CN105316418B - 用于检测肉制品中鸭源性成分的特异性引物、探针、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组用于检测肉制品中鸭源性成分的特异性引物和探针；所述引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了一种定量检测肉制品中鸭源性成分含量的方法和检测试剂盒。本发明的检测方法及检测试剂盒具有检测准确，灵敏度高，特异性强，简便快速等优点。
Description
技术领域
本发明涉及食品检验和生物学检测技术领域，具体涉及一种用于定量检测肉制品中鸭源性成分的特异性引物、探针、试剂盒及其检测方法。
背景技术
近年来，我国肉制品市场中肉类掺假问题日益严重，在经济利益的驱使下，一些不法分子为牟取暴利而掺杂使假，将相对廉价的鸭肉、猪肉等深加工后冒充牛羊肉进行销售；其中，相对于猪肉，鸭肉的纹理色泽和牛羊肉最为接近，因此，市售牛羊肉及其制品中，很多都掺杂鸭肉冒充牛羊肉进行销售，为弥补羊肉味不足，有的甚至掺入羊肉粉，羊肉精膏等添加剂来粉饰其掺假行为。肉制品掺假的行为，严重侵害了消费者的权益，因此，对食品监管部门而言，建立一种快速、简便、有效的检测肉制品中鸭源性成分的方法非常必要。
随着现代生物学的发展，食品中肉类成分的鉴别与分析已逐步形成了分别以蛋白质和核酸检测为基础的方法体系，其中以PCR技术为基础的种属检测技术最为突出。但是普通PCR的扩增效率低，qPCR需建立标准曲线及容易出现假阳性等因素，使得其定量体系需进一步完善。微滴式数字PCR方法(Droplet digital PCR，ddPCR)是近年来发展起来的快速、准确、可实现DNA绝对定量的PCR方法。其原理是通过微滴发生器把PCR反应体系生成约20000个微滴，PCR扩增后通过微滴分析仪读取阳性微滴数目，再根据泊松分布计算出样本中的DNA拷贝数。ddPCR与qPCR方法相比，灵敏度高，无需核酸标准品，就可对起始样品进行绝对定量，可以用于物种鉴定、致病菌、转基因及肉源性成分检测等。因此，研究和建立肉制品中鸭源性成分的ddPCR检测方法对肉制品中鸭源性的快速、准确的定性和定量检测具有重大意义。
β-actin基因是构成细胞骨架的主要成分——肌动蛋白的一种单拷贝基因，具有基因序列高度保守、能在不同组织细胞中稳定表达、mRNA表达数量高且稳定的特点。本申请根据鸭的β-actin基因，设计一种特异性的引物、探针，建立一种定量检测肉制品中鸭源性成分含量的方法，并组装成试剂盒，为相关部门定量分析检测肉制品中鸭源性成分提供有力的科学依据。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于检测肉制品中鸭源性成分的特异性引物和探针；本发明的另一目的是提供一种定量检测肉制品中鸭源性成分含量的方法；本发明的再一目的是提供一种检测肉制品中鸭源性成分的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种检测肉制品中鸭源性成分的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3’(SEQ ID NO.1)，
下游引物：5’-GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明还提供了一种与上述引物配合使用的探针，所述探针的核苷酸序列为：5’-H-TCCTGGTGTTAGGTTGTAAACGCTTG-Q-3’(SEQ ID NO.3)，其中，H为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团为HEX，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
本发明所述的引物和探针是通过核酸比对软件DNAMAN对GenBank中公布的多种动物的β-actin单拷贝基因进行序列比对，筛选出鸭β-actin基因特异序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，根据筛选得到的特异序列利用Primer5.0设计特异性引物和探针。所有的引物和探针均由上海辉睿生物科技有限公司合成。
本发明还提供了一种定量检测肉制品中鸭源性成分含量的方法，具体包括以下步骤：
(1)建立鸭肉样品质量和基因拷贝数之间的线性关系式：
