CN112609003A - 一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物、试剂盒及其用途 - Google Patents

一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物、试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体的，提供了一种可以通过检测组织中hsa‑miR‑146b‑3p表达量的变化，鉴别甲状腺结节良恶性的组合物，同时还提供了含有该组合物的试剂盒以及所述组合物的用途。使用本发明的组合物能够以较高的灵敏度和特异性对细胞学无法明确诊断的甲状腺结节进行良恶性鉴别，提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性，减少甲状腺结节患者的过度医疗，为国家节约医疗资源，无疑具有非常重大的临床价值和巨大的经济效益。

Description

一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物、试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地，涉及鉴别甲状腺结节良恶性的领域，更具体地，涉及组织样本中hsa-miR-146b-3p表达量的检测。
背景技术
甲状腺结节是甲状腺疾病中最为常见的一种疾病，根据性质可分为良性结节和甲状腺癌，两者的处理方式不同，对患者生存质量的影响和涉及的医疗花费也有显著差异。在我国，甲状腺结节的患病率呈逐年增长的趋势，甲状腺结节患者的人数高达1.5亿，而其中5%-15%的甲状腺结节为甲状腺癌。若能早发现、早诊断、早治疗显得尤为重要。对于甲状腺癌的诊断方法，目前临床所使用的“金标准”是超声引导下的甲状腺细针穿刺活检细胞病理学检查，其检测灵敏度和特异性分别为86%和74%。对那些未能准确判断出结节良恶性的患者，临床医生会比较倾向于选择激进的手术方式进行治疗，但如果后期病理证实被手术切除的结节是良性的，则手术就是不必要的，是一种医疗浪费，而手术所带来的后遗症也会对患者的生活质量产生长期的影响。鉴于此，临床上亟需一种性能稳定可靠、灵敏度和特异性高的检测方法用于甲状腺癌的辅助诊断，作为“金标准”穿刺活检的补充。
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。具有发夹结构的pre-microRNA是成熟microRNA的前体，其长度大约为70-80个核苷酸，其形成发夹结构的两个臂可以分别产生不同的成熟microRNA。早先时候，科学家们并没有严格地区分这种分别来自同一个条pre-microRNA的两条臂上的不同的microRNA，例如，都被命名为hsa-miR-146b，但是随着研究的不断深入，科学家们发现虽然是同一个pre-microRNA，但其所产生的成熟microRNA却有着很大的差别，不但基因序列不同，这些microRNA的功能也不同。因此新的命名规则被采纳，即以microRNA的成熟体产生于pre-microRNA的5’端臂还是3’端臂，分别加上后缀“-5p”和“-3p”分别命名（如hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-146b-3p）。
大量的研究表明，作为基因表达的关键调节因子，microRNA在癌组织中表达谱系发生显著的变化，若能够找到甲状腺良性结节与甲状腺癌中具有稳定表达差异的microRNA，就能够用于区分甲状腺结节的良恶性，而本发明主要就是为了解决这样的问题。
hsa-miR-146b的前体是Pre-microRNA-146b，其形成发夹结构的两个臂可以分别产生两个成熟体microRNA，分别是hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-146b-3p，但这两个独立的成熟microRNA，各自具有独特的靶向调控基因和生物学功能，在不同的生物学过程中扮演不同的角色，是两种完全不同的microRNA。虽然有很多文献报道发现hsa-miR-146b在甲状腺癌组织中高表达（PMID：28937915、PMID：29048684、PMID：24301304、PMID：20406109、PMID：26581891等），但通过序列比对，这些文献报道中所称的hsa-miR-146b均为hsa-miR-146b-5p。当然也有不少文献单独报道了hsa-miR-146b-5p在甲状腺癌组织中表达升高的情况（PMID：32103998、PMID：31839944）。但是，有关hsa-miR-146b-3p在甲状腺组织中的表达情况的研究报道并不多见，有些文献虽然发现了hsa-miR-146b-3p在甲状腺癌组织中的表达相比周围正常甲状腺组织有所升高（PMID：32637757、PMID: 30244634），但却并没有披露hsa-miR-146b-3p在甲状腺良性结节组织中的表达情况。在没有大量临床实验数据的支持下，并不能想当然地认为hsa-miR-146b-3p在甲状腺良性结节中的表达一定会增高或降低。因此，仅仅通过现有的技术方案，显然无法充分地得出可以利用hsa-miR-146b-3p的表达情况来鉴别甲状腺结节良恶性的结论。