CN103981267A - 一种microRNA在猪肌内脂肪检测中的应用 - Google Patents

一种microRNA在猪肌内脂肪检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于本发明属于家畜分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种与猪肌内脂肪相关miRNA标志物及其特异引物的应用，所述的miRNA标志物基因是基于猪的microRNA-133a3p基因，利用该基因作为内参基因通过实时荧光定量PCR方法检测microRNA在猪肌内脂肪中的表达量的差异，结果显示本发明克隆制备的Ssc-miR133a3p基因的标志物的表达量高，稳定性强，重复性优于U6和18S rRNA基因的引物。

Description

一种microRNA在猪肌内脂肪检测中的应用
技术领域
本发明属于家畜分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种与猪肌内脂肪相关miRNA标志物及其特异引物的应用，所述的miRNA标志物基因是基于猪的microRNA-133a3p基因，利用该基因作为内参基因通过实时荧光定量PCR方法检测microRNA在猪肌内脂肪中的表达量。
背景技术
随着人们生活质量的提高，消费者对猪肉的品质要求也相应的提高，比如猪肉的口感，多汁和嫩度。而肌内脂肪(Intramuscular fat，简称IMF)即大理石纹对猪肉的品质有着至关重要的作用(谭林和姜海龙，2010)。IMF主要分布在肌束和肌纤维之间，其从肌纤维间融化出来而使肉质鲜嫩多汁。研究表明，IMF与肉质优劣呈正相关，但IMF沉积的具体机制还不是很清楚。
IMF含量是由脂肪细胞的生长发育决定的，脂肪细胞的增殖和肥大可以促进IMF的沉积。有研究发现，涉及到脂滴代谢和脂肪形成的microRNA对脂肪细胞的形成有重要的作用(Xie et al.,2009)。microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为18-25个核苷酸的非编码单链RNA分子。有研究表明miRNA可以调节脂肪代谢和骨骼肌的分化(Krutzfeldt andStoffel,2006)。为了揭示miRNA在猪的IMF形成过程中的作用，我们检测了236头纯种大白猪的背最长肌IMF含量，从中选取高低各3个个体，选取与肌内脂肪高度相关的几个miRNA，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行表达量的检测。
qRT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点。然而在分析数据过程中，RNA样品之间，反转录效率，以及人为因素等都会对目的基因表达结果产生影响，因此需要选择合适的内参基因进行校正和标准化，减少样本之间的差异(袁伟等，2012)。使用不理想的内参基因会对数据分析造成偏差。内参基因常常是看家基因，动物中常用的内参基因包括18S核糖体RNA(18S rRNA)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)，U6，ATCB等，选择正确的内参基因很大程度上取决于所研究的组织、细胞及实验目的等。
目前还没有一种理想的内参基因可以完全用于任何实验条件，且表达恒定不变，申请人根据实验目的和样品类型的不同，应当选择合适而稳定的内参基因进行校正和标准化，以期得到可靠的实验结果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种与猪肌内脂肪相关microRNA标志物及其特异引物的应用，该microRNA标志物在肌肉中特异性表达，且表达量高，我们将其命名为ssc-miR-133a3p基因，本发明通过筛选得到一种与猪肌内脂肪性状相关的microRNA实时荧光定量(qPCR)内参基因，通过与动物常用内参基因U6和18S rRNA或其组合，提供双内参基因片段，通过双内标方法进行猪的肌内脂肪性状的检测。
在本发明中，申请人选择以U6为内参基因，研究microRNA的表达情况。结果发现U6在猪肌内脂肪中的表达稳定性较差，扩增效率不均一，同一批处理样品，U6的Ct值会有2-3个的差异，而ssc-miR-133a3p在相应组织样中的表达稳定性均优于传统内参基因U6，其主要特点是扩增效率高，适合用于本发明的需要。
更详细的技术方案如下所述：
申请人从NCBI数据库中克隆得到猪的U6，18S rRNA和ssc-miR-133a3p基因的核苷酸序列，NCBI数据库中miR-133a3p基因被著录的用途定义为与脂肪的沉积相关。
一种与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物在猪肌内脂肪相关检测中的应用，该标志物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：9所示。
一种与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，这些特异引物是如下所示的引物对和茎环引物，它们的核苷酸序列如下所示：
U6基因的引物：
正向引物：TCGCTTCGGCAGCACATATAC，
反向引物：CGAATTTGCGTGTCATCCTTGC；
18S rRNA基因的引物：
正向引物：CGACCATAAACGATGCCGACT，
反向引物：GTGCCCTTCCGTCAATTCCT；
ssc-miR133a3p基因的引物：
茎环引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG，
正向引物：CGCGGATTGGTCCCCTTC，
通用引物：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA。
