CN111705132A - 一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组、试剂盒和方法 - Google Patents

一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组、试剂盒和方法，本发明根据基因TP53的部分碱基序列开发出ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组、试剂盒和方法，从而有效预测肝癌手术病人和非手术病人的预后情况，本发明突变型探针具备较好的特异性，本发明ddPCR在血浆中的循环游离DNA(circulating free DNA,cfDNA)中检测肝癌预后标志物TP53 R249S的方法，可以检出稀释倍数最低为1:2000(0.05％)的突变样品，具备较高的灵敏度。

Description

一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组、试 剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组、试剂盒和方法。
背景技术
肝癌是世界上第七大常见恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们常说的肝癌指的多是原发性肝癌。肝癌恶性程度高，而且预后差，但是目前尚没有特别有效的生物标志物用于判断肝癌的预后。
TP53是一种重要的肿瘤抑制基因，TP53突变在50％以上的人类肿瘤中被发现，该基因的突变可能是人类肿瘤产生的主要发病因素之一。正常TP53基因产物是细胞生长的监控器，野生型TP53蛋白在正常细胞中含量极少而难以检测，而突变型TP53蛋白在癌细胞中可高达100倍，通常用免疫组化方法可检测。肿瘤抑制基因TP53在人类癌症中有着较为广泛的变异谱，包括等位基因的丢失、缺位突变、插入突变和点突变。TP53 R249S就是典型的点突变，TP53 R249S是基因TP53第249位密码子的第三个碱基由G突变成了T，即AGG变成了AGT，从而导致了一个氨基酸的突变：精氨酸(R)变成了丝氨酸(S)，而现有技术中对TP53R249S的检测方法还较为少见。
申请人武汉大学于2018年7月17日提出了发明专利申请CN201810292776.3，公开了一种临床检测HBV cccDNA的微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)方法及试剂盒，该发明方法包括如下步骤：提取待测样本DNA，使用cccDNA引物对和探针对PSAD酶消化后的DNA样本进行cccDNA定量，使用管家基因引物对和探针对未经PSAD酶消化的DNA样本进行管家基因定量标化肝细胞数目。该发明试剂盒包含用于扩增HBV cccDNA和管家基因的引物对和探针，阴性质控品和阳性质控品，ddPCR试剂和PSAD酶消化试剂。该发明检测全过程操作简单、省时，为临床患者的多种来源标本的cccDNA定量检测提供了一种新的高灵敏度方法和试剂盒。
申请人上海赛安生物医药科技有限公司于2016年10月17日提出了发明专利申请CN201610902482.9，公开了一种肝癌检测引物探针及其试剂盒，试剂盒包括用于配制数字PCR反应液的数字PCR预混液、液滴稳定剂和miRNAs引物探针混合液，以及用于进行RNA逆转录的茎环逆转录引物混合液；miRNAs引物探针混合液中包括用于检测hsa-mir-21、hsa-mir-122和hsa-miR-199a和hsa-miR-1228的上游引物和探针，以及用于检测hsa-mir-21、hsa-mir-122、hsa-miR-199a和hsa-miR-1228的通用下游引物；茎环逆转录引物混合液中包括分别用于逆转录hsa-mir-21、hsa-mir-122和hsa-miR-199a和hsa-miR-1228的茎环逆转录引物；hsa-mir-21、hsa-mir-122和hsa-miR-199a是标志物，hsa-miR-1228是内参。该发明的肝癌检测试剂盒可以快速、便捷、准确地检测作为肝癌早期诊断标志物的miRNA的表达水平。
申请人复旦大学于2016年9月30日提出了发明专利申请CN201610876947.8，公开了一种检测肺癌血浆游离目标DNA多位点低频突变的方法及其试剂盒。该发明提供了高灵敏度和高通量的用于一次性检测肺癌血浆游离DNA多位点突变的方法及试剂盒。该检测方法结合ddPCR及二代测序技术对肺癌ctDNA突变进行检测，包括步骤：1)数字PCR混合液制备，包括待测样品DNA模板、引物及PCR预混液；2)制作数字PCR微反应液滴，进行PCR扩增反应；3)PCR产物的回收与纯化；4)二轮PCR混合液制备及扩增；5)PCR产物纯化及文库质控；6)上机测序及数据分析；可一次性检测肺癌EGFR/BRAF/KRAS/PIK3A/MET2/ERBB2/AKT1/NRAS/TP53/PTEN共10个基因的热点突变信息，能显著节约样本，实现高灵敏、高通量的检测肺癌ctDNA突变信息。
以上发明专利申请均未提及使用ddPCR方法对肝癌预后标志物TP53 R249S进行检测。