a.鸭肉样品质量与鸭肉样品DNA浓度之间线性关系式的确定：称取至少5个(优选为5-10个)不同质量梯度的预处理后的鸭肉样品，分别对每一个鸭肉样品进行基因组DNA的提取，并运用核酸定量分析仪测定每个鸭肉样品基因组DNA提取物中的DNA浓度，得到与每一个质量梯度鸭肉样品相对应的鸭肉样品DNA浓度；然后根据检测到的鸭肉样品DNA浓度和与之相对应的鸭肉样品的质量，制作关于鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的标准工作曲线，得到鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的线性关系式：C＝k1M+b1，其中，M代表鸭肉样品肉质量；C代表鸭肉样品DNA浓度；
b.鸭肉样品DNA浓度与基因拷贝数之间线性关系式的确定：对步骤a中得到的已知鸭肉样品DNA浓度的鸭肉样品基因组DNA提取物进行梯度稀释，稀释成系列浓度梯度的DNA样品，然后分别以每一个稀释浓度的DNA样品作为模板，进行微滴数字PCR扩增反应；微滴数字PCR反应结束后，采用微滴分析仪进行分析，记录每一个微滴数字PCR反应体系中的基因拷贝数，然后根据基因拷贝数和与之相对应的模板DNA含量，制作关于模板DNA含量-基因拷贝数的标准工作曲线，得到模板DNA含量-基因拷贝数的线性关系式：Y＝k2M1+b2，其中，M1代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA含量；Y代表微滴数字PCR反应后所测得的基因拷贝数；
其中，在每一个微滴数字PCR反应体系中，模板DNA含量与鸭肉样品DNA浓度、反应体系中模板DNA的加入体积之间的线性关系式为：M1＝CV/N，其中，C代表鸭肉样品DNA浓度；V代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA的加入体积；N代表鸭肉样品基因组DNA提取物的稀释倍数；M1代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA的含量；
将M1＝CV/N代入模板DNA含量-基因拷贝数的线性关系式Y＝k2M1+b2中，即得到鸭肉样品DNA浓度-基因拷贝数的线性关系式，即为Y＝k2CV/N+b2；
c.鸭肉样品质量与基因拷贝数之间关系式的确定：根据步骤a建立的鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的线性关系式C＝k1M+b1和步骤b建立的鸭肉样品DNA浓度-基因拷贝数的线性关系式Y＝k2CV/N+b2，选择以鸭肉样品DNA浓度C作为中间换算变量，计算鸭肉样品质量与基因拷贝数之间的关系，得到鸭肉样品质量-基因拷贝数的关系式，即为M＝(NY-N b2-k2b1V)/k1k2V；
(2)待检测肉制品中鸭源性成分含量的测定：
取已知质量的预处理后的待检测肉制品，提取待检测肉制品的基因组DNA，并运用核酸定量分析仪测定其基因组DNA提取物中的DNA浓度，然后将待检测肉制品基因组DNA提取物稀释N倍，稀释后的待检测肉制品基因组DNA提取物中的DNA浓度小于100ng/μL；以稀释后的待检测肉制品基因组DNA作为模板进行微滴数字PCR反应，微滴数字PCR反应结束后，采用微滴分析仪测定微滴数字PCR反应体系中的基因拷贝数；然后将基因拷贝数代入步骤(1)得到的鸭肉样品质量-基因拷贝数的关系式M＝(NY-N b2-k2b1V)/k1k2V中，计算待检测肉制品中的鸭肉质量；然后根据计算出的鸭肉质量，计算鸭肉质量与待检测肉制品质量的比值，即得到待检测肉制品中鸭源性成分的百分含量；
其中，步骤(1)和步骤(2)中所述微滴数字PCR扩增反应体系优选为20μL反应体系，其具体配置见表1；其中，反应体系中所述上游引物的核苷酸序列为：5’-TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3’；所述下游引物的核苷酸序列为：5’-GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3’；所述探针的核苷酸序列为：5’-HEX-TCCTGGTGTTAGGTTGTAAACGCTTG–BHQ1-3’。
表1微滴数字PCR的反应体系
| 试剂 | 体积 | 终浓度 |
| ddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP) | 10μL | |
| 上游引物 | 1.8μL | 900nmol/L |
| 下游引物 | 1.8μL | 900nmol/L |
