CN108315432A

CN108315432A - ddPCR技术检测IDH1 R132C基因变异的引物、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN108315432A
Application number: CN201810421191.7A
Authority: CN
Inventors: 王昕昀
Original assignee: Good Gene Biotechnology (wuhan) Co Ltd
Current assignee: Good Gene Biotechnology (wuhan) Co Ltd
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2018-07-24

Abstract

本发明公开了一种ddPCR技术检测IDH1 R132C基因变异的引物、试剂盒及检测方法。以数字PCR为检测平台，针对IDH1 R132C突变基因，设计合成用于检测IDH1 R132C基因变异的上下游引物和检测探针、野生型检测探针，并将待测样品gDNA模板、检测IDH1 R132C基因变异的上下游引物和检测探针、野生型检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR微反应液滴进行PCR扩增反应，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有IDH1 R132C突变基因及其绝对数量和含量。本发明的引物和探针的设计特异性强，结合数字PCR技术对人IDH1 R132C基因变异进行绝对定量检测，灵敏度更高，可用于对AML临床治疗指导、患者预后改善。本发明的试剂盒结合ddPCR技术简单、方便地检测样本所携带IDH1 R132C变异基因DNA的绝对数量和比例，操作简单、灵敏度高。

Description

ddPCR技术检测IDH1 R132C基因变异的引物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及指导白血病治疗的生物技术领域中基因的分子生物学检测，尤其涉及一种ddPCR技术检测IDH1 R132C基因变异的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

急性髓系白血病(AML)是一组高度异质性的造血系统恶性肿瘤。造血组细胞的获得性遗传和表观遗传学的改变是急性髓系白血病(AML)的发病因素之一，这些变化改变了造血组细胞的生长、增值和分化的正常机制。AML发病时骨髓原始细胞隐藏着一种或一种以上的染色体变异，这些变异不仅是AML的诊断标志，更是评价完全缓解率(CR)、复发风险(RR)及总生存(OS)的指标。

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是一类在三羧酸循环中起重要作用的酶家族，不仅在能量代谢、氨基酸和维生素合成中扮演重要角色，而且对该酶的活性调节将直接影响IDH或IDH底物参与不同的生物途径、发挥不同的生物功能。在哺乳动物细胞中，IDH同工酶有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH1，依赖NADP的线粒体IDH2，依赖NADP的细胞质IDH3。编码依赖NADP的人异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)的基因位于染色体2q33.3，其转录mRNA长2339bp，含有10个外显子，编码由414个氨基酸残基组成的异柠檬酸脱氢酶1，主要定位于细胞浆和过氧化物酶体。现有研究表明，在AML患者中，IDH1基因突变的发生频率为6.6-9.6％；在核型正常的AML(Cytogeneticallynormal acute myeloid leukemia,CN-AML)中，IDH1基因突变的发生频率为10～16％。IDH1基因突变主要为外显子4上的点突变，其中最常见的突变是c.394C>T(R132C)，约占所有突变的34.5％。IDH1和/或IDH2基因突变的CN-AML患者具有较低的完全缓解率(CR)、较高的客观有效率(RR)和较短的总生存期(OS)，因此，IDH1基因突变一般代表较差的预后。

目前对于IDH1的检测主要采用直接测序和荧光定量PCR的方法，直接测序的方法步骤繁琐、成本高、灵敏性差。荧光定量PCR虽然具有重复性好，特异性强等优点，但由于其依赖于标准曲线和Ct值，定量的准确度不够，且灵敏度比较差，目前该方法的灵敏度最好的为1％，无法满足某些高灵敏度的检测需求。此外，这两种方法均为定性检测，无法测定携带基因变异的DNA的比例，也就是说难以定量检测，或定量分析误差较大。

发明内容

为了克服现有技术的上述不足，本发明提出一种ddPCR技术检测IDH1 R132C基因变异的引物、试剂盒及检测方法，本发明设计的引物和探针特异性强，并且以数字PCR为检测平台，判断待测样品中是否含有IDH1 R132C基因变异和发生突变的绝对含量及比例。该方法对于检测全血样本中IDH1 R132C基因变异灵敏度高。

