CN109022573B - 乳腺癌pik3ca热点突变检测探针引物序列组合和试剂盒 - Google Patents

乳腺癌pik3ca热点突变检测探针引物序列组合和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了乳腺癌PIK3CA热点突变检测探针引物序列组合和试剂盒，检测探针引物序列组合包括SEQ ID NO：1~4所示的引物序列，以及SEQ ID NO：5~10所示的探针序列，其中探针序列带有荧光基团修饰。本发明基于微滴式数字PCR平台，针对PIK3CA基因的三个突变位点进行引物和探针的设计，并经试验验证确定了一组乳腺癌PIK3CA热点突变检测探针引物序列组合，能够有效地检测PIK3CA基因的三个突变位点。

Description

乳腺癌PIK3CA热点突变检测探针引物序列组合和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及乳腺癌PIK3CA热点突变检测探针引物序列组合和试剂盒。
背景技术
乳腺癌是严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤，其发病率逐年上升，目前已成女性发病第一的恶性肿瘤。随着对乳腺癌发生、发展过程中的分子生物学变化研究的不断深入，以肿瘤细胞信号转导通路为治疗位点的靶向治疗成为继化疗和内分泌治疗后的又一种有效的乳腺癌治疗手段。
磷脂酰肌醇-3-激酶催化单位(phosphatidylinositol-3-kinase catalyticalpha，PIK3CA)是由Volinia在1994年利用原位杂交技术检测到的，其定位于3q26.3，长34kb，包含21个外显子，编码1068个氨基酸，该组氨基酸产生一长124kD的蛋白。PIK3CA的突变约4/5发生在螺旋区(外显子9)和激酶区(外显子20)这两个热点区域。其突变集中于3个热点即E542K、E545K和H1047R。其中E542K、E545K定位于外显子9的螺旋区而H1047R定位于外显子20的激酶区。
PIK3CA基因突变是除HER2基因突变、P53基因突变之外乳腺癌常见的突变基因之一，其在乳腺癌中的突变率约为8％～40％。PIK3CA基因突变通过PI3K/AKT途径引发AKT持续活化，导致成纤维细胞和乳腺上皮细胞的生长和转化，抑制细胞凋亡，与乳腺癌的发生、发展关系密切。因此，准确检测出PIK3CA的基因突变是急需的。
目前用于基因检测的手段主要有基因测序、基因分型技术(SNP)、基因芯片等。其中基因测序被国际公认为最标准、最准确，但成本高，通量小，更利于分析复杂且具有高度多态性的基因。基因芯片的优势在于其自动化和高通量，由软件自动分析结果，方便快捷，但它也容易受到多种因素影响，假阳性率高，结果重复率不高。基因分型技术具有准确、快捷及操作简单等优点，但成本高。
数字PCR是近年来引起重视并迅速发展起来的核酸分子绝对定量技术，由于生物学研究的需要和多学科技术的交叉融合，数字PCR已经迈入第三代——微滴式数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)时代。ddPCR技术是一种通量较高、成本较低的绝对定量技术，可作为基因检测的初筛技术。该技术与传统方法的检测结果符合率高，方法一致性好，相比于目前主流的NGS，数字PCR在如下方面优势突出：操作快速、简便，无需复杂的生物信息学分析，检测灵敏度高。该技术基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，对微滴的荧光信号逐个分析统计。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度，不再依赖ct值或内参基因即可确定低至单拷贝待检靶分子的绝对数目。
发明内容
本发明提供一种乳腺癌PIK3CA热点突变检测探针引物序列组合和试剂盒，能够对乳腺癌PIK3CA热点突变进行数字PCR扩增检测。
根据第一方面，一种实施例中提供一组乳腺癌PIK3CA热点突变检测探针引物序列组合，包括如下引物序列：
PIK3CA545K(E542K)-F8：GGAAAATGACAAAGAACAGC(SEQ ID NO：1)；
PIK3CA545K(E542K)-R8：TACCTGTGACTCCATAGAAA(SEQ ID NO：2)；
PIK3CA1047R-F4：AGGCTTTGGAGTATTTCA(SEQ ID NO：3)；
PIK3CA1047R-R4：CATGCTGTTTAATTGTGTGG(SEQ ID NO：4)；
以及如下探针序列：
PIK3CA542-WT3：CTCTCTGAAATCACTGAGCAG(SEQ ID NO：5)；
PIK3CA542-MT3：CTCTCTAAAATCACTGAGCAG(SEQ ID NO：6)；
PIK3CA545K-WT3：TCCTGCTCAGTGATTTCAGA(SEQ ID NO：7)；
PIK3CA545K-MT3：TCCTGCTTAGTGATTTCAGA(SEQ ID NO：8)；
PIK3CA1047R-WT6：ATGCACATCATGGTGGCT(SEQ ID NO：9)；