而本发明通过大量的临床研究，证实hsa-miR-146b-3p在甲状腺良性结节组织与甲状腺癌组织中具有显著的表达差异，可作为分子标志物用于甲状腺结节的良恶性鉴别。不仅如此，如果同时检测hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-146b-3p来鉴别甲状腺结节良恶性的准确性，也要明显优于单独检测hsa-miR-146b-5p的准确性。因此，本发明通过检测甲状腺结节中hsa-miR-146b-3p的表达情况，有助于进一步提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性，减少甲状腺结节患者的过度医疗，为国家节约医疗资源，无疑具有非常重大的临床价值和巨大的经济效益。
发明内容
本发明利用荧光定量PCR的检测方法，发现检测组织中的hsa-miR-146b-3p表达量变化能够用于甲状腺结节的良恶性鉴别，且具有较高的灵敏度和特异性，可以提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性。
第一方面，本发明提供一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物，所述组合物包括：
hsa-miR-146b-3p逆转录茎环引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCAGA（SEQ ID NO.1）；
hsa-miR-146b-3p检测正向引物：
CCTGTGGACTCAGTTCTG（SEQ ID NO.2）；
通用反向引物：
ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG（SEQ ID NO.3）；
内参基因U68逆转录茎环引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTGTGG（SEQ ID NO.4）；
内参基因U68检测正向引物：
AGAGGTGCAAACAGCAAGC（SEQ ID NO.5）。
进一步地，所述组合物还包括阳性质控品和阴性质控品。
阳性质控品为人工合成单链hsa-miR-146b-3p mimics：GCCCUGUGGACUCAGUUCUGGU（SEQ ID NO.6）和人工合成内参基因U68的RNA mimics：AUUGCACCUAAACCCAAGAAUCACUGUUUCUUAUAGCGGUGGUUUAAACAGAGGUGCAAACAGCAAGCGGAUCUUGUCGCCUUUGGGGGGCUGUGGCCGUGCCCCUCAAAGUGAAUUUGGAGGUUCCACAACU（SEQ ID NO.7）的混合物；阴性质控品为人工合成单链cel-mir-39-3p mimics：UAUACCGAGAGCCCAGCUGAUUUCGUCUUGGUAAUAAGCUCGUCAUUGAGAUUAUCACCGGGUGUAAAUCAGCUUGGCUCUGGUGUC（SEQ ID NO.8）。
第二方面，本发明提供了上述组合物在制备鉴别甲状腺结节良恶性的试剂盒中的用途。
具体的，其使用方法包括如下步骤：
（1）使用提取试剂盒从手术组织和/或穿刺组织样本中提取microRNA，提取后的microRNA应立即使用，若暂时不用则保存于-70℃以下；
（2）以步骤（1）提取的microRNA为模板，用hsa-miR-146b-3p逆转录茎环引物SEQID NO.1和内参基因U68逆转录茎环引物SEQ ID NO.4为引物逆转录制备cDNA；
按照下面反应体系和扩增条件进行hsa-miR-146b-3p和内参基因U68逆转录：
试剂 体积
反转录反应液 6μL
Total microRNA 12μL
hsa-miR-146b-3p逆转录茎环引物 1μL
内参基因U68逆转录茎环引物 1μL
Total 20μL
扩增程序设置：
温度 时间 循环数
37 ˚C 60 min 1
85 ˚C 5min 1
将获得的cDNA作为扩增反应模板备用。
（3）将制备好的cDNA进行定量PCR检测；
hsa-miR-146b-3p定量PCR检测体系按照下列反应体系制备：
试剂 体积
PCR 反应液 12.5μL
hsa-miR-146b-3p正向引物 1μL
通用反向引物 1μL
cDNA模板 2μL
无核酸酶水 补足25μL
内参基因U68定量PCR检测体系按照下列反应体系制备：
试剂 体积
PCR 反应液 12.5μL
内参基因U68正向引物 1μL
通用反向引物 1μL
cDNA模板 2μL
无核酸酶水 补足25μL
按照下列扩增条件进行PCR扩增：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（4）检测结果判定。
具体的，检测结果判定包括如下步骤：
①判定检测体系是否合格：阳性质控品hsa-miR-146b-3p检测Ct值与内参基因U68检测Ct值均≤30；阴性质控品hsa-miR-146b-3p和内参基因U68无检测信号或检测Ct值均>40；判定检测体系合格；
②判定样本是否符合要求：样本内参基因U68检测Ct值≤30判定样本合格；