| 探针 | 0.5μL | 250nmol/L |
| DNA模板 | 4μL | ﹤400ng |
| ddH2O | 1.9μL | |
| 总共 | 20μL |
根据上述方法，优选地，所述微滴数字PCR的反应程序为：(1)微滴生成：通过微滴发生器进行微滴化处理，生成约20000个微滴；(2)PCR扩增：95℃预变性10min，1个循环；94℃变性30s，60℃退火1min，98℃延伸10min，40个循环。
根据上述方法，步骤a所述的鸭肉样品和步骤(2)中所述的待检测肉制品的预处理过程相同，均为：将鸭肉或肉制品切成约1cm2-2cm2大小的肉丁，用蒸馏水洗净，在10℃水中浸泡过夜，以除去多余的盐分和油脂，用组织匀浆机绞碎后于烘箱中80℃-85℃烘干72h，然后将烘干后的肉加入粉碎机中进行粉碎、匀质处理，得到预处理后的鸭肉样品或待检测肉制品。
本发明还提供了一种检测肉制品中鸭源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物和与该特异性引物配合使用的探针，其中，所述特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3’(SEQ ID NO.1)，
下游引物：5’-GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3’(SEQ ID NO.2)；
所述探针的核苷酸序列为：
5’-H-TCCTGGTGTTAGGTTGTAAACGCTTG-Q-3’(SEQ ID NO.3)，其中，H为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团；其中，优选地，所述荧光报告基团为HEX，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
优选地，本发明提供的试剂盒还包括：ddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)、阳性对照、阴性对照和鸭肉标准品，所述阳性对照为鸭肉基因组DNA，所述阴性对照为双蒸水；其中，所述鸭肉标准品的制备方法为：取新鲜纯鸭肉，将鸭肉切成约1cm2-2cm2大小的肉丁，用蒸馏水洗净，在10℃水中浸泡过夜，以除去多余的盐分和油脂，用组织匀浆机绞碎后于烘箱中80℃-85℃烘干72h，然后将烘干后的肉加入粉碎机中进行粉碎、匀质处理，即得到鸭肉标准品；所述ddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)从BIO-RAD公司购买得到。
本发明中，优选地，所述试剂盒的工作反应体系见表1；所述试剂盒的工作程序为：(1)微滴生成：通过微滴发生器进行为微滴化处理，生成约20000个微滴；(2)PCR扩增：95℃预变性10min，1个循环；94℃变性30s，60℃退火1min，98℃延伸10min，40个循环。
本发明所述的试剂盒在检测肉制品中鸭源性成分中的应用。
本发明的积极有益效果：
(1)本发明提供了用于检测肉制品中鸭源性成分的微滴数字PCR特异性引物和与该引物配合使用的探针，该引物具有很高的检测灵敏度，对鸭源性成分的检测下限为10pg/μL，远远低于现有检测技术的检测限；而且检测特异性强，重复性好，因此，可以实现对肉及肉制品中鸭源性成分精确的物种鉴定。
(2)本发明定量检测肉制品中鸭源性成分含量的方法操作简单，准确性高，检测速度快，可以实现对肉及肉制品中鸭源性成分的定量检测，极大地提高了工作效率；而且，与定性检测方法相比，可以有效区分所检出的肉源成分是故意掺假或无意沾染，从而能够用于检测其他检测技术很难区分的样品。
(3)本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针、阴性对照、阳性对照和鸭肉标准品，利用该试剂盒能够准确定量被检肉制品中鸭源性成分，操作简单，大大缩短了检测周期，而且，该试剂盒有助于对肉制品的生产与销售中掺杂鸭肉冒充牛羊肉销售的行为进行监测，适合推广应用，为监管部门提供强有力的科学依据。
附图说明
图1为利用本发明特异性引物和探针检测肉制品中鸭源性成分的微滴数字PCR方法的特异性结果分析图：其中，duck为阳性对照(鸭肉DNA提取物为模板)的拷贝数；1为猪肉基因组DNA提取物为模板的拷贝数；2为羊肉基因组DNA为模板的拷贝数；3为牛肉基因组DNA为模板的拷贝数；4为鸡肉基因组DNA为模板的拷贝数；5为鹅肉基因组DNA为模板的拷贝数；6为小麦基因组DNA为模板的拷贝数；7为玉米基因组DNA为模板的拷贝数，8为水稻基因组DNA为模板的拷贝数；9为阴性对照(以双蒸水为模板)的拷贝数。