因此，本发明要解决的技术问题是：如何利用ddPCR在循环游离DNA(circulatingfree DNA，cfDNA)中特异灵敏地检测TP53 R249S突变，从而有效预测肝癌手术病人和非手术病人的预后情况。
发明内容
本发明利用ddPCR在cfDNA中可以特异灵敏地检测TP53 R249S突变，从而有效预测肝癌手术病人和非手术病人的预后情况。
本发明的目的在于提供一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组；
本发明另一目的在于提供一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的试剂盒；
本发明再一目的在于提供一种检测肝癌预后标志物TP53 R249S的ddPCR检测方法，本发明根据网址为http://genome.uscs.edu/的UCSC Genome Browser Gateway数据库获得基因TP53的部分碱基序列(SEQ ID NO:1)，根据基因TP53的部分碱基序列开发出ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组、试剂盒和方法，从而有效预测肝癌手术病人和非手术病人的预后情况。
基因TP53的部分碱基序列
ACTATTGCACAGTTGAAAAAACTGAAGCTTACAGAGGCTAAGGGCCTCCCCTGCTTGGCTGGGCGCAGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGCAGGCGGATCACGAGGTTGGGAGATCGAGACCATCCTGGCTAACGGTGAAACCCCGTCTCTACTGAAAAATACAAAAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGCTGGGCACCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGAAGGAGAATGGCGTGAACCTGGGCGGTGGAGCTTGCAGTGAGCTGAGATCACGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGCGAGATTCCATCTCAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCTCCCCTGCTTGCCACAGGTCTCCCCAAGGCGCACTGGCCTCATCTTGGGCCTGTGTTATCTCCTAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAG[G/T]CCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGGTCAGGAGCCACTTGCCACCCTGCACACTGGCCTGCTGTGCCCCAGCCTCTGCTTGCCTCTGACCCCTGGGCCCACCTCTTACCGATTTCTTCCATACTACTACCCATCCACCTCTCATCACATCCCCGGCGGGGAATCTCCTTACTGCTCCCACTCAGTTTTCTTTTCTCTGGCTTTGGGACCTCTTAACCTGTGGCTTCTCCTCCACCTACCTGGAGCTGGAGCTTAGGCTCCAGAAAGGACAAGGGTGGTTGGGAGTAGATGGAGCCTGGTTTTTTAAATGGGACAGGTAGGACCTGATTTCCTTACTGCCTCTTGCTTCTCTTTTCCTATCCTGAGTAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAG(SEQ ID NO:1)
本发明的技术方案为：
一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组，所述引物探针组的核苷酸序列如下所示：
TP53-F GTACCACCATCCACTACAACTACATGT(SEQ ID NO:2)
TP53-R GGCTCCTGACCTGGAGTCTTC(SEQ ID NO:3)
TaqMan MGB(WT)FAM-ACCGGAGTCCCATC-MGB(SEQ ID NO:4)
TaqMan MGB(MT)VIC-ACCGGAGGCCCAT-MGB(SEQ ID NO:5)。
一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物探针组。
一种利用上述引物探针组检测肝癌预后标志物TP53 R249S的ddPCR检测方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)配置ddPCR反应体系；
(3)将步骤(2)中的ddPCR体系置于微滴生成仪中进行微滴生成；
(4)将步骤(3)中生成的微滴进行PCR扩增；
(5)将步骤(4)中的扩增产物进行微滴读数，判断是否为阳性微滴。
进一步地，所述提取待测样品DNA是指采用QIAamp Blood Mini Kit试剂盒从人血浆中提取cfDNA，提取的cfDNA于-80℃下保存。