PIK3CA1047R-MT6：ATGCACGTCATGGTGGCT(SEQ ID NO：10)；
其中，上述探针序列带有荧光基团修饰。
进一步地，上述探针序列PIK3CA542-WT3、PIK3CA545K-WT3和PIK3CA1047R-WT6的荧光基团修饰与上述探针序列PIK3CA542-MT3、PIK3CA545K-MT3和PIK3CA1047R-MT6的荧光基团修饰不同。
进一步地，上述探针序列PIK3CA542-WT3、PIK3CA545K-WT3和PIK3CA1047R-WT6的荧光基团修饰是FAM。
进一步地，上述探针序列PIK3CA542-MT3、PIK3CA545K-MT3和PIK3CA1047R-MT6的荧光基团修饰是VIC。
进一步地，上述检测探针引物序列组合用于微滴式数字PCR中。
根据第二方面，一种实施例中提供一种乳腺癌PIK3CA热点突变检测试剂盒，包括一组检测探针引物序列组合，其包括如下引物序列：
PIK3CA545K(E542K)-F8：GGAAAATGACAAAGAACAGC(SEQ ID NO：1)；
PIK3CA545K(E542K)-R8：TACCTGTGACTCCATAGAAA(SEQ ID NO：2)；
PIK3CA1047R-F4：AGGCTTTGGAGTATTTCA(SEQ ID NO：3)；
PIK3CA1047R-R4：CATGCTGTTTAATTGTGTGG(SEQ ID NO：4)；
以及如下探针序列：
PIK3CA542-WT3：CTCTCTGAAATCACTGAGCAG(SEQ ID NO：5)；
PIK3CA542-MT3：CTCTCTAAAATCACTGAGCAG(SEQ ID NO：6)；
PIK3CA545K-WT3：TCCTGCTCAGTGATTTCAGA(SEQ ID NO：7)；
PIK3CA545K-MT3：TCCTGCTTAGTGATTTCAGA(SEQ ID NO：8)；
PIK3CA1047R-WT6：ATGCACATCATGGTGGCT(SEQ ID NO：9)；
PIK3CA1047R-MT6：ATGCACGTCATGGTGGCT(SEQ ID NO：10)；
其中，上述探针序列带有荧光基团修饰。
进一步地，上述探针序列PIK3CA542-WT3、PIK3CA545K-WT3和PIK3CA1047R-WT6的荧光基团修饰与上述探针序列PIK3CA542-MT3、PIK3CA545K-MT3和PIK3CA1047R-MT6的荧光基团修饰不同。
进一步地，上述探针序列PIK3CA542-WT3、PIK3CA545K-WT3和PIK3CA1047R-WT6的荧光基团修饰是FAM。
进一步地，上述探针序列PIK3CA542-MT3、PIK3CA545K-MT3和PIK3CA1047R-MT6的荧光基团修饰是VIC。
进一步地，上述检测试剂盒用于微滴式数字PCR中。
本发明基于微滴式数字PCR平台，针对PIK3CA基因的三个突变位点进行引物和探针的设计，并经试验验证确定了一组乳腺癌PIK3CA热点突变检测探针引物序列组合，能够有效地检测PIK3CA基因的三个突变位点。
附图说明
图1是本发明一个实施例中微滴式数字PCR检测结果图，其中，上图表示临床样本(A08)、阴性对照(B08)、阳性对照(C08)、空白对照(D08)四个样本的FAM通道扩增效果，下图为VIC通道扩增效果；图中每个点代表微滴扩增情况；横坐标Event Number表示总反应数；纵坐标Ch1Amplitude指FAM荧光通道扩增效果；纵坐标Ch2Amplitude指VIC荧光通道扩增效果；Ch1Pos:920Neg:53591表示FAM荧光通道中突变型总反应数为920，无信号总反应数为53591。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明主要基于微滴式数字PCR平台，针对PIK3CA基因的三个突变位点进行引物和探针的设计，以细胞系DNA和阳性标准品为样本进行测试和优化，从而确定反应体系。具体检测位点如下表1所示：
表1
Figure BDA0001319648150000051
PIK3CA突变位点的检测引物序列如表2所示：
表2
Figure BDA0001319648150000052
Figure BDA0001319648150000061
PIK3CA突变位点的检测探针序列如表3所示，其中FAM和VIC荧光基团均位于5’端。
表3
Figure BDA0001319648150000062
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案。
本实施例基于微滴式数字PCR技术对乳腺癌样本中的PIK3CA基因的热点突变区域进行检测，乳腺癌组织样本或血浆游离DNA均可以进行突变位点的检测。以血浆游离DNA为例，操作步骤如下：
(一)DNA样本提取：
使用Qiagen(德国)的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取血浆游离DNA。
准备工作：
