CN104975092B - 血清ssc‑miR‑194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物学领域，涉及血清ssc‑miR‑194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用，血清ssc‑miR‑194b的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，反转录ssc‑miR‑194b所需的茎－环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，扩增ssc‑miR‑194b所需的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，采用上述引物可实现断奶仔猪肠道应激损伤的诊断，诊断方法包括血清总RNA的提取、小分子RNA的分离、cDNA合成、PCR扩增和鉴定，本发明将为断奶仔猪肠道应激损伤的预防、诊断和治疗提供指导，为猪抗应激品系的标记辅助选择提供一个新的分子标记物。

Description

血清ssc-miR-194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的 应用

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及血清ssc-miR-194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用。

背景技术

仔猪断奶应激是全世界生猪养殖中的一大难题，每年都给养猪业造成巨大的经济损失。应激导致的仔猪腹泻，更是目前养猪生产中最常见和危害性最大的一种应激性疾病。断奶应激主要的靶点是仔猪的胃肠道，其中对小肠的损伤尤为严重。断奶应激引发的仔猪小肠组织损伤和重建严重影响了仔猪肠道的发育和成熟，从而制约了仔猪的健康和生长。同样，断奶应激引发肠道损伤致使胃肠酶合成和吸收能力的下降被认为是断奶仔猪腹泻的原发性因素(伍晓雄，1999)；肠黏膜受损是导致仔猪腹泻的主要原因之一(严宏祥等，2006)。故断奶期被认为是肠道发育的一个重要时期，在这个时期由于仔猪的肠道尚未发育成熟，断奶应激有可能对仔猪肠道健康造成终生影响(Smith et al，2010)。

目前，肠道受损最有力的直接证据是将仔猪屠宰后进行肠粘膜形态学变化的检测。肠绒毛高度的降低和隐窝深度的增加是研究报道中证实肠粘膜结构受损的一项最主要的指标(Nabuurs等,1993)。然而，屠宰破坏性的研究只能用于研究机理的阐述。若能通过非屠宰的方式，例如在血液中发现可靠的反映肠道应激损伤的指标，对于尽早预防、诊断和治疗肠道应激损伤、提高养猪生产性能、增加养猪经济效益，以及特别是将其作为分子标记物应用于猪分子育种中提高生猪整体健康水平，均具有非常重要的生产实践意义和科学意义。因此，科学家们对断奶仔猪血清/血浆中二胺氧化酶(DAO)活性、D－乳酸含量和皮质醇含量等的变化进行了相关研究(钱仲仓等,2009；钟武装等，2013；胡彩虹等，2013；黄其春等，2014；Wolvekamp等，1994；黎君友等，2000；胡泉舟，2007)。但上述指标变化的检测均为相对值，要求有相应对照样品做参比并通过对数据进行显著性差异分析才能得出结论，因此不具备诊断价值。

血清/血浆miRNAs的发现无疑是miRNAs研究领域中的一项重大突破，为miRNAs在动物上的研究提供了新的研究思路。现有研究证实血清miRNAs不仅存在且具有广泛性、稳定性和特异性，特别是具有无创性和便捷性等无可比拟的优点。此外，它的变化与机体的生长发育、疾病发生发展和应激等多种生理现象密切相关。Mitchell等(2008)首先在肿瘤患者血浆中证实了miRNAs的存在。几乎同时，Chen等又在健康人类、肺癌、结肠癌和糖尿病等疾病患者以及包括鼠、牛和马等动物血清和血浆中检测到了多种miRNAs，并证实miRNAs在血清和血浆中无显著差异、且其含量几乎不受室温、高温、pH、多次冻融的影响。Gilad等(2008)通过比较妊娠妇女血清、尿液、唾液、羊水和胸膜液中的miRNAs，认为血清miRNAs更适合作为一种新型生物标记物。Blondal等(2013)指出当机体发生病理变化时，miRNAs可快速从组织释放到体液。提示血清循环miRNAs具有及时、特异性反映机体生理状态的优势。已有报道表明血清/血浆miRNAs的检测有助于诊断组织器官损伤(Redell等,2010)、关节炎(Murata等,2010)、心血管系统疾病(Tijsen等,2012)、肝炎(Zhang等,2012)和糖尿病(Guay等,2013)等多种疾病，特别是在各种恶性肿瘤方面的研究成果更为丰富(Liu等,2013；Madhavan等,2013；Sozzi等,2014)。

发明内容

本发明的目的针对现有技术的不足，提供血清ssc-miR-194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