与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，上述U6基因的引物、18S rRNA基因的引物以及ssc-miR133a3p基因的引物可以单独或组合使用作为检测猪肌内脂肪含量的标准化的内参标志物，其中：所述的U6基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，所述18S rRNA基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所述，ssc-miR133a3p基因的引物如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所述，这些引物单独或组合使用可以作为检测肌内脂肪含量的标准化的内参标志物。
申请人建立了一种与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，其核心在于采用双内标的法构建反转录反应体系，该反转录反应体系包括如下所述：
核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的microRNAs标志物和如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物，反转录反应体系如下所示：
总RNA/mRNA 20ng-5μg/5-500ng；
Anchored Oligo(dT)18引物(0.5μg/μl)，1μl；
随机引物(0.1μg/μl)，1μl；或GSP特异性引物，2pmol(0.5μl)；
2×反转录反应Mix，10μl，TransScript○R RT/RI Enzyme Mix反转录酶，1μl；
去基因组DNA酶，1μl；
RNase-无RNA酶水，补充至20μl。
如上述体系所述应用，其中microRNA使用的是茎环引物方法扩增，以Ssc-miR-133a3p作为标志物，其扩增引物DNA序列如下：
茎环引物：
5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG3'，长度为50bp，
正向引物：5'CGCGGATTGGTCCCCTTC3'，长度为18bp，
通用引物：5'CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA3'；长度20bp，
PCR扩增所得产物长度为为71bp
具体地，本发明通过以下技术方案实现：
提取猪背最长肌的RNA，进行反转录；根据NCBI和miRBase数据库中公布的猪的U6，18S rRNA(基因登录号：GI:374532828)，ssc-miR-133a3p(登录号：MIMAT0010186)基因的序列信息，设计PCR特异引物。用该引物对进行PCR扩增，分别得到长度为84bp、141bp和71bp的扩增片段(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示)，与此同时对U6，18S rRNA和ssc-miR133a3p基因进行实时荧光定量PCR反应，多次重复后发现miR-133a3p片段在猪肌内脂肪中的表达量明显比基因U6和18S rRNA的表达量要稳定，反转录效率较高，为研究猪的肉质性状特别是与猪肌内脂肪相关检测提供了适宜的内参基因，或者可以与U6基因作为双内标基因对猪的肌内脂肪性状进行相关的研究、分析和检测。
更详细的技术方案如《具体实施方法》所述。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是报道的猪U6基因全序列的核苷酸序列，序列长度为107bp。
序列表SEQ ID NO：2是本发明扩增U6基因的正向引物的序列(21bp)。
序列表SEQ ID NO：3是本发明扩增U6基因的反向引物的序列(22bp)。
序列表SEQ ID NO：4是本发明扩增18S rRNA基因的正向引物的序列(21bp)。
序列表SEQ ID NO：5是本发明扩增18S rRNA的基因反向引物的序列(20bp)。
序列表SEQ ID NO：6是本发明扩增ssc-miR133a3p基因的茎环引物的序列(50bp)。
序列表SEQ ID NO：7是本发明扩增ssc-miR133a3p基因的正向引物的序列(18bp)。
序列表SEQ ID NO：8是本发明扩增ssc-miR133a3p的基因的通用引物序列(20bp)。
序列表SEQ ID NO：9是本发明克隆得到的猪的ssc-miR-133a3p基因的成熟子序列(即，本发明的分子标记)(21bp)。
图1：是本发明的总体技术路线图。
图2：是大白猪高低肌内脂肪组织反转录后U6，18S rRNA和ssc-miR133a3p基因的cDNA检测。图中标记说明：M泳道为DNA分子量标记(DL500，宝生物工程大连有限公司)。
图3：大白猪高低肌内脂肪个体RNA凝胶电泳结果。其中肌内脂肪含量高的个体为：H153，H193，H309，肌内脂肪含量低的个体为L13，L18，L311。
图4：对大白猪高低IMF含量个体中各候选基因的表达情况的检测(仅对各个基因表达的Ct值进行了统计分析)。
图5：利用在线软件综合分析各个候选内参基因的表达稳定性。
图6：利用在线软件通过△Ct方法分析各个候选内参基因的表达稳定性。
图7：利用在线软件Bestkeeper方法分析各个候选内参基因的表达稳定性。
图8：利用在线软件Normfinder方法分析各个候选内参基因的表达稳定性。
图9：利用在线软件Genorm方法分析个各候选内参基因的表达稳定性。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式及发明效果进行说明，但不是对本发明的限制。
实施例1
一、构建猪的家系及猪肌内脂肪测定
用于分析的实验猪群为纯种大白猪(为常规品种，华中农业大学动物遗传育种与繁殖分子生物学实验室与辉瑞制药有限公司合作组建的FCR项目试验群体，按照常规方法，该群体由华中农业大学实验猪场喂养，共计236头，大白猪为来自国外血缘猪的常用品种)，体重达到80-100kg时进行屠宰，样品收集分21个批次进行，屠宰后测定性状包括关联分析所用的体长数据，其包括：胴体长(简称CL)、胴体斜长(简称CDL)、肋骨数(简称RN)、肌内脂肪(简称IMF)等。
对236头纯种大白猪的背最长肌进行肌内脂肪测定，检测不同个体的肌内脂肪含量，并进行相关的分析。
二、个体的选择