为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明首先提供了一组用于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1 R132C突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ IDNO：4所示。

进一步地，所述IDH1 R132C突变基因检测探针序列的5’端设有一种荧光标记，3’端设有另一种荧光标记，野生基因检测探针序列的5’端设有一种荧光标记，3’端设有另一种荧光标记。

本发明还提供了一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的的方法，包含以下步骤：

1)提供一检测样本，所述的检测样本是全血样本；

2)对所述的检测样本进gDNA抽取处理，从而获得gDNA抽取物；

3)以步骤2)所得到的gDNA抽取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含IDH1 R132C变异基因和野生基因的扩增产物，其中ddPCR反应体系中含有用于检测人IDH1 R132C基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1 R132C突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ ID NO：4所示；

4)对所述扩增产物进行分析，从而得出样本中IDH1 R132C变异的绝对含量以及相对与总DNA的比例。

进一步地，ddPCR反应体系中gDNA模板的含量为0.3-2ng/μL。

进一步地，ddPCR反应体系中扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的上游引物的含量均为400-700nM，扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的下游引物的含量均为400-700nM。

进一步地，ddPCR反应体系中IDH1 R132C突变基因检测探针含量为200-400nM，野生基因检测探针含量为200-400nM。

进一步地，步骤3)中ddPCR反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。

更进一步地，步骤3)中ddPCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸60秒，共进行40个循环，10℃终止反应。

最后，本发明提供了一种用于绝对定量检测人IDH1 R132C基因变异的的试剂盒，所述试剂盒包括上述的用于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的引物对和探针。

进一步地，所述试剂盒还包括：ddPCR Supermix、ddH2O、阳性标准品和微滴生成油中的至少一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的用于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的引物对和探针具有特异性好、灵敏度高的特点，可应用于ddPCR平台对人IDH1 R132C基因变异进行绝对定量检测，以及用于对急性髓系白血病(AML)临床治疗指导、患者预后改善。

(2)本发明的检测方法具有较高的灵敏度(0.01％)(即可以从1万个正常DNA分子中检测到一个突变分子的存在)，因此可以检测到极低丰度的变异，即使在突变样本含量极低的情况下，定量分析的误差也很小。

(3)本发明提供的用于绝对定量检测人IDH1 R132C基因变异的的试剂盒可以结合ddPCR技术简单、方便地对样本所携带IDH1 R132C基因变异DNA的绝对数量和比例进行检测，操作简单，且具有特异性好、灵敏度高的特点。

附图说明

图1为实施例2中野生型IDH1 R132C基因的DNA样本的荧光检测结果；

图2为实施例2中突变体与野生型含量比为1/100的样本的荧光检测结果；

图3为实施例2中突变体与野生型含量比为1/1000的样本的荧光检测结果；

图4为实施例2中突变体与野生型含量比为1/10000的样本的荧光检测结果。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。

ddPCR的原理是通过无限稀释形成油包水的微滴，从而将PCR反应分配至20000个纳米级别的微滴中进行。PCR反应结束后，通过微滴分析仪检测每个微滴的荧光信号，含有荧光信号的微滴判为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算得出靶分子的起始拷贝数。与传统的定量PCR相比，ddPCR不需要建立标准曲线就能实现靶分子的绝对定量检测，而且具有特异性强、灵敏度高(最低可检测单拷贝的靶分子)、定量准确等优点。

一方面，本发明提供了一组用于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ IDNO：1所示，扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1 R132C突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ IDNO：4所示。其中IDH1 R132C突变基因检测探针序列和野生基因检测探针序列的5’端均设有一种荧光标记，3’端均设有另一种荧光标记。