进一步地，步骤(2)中所述ddPCR反应体系为：ddPCR Supermix for probes 10μL，终浓度为250nM的TP53野生型探针TaqMan MGB(WT)或者TP53 R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)0.8μL，终浓度为900nM的引物TP53-F 1μL，终浓度为900nM的引物TP53-R 1μL，DNA含量为8-12ng的DNA模板和灭菌双蒸水7.2μL。
更进一步地，步骤(2)中所述ddPCR反应体系包括8个体系，分别为突变型探针待测样品DNA模板体系、突变型探针阳性对照体系、突变型探针阴性对照体系、突变型探针无模板对照体系、野生型探针待测样品DNA模板体系、野生型探针阳性对照体系、野生型探针阴性对照体系、野生型探针无模板对照体系。
进一步地，所述微滴生成方法为：将ddPCR反应体系加入微滴发生卡中的孔中，然后在下方孔中加入70μL微滴生成油，放入微滴发生器中进行微滴制备，等待2min后取出微滴发生卡。
进一步地，所述PCR扩增的反应流程为：95℃变性10分钟；95℃变性30秒，58℃退火1分钟，循环40次；98℃延伸10分钟；最后保持在4℃。
进一步地，步骤(5)中的判断方法为：有荧光信号的微滴为阳性微滴，无荧光信号的微滴为阴性微滴。
本发明的有益效果如下：
1、本发明的突变型探针的特异性较好，突变型探针只和突变型模板发生特异性结合扩增出阳性信号，而不会与野生型模板发生非特异性结合而扩增出假阳性信号；
2、本发明ddPCR检测人血浆中的cfDNA中肝癌预后标志物TP53 R249S的方法可以检出稀释倍数最低为1:2000(0.05％)的突变样品，具备较高的灵敏度。
附图说明
附图1为实施例1～6中检测样本的TP53 R249S突变的结果图，其中A为TP53 R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)检测各样本的结果图，B为TP53野生型探针TaqMan MGB(WT)检测各样本的结果图，其中“NC”为阴性对照、“PC”为阳性对照、“Water”为无模板对照；
附图2为测试例1中ddPCR反应体系的最适退火温度检测结果图；
附图3为测试例2中TP53 R249S突变型探针扩增TP53纯野生型模板的检测结果图；
附图4为测试例3中ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的方法的灵敏度检测结果图，其中A～E分别为稀释比例1:20、1:100、1:500、1:1000、1:2000的TP53 R249S梯度稀释突变样品的检测结果图，F为灭菌双蒸水(即无模板对照)的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
以下实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。
实施例1
根据网址为http://genome.uscs.edu/的UCSC Genome Browser Gateway数据库获得基因TP53的部分碱基序列，通过在线引物设计工具Primer 3设计检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组的碱基序列，设计好的碱基序列由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成得到以下引物探针组：
Figure BDA0002568827550000051
利用上述引物探针组制备检测肝癌预后标志物TP53 R249S的试剂盒。
利用上述引物探针组检测受试者Sample 1血浆中cfDNA中的肝癌预后标志物TP53R249S的方法，包括以下步骤：
(1)采用QIAamp Blood Mini Kit试剂盒(购置于QIAGEN公司)按照以下方法从受试者Sample 1的血浆(400μL)中提取cfDNA，溶于30μL缓冲液中，并将其保存于-80℃冰箱待用；
a.吸取20μL蛋白酶K于一个新的1.5ml EP管中；
b.吸取200μL血浆样品加入上述EP管中；
c.吸取200μL Buffer AL至上述样品中，漩涡震荡15s混匀，56℃水浴10min；
d.离心机短暂快速离心，将1.5ml离心管盖及管壁上的液滴聚集至管底；
e.取与样品同体积的无水乙醇(约200μL)，漩涡震荡器震荡15s之后，使用离心机短暂快速离心；
f.将离心后的溶液移至试剂盒所提供的吸附柱内(吸附柱置于2ml的离心管中)，8000rpm离心1min后，弃去离心管及管中滤液，将吸附柱放入新的2ml的离心管中；
g.开启吸附柱管盖，加入500μL Buffer AW1，8000rpm离心1min,弃去离心管及滤液，将吸附柱放入一个新的2ml离心管中；
h.开启吸附柱管盖，加入500μL Buffer AW2，12000rpm离心3min,弃去滤液后放回离心机，12000rpm离心1min；
i.将吸附柱转移至一个新的1.5ml离心管中，加入65℃温浴过的灭菌双蒸水，室温孵育1min后，置离心机内，8000rpm离心1min后，弃去吸附柱，使用Nano Drop分光光度计测定所提取DNA的浓度及纯度，确定符合提取标准(A260/A280>1.8)。