根据本发明所需要的样品要求，对肌内脂肪数据进行标准化后，选取高低肌内脂肪含量的纯种大白猪个体各3头作为分析样本，选取个体的肌内脂肪含量进行测定，数据统计见表1所述。
表1纯种大白猪高低肌内脂肪含量的个体信息
注：表1中的性状值通过索氏提取法(soxhlet extraction)测定的IMF含量。
实施例2
猪U6，18S rRNA，mir133a3p基因在不同肌内脂肪含量个体中的表达差异检测
一、选择个体，提取猪基因组RNA。
样品为纯种大白猪(来源同上)，体重均为90Kg左右。
从上述实施例1的群体中选取肌内脂肪高低各三个个体，提取背最长肌的总RNA(总RNA制备方法为常规方法，具体步骤如下所述)。测量每个个体的背最长肌肌内脂肪含量，统计结果见表1。
总RNA提取采用Invitrogen公司生产的Reagent试剂盒提取(按试剂盒的说明书操作)，具体步骤如下：
(1)从-80℃冰箱中取出保存的纯种大白猪背最长肌组织样品，立即进行液氮研磨，研成粉末；
(2)称取100mg研磨后的组织样，加入到1.5ml无RNA酶的EP管中，用1ml Trizol试剂对其进行裂解，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；
(3)在室温15-30℃下放置5min，最后放在冰上，若不进行后续提取RNA实验，可将样品置于-80℃冰箱保存；
(4)加入0.2ml氯仿，盖上EP管盖子，剧烈震荡15s，在室温下(15-30℃)放置2-3分钟后，于12000g，2-8℃下离心15min；
(5)小心拿出EP管，取上层水相0.4ml置于新的EP管中，加入等体积的(用量为0.4ml)异丙醇，在室温下(15-30℃)放置10min，于12000g，2-8℃下离心15min，以沉淀总RNA；
(6)弃上清，加入预冷的75％乙醇1ml进行洗涤，弹起沉淀，于7500g，2-8℃下离心5min；
(7)弃上清，让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
(8)用Rnase-free water溶解RNA沉淀；
(9)将提取后的RNA，用NanoDrop2000仪器对其浓度和质量进行检测后，再用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果(见表2和图2)，置于-80℃下保存备用。
表2利用NanoDrop2000仪器检测RNA的质量信息
根据NCBI数据库和miRbase数据库中的猪的U6，18S rRNA和miR-133a3p基因的序列信息，设计相应的定量PCR引物，检测其在不同个体的背最长肌组织中的表达量。
相关信息如下：
U6基因的定量引物的DNA序列如下：
正向引物：5'TCGCTTCGGCAGCACATATAC3'，
反向引物：5'CGAATTTGCGTGTCATCCTTGC3'；
18S rRNA基因的定量引物的DNA序列：
正向引物：5'CGACCATAAACGATGCCGACT3'，
反向引物：5'GTGCCCTTCCGTCAATTCCT3'；
miR-133a3p基因的茎环引物和定量引物的的DNA序列：
茎环引物的DNA序列：
5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG3'；
正向引物：5'CGCGGATTGGTCCCCTTC3'，
通用引物：5'CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA3'；
二、RT-PCR反应
将所提取的RNA样品进行反转录，反转录所用的试剂盒为商业试剂盒(购自全式金反转录试剂盒(One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)，按该试剂盒的说明书进行操作。具体步骤及反应体系如下所述：
(1)反转录反应体系为20μl，相关试剂即及用量如表3。
表3反转录反应体系
(2)将反转录后得到的cDNA用40μl的双蒸水进行稀释，置于-20℃备用；
(3)半定量：反应总体积为10μl，其中模板1μl，2×PCR mix(购自广东东盛生物科技有限公司产品)5μl，加上述实施例2中的正、反向引物至终浓度各0.3μm，不足部分以双蒸水补足
(4)PCR扩增程序：95℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃20s，循环28次，最后72℃延伸5min，15℃停止反应；
在本实施例中，PCR扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物，片段大小分别为U6基因为84bp，18S rRNA为141bp,Ssc-mir133a3p为71bp(见图1)
三、荧光定量PCR(QPCR)
反应总体积为20μl，其中cDNA模板4μl，2×SYBRGreenΙqPCR mix(购自Genecopnia公司)10μl，加上述实施例2中的正、反向引物至终浓度各0.4μm，不足部分以双蒸水补足。
反应程序：95℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃15s，循环40次；随后以比退火温度低2℃的温度，本实验中为58℃，以每10s上升0.5℃直至达到90℃的程序绘制溶解曲线。每个循环，程序都会记录下每个孔对应的Ct值。
四、QPCR数据分析：
数据分析在Excel中进行，利用标准曲线分析各个候选内参基因的扩增效率和稳定性。首先根据实验结果的Ct值计算候选基因的相关系数(R2)，然后根据公式lg(1+E)＝R2得出扩增效率的值；评价内参基因稳定性有2种简单数据分析，即稳定指数分析、△Ct值分析(Silveret al.,2006)，和3种基于统计学的分析软件，即GeNorm(Vandesompele et al.,2002)、NormFinder(Andersen et al.,2004)、BestKeeper(Pfaffl et al.,2004)。本发明通过在线分析网站对数据进行分析(http://www.leonxie.com/referencegene.php？type＝reference)。