另一方面，本发明还提供了一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的的方法，包含以下步骤：

1)提供一检测样本，所述的检测样本是全血样本；

2)对所述的检测样本进gDNA抽取处理，从而获得gDNA抽取物，参考QIAGEN公司的QIAamp DNAMini Kit试剂盒说明书抽提gDNA；

3)以步骤2)所得到的gDNA抽取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含IDH1 R132C变异基因和野生基因的扩增产物，其中ddPCR反应体系中含有用于检测人IDH1 R132C基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1 R132C突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ ID NO：4所示；ddPCR反应体系中扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的上游引物的含量均为400-700nM，优选为500nM，扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的下游引物的含量均为400-700nM，优选为500nM；ddPCR反应体系中IDH1R132C突变基因检测探针含量为200-400nM，优选为250nM，野生基因检测探针含量为200-400nM，优选为250nM。

ddPCR反应体系中gDNA模板的含量为0.3-2ng/L，优选为1ng/μL。

ddPCR反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。ddPCR反应条件优选为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸60秒，共进行40个循环，10℃终止反应。

4)对所述PCR扩增产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有突变基因模板，用QuantaSoft(Biorad)软件进行数据分析，从而得出样本中IDH1 R132C变异的绝对含量以及相对与总cfDNA的比例。

另一方面，本发明提供了一种用于绝对定量检测人IDH1 R132C基因变异的的试剂盒，其包括上述的用于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的引物对和探针。在一些实施例中，该试剂盒还包括：ddPCR Supermix、ddH2O、阳性标准品和微滴生成油中的至少一种。试剂盒可以结合ddPCR技术简单、方便地对样本所携带IDH1 R132C基因变异DNA的绝对数量和比例进行检测，操作简单，且具有特异性好、灵敏度高的特点。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1：

本实施例针对人IDH1 R132C基因设计了适用于ddPCR技术平台上定量检测R132C基因变异的引物对和探针。

扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的上、下游引物：

上游引物SEQ NO1：5’-GCCAACATGACTTACTTGATCC-3’

下游引物SEQ NO2：5’-AAATATCCCCCGGCTTGTGA-3‘

IDH1 R132C突变基因检测探针：

SEQ NO3：5’-FAM-AAGCATGAAGACCTATGATG-MGB-3’

野生型检测探针：

SEQ NO3：5’-HEX-AAGCATGACGACCTATGATG-MGB-3’

本发明提供的用于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的引物对和探针具有特异性好、灵敏度高的特点，可应用于ddPCR平台对人IDH1 R132C基因变异进行绝对定量检测，以及用于对急性髓系白血病(AML)临床治疗指导、患者预后改善。

实施例2：全血样本中IDH1 R132C基因变异检测

1.准备待测样品：含有野生型人IDH1 R132C基因的DNA、人IDH1 R132C突变基因的DNA、以及野生型突变DNA混合样本(其中突变体与野生型的含量比分别为1/100、1/1000、1/10000)。DNA来源于血浆中，其中，人IDH1 R132C突变基因的DNA模板来源于IDH1 R132C基因变异细胞系(经PCR测序鉴定)。

2.gDNA的提取：采用试剂盒提取gDNA，具体操作参考QIAGEN公司的QIAampDNAMini Kit试剂盒说明书。

3.配置PCR预混液

20μL的PCR预混液包括：2×数字PCR预混液(Biorad，#1863010)10μL，扩增IDH1R132C突变基因和扩增野生基因的上游引物500nM，扩增IDH1R132C突变基因和扩增野生基因的下游引物500nM，IDH1 R132C突变基因检测探针250nM，野生型基因检测探针250nM，待测样品的gDNA模板1ng/μL，用蒸馏水补足至终体积为20μL，配制成数字PCR混合液。但需要说明的是，在其他的实施例中，各引物的浓度可以是400、450、550、600、700nM中的任意一种，只要在400-700nM的范围内即可；各探针的浓度可以是200、300、350、400nM中的任意一种，只要在200-400nM的范围内即可；待测样品的gDNA模板浓度可以是0.3、0.5、1.5、2ng/μL中的任意一种，只要在0.3-2ng/μL的范围内即可。

4.将装有配制好的20μL数字PCR混合液的PCR板、新的96孔PCR板、枪头、微滴发生卡和微滴生成油装入AutoDG自动化微滴发生器，用于制备PCR微反应微滴。