图2为利用本发明特异性引物和探针检测肉制品中鸭源性成分的微滴数字PCR方法的灵敏度结果分析图：其中，duck-1为DNA提取物(DNA浓度为100ng/μL)作为模板的拷贝数；duck-2为10-1稀释液作为模板的拷贝数；duck-3为10-2稀释液作为模板的拷贝数；duck-4为10-3稀释液作为模板的拷贝数；duck-5为10-4稀释液作为模板的拷贝数；duck-6为10-5稀释液作为模板的拷贝数；duck-N为空白对照。
图3为鸭肉样品质量与鸭肉样品DNA浓度的关系图。
图4为模板DNA含量与基因拷贝数的关系图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
除非特别说明，本发明采用的除引物、探针之外的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明使用的样品、试剂和试剂盒均为市购。
主要仪器设备：Bio-Rad QX200ddPCR微滴生成仪美国BIO-RAD公司；HermLe Z36HK高速冷冻离心机HERMLE；DT500电子天平江苏常熟长青仪器厂；BioSpec-nano微量核酸蛋白仪岛津企业管理(中国)有限公司；NTS-4000AM恒温振荡水槽Tokyo Tikakikai；SensoQuest LabCycler梯度PCR仪德国Senso公司。
主要试剂：蛋白酶K(20mg/mL)购自日本TAKARA公司；Tris-饱和酚购自索莱宝生物科技有限公司；组织裂解液(1mol/L Tris-HCL、0.5mol/L EDTA、10％SDS)、3mol/L醋酸钠、氯仿/异戊醇(24:1)均为自配试剂；ddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)购自BIO-RAD公司。
实施例1：引物和探针的设计与合成
通过核酸比对软件DNAMAN对GenBank中公布的多个物种的β-actin单拷贝基因共17个序列进行序列比对，其中包括5个鸭源β-actin单拷贝基因(GenBank中的登录号分别为EF667345.1、NM_001310421.1、GU564232.1、AY251275.1、DQ675572.1)，1个鹅源β-actin单拷贝基因(GenBank中的登录号为M26111.1)，3个鸡源β-actin单拷贝基因(GenBank中的登录号分别为L08165.1、NM_205518.1、JF436880.1)，2个牛源β-actin单拷贝基因(GenBank中的登录号分别为AY141970.1、BT030480.1)，3个羊源β-actin单拷贝基因(GenBank中的登录号分别为NM_001009784.1、U39357.1、AF035422.1)，3个猪源β-actin单拷贝基因(GenBank中的登录号分别为DQ452569.1、DQ845171.1、U07786.1)，筛选出鸭β-actin单拷贝基因的特异序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，并利用Primer5.0软件设计用于检测肉制品中鸭源性成分的特异性引物和与该引物配合使用的探针。
所述特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’-TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3’，
下游引物：5’-GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3’。
所述探针的核苷酸序列为：5’-HEX-TCCTGGTGTTAGGTTGTAAACGCTTG–BHQ1-3’。
所述特异性引物和探针均由上海辉睿生物科技有限公司合成。
实施例2：样品DNA的提取
(1)样品预处理：将肉或肉制品切成约1cm2-2cm2大小的肉丁，用蒸馏水洗净，在10℃水中浸泡过夜，以除去多余的盐分和油脂，用组织匀浆机将肉丁绞碎并搅拌均匀，然后置于烘箱中80℃-85℃烘干72h，然后将烘干后的肉加入粉碎机中进行粉碎、匀质处理，得到预处理后的肉样。
(2)DNA的提取：采用苯酚/氯仿法提取样品的基因组DNA，具体步骤如下：