血清ssc-miR-194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用，所述ssc-miR-194b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述ssc-miR-194b的反转录引物(茎-环引物)如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述ssc-miR-194b正向引物如SEQ ID NO.3所示，ssc-miR-194b反向引物如SEQ ID NO.4所示。

上述应用包括以下步骤：

(1)收集断奶仔猪全血，制备血清样品；

(2)采用Plasma/Serum Exosome Kit(Norgen，49200)试剂提取血清样品中totalRNA；

(3)采用miRNeasy Mini Kit(Qiagen 217004)试剂盒提取total RNA中的血清中小分子RNA；

(4)采用如SEQ ID NO.2所示的ssc-miR-194b反转录引物对小分子RNA进行反转录，获得cDNA：所述反转录体系为：小分子RNA样品2.5ul(40ng/ul)、ssc-miR-194b反转录引物0.5ul(2uM)、dNTP 0.25ul(10mM each)、

5×RT buffer 1.0ul、RNase inhibitor 0.25ul(40U/ul)、M-MLV 0.5ul(200U/ul)，反应体系总体积为5.0ul，将均匀混合的反应体系放置42℃反应60min，再放置70℃反应15min，4℃保存；

(5)以U6为内参，采用ssc-miR-194b的正向引物和反向引物对cDNA进行荧光定量PCR；反应体系为：步骤4得到的cDNA 1.0ul、2×SYBR Green Mix10.0ul、RNase-free Water8.2ul、SEQ ID NO.3所示的ssc-miR-194b正向引物0.4ul(10uM)，SEQ ID NO.4所示的ssc-miR-194b反向引物0.4ul(10uM)，反应体系总体积为20.0ul；荧光定量PCR反应条件：50℃反应2min、95℃反应5min；然后95℃反应15s、60℃反应15s，40cycles。

(6)荧光定量PCR结果ΔCt值若为负值，则表明断奶仔猪肠道应激损伤；若荧光定量PCR结果ΔCt值为正值，则表明断奶仔猪肠道没有发生应激损伤。

本发明的有益效果在于：本发明填补了目前断奶仔猪肠道应激损伤诊断方法的空白，提供了血清ssc-miR-194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用。本发明的优点在于：本发明首次公开了采用血清ssc-miR-194b以及分别用于反转录和扩增ssc-miR-194b的茎－环引物和正向引物、内参基因为U6对断奶仔猪的肠道应激进行诊断，诊断结果ΔCt值结果若为负值，则表明断奶仔猪肠道应激损伤，ΔCt值为正值，则表明断奶仔猪肠道没有发生应激损伤。该标记物的发掘和应用为断奶仔猪肠道应激损伤的预防、诊断和治疗提供指导，特别是为猪抗应激品系的标记辅助选择提供一个新的分子标记物。

附图说明

图1为3号仔猪空肠绒毛形态图；

图2为5仔猪空肠绒毛形态图；

图3为13号仔猪空肠绒毛形态图；

图4为15仔猪空肠绒毛形态图。

具体实施方式

实施例1：本实施例通过断奶仔猪的血清microRNA和肠道microRNA相关性分析，获得ssc-miR-194b，包括以下步骤：

1.仔猪肠道样品总RNA提取

从胎次及出生日期均相同的4窝、25日龄仔猪中选取24头(每窝6头)为研究对象，平均分为哺乳组和断奶组(当日断奶)。分别在断奶组仔猪断奶后1d，4d和7d，每组各屠宰仔猪4头(每窝1头)。收集空肠组织样品，采用Trizol法提取仔猪肠道组织总RNA样品。

2.小分子RNA文库构建

将各处理组的4个生物学重复总RNA样品按浓度折算后进行等量混合分别形成RNA样品池，利用15％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从总RNA样品中分离20-30nt范围内的小分子RNA，连接5′和3′接头、纯化，反转录为cDNA并经PCR扩增后形成测序文库。纯化小分子RNA文库，经质量检测合格后上机测序。本实验采用Illumina Hiseq2000测序平台的单端50bp测序模式完成样品的高通量测序。测序获得的原始数据需去除引物和adaptor序列，并经过对测序片段碱基的质量检验和长度筛选，最终选择质量可靠的测序片段。