(2)利用Bio-Rad公司的ddPCR系统(ddPCRTM system，Bio-Rad)进行ddPCR反应体系的配置和操作，其中ddPCR反应体系组成如下表1所示：
表1 ddPCR反应体系
反应液成分 体积
ddPCR Supermix for probes 10μl
TaqMan MGB 0.8μl
TP53-F 1μl
TP53-R 1μl
DNA模板/灭菌双蒸水 7.2μl
本实施例设置8个反应体系，即突变型探针待测样品DNA模板体系、突变型探针阳性对照体系、突变型探针阴性对照体系、突变型探针无模板对照体系、野生型探针待测样品DNA模板体系、野生型探针阳性对照体系、野生型探针阴性对照体系、野生型探针无模板对照体系；所述突变型探针待测样品DNA模板体系中探针TaqMan MGB为TP53 R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)，DNA模板为受试者Sample 1血浆中提取的cfDNA；所述突变型探针阳性对照体系中探针TaqMan MGB为TP53 R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)，DNA模板为含有1％TP53 R249S突变的TP53 R249S突变型模板；所述突变型探针阴性对照体系中探针TaqManMGB为TP53 R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)，DNA模板为TP53纯野生型模板；所述突变型探针无模板对照体系中探针TaqMan MGB为TP53 R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)，DNA模板由灭菌双蒸水代替；所述野生型探针待测样品DNA模板体系中探针TaqMan MGB为TP53野生型探针TaqMan MGB(WT)，DNA模板为受试者Sample 1血浆中提取的cfDNA；所述野生型探针阳性对照体系中探针TaqMan MGB为TP53野生型探针TaqMan MGB(WT)，DNA模板为含有1％TP53 R249S突变的TP53 R249S突变型模板；所述野生型探针阴性对照体系中探针TaqManMGB为TP53野生型探针TaqMan MGB(WT)，DNA模板为TP53纯野生型模板；所述野生型探针无模板对照体系中探针TaqMan MGB为TP53野生型探针TaqMan MGB(WT)，DNA模板由灭菌双蒸水代替。
其中，TP53 R249S纯突变型模板和TP53纯野生型模板制备方法如下：
HepG2和PLC/PRF/5是两种肝癌细胞系，在HepG2细胞基因组中基因TP53无突变，是TP53野生型；在PLC/PRF/5细胞基因组中基因TP53具有R249S突变，是纯合TP53 R249S突变型；所以，可以提取上述两种细胞系的基因组分别用来制作TP53 R249纯突变型模板和TP53纯野生型模板；
A.消化已培养72小时的HepG2细胞，得到细胞悬液(含细胞大约1×106个)，12000rpm离心8分钟；
B.使用200μLPBS悬浮细胞沉淀，加入20μL蛋白酶K；
C.取DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit,QIAGEN)中的200μL Buffer AL至处理过的细胞样中，漩涡震荡15s混匀，56℃水浴10min；
D.离心机短暂快速离心，将1.5mL离心管盖及管壁上的液滴聚集至管底；
E.取与样品同体积的无水乙醇(约200μL)，漩涡震荡器震荡15s之后，使用离心机短暂快速离心；
F.将离心后的溶液移至试剂盒所提供的吸附柱内(吸附柱置于2mL的离心管中)，8000rpm离心1min后，弃去离心管及管中滤液，将吸附柱放入新的2mL的离心管中；
G.开启吸附柱管盖，加入500μL Buffer AW1，8000rpm离心1min，弃去离心管及滤液，将吸附柱放入一个新的2ml离心管中；
H.开启吸附柱管盖，加入500μL Buffer AW2，12000rpm离心3min，弃去滤液后放回离心机，12000rpm离心1min；
I.将吸附柱转移至一个新的1.5mL离心管中，加入65℃温浴过的灭菌双蒸水，室温孵育1min后，置离心机内，8000rpm离心1min后，弃去吸附柱，使用Nano Drop分光光度计测定所提取DNA的浓度及纯度，确定符合提取标准(A260/A280>1.8)；
J.用灭菌双蒸水将上述提取的细胞基因组DNA稀释至浓度为10ng/μL，接着使用Nhe I内切酶对配置的模板进行酶切，模仿人体血浆碎片化的cf DNA,即为TP53纯野生型模板；
TP53 R249S纯突变型模板是从PLC/PRF/5细胞中进行细胞基因组提取，其制备方法与TP53纯野生型模板相同。
本实施例中含有1％TP53 R249S突变的TP53 R249S突变型模板是由TP53 R249S纯突变型模板和TP53纯野生型模板按照体积比1:99混合得到的。
(3)在微滴生成仪(QX100TM，Bio-Rad)中进行微滴生成，将上述8个反应体系加入微滴发生卡中的8个孔中，然后在下方孔中加入70μL微滴生成油，放入微滴发生器中进行微滴制备，等待约2min后取出微滴发生卡；