五、试验结果分析
用不同的分析方法对定量结果进行分析，结果表明ssc-miR-133a3p在猪肌内脂肪中表达稳定性较动物常用内参U6和18S rRNA基因要好，特异性强，在肌内脂肪高的个体和肌内脂肪低的个体之间表达量很高，差异不大，且重复性好(参见图3定量数据所得Ct值比较分析，图4至图9为利用不同软件的处理分析方法得到的上述三个基因的表达稳定性结果测试)。
主要参考文献
1.Andersen CL等，Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data:a model-basedvariance estimation approach to identify genes suited for normalization,applied to bladder and colon cancer datasets.Cancer research,2004,64:5245-5250.
2.Krutzfeldt J等，MicroRNAs:a new class of regulatory genes affecting metabolism.Cell Metab,2006,4:9-12
3.Pfaffl MW,Tichopad A,Prgomet C,Neuvians TP.Determination of stable housekeeping genes,differentiallyregulated target genes and sample integrity:BestKeeper–Excel-based tool using pair-wise correlations.Biotechnology letters,2004,26:509-515.
4.Silver N等，Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-timePCR.BMC molecular biology,2006,7:33.
5.Vandesompele J等,Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging ofmultiple internal control genes.Genome biology,2002,3:research0034.
6.袁伟等，植物实时荧光定量PCR内参基因的特点及选择.植物学报,2012,47:427-436.
7.谭林等，猪肌内脂肪的研究进展.畜牧与饲料科学,2010,31.
8.Xie H等，MicroRNAs induced during adipogenesis that accelerate fat cell development are downregulated inobesity.Diabetes,2009,58:1050-1057.

Claims (4)

1.一种与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物在猪肌内脂肪相关检测中的应用，其特征在于该标志物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：9所示。
2.一种权利要求1所述的与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，其特征在于，所述的特异引物是如下所示的引物对和茎环引物，其核苷酸序列如下所示：
U6基因的引物：
正向引物：TCGCTTCGGCAGCACATATAC，
反向引物：CGAATTTGCGTGTCATCCTTGC；
18S rRNA基因的引物：
正向引物：CGACCATAAACGATGCCGACT，
反向引物：GTGCCCTTCCGTCAATTCCT；
ssc-miR133a3p基因的引物：
茎环引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG，
正向引物：CGCGGATTGGTCCCCTTC，
通用引物：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA。
3.如权利要求2所述的与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，其特征在于，U6基因的引物、18S rRNA基因的引物以及ssc-miR133a3p基因的引物单独或组合作为检测猪肌内脂肪含量的标准化的内参标志物，其中：所述的U6基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，所述18S rRNA基因的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所述，ssc-miR133a3p基因的引物如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所述，这些引物单独或组合使用作为检测肌内脂肪含量的标准化的内参标志物。
4.如权利要求2所述的与猪肌内脂肪含量相关microRNA标志物的特异引物在检测与猪肌内脂肪含量相关差异microRNAs中的应用，其特征在于，采用双内标的法构建反转录反应体系，该反转录反应体系包括如下所述：
核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示的microRNAs标志物和如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物，该反转录反应体系如下所示：
总RNA/mRNA 20ng-5μg/5-500ng；
0.5μg/μl的Anchored Oligo(dT)18引物，1μl；
0.1μg/μl的随机引物，1μl；
或0.5μl的GSP特异性引物，2pmol；
2×反转录反应Mix，10μl，RT/RI Enzyme Mix反转录酶，1μl；去基因组DNA酶，1μl；
RNase-无RNA酶水，补充至20μl。
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