3.断奶仔猪肠道差异表达miRNAs的分析

将miRNAs表达量进行归一化后，对已鉴定的miRNAs进行差异表达分析结果表明(表1～表3)：仔猪断奶后1d组与其对照组相比，共发现16个差异表达的miRNAs，其中11个显著上调，5个显著下调；断奶后4d组与其对照组相比，共发现98个差异表达的miRNAs，其中92个显著上调，6个显著下调；断奶后7d组与其对照组相比，共发现22个差异表达的miRNAs，其中15个显著上调，7个显著下调。由上可见，断奶应激显著影响了仔猪肠道组织中miRNAs的表达，且在断奶后4d影响最为显著，另外miR-194b和miR-194b在所有差异表达的miRNAs中呈最大表达丰度、且均为少数下调miRNAs之一。因此，后续的microRNA芯片和荧光定量PCR实验主要是比较了仔猪断奶后4日龄组及其对照组的差异。

表1：断奶后1日龄组

表2：断奶后4日龄组

表3：断奶后7日龄组

二、microRNA芯片获得断奶仔猪血清microRNA的差异表达谱

1.仔猪血清样品总RNA提取

试验仔猪在屠宰前2h，采用5ml注射器收集全血，3000g离心10min，制备血清样品。采用Plasma/Serum Exosome Kit(Norgen，49200)试剂提取血清样品中Total RNA。将断奶后4日龄组及其对照组的4个生物学重复总RNA样品按浓度折算后进行等量混合分别形成RNA样品池，用于后续的芯片实验。

2.microRNA芯片实验

微阵列实验由LC Sciences公司进行。采用5ug总RNA样品，使用Poly(A)聚合酶在总RNA3'端加上poly(A)尾巴，再将一个寡聚核苷酸标记与这个poly(A)尾巴连接(ligation)用于后续的荧光标记。杂交反应利用微循环泵(Atactic Technologies)的循环作用在μParaflo微流体芯片上过夜进行。检测探针为来自miRbase20.0数据库中猪的所有成熟miRNA序列及高通量测序中新发现的miRNA序列。检测探针均使用PGR(photogeneratedreagent)化学法进行原位合成。杂交解链温度是通过化学修饰检测探针进行平衡。杂交使用含有25％甲酰胺的100μL 6xSSPE缓冲液(0.90M NaCl，60mM Na2HPO4，6mM EDTA，pH6.8)，杂交温度为34℃。RNA与探针杂交后，与标记特异结合的Cy3染料在微流体芯片上循环流动进行染色。

3.断奶仔猪血清差异表达miRNA的分析

利用激光扫描仪(GenePix 4000B，Molecular Device)采集杂交图像并使用Array-Pro图像分析软件(Media Cybernetics)进行图像数字化转换。数据分析首先是减除背景值，然后使用LOWESS过滤(Locally-Weighted Regression)进行信号归一化。统计分析设定P<0.01，signal<500。对芯片数据进行分析结果表明：115个miRNAs在断奶仔猪血清中呈差异表达(表4)；64个miRNAs的杂交信号小于500，这些miRNAs可认为在仔猪血清中不表达；122个miRNAs的表达在断奶仔猪及其对照组中的差异不显著。

表4

三、断奶仔猪肠道和血清中microRNAs差异表达变化的一致性分析

将表2和表4中的数据进行对比，发现在断奶仔猪肠道和血清中均呈差异表达的miRNAs共有33个，其中有16个miRNAs的表达变化方向一致，既均为表达上调或下调，另外17个miRNAs的表达变化方向不一致。为避免假阳性结果，进一步以血清miRNA芯片结果中断奶仔猪及其对照组的│log2│≥2且高通量测序结果中│log2│≥1.5对16个表达变化一致的miRNAs进行筛选，发现仅ssc-miR-215和ssc-miR-194b符合筛选条件，而且miR-215和miR-194b在仔猪肠道中呈最高丰度表达、在断奶仔猪肠道中均为少数下调miRNAs之一。

实施例2：本实施例将实施例1获得的ssc-miR-194b用于标记断奶仔猪肠道应激损伤。

(1)随机选取24头断奶仔猪，分别标记为1～24号，收集断奶仔猪全血，制备1～24号血清样品；

(2)采用Plasma/Serum Exosome Kit(Norgen，49200)试剂提取血清样品中总RNA；

(3)采用miRNeasy Mini Kit(Qiagen 217004)试剂盒提取Total RNA中的血清microRNA；

(4)采用如SEQ ID NO.2所示的ssc-miR－194b反转录引物对microRNA进行反转录，获得cDNA：所述反转录体系为：microRNA样品2.5ul(40ng/ul)、ssc-miR－194b反转录引物0.5ul(2uM)、dNTP 0.25ul(10mM each)、

