切分成窗口的形式进行序列数的计算,便于根据不同的测序数据的测序深度和目标缺失片段的大小来灵活切分窗口的大小,使检测的缺失片段的大小范围更广泛;并且,在确定某一窗口是否存在缺失突变时,根据待测样本在各窗口的第二序列与对照样本间的中位数的比值进行确定,通过采用对照样本间的中位数作为比较的标准,相比采用平均值和标准差作为比较的标准,更容易区分假阳性,使确定结果更准确,因为当某个窗口上未发生拷贝数变异时,采用平均值和标准差作为比较的标准的确定方式会影响确定结果的准确性。
需要说明的是,在附图的流程图示出的步骤可以在诸如一组计算机可执行指令的计算机系统中执行,并且,虽然在流程图中示出了逻辑顺序,但是在某些情况下,可以以不同于此处的顺序执行所示出或描述的步骤。
显然,本领域的技术人员应该明白,上述的本发明的各模块或各步骤可以用通用的计算装置来实现,它们可以集中在单个的计算装置上,或者分布在多个计算装置所组成的网络上,可选地,它们可以用计算装置可执行的程序代码来实现,从而,可以将它们存储在存储装置中由计算装置来执行,或者将它们分别制作成各个集成电路模块,或者将它们中的多个模块或步骤制作成单个集成电路模块来实现。这样,本发明不限制于任何特定的硬件和软件结合。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种基因缺失突变的检测方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
步骤S1,对待测样本和对照样本的外显子文库进行测序,得到所述待测样本和对照样本各自的测序数据;
步骤S2,对所述测序数据以切分成窗口的形式分别计算所述待测样本和对照样本在各窗口的序列数,得到所述待测样本和对照样本各自在各窗口的第一序列数;
步骤S3,对所述待测样本和对照样本各自在各窗口上的所述第一序列数进行均一化处理,得到所述待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数;
步骤S4,取所述对照样本在各窗口的所述第二序列数的中位数,将所述待测样本在各所述窗口的第二序列数与所述中位数相除,得到比值;
步骤S5,若所述比值小于设定值,则所述窗口中存在基因缺失突变。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述窗口为连续不相交的窗口。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述窗口的长度根据所述待测样本和对照样本的测序深度和预期检测的基因缺失突变的长度设置。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,在所述测序深度大于等于300×时,各所述窗口的长度为50~160bp,优选为50~100bp。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S3包括:
对所述待测样本和对照样本各自的所述第一序列数的总和进行统计,得到各自的总第一序列数;
分别将所述待测样本和对照样本在各窗口上的第一序列数按式(1)所示的公式
第二序列数=第一序列数*1000/总第一序列数………………………..(1)
进行均一化处理,得到所述待测样本和对照样本各自在各窗口的所述第二序列数。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述设定值小于等于0.6。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述步骤S1之前,还包括分别制备所述待测样本和对照样本的外显子文库的步骤,所述分别制备待测样本和对照样本的外显子文库的步骤中采用液相捕获的方法进行制备。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,采用所述液相捕获的方法进行制备之前,还包括根据目标基因外显子区域设计液相捕获探针的步骤。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于,所述制备待测样本的外显子文库和对照样本的外显子文库的步骤包括:
分别对所述待测样本和对照样本的基因组DNA进行破碎处理,得到破碎DNA;
对所述破碎DNA进行末端修复和加A处理,得到3’端带“A”的修复DNA;
对所述修复DNA进行接头连接,得到带接头DNA;
对所述带接头DNA进行PCR扩增,得到扩增DNA;
用所述液相捕获探针与所述扩增DNA进行杂交,分别得到所述待测样本和所述对照样本的外显子文库。
10.一种基因缺失突变检测的装置,其特征在于,所述装置包括:
检测模块:用于对待测样本和对照样本的外显子文库进行测序,得到所述待测样本和对照样本各自的测序数据;
切分统计模块:用于对所述测序数据以切分成窗口的形式分别计算待测样本和对照样本在各窗口的序列数,得到所述待测样本和对照样本各自在各窗口的第一序列数;
均一化模块:用于对待测样本和对照样本各自在各窗口上的所述单一序列数进行均一化处理,得到所述待测样本和对照样本各自在各窗口的第二序列数;
计算模块:用于取所述对照样本在各窗口的所述第二序列数的中位数,将所述待测样本在各所述窗口的第二序列数与所述中位数相除,得到比值;
确定模块:用于在所述比值小于设定值时,则确定所述窗口中存在基因缺失突变。
11.根据权利要求10所述的装置,其特征在于,所述均一化模块进一步包括:
统计子模块:用于对所述待测样本和对照样本各自的所述第一序列数的总和进行统计,得到各自的总第一序列数;
计算子模块:用于分别将所述待测样本和对照样本在各窗口上的第一序列数按照式(1)所示的公式
第二序列数=第一序列数*1000/总第一序列数………………………..(1)
进行均一化处理,得到所述待测样本和对照样本各自在各窗口的所述第二序列数。
12.根据权利要求10所述的装置,其特征在于,所述确定模块中的所述设定值小于等于0.6。
13.根据权利要求10所述的装置,其特征在于,在所述检测模块之前,所述装置还包括外显子文库制备模块,用于采用液相捕获方法对所述待测样本和对照样本的外显子文库进行制备。
14.根据权利要求13所述的装置,其特征在于,在所述外显子文库制备模块之前,所述装置还包括探针设计模块,用于根据目标外显子区域设计液相捕获探针。
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