打开三台水浴锅或温育仪，温度分别设置在37℃、56℃和60℃；准备一个冰盒；取50mL离心管，加入样本数及质控品总数A 900μL体积的缓冲液(Buffer)ACL，后加入样本数及质控品总数A 5.6μL的载运RNA(CarrierRNA)，震荡5s，短暂离心。
样本前处理：
a)样本为全血：4℃下1600×g(3000rpm)离心10min，将上层黄色血浆转移至管中(通常有2-2.5mL)，避免转移至中间层。再将血浆样本在4℃下1600×g(3000rpm)离心10min，将上清液转移至新EP管中，保存在冰盒内或其它2-8℃冰箱，最多可以保存24小时，更长时间需要冻存在超低温冰箱。
b)样本为血浆样本：将样本管取出后，置于37℃水浴锅解冻后，置于冰盒内。
c)取出2个2mL离心管，至于离心管架中。
提取步骤：
1)自样本管中取500μL血浆至2mL离心管中，并将样本管放置于2-8℃冰箱。
2)向2mL离心管中分别加入50μL蛋白酶K，400μL缓冲液(Buffer)ACL，盖上管盖，震荡30s，短暂离心。
3)置于60℃水浴锅或温育仪中温育30min。
4)取出2mL离心管，短暂离心。
5)加入900μL Buffer ACB，震荡30s，短暂离心。
6)置于0-4℃冰盒内温育5min。
7)取出QIAamp Mini column收集柱，将2个2mL离心管中液体转移650μL至收集柱中，并8000rpm/s离心1min，弃除收集管中的液体，再逐次将2个2mL离心管中的液体全部通过收集柱。
8)加入600μL的Buffer ACW1至收集柱中，8000rpm/s离心1min，弃废液。
9)加入750μL的Buffer ACW2至收集柱中，8000rpm/s离心1min，弃废液。
10)加入750μL的无水乙醇至收集柱中，8000rpm/s离心1min，弃废液。
11)14000rpm/s离心3min后，将收集柱置于一个新的采集管中，打开管盖，并置于56℃水浴锅或温育仪中温育10分钟。
12)将收集柱置于一个新的1.5mL离心管中，将50μL Buffer AVE加入到收集管中的滤膜中，盖上管盖，并室温温育3min。
13)全速14000rpm/s离心1分钟，弃采集柱，并在离心管盖上标上样本编号。
(二)ddPCR检测
1)配制反应液：将引物、探针、DNA模板、ddPCRsupermix(BIORAD公司)配制成22μL反应液，加入到微滴发生卡上，具体反应体系如下表4所示，其中，引物是针对每个检测位点对应的引物；探针是针对每个检测位点对应的探针，即检测某个位点突变加对应位点的探针。
表4
Figure BDA0001319648150000091
2)制备微滴：将微滴发生卡放入微滴生成器内，在2.5分钟内将每个22μL反应液分成20000个液滴。
3)PCR扩增：将微滴转移到96孔板上，于PCR仪上按照如下表5的程序进行扩增。
表5
Figure BDA0001319648150000092
4)检测微滴：将96孔板放入微滴分析仪，顺序吸取每个样品的微滴并随载液流逐一通过双色检测器。
5)分析数据：有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性，软件记录每个样品里阳性微滴的比例。
6)显示结果：软件自动分析数据，并以多种方式显示检测结果。
图1示出了本实施例中ddPCR检测结果图，其中，A08是临床样本；B08是阴性对照；C08是阳性对照；D08是空白对照。可以看出，能够明显区分野生型和突变型，探针特异性佳；且临床样本检测结果为阳性。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大基因研究院
<120> 乳腺癌PIK3CA热点突变检测探针引物序列组合和试剂盒
<130> 17I24512
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaaaatgac aaagaacagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacctgtgac tccatagaaa 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggctttgga gtatttca 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catgctgttt aattgtgtgg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctctctgaaa tcactgagca g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctctctaaaa tcactgagca g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcctgctcag tgatttcaga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcctgcttag tgatttcaga 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgcacatca tggtggct 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgcacgtca tggtggct 18