5×RT buffer 1.0ul、RNase inhibitor 0.25ul(40U/ul)、M-MLV 0.5ul(200U/ul)，反应体系总体积为5.0ul，将均匀混合的反应体系放置42℃反应60min，再放置70℃反应15min，4℃保存；

(5)以U6(U6的反转录引物ATGCGGCGGCGTATTGT，U6的正向引物GACCTCGCGGTGGTTATG，U6的反向引物ATGCGGCGGCGTATTGT)为内参，采用ssc-miR－194b的正向引物和反向引物对cDNA进行荧光定量PCR；

反应体系为：步骤4得到的cDNA 1.0ul、2×SYBR Green Mix 10.0ul、RNase-freeWater 8.2ul、SEQ ID NO.3所示的ssc-miR－194b正向引物0.4ul(10uM)，SEQ ID NO.4所示的ssc-miR－194b反向引物0.4ul(10uM)，反应体系总体积为20.0ul；荧光定量PCR反应条件：50℃反应2min、95℃反应5min；然后95℃反应15s、60℃反应15s，40cycles；

(6)荧光定量PCR结果以ΔCt值表示：即同一个样本中，ΔCt＝Ct内参基因–Ct目的基因。ΔCt值若为负值，则表明断奶仔猪肠道应激损伤；若荧光定量PCR结果ΔCt值为正值，则表明断奶仔猪肠道没有发生应激损伤。

表5断奶仔猪血清ssc-miR－194b的荧光定量PCR结果

选取│ΔCt│最小的3号、5号、13号和15号仔猪将其进行屠宰，收集空肠组织，进行空肠光镜切片的制作。如图1-4和表6所示。

表6屠宰仔猪的空肠绒毛高度和隐窝深度

	3	5	13	15
					绒毛高度,μm	426.50	213.50	421.80	218.85
隐窝深度,μm	110.47	176.49	161.67	218.02

从图1-4以及表6中可以看出，3号和13号仔猪空肠绒毛形态结构完整，绒毛上皮细胞间边缘清晰，而5号和15号断奶仔猪空肠绒毛明显变短，绒毛上皮细胞边界不清晰，且上皮间杯状细胞数量增加，隐窝加深，可证实5号和15号仔猪受到断奶应激，造成肠道损伤。上述结果表明本发明所述方法具有较高准确度和灵敏度。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 血清ssc-miR-194b作为检测仔猪肠道应激损伤分子标记物的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

uguaacagcg acuccaugug ga 22

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactccaca 50

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccagcgtgtg taacagcgac t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cagtgcaggg tccgaggtat t 21

Claims (4)

1.血清ssc-miR-194b在制备检测仔猪断奶肠道应激损伤分子标记物的应用，其特征在于，所述ssc-miR-194b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ssc-miR-194b的反转录引物如SEQ IDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ssc-miR-194b正向引物如SEQ IDNO.3所示，ssc-miR-194b反向引物如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该应用包括以下步骤：

(1)收集断奶仔猪全血，制备血清样品；

(2)采用Plasma/Serum Exosome Kit试剂提取血清样品中total RNA；

(3)采用miRNeasy Mini Kit试剂盒提取total RNA中的小分子RNA；

(4)采用如SEQ ID NO.2所示的ssc-miR-194b反转录引物对小分子RNA进行反转录，获得cDNA：所述反转录体系为：小分子RNA样品2.5μl，浓度为40ng/μl、ssc-miR-194b反转录引物0.5μl，浓度为2μM、dNTP 0.25μl，浓度为10mM each、5×RT buffer 1.0μl、RNaseinhibitor 0.25μl，浓度为40U/μl、M-MLV 0.5μl，浓度为200U/μl，反应体系总体积为5.0μl，将均匀混合的反应体系放置42℃反应60min，再放置70℃反应15min，4℃保存；

(5)以U6为内参，采用ssc-miR-194b的正向引物和反向引物对cDNA进行荧光定量PCR；反应体系为：步骤4得到的cDNA 1.0μl、2×SYBR Green Mix 10.0μl、RNase-free Water8.2μl、SEQ ID NO.3所示的ssc-miR-194b正向引物0.4μl，浓度为10μM，SEQ ID NO.4所示的ssc-miR-194b反向引物0.4μl，浓度为10μM，反应体系总体积为20.0μl；荧光定量PCR反应条件：50℃反应2min、95℃反应5min；然后95℃反应15s、60℃反应15s，40cycles；

(6)荧光定量PCR结果ΔCt值若为负值，则表明断奶仔猪肠道应激损伤；若荧光定量PCR结果ΔCt值为正值，则表明断奶仔猪肠道没有发生应激损伤。