(4)将微滴发生卡取出后确认微滴生成成功(最上方可看到有悬浊液体生成)，将生成的微滴使用8联移液器缓慢吸取转移至96孔PCR板内，PCR板上覆盖封口金属膜，于PX1TMPCR板封口仪(Bio-Rad)上于180℃加热5秒进行密封，然后将PCR板转移至T100TM PCR仪(Bio-Rad)内进行PCR扩增，反应程序为：95℃变性10分钟；95℃变性30秒，58℃退火1分钟，循环40次；98℃延伸10分钟；最后保持在4℃；
(5)PCR扩增结束前，打开QuantaSoft软件(Bio-Rad)，进行样品设置，对每个样品进行命名，实验类型选择ABS(绝对定量)，试剂类型为Supermix for probes(no dUTP)；待PCR结束之后，将PCR板放置于微滴计数器(Droplet Reader，Bio-Rad)内，点击软件内的flush进行管道润洗，然后点击运行开始读数，有荧光信号的微滴为阳性微滴，无荧光信号的微滴为阴性微滴。
实施例2
实施例2的受试者为受试者Sample 2，其他与实施例1相同。
实施例3
实施例3的受试者为受试者Sample 3，其他与实施例1相同。
实施例4
实施例4的受试者为受试者Sample 4，其他与实施例1相同。
实施例5
实施例5的受试者为受试者Sample 5，其他与实施例1相同。
实施例6
实施例6的受试者为受试者Sample 6，其他与实施例1相同。
实施例1～6中检测TP53 R249S突变的结果图如附图1所示，其中A为TP53 R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)检测各样本的结果图，B为TP53野生型探针TaqMan MGB(WT)检测各样本的结果图，其中“NC”为阴性对照(纯野生型模板)、“PC”为阳性对照(含有1％TP53R249S突变的突变模板)、“Water”为无模板对照；A图中横线以上的小圆点为检测到的TP53R249S突变阳性信号，B图中横线以上的小圆点为检测到的TP53野生型阳性信号；由A图和B图可知，无论哪种探针，无模板对照(water)都检测不到信号，在用TP53野生型探针TaqManMGB(WT)时，都可以检测到信号，在此情况下用TP53 R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)时，阴性对照(NC)检测不到TP53 R249S突变，阳性对照(PC)可以检测到该突变，说明该探针的具有很强的特异性；另外，检测到受试者Sample 4、Sample 5和Sample 6样品有TP53 R249S突变。
测试例1
一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的方法，具体步骤按照实施例1进行操作，不同点在于：ddPCR体系中DNA模板为TP53 R249S纯突变型模板(制备方法见实施例1)，探针TaqMan MGB为TP53 R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)；在ddPCR反应过程中设置8种ddPCR反应流程，其退火温度分别为56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃和63℃，将上述体系分别按照8种退火温度进行PCR扩增，得到8组检测结果，分别为H05、G05、F05、E05、D05、C05、B05、A05，得到的ddPCR反应体系的最适退火温度检测结果图如附图2所示，可知该体系在58℃退火温度下的区分度及特异性均较好，同时对于较少量模板扩增效率也较好，故选择58℃作为PCR反应退火温度最优。
测试例2
一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的方法，具体步骤按照实施例1进行操作，不同点在于：ddPCR体系中DNA模板为TP53纯野生型模板，探针TaqMan MGB为TP53R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)；由于HepG2细胞基因组中基因TP53是野生型，所以本测试例以该细胞的细胞基因组DNA为野生型模板(制备方法见实施例1)。得到的TP53R249S突变型探针扩增TP53纯野生型模板的检测结果图如附图3所示，可知TP53纯野生型模板的突变型信号虽然基底信号较高，但是无明显离群信号，无假阳性信号出现，说明TP53R249S突变型探针的特异性较好，不会与TP53野生型模板发生非特异性结合从而扩增出假阳性信号。
测试例3
