CN104232742A - 一种荧光实时pcr法检测食品中鸭源性成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种荧光实时PCR法检测食品中鸭源性成分的方法。本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及食品中鸭源性成分的方法；尤其涉及一种荧光实时PCR法检测食品中鸭源性成分的方法。本发明旨在鉴别食品中是否含有鸭源性成分。本发明根据鸭线粒体细胞色素b(cytb)基因设计鸭源特异引物和探针体系，对食品中鸭源性成分进行检测，操作简便快速，结果准确可靠，进一步完善食品肉种来源鉴别体系，维护消费者权益。

Description

一种荧光实时PCR法检测食品中鸭源性成分的方法
技术领域：
本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及食品中鸭源性成分的方法；尤其涉及一种荧光实时PCR法检测食品中鸭源性成分的方法。
背景技术：
随着人民生活水平的提高、食品质量安全监管部门检测技术的不断完善和更新，食品掺假的手段也在不断提高。不法商贩、企业为获得非法利润，常以较低价的鸡肉、猪肉或鸭肉冒充牛、羊肉，再在掺假的肉类中加入各种香精基料，使消费者不能从感官上加以鉴别。由于替代成分通常与被替代成分在生化、理化、感官性质上及其相似，加之食物本身的复杂性和可变性，使得常规检测方法如电泳、免疫学技术、色谱技术、传统PCR等多有不足，如灵敏度低、周期长、费时费力。
实时荧光PCR技术以DNA为模板，设计特异引物探针，在封闭的体系中进行扩增和实时检测，无需电泳就可以对结果进行分析，避免了传统PCR产物的污染和EB带来的危害，缩短检测时间，且扩增目的片段较短，尤其适用加工食品。该发明旨在利用实时荧光PCR技术建立食品中鸭源成分检测方法，为质检部门打击不法商贩、维护消费者合法利益提供有力的科学依据。
发明内容：
本发明旨在鉴别食品中是否含有鸭源性成分。
技术解决方案：
基于Genbank上已公布的鸭线粒体细胞色素Cyt b基因设计鸭特异性的引物探针体系(鸭源性上游引物F：5′-GCAACTGCCTTCGTAGGTTATGTC-3′；鸭特异性下游引物R：5′-GGAGGGCTGAAAATAAGTTGGTAA-3′；鸭特异性探针序列P：5′(FAM)-ATGAGGACAAATATCGTTCTGAGGAGCTACCGTA-3′(TRAMA))，以提取的肉(制)品中动物组织DNA为PCR扩增模板，进行鸭特异性扩增探针引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，最终对样品中目标DNA进行判定，达到对样品中所含成分进行鉴别判断。主要步骤包括：
1)样品中DNA的提取；
2)以提取到的DNA为模板，用权利要求1所述引物探针体系进行实时荧光PCR反应，反应体系的体积为25μL：Taqman PCR master mix12.5μL；上下游引物、荧光标记探针各1μL；模板DNA1μL；其余不足用灭菌双蒸水补齐；
3)在样品检测的同时，设置空白对照(以水代替DNA模板)、阴性对照(以非目标肉DNA为模板)、阳性对照(以纯鲜鸭肉DNA为模板)；
4)反应循环参数：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环，于实时荧光PCR仪上进行。阈值设置时保证阈值不小于阴性对照的最高荧光值，使阴性对照Ct值大于35；
5)质量控制对照结果：
空白对照：无荧光信号检出；
阴性对照：无荧光信号检出(Ct值大于35)；
阳性对照：有荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值＜28。
6)结果判定：
Ct值小于35，且空白、阴性及阳性对照结果正常者判为检出鸭源性成分；
Ct值大于35，且空白、阴性及阳性对照结果正常者判为未检出鸭源性成分；空白、阴性及阳性对照结果结果异常时重做实验；
本发明的有益效果：
本发明设计了鸭源性成分检测的特异性引物、探针体系，规定了具体检测和结果判定方法，可定性检测食品中的鸭源性成分，进一步完善食品肉种来源鉴别体系，维护消费者权益。
附图说明
图1是鸭源性引物探针体系特异性检测实时荧光PCR扩增曲线
图2是鸭源引物探针体系灵敏度检测实时荧光PCR扩增曲线
具体实施方式
1、所用引物、探针体系
鸭源性上游引物F：5′-GCAACTGCCTTCGTAGGTTATGTC-3′；
鸭特异性下游引物R：5′-GGAGGGCTGAAAATAAGTTGGTAA-3′；
鸭特异性探针序列P：
5′(FAM)-ATGAGGACAAATATCGTTCTGAGGAGCTACCGTA-3′(TRAMA)
2、基因组模板制备采用一次性的组织研磨棒等实验器具对样品进行均质处理，保证样品的均匀性以及避免样品间的相互污染，按照组织基因组DNA提取试剂盒说明书步骤进行，最终提取D260/OD280比值均在1.5～2.0之间的动物组织DNA。
3、实时荧光PCR反应体系反应体系的体积为25μL：Taqman PCR master mix12.5μL；上下游引物、荧光标记探针各1μL；模板DNA1μL；其余不足用灭菌双蒸水补齐。
4、实时荧光PCR反应循环参数反应循环参数：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环，于实时荧光PCR仪上进行。阈值设置时保证阈值不小于阴性对照的最高荧光值，使阴性对照Ct值大于35。
5、特异性试验以鸡、牛、羊、猪及鸭等纯肉提取的DNA，控制浓度在50ng/μL左右，进行实时荧光PCR反应，以验证所设计引物、探针的特异性。鸭特异性引物和探针体系应对鸭源以外成分无扩增。
6、灵敏度试验取纯鸭肉提取DNA，用灭菌双蒸水进行稀释，浓度25～0.0016ng/μL，取1μL为模板，进行实时荧光PCR，检测所设计鸭特异性引物探针体系的灵敏度。
7、质量控制对照结果：
空白对照：无荧光信号检出；
阴性对照：无荧光信号检出(Ct值大于35)；
阳性对照：有荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值＜28。
8、结果判定：
Ct值小于35，且空白、阴性及阳性对照结果正常者判为检出鸭源性成分；
Ct值大于35，且空白、阴性及阳性对照结果正常者判为未检出鸭源性成分；空白、阴性及阳性对照结果结果异常时重做实验；
9、检测结果
所设计鸭的引物探针体系只针对鸭源模板进行扩增，且重复性良好，对其他动物源性成分：猪、牛、羊、鸡等肉类均不能扩增出正常曲线，正常扩增Ct值限定为35循环内，证实该检测体系具有较好的特异性。
鸭DNA模板浓度依次为25、5、1、0.2、0.04、0.008及0.0016ng/μL，其Ct值分别为：18.78、21.57、24.17、26.94、29.74、33.02、37.34。其中浓度0.008ng/μL的模板获得正常的扩增曲线，Ct值＜35，说明该引物探针体系可检测到0.008ng的鸭源DNA。
本发明的一种荧光实时PCR法检测食品中鸭源性成分的方法具有良好的灵敏度以及特异性。