5.将装有PCR微反应液滴的96孔PCR板用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。

6.将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。

7.PCR扩增反应后将PCR反应板放置于PCR微反应液滴信号读取仪(QX200微滴荧光信号收集系统)中进行信号收集，检测FAM和HEX的荧光信号。用QuantaSoft(Biorad)软件进行数据分析结果如图1、图2、图3和图4所示。同时进行定量分析，得出样本中IDH1 R132C突变DNA的绝对含量以及相对总DNA的比例。

例如，待测样本中含有X个突变型基因目标分子，Y个野生型基因目标分子。经过反应及检测后，结果采用这样的方式进行分析。

则突变型基因检测数目为X＝B，野生型基因检测数目为Y＝C，其突变频率为X/(X+Y)＝B/(B+C)。

根据上述的方法对不同突变型与野生型的含量进行样品检测，突变阳性信号(FAM)与总信号数(FAM和HEX)如下：

1/100样品：计算值突变/野生＝1/100，误差为零；

1/1000样品：计算值突变/野生＝1/1000，误差为零；

1/10000样品：计算值突变/野生＝0.998/10000，误差0.2％。

由此可知，突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/100-1/1000时，定量检测误差为零，突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/100-1/10000时，定量检测误差为0.2％，因此可以从gDNA中检测到极低丰度的变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用。

基于上述的检测方法，本实施例中的引物、探针可用于制备试剂盒，该试剂盒用于绝对定量人全血样本中IDH1 R132C基因变异。试剂盒20μL反应体系包括以下组分：

其中2×ddPCR SuperMix 10.0μL，扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生型基因的上下游引物各1.0μL、IDH1 R132C突变基因和野生型基因检测探针各1.0μL，cfDNA模板4.0μL，其中扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生型基因的上下游引物各500nM，IDH1突变基因和野生型基因检测探针各250nM，gDNA模板1ng/μL。

序列表

<110> 良培基因生物科技（武汉）有限公司

<120> ddPCR技术检测IDH1 R132C基因变异的引物、试剂盒及检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccaacatga cttacttgat cc 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaatatcccc cggcttgtga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcatgaag acctatgatg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcatgacg acctatgatg 20

Claims

1.一组用于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述引物对中扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1R132C突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ ID NO：4所示。

2.根据权利要求1所述的一组用于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的引物对和探针，其特征在于，所述IDH1 R132C突变基因检测探针序列的5’端设有一种荧光标记，3’端设有另一种荧光标记，野生基因检测探针序列的5’端设有一种荧光标记，3’端设有另一种荧光标记。

3.一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)提供一检测样本，所述的检测样本是全血样本；

2)对所述的检测样本进行gDNA抽取处理，从而获得gDNA抽取物；

3)以步骤2)所得到的gDNA抽取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含IDH1 R132C变异基因和野生基因的扩增产物，其中ddPCR反应体系中含有用于检测人IDH1R132C基因变异的引物对和探针，所述引物对中扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，IDH1 R132C突变基因检测探针序列如SEQ ID NO：3所示，野生基因检测探针序列如SEQ ID NO：4所示；

4.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的的方法，其特征在于，ddPCR反应体系中gDNA模板的含量为0.3-2ng/μL。

5.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的的方法，其特征在于，ddPCR反应体系中扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的上游引物的含量均为400-700nM，扩增IDH1 R132C突变基因和扩增野生基因的下游引物的含量均为400-700nM。

6.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的的方法，其特征在于，ddPCR反应体系中IDH1 R132C突变基因检测探针含量为200-400nM，野生基因检测探针含量为200-400nM。

7.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的的方法，步骤3)中ddPCR反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟，93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。

8.根据权利要求7所述的一种基于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的的方法，步骤3)中ddPCR反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火/延伸60秒，共进行40个循环，10℃终止反应。

9.一种用于绝对定量检测人IDH1 R132C基因变异的的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于ddPCR技术检测人IDH1 R132C基因变异的引物对和探针。

10.根据权利要求9所述的一种用绝对定量检测人IDH1 R132C基因变异的的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：ddPCR Supermix、ddH2O、阳性标准品和微滴生成油中的至少一种。