取50mg经过步骤(1)处理后的肉样，向其中加入700μL组织裂解液和20μL蛋白酶K(20mg/mL)，涡旋振荡混匀，56℃水浴2h，加入等量Tris平衡酚，上下颠倒混匀，10000rpm离心10min；取上清，加入1/2体积的Tris平衡酚和1/2体积的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀，10000rpm离心10min；然后取上清，将上清转移至一干净的EP管中，加入等量氯仿：异戊醇(24:1)，10000rpm离心10min；取上清，加入等体积的氯仿，10000rpm离心10min；取上清约400μL，加入2.5倍体积的无水乙醇及1/10体积的3M的醋酸钠，混匀，-20℃沉淀2h后4℃12000rpm离心30min；弃上清，加入1mL 75％的乙醇，4℃12000rpm离心10min；弃上清，自然干燥后加入1×TE100μL溶解DNA，然后采用核酸定量测定仪测定提取肉样的DNA含量。
实施例3：利用本发明特异性引物和探针检测肉制品中鸭源性成分的微滴数字PCR方法的建立
(1)微滴数字PCR扩增反应体系的优化：经过引物、探针和模板浓度的优化，最终确定本发明微滴数字PCR扩增反应体系为20μL，其具体配置见表1。
(2)微滴数字PCR扩增反应的反应程序为：反应程序中优化了退火温度，其中，退火温度从55℃～63℃，共设置9个梯度进行优化，每个梯度相差1℃；经过优化，最终定本发明微滴数字PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；94℃变性30s，60℃退火1min，98℃延伸10min，40个循环。
微滴数字PCR的具体操作步骤如下：按照表1配制20μL微滴数字PCR反应体系，然后将20μL反应体系转移至DG8cartridge(购自BIO-RAD公司)中间的8个孔中，不足8孔样品用20μL 1×buffer control补足；于Bio-Rad QX200ddPCR微滴生成仪中生成10000-20000个微滴；用PCR仪(购自SENSO公司)进行扩增反应，反应程序为95℃10min；94℃30s，60℃1min，98℃10min，40个循环；最后，用QX200Droplet Reader(购自BIO-RAD公司)进行微滴检测。
实施例4：利用本发明特异性引物和探针检测肉制品中鸭源性成分的微滴数字PCR方法特性评价
(1)检测肉制品中鸭源性成分的微滴数字PCR方法的特异性检验
取预处理后(样品的预处理过程同实施例2)的猪肉、鸭肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉以及小麦、玉米、水稻样品(本实验所用样品均为各物种的纯样品)，分别对这些样品进行基因组DNA提取(基因组DNA的提取方法同实施例2)，其中，基因组DNA的提取方法同实施例2；然后分别以猪肉、鸭肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉以及小麦、玉米、水稻的基因组DNA提取物稀释10倍后的样品为模板，利用本发明的特异性引物和探针进行微滴数字PCR扩增反应，同时设置阴性对照(以双蒸水为模板)；其中，微滴数字PCR的反应体系配制、反应程序和操作过程同实施例3。微滴数字PCR反应后，用微滴分析仪测定每一个微滴数字PCR反应体系的基因拷贝数。
结果如附图1所示，以鸭肉阳性对照为模板时拷贝数为4340copies/μL，当以其他物种的DNA为模板时拷贝数均为0，说明本发明的特异性引物和探针对鸭的DNA能够特异性扩增，可以用于区分鸭肉和其他物种的肉制品。
(2)检测肉制品中鸭源性成分的微滴数字PCR方法的敏感性检验
取预处理后的纯鸭肉样品(预处理过程同实施例2)，对其进行基因组DNA的提取(基因组DNA的提取方法同实施例2)，用核酸定量分析仪检测并调整其基因组DNA提取物中的DNA浓度为100ng/μL，对该DNA提取物(DNA浓度为100ng/μL)进行10倍梯度稀释，共设置10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个稀释梯度，然后分别以DNA提取物(DNA浓度为100ng/μL)、10-1稀释液、10-2稀释液、10-3稀释液、10-4稀释液和10-5稀释液作为模板，利用本发明的特异性引物和探针进行微滴数字PCR检测，同时设置阴性对照；其中，微滴数字PCR的反应体系配制、反应程序和操作过程同实施例3。微滴数字PCR反应后，用微滴分析仪测定每一个微滴数字PCR反应体系的基因拷贝数。