③若hsa-miR-146b-3p检测Ct值-内参基因U68检测Ct值≤临界值，则判定该样本hsa-miR-146b-3p表达量增加，临床提示该样本可能为甲状腺癌的概率增加；
④若hsa-miR-146b-3p检测Ct值-内参基因U68检测Ct值>临界值，则判定该样本hsa-miR-146b-3p表达量降低，临床提示该样本可能为甲状腺癌的概率降低。
进一步地，临界值根据甲状腺良性结节组织hsa-miR-146b-3p表达水平、甲状腺癌组织hsa-miR-146b-3p表达水平以及内参基因U68的表达水平设定，用于区分是否是甲状腺癌。所述临界值为8.86。
第三方面，本发明提供了一种鉴别甲状腺结节良恶性的试剂盒，所述试剂盒包括上述组合物中的一种或多种。
进一步地，所述试剂盒还包括microRNA逆转录反应所需试剂，例如，RNA逆转录酶、5×缓冲液、0.1M DTT、dNTPs、RNA酶抑制剂。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应所需试剂，例如，DNA聚合酶、KCl、MgCl2、Tris-HCl、dNTPs、SYBR GREEN染料。
进一步地，一种鉴别甲状腺结节良恶性的试剂盒，检测对象为甲状腺良性结节组织和/或甲状腺癌组织。
优选地，检测对象可以是新鲜的手术组织和/或穿刺组织，也可以是冷冻的手术组织和/或穿刺组织。
该试剂盒可以用来检测组织中hsa-miR-146b-3p表达量的变化。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明可以检测组织中hsa-miR-146b-3p表达量的变化，而该表达量的变化与甲状腺结节的良恶性密切相关，因此其检测结果可以用来协助医生对细胞学无法明确诊断的甲状腺结节进行良恶性鉴别，提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性。
（2）本发明通过实时荧光定量PCR检测，通过计算hsa-miR-146b-3p检测Ct值-内参基因U68检测Ct值进行甲状腺结节良恶性鉴别，该检测方法无需电泳、杂交等操作步骤，降低了假阳性，减少了污染，操作简单。
（3）本发明设置有内参基因U68，可以有效避免漏检及判定样本的质量；设置有阳性质控品，若阳性质控品检测呈阳性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阴性结果及漏检；设置有阴性质控品，若阴性质控检测呈阴性结果，说明检测体系没有问题；这样的设计使得检测方法严谨，有效避免漏检、错检的可能。
（4）本发明选用的引物组合具有灵敏度高、特异性好、重复性好的特点。
附图说明
图1为hsa-miR-146b-3p在甲状腺正常组织、甲状腺良性结节组织与甲状腺癌组织中表达差异图；
图2为本发明的一种实施例的流程图；
图3为本发明阳性质控品hsa-miR-146b-3p和内参基因U68扩增曲线；
图4为本发明阴性质控品hsa-miR-146b-3p和内参基因U68扩增曲线。
具体实施方式
为了更加透彻和全面地理解本发明所公开的内容，下面将参照附图对本发明进行详细的描述，但是本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，通常属于本发明的技术领域的普通技术人员都能够理解这些描述，并可能在不脱离本发明方法的前提下，做出若干非意想不到的改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
实施例1 设计本发明所使用的引物
本实施例涉及的hsa-miR-146b-3p和内参基因U68序列来自miRBase数据库，依据相关序列进行引物设计。
hsa-miR-146b-3p逆转录茎环引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCAGA（SEQ ID NO.1）；
hsa-miR-146b-3p检测正向引物：
CCTGTGGACTCAGTTCTG（SEQ ID NO.2）；
通用反向引物：
ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG（SEQ ID NO.3）；
内参基因U68逆转录茎环引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTGTGG（SEQ ID NO.4）；
内参基因U68表达量检测正向引物：
AGAGGTGCAAACAGCAAGC（SEQ ID NO.5）。
上述引物经过反复验证，具有检测特异性强、产物结构稳定、二聚体结构少等优点。
具体的，本实施例的特异性引物在荧光定量PCR扩增时表现出很好的特异性、稳定性，在确保PCR扩增特异性的同时能保证其扩增效率。
实施例2 使用本发明检测hsa-miR-146b-3p在甲状腺正常组织、甲状腺良性结节与甲状腺癌中的表达情况
具体步骤如下（图2）：
一、样本收集
收集了194例经细胞病理确定的甲状腺癌和甲状腺良性结节的临床样本，包括：50例甲状腺癌组织样本，50例配对的临近正常组织；47例甲状腺良性结节组织样本，47例配对的临近正常组织，样本信息如表1所示：
表1