Claims (10)

1.一组乳腺癌PIK3CA热点突变检测探针引物序列组合，其特征在于，包括如下引物序列：
PIK3CA545K（E542K）-F8：GGAAAATGACAAAGAACAGC（SEQ ID NO：1）；
PIK3CA545K（E542K）-R8：TACCTGTGACTCCATAGAAA（SEQ ID NO：2）；
PIK3CA1047R-F4：AGGCTTTGGAGTATTTCA（SEQ ID NO：3）；
PIK3CA1047R-R4：CATGCTGTTTAATTGTGTGG（SEQ ID NO：4）；
以及如下探针序列：
PIK3CA542 -WT3：CTCTCTGAAATCACTGAGCAG（SEQ ID NO：5）；
PIK3CA542 -MT3：CTCTCTAAAATCACTGAGCAG（SEQ ID NO：6）；
PIK3CA545K -WT3：TCCTGCTCAGTGATTTCAGA（SEQ ID NO：7）；
PIK3CA545K -MT3：TCCTGCTTAGTGATTTCAGA（SEQ ID NO：8）；
PIK3CA1047R -WT6：ATGCACATCATGGTGGCT（SEQ ID NO：9）；
PIK3CA1047R -MT6：ATGCACGTCATGGTGGCT（SEQ ID NO：10）；
其中，所述探针序列带有荧光基团修饰。
2. 根据权利要求1所述的检测探针引物序列组合，其特征在于，所述探针序列PIK3CA542 -WT3、PIK3CA545K -WT3和PIK3CA1047R -WT6的荧光基团修饰与所述探针序列PIK3CA542 -MT3、PIK3CA545K -MT3和PIK3CA1047R -MT6的荧光基团修饰不同。
3. 根据权利要求2所述的检测探针引物序列组合，其特征在于，所述探针序列PIK3CA542 -WT3、PIK3CA545K -WT3和PIK3CA1047R -WT6的荧光基团修饰是FAM。
4. 根据权利要求2所述的检测探针引物序列组合，其特征在于，所述探针序列PIK3CA542 -MT3、PIK3CA545K -MT3和PIK3CA1047R -MT6的荧光基团修饰是VIC。
5.根据权利要求1至4任一项所述的检测探针引物序列组合，其特征在于，所述检测探针引物序列组合用于微滴式数字PCR中。
6.一种乳腺癌PIK3CA热点突变检测试剂盒，其特征在于，包括一组检测探针引物序列组合，其包括如下引物序列：
PIK3CA545K（E542K）-F8：GGAAAATGACAAAGAACAGC（SEQ ID NO：1）；
PIK3CA545K（E542K）-R8：TACCTGTGACTCCATAGAAA（SEQ ID NO：2）；
PIK3CA1047R-F4：AGGCTTTGGAGTATTTCA（SEQ ID NO：3）；
PIK3CA1047R-R4：CATGCTGTTTAATTGTGTGG（SEQ ID NO：4）；
以及如下探针序列：
PIK3CA542 -WT3：CTCTCTGAAATCACTGAGCAG（SEQ ID NO：5）；
PIK3CA542 -MT3：CTCTCTAAAATCACTGAGCAG（SEQ ID NO：6）；
PIK3CA545K -WT3：TCCTGCTCAGTGATTTCAGA（SEQ ID NO：7）；
PIK3CA545K -MT3：TCCTGCTTAGTGATTTCAGA（SEQ ID NO：8）；
PIK3CA1047R -WT6：ATGCACATCATGGTGGCT（SEQ ID NO：9）；
PIK3CA1047R -MT6：ATGCACGTCATGGTGGCT（SEQ ID NO：10）；
其中，所述探针序列带有荧光基团修饰。
7. 根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针序列PIK3CA542 -WT3、PIK3CA545K -WT3和PIK3CA1047R -WT6的荧光基团修饰与所述探针序列PIK3CA542 -MT3、PIK3CA545K -MT3和PIK3CA1047R -MT6的荧光基团修饰不同。
8. 根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针序列PIK3CA542 -WT3、PIK3CA545K -WT3和PIK3CA1047R -WT6的荧光基团修饰是FAM。
9. 根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针序列PIK3CA542 -MT3、PIK3CA545K -MT3和PIK3CA1047R -MT6的荧光基团修饰是VIC。
10.根据权利要求6至9任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于微滴式数字PCR中。
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