结果如附图2所示，以10-4稀释液作为模板(模板含量10pg/μL)时仍然有PCR扩增，而以10-5稀释液作为模板时没有出现扩增，说明鸭源数字PCR检测的敏感度为10pg/μL，由此可知，本发明的特异性引物和探针具有良好的敏感性。
实施例5：定量检测肉制品中鸭源性成分含量的方法的建立
1、建立鸭肉样品质量和基因拷贝数之间的线性关系式：
(1)鸭肉样品质量与鸭肉样品DNA浓度之间线性关系式的确定：
分别称取10个不同质量梯度的预处理后(预处理方法同实施例2)的纯鸭肉样品(鸭肉样品的质量依次为5mg，10mg，15mg，20mg，25mg，30mg，35mg，40mg，45mg和50mg)，分别对每一个质量梯度的鸭肉样品进行基因组DNA的提取(基因组DNA的提取方法同实施例2)，并运用核酸定量分析仪测定每个鸭肉样品基因组DNA提取物中的DNA浓度；其中，每个质量梯度的鸭肉样品重复3次；然后根据检测得到的鸭肉样品DNA浓度和与之相对应的鸭肉样品的质量，制作关于鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的标准工作曲线，由标准工作曲线得到鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的线性关系式，相关系数R2的计算用Excel自动生成；
通过3次重复测定，结果如附图3所示，由图3可知，鸭肉样品DNA浓度随着鸭肉样品质量的增加而增加，两者呈现明显的线性关系。由此可以表明，鸭肉样品质量在5mg-50mg范围内时，鸭肉样品质量与鸭肉样品DNA浓度有明显的线性关系，由标准工作曲线可得到鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的线性关系式为C＝17.601M+3.6513，其中，M代表鸭肉样品肉质量，单位为mg；C代表所测得鸭肉样品DNA浓度，单位为ng/μL。
(2)鸭肉样品DNA浓度与基因拷贝数之间线性关系式的确定：
将步骤(1)中提取得到的鸭肉样品基因组DNA提取物(DNA浓度为500ng/μL)进行适当倍数的梯度稀释，稀释成8个不同浓度梯度的DNA样品(8个DNA样品的浓度依次为：12.5ng/μL，25ng/μL，37.5ng/μL，50ng/μL，62.5ng/μL，75ng/μL，87.5ng/μL和100ng/μL)，然后分别以上述8个浓度梯度的DNA样品作为模板，利用本发明的鸭特异性引物和探针进行微滴数字PCR扩增反应(微滴数字PCR的反应体系、反应程序和操作步骤同实施例3)。
微滴数字PCR反应结束后，采用微滴分析仪测定每一个微滴数字PCR反应体系中的基因拷贝数，然后根据基因拷贝数和与之相对应的微滴数字PCR反应体系中的模板DNA含量，制作关于模板DNA含量-基因拷贝数的标准工作曲线，得到模板DNA含量-基因拷贝数的线性关系式。结果见附图4，由附图4可知，微滴数字PCR反应体系中模板DNA含量在50ng-400ng范围内，模板DNA含量与基因拷贝数之间呈明显的线性关系，由标准工作曲线可得到模板DNA含量与基因拷贝数的线性关系式为Y＝11.554M1-38.256，其中，M1代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA的含量，单位为ng；Y代表微滴数字PCR反应后所测得的基因拷贝数，单位为copies/μL。
其中，在每一个微滴数字PCR反应体系中，模板DNA含量与鸭肉样品基因组DNA提取物中的DNA浓度(即鸭肉样品DNA浓度)、反应体系中模板DNA的加入体积之间的线性关系式为：M1＝CV/N，其中，C代表鸭肉样品基因组DNA提取物中的DNA浓度(即鸭肉样品DNA浓度)，单位为ng/μL；V代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA的加入体积，单位为μL；N代表鸭肉样品基因组DNA提取物的稀释倍数；M1代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA的含量，单位为ng。
将M1＝CV/N代入模板DNA含量-基因拷贝数的线性关系式Y＝11.554M1-38.256中，即得到鸭肉样品DNA浓度-基因拷贝数的线性关系式，即为Y＝11.554CV/N-38.256。
(3)鸭肉样品质量与基因拷贝数之间关系式的确定：