一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的方法，具体步骤按照实施例1进行操作，不同点在于：ddPCR反应体系中探针TaqMan MGB为TP53 R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)，DNA模板分别为稀释比例1:20、1:100、1:500、1:1000、1:2000的TP53 R249S梯度稀释突变样品，另外包含一个灭菌双蒸水的无模板对照体系，该TP53 R249S梯度稀释突变样品由PLC/PRF/5细胞经梯度稀释制备而成，稀释比例1:20、1:100、1:500、1:1000、1:2000的TP53 R249S梯度稀释突变样品分别由实施例1中的TP53 R249S纯突变型模板和TP53纯野生型模板按照体积比1:19、1:99、1:499、1:999、1:1999混合而成。得到的ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的方法的灵敏度检测结果图如附图4所示，其中A～E分别为稀释比例1:20、1:100、1:500、1:1000、1:2000的TP53 R249S梯度稀释突变样品的检测结果图，F为为灭菌双蒸水(即无模板对照)检测结果图；可知，在本发明中，ddPCR检测方法可以检出稀释倍数最低为1:2000(0.05％)的突变样品。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组、试剂盒和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
gtaccaccat ccactacaac tacatgt 27
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
ggctcctgac ctggagtctt c 21
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
accggagtcc catc 14
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
accggaggcc cat 13

Claims (9)

1.一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组的核苷酸序列如下所示：
TP53-F GTACCACCATCCACTACAACTACATGT(SEQ ID NO:2)
TP53-R GGCTCCTGACCTGGAGTCTTC(SEQ ID NO:3)
TaqMan MGB(WT)FAM-ACCGGAGTCCCATC-MGB(SEQ ID NO:4)
TaqMan MGB(MT)VIC-ACCGGAGGCCCAT-MGB(SEQ ID NO:5)。
2.一种ddPCR检测肝癌预后标志物TP53 R249S的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物探针组。
3.一种利用权利要求1所述的引物探针组检测肝癌预后标志物TP53 R249S的ddPCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)配置ddPCR反应体系；
(3)将步骤(2)中的ddPCR体系置于微滴生成仪中进行微滴生成；
(4)将步骤(3)中生成的微滴进行PCR扩增；
(5)将步骤(4)中的扩增产物进行微滴读数，判断是否为阳性微滴。
4.根据权利要求3所述的一种检测肝癌预后标志物TP53 R249S的ddPCR检测方法，其特征在于，所述提取待测样品DNA是指采用QIAamp Blood Mini Kit试剂盒从人血浆中提取循环游离DNA，提取的DNA于-80℃下保存。
5.根据权利要求3所述的一种检测肝癌预后标志物TP53 R249S的ddPCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述ddPCR反应体系为：ddPCR Supermix for probes 10μL，终浓度为250nM的TP53野生型探针TaqMan MGB(WT)或者TP53 R249S突变型探针TaqMan MGB(MT)0.8μL，终浓度为900nM的引物TP53-F 1μL，终浓度为900nM的引物TP53-R 1μL，DNA含量为8-12ng的DNA模板和灭菌双蒸水7.2μL。
6.根据权利要求5所述的一种检测肝癌预后标志物TP53 R249S的ddPCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述ddPCR反应体系包括8个体系，分别为突变型探针待测样品DNA模板体系、突变型探针阳性对照体系、突变型探针阴性对照体系、突变型探针无模板对照体系、野生型探针待测样品DNA模板体系、野生型探针阳性对照体系、野生型探针阴性对照体系、野生型探针无模板对照体系。
7.根据权利要求3所述的一种检测肝癌预后标志物TP53 R249S的ddPCR检测方法，其特征在于，所述微滴生成方法为：将ddPCR反应体系加入微滴发生卡中的孔中，然后在下方孔中加入70μL微滴生成油，放入微滴发生器中进行微滴制备，等待2min后取出微滴发生卡。
8.根据权利要求3所述的一种检测肝癌预后标志物TP53 R249S的ddPCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应流程为：95℃变性10分钟；95℃变性30秒，58℃退火1分钟，循环40次；98℃延伸10分钟；最后保持在4℃。
9.根据权利要求3所述的一种检测肝癌预后标志物TP53 R249S的ddPCR检测方法，其特征在于，步骤(5)中所述判断方法为：有荧光信号的微滴为阳性微滴，无荧光信号的微滴为阴性微滴。
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