Claims (2)

1.一种鸭源特异性的实时荧光PCR引物、探针体系。鸭源性上游引物F：5′-GCAACTGCCTTCGTAGGTTATGTC-3′；鸭特异性下游引物R：5′-GGAGGGCTGAAAATAAGTTGGTAA-3′；鸭特异性探针序列P：5′(FAM)-ATGAGGACAAATATCGTTCTGAGGAGCTACCGTA-3′(TRAMA)。 
2.一种用权利要求1所述的鸭源特异性的实时荧光PCR引物、探针体系进行食品中鸭源性成分的检测。主要步骤包括： 
1)样品中DNA的提取； 
2)以提取到的DNA为模板，用权利要求1所述引物探针体系进行实时荧光PCR反应，反应体系的体积为25μL：Taqman PCR master mix12.5μL；上下游引物、荧光标记探针各1μL；模板DNA1μL；其余不足用灭菌双蒸水补齐； 
3)在样品检测的同时，设置空白对照(以水代替DNA模板)、阴性对照(以非目标肉DNA为模板)、阳性对照(以纯鲜鸭肉DNA为模板)； 
4)反应循环参数：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环，于实时荧光PCR仪上进行。阈值设置时保证阈值不小于阴性对照的最高荧光值，使阴性对照Ct值大于35； 
5)质量控制对照结果： 
空白对照：无荧光信号检出； 
阴性对照：无荧光信号检出(Ct值大于35)； 
阳性对照：有荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值＜28。 
6)结果判定： 
Ct值小于35，且空白、阴性及阳性对照结果正常者判为检出鸭源性成分； 
Ct值大于35，且空白、阴性及阳性对照结果正常者判为未检出鸭源性成分；空白、阴性及阳性对照结果结果异常时重做实验。 
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