根据步骤(1)建立的鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的线性关系式C＝17.601M+3.6513和步骤(2)建立的鸭肉样品DNA浓度-基因拷贝数的线性关系式Y＝11.554CV/N-38.256，选择以鸭肉样品DNA浓度C作为中间换算变量，计算鸭肉样品质量与基因拷贝数之间的关系，得到鸭肉样品质量-基因拷贝数的关系式，即为M＝(NY+38.256N-42.187V)/203.362V。
2、待检测肉制品中鸭源性成分含量的测定：
取已知质量的预处理(预处理过程同实施例2)后的待检测肉制品，提取待检测肉制品的基因组DNA(基因组DNA的提取方法同实施例2)，并运用核酸定量分析仪测定其基因组DNA提取物中的DNA浓度，然后将待检测肉制品的基因组DNA提取物稀释N倍，保证稀释后的基因组DNA提取物中的DNA浓度小于100ng/μL。以稀释后的基因组DNA作为模板，利用本发明的鸭特异性引物和探针进行微滴数字PCR反应(微滴数字PCR的反应体系配制、反应程序和操作过程同实施例3)，微滴数字PCR反应结束后，采用微滴分析仪测定微滴数字PCR反应体系中的基因拷贝数；然后将基因拷贝数代入步骤(3)得到的鸭肉样品质量-基因拷贝数关系式M＝(NY+38.256N-42.187V)/203.362V中，计算待检测肉制品中的鸭肉质量；然后根据计算出的鸭肉质量，计算鸭肉质量与待检测肉制品质量的比值，即得到待检测肉制品中鸭源性成分的百分含量。
实施例6：模拟混合肉样中鸭源性成分含量的检测
为了验证本发明定量检测肉制品中鸭源性成分含量方法的准确性，利用本发明实施例5建立的定量检测肉制品中鸭源性成分含量方法，分别对已知鸭源性成分含量的模拟混合肉样进行检测分析，该模拟混合肉样是将经过预处理(预处理过程同实施例2)后的已知质量的鸭肉样品与经过同样预处理的已知质量的其它肉类样品混合得到的。
具体实验操作如下：每一种模拟混合肉样各取50mg，按照实施例2所述的方法提取其基因组DNA；然后分别将每一种模拟混合肉样的基因组DNA提取物稀释10倍后进行微滴数字PCR反应(微滴数字PCR的反应体系配制、反应程序和操作过程同实施例3)。微滴数字PCR反应结束后，采用微滴分析仪测定每一个微滴数字PCR反应体系中的基因拷贝数；然后将基因拷贝数代入实施例5得到的鸭肉样品质量-基因拷贝数的关系M＝(NY+38.256N-42.187V)/203.362V(由微滴数字PCR反应体系可知V＝4μL，N＝10)中，计算每一种模拟混合肉样中的鸭源性成分质量；然后根据计算出的鸭源性成分质量，计算鸭源性成分质量与模拟混合肉样质量的比值，即得到待检测肉制品中鸭源性成分的百分含量。
每一种模拟混合肉样重复测定三次，其检测结果如表2所示，由表2可知，每一种模拟混合肉样中鸭源性成分含量的测量平均值与真实值基本一致，由此说明，本发明定量检测肉制品中鸭源性成分含量的方法准确性高，可以实现对肉及肉制品中鸭源性成分的定量检测；而且，该方法不受模拟混合肉样中其它外源肉样的干扰，因此，表明该方法可以应用于不同肉制品中鸭源成分的定量检测。
表2模拟混合肉样中鸭源性成分含量的检测结果
实施例7：市售的肉制品样品中鸭源性成分含量的定量检测
市售样品复杂多样，含有多种成分，而DNA的提取过程往往会受到多种因素如组织成分、样品处理方式等的影响，导致测得的肉制品的质量不能反应真实值。因此，为检测本发明建立的定量检测牛、羊肉制品中鸭源性成分含量方法的市场应用能力，采用实施例5所述的方法对收集的51份市售的牛、羊肉制品进行了检测，每种肉制品重复检测三次；其中，肉制品DNA的提取方法同实施例2，微滴数字PCR的反应体系、反应程序和操作过程同实施例3。检测结果见表3所示，由表3可知，在抽检的51份牛、羊肉制品中，有10份牛、羊肉制品掺有鸭肉，掺有鸭肉的样品(掺假样品)所占的比例为19.61％，而且掺假样品中鸭肉的最大含量达到了89.23％；由此可以说明本发明建立的定量检测肉制品中鸭源性成分含量的方法具有潜在的市场应用价值。
表3市售牛、羊肉制品中鸭源成分的定量鉴定
Claims (5)
1.一种定量检测肉制品中鸭源性成分含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)建立鸭肉样品质量和基因拷贝数之间的线性关系式：
a.鸭肉样品质量与鸭肉样品DNA浓度之间线性关系式的确定：称取至少5个不同质量梯度的预处理后的鸭肉样品，分别对每一个鸭肉样品进行基因组DNA的提取，并运用核酸定量分析仪测定每个鸭肉样品基因组DNA提取物中的DNA浓度，得到与每一个质量梯度鸭肉样品相对应的鸭肉样品DNA浓度；然后根据检测到的鸭肉样品DNA浓度和与之相对应的鸭肉样品的质量，制作关于鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的标准工作曲线，得到鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的线性关系式：C＝k1M+b1，其中，M代表鸭肉样品肉质量；C代表鸭肉样品DNA浓度；
b.鸭肉样品DNA浓度与基因拷贝数之间线性关系式的确定：对步骤a中得到的已知鸭肉样品DNA浓度的鸭肉样品基因组DNA提取物进行梯度稀释，稀释成系列浓度梯度的DNA样品，然后分别以每一个稀释浓度的DNA样品作为模板，进行微滴数字PCR扩增反应；微滴数字PCR反应结束后，采用微滴分析仪进行分析，记录每一个微滴数字PCR反应体系中的基因拷贝数，然后根据基因拷贝数和与之相对应的模板DNA含量，制作关于模板DNA含量-基因拷贝数的标准工作曲线，得到模板DNA含量-基因拷贝数的线性关系式：Y＝k2M1+b2，其中，M1代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA含量；Y代表微滴数字PCR反应后所测得的基因拷贝数；
其中，在每一个微滴数字PCR反应体系中，模板DNA含量与鸭肉样品DNA浓度、反应体系中模板DNA的加入体积之间的线性关系式为：M1＝CV/N，其中，C代表鸭肉样品DNA浓度；V代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA的加入体积；N代表鸭肉样品基因组DNA提取物的稀释倍数；M1代表微滴数字PCR反应体系中模板DNA的含量；
将M1＝CV/N代入模板DNA含量-基因拷贝数的线性关系式Y＝k2M1+b2中，即得到鸭肉样品DNA浓度-基因拷贝数的线性关系式，即为Y＝k2CV/N+b2；
c.鸭肉样品质量与基因拷贝数之间关系式的确定：根据步骤a建立的鸭肉样品质量-鸭肉样品DNA浓度的线性关系式C＝k1M+b1和步骤b建立的鸭肉样品DNA浓度-基因拷贝数的线性关系式Y＝k2CV/N+b2，选择以鸭肉样品DNA浓度C作为中间换算变量，计算鸭肉样品质量与基因拷贝数之间的关系，得到鸭肉样品质量-基因拷贝数的关系式，即为M＝(NY-N b2-k2b1V)/k1k2V；
(2)待检测肉制品中鸭源性成分含量的测定：
取已知质量的预处理后的待检测肉制品，提取待检测肉制品的基因组DNA，并运用核酸定量分析仪测定其基因组DNA提取物中的DNA浓度，然后将待检测肉制品基因组DNA提取物稀释N倍，稀释后的待检测肉制品基因组DNA提取物中的DNA浓度小于100ng/μL；以稀释后的待检测肉制品基因组DNA作为模板进行微滴数字PCR反应，微滴数字PCR反应结束后，采用微滴分析仪测定微滴数字PCR反应体系中的基因拷贝数；然后将基因拷贝数代入步骤(1)得到的鸭肉样品质量-基因拷贝数的关系式M＝(NY-N b2-k2b1V)/k1k2V中，计算待检测肉制品中的鸭肉质量；然后根据计算出的鸭肉质量，计算鸭肉质量与待检测肉制品质量的比值，即得到待检测肉制品中鸭源性成分的百分含量；
其中，步骤(1)和步骤(2)中所述微滴数字PCR的反应体系为20μL，20μL反应体系包含：
所述上游引物的核苷酸序列为：5’-TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3’；
所述下游引物的核苷酸序列为：5’-GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3’；
所述探针的核苷酸序列为：5’-HEX-TCCTGGTGTTAGGTTGTAAACGCTTG-BHQ1-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微滴数字PCR的反应程序为：
(1)微滴生成：通过微滴发生器进行微滴化处理，生成微滴；
(2)PCR扩增：95℃预变性10min，1个循环；94℃变性30s，60℃退火1min，98℃延伸10min，40个循环。
3.一种包含权利要求1中所述上游引物、下游引物和所述探针的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：ddPCRTM Supermixfor Probes No dUTP、阳性对照、阴性对照和鸭肉标准品，所述阳性对照为鸭肉基因组DNA，所述阴性对照为双蒸水。
5.权利要求3或4所述的试剂盒在检测肉制品中鸭源性成分中的应用。
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