序号 样本编号 样本类型 样本编号 样本类型 性别 年龄
1 QPCR-A001 甲状腺癌组织 QPCR-C001 临近正常组织 女 48
2 QPCR-A002 甲状腺癌组织 QPCR-C002 临近正常组织 女 63
3 QPCR-A003 甲状腺癌组织 QPCR-C003 临近正常组织 女 78
4 QPCR-A004 甲状腺癌组织 QPCR-C004 临近正常组织 女 43
5 QPCR-A005 甲状腺癌组织 QPCR-C005 临近正常组织 男 66
6 QPCR-A006 甲状腺癌组织 QPCR-C006 临近正常组织 男 71
7 QPCR-A007 甲状腺癌组织 QPCR-C007 临近正常组织 女 53
8 QPCR-A008 甲状腺癌组织 QPCR-C008 临近正常组织 女 31
9 QPCR-A009 甲状腺癌组织 QPCR-C009 临近正常组织 男 62
10 QPCR-A010 甲状腺癌组织 QPCR-C010 临近正常组织 女 69
11 QPCR-A011 甲状腺癌组织 QPCR-C011 临近正常组织 女 57
12 QPCR-A012 甲状腺癌组织 QPCR-C012 临近正常组织 女 46
13 QPCR-A013 甲状腺癌组织 QPCR-C013 临近正常组织 男 48
14 QPCR-A014 甲状腺癌组织 QPCR-C014 临近正常组织 女 52
15 QPCR-A015 甲状腺癌组织 QPCR-C015 临近正常组织 女 77
16 QPCR-A016 甲状腺癌组织 QPCR-C016 临近正常组织 女 72
17 QPCR-A017 甲状腺癌组织 QPCR-C017 临近正常组织 女 63
18 QPCR-A018 甲状腺癌组织 QPCR-C018 临近正常组织 女 51
19 QPCR-A019 甲状腺癌组织 QPCR-C019 临近正常组织 男 68
20 QPCR-A020 甲状腺癌组织 QPCR-C020 临近正常组织 女 62
21 QPCR-A021 甲状腺癌组织 QPCR-C021 临近正常组织 女 33
22 QPCR-A022 甲状腺癌组织 QPCR-C022 临近正常组织 女 43
23 QPCR-A023 甲状腺癌组织 QPCR-C023 临近正常组织 女 48
24 QPCR-A024 甲状腺癌组织 QPCR-C024 临近正常组织 男 64
25 QPCR-A025 甲状腺癌组织 QPCR-C025 临近正常组织 女 59
26 QPCR-A026 甲状腺癌组织 QPCR-C026 临近正常组织 女 48
27 QPCR-A027 甲状腺癌组织 QPCR-C027 临近正常组织 女 67
28 QPCR-A028 甲状腺癌组织 QPCR-C028 临近正常组织 女 59
29 QPCR-A029 甲状腺癌组织 QPCR-C029 临近正常组织 男 52
30 QPCR-A030 甲状腺癌组织 QPCR-C030 临近正常组织 女 72
31 QPCR-A031 甲状腺癌组织 QPCR-C031 临近正常组织 女 47
32 QPCR-A032 甲状腺癌组织 QPCR-C032 临近正常组织 女 39
33 QPCR-A033 甲状腺癌组织 QPCR-C033 临近正常组织 女 67
34 QPCR-A034 甲状腺癌组织 QPCR-C034 临近正常组织 女 55
35 QPCR-A035 甲状腺癌组织 QPCR-C035 临近正常组织 男 71
36 QPCR-A036 甲状腺癌组织 QPCR-C036 临近正常组织 女 72
37 QPCR-A037 甲状腺癌组织 QPCR-C037 临近正常组织 女 41
38 QPCR-A038 甲状腺癌组织 QPCR-C038 临近正常组织 女 39
39 QPCR-A039 甲状腺癌组织 QPCR-C039 临近正常组织 女 61
40 QPCR-A040 甲状腺癌组织 QPCR-C040 临近正常组织 男 67
41 QPCR-A041 甲状腺癌组织 QPCR-C041 临近正常组织 女 52
42 QPCR-A042 甲状腺癌组织 QPCR-C042 临近正常组织 女 29
43 QPCR-A043 甲状腺癌组织 QPCR-C043 临近正常组织 女 51
44 QPCR-A044 甲状腺癌组织 QPCR-C044 临近正常组织 女 46
45 QPCR-A045 甲状腺癌组织 QPCR-C045 临近正常组织 男 53
46 QPCR-A046 甲状腺癌组织 QPCR-C046 临近正常组织 男 71
47 QPCR-A047 甲状腺癌组织 QPCR-C047 临近正常组织 女 78
48 QPCR-A048 甲状腺癌组织 QPCR-C048 临近正常组织 女 36
49 QPCR-A049 甲状腺癌组织 QPCR-C049 临近正常组织 女 46
50 QPCR-A050 甲状腺癌组织 QPCR-C050 临近正常组织 女 59
51 QPCR-B001 甲状腺良性结节组织 QPCR-D001 临近正常组织 女 40
52 QPCR-B002 甲状腺良性结节组织 QPCR-D002 临近正常组织 女 34
53 QPCR-B003 甲状腺良性结节组织 QPCR-D003 临近正常组织 女 59
54 QPCR-B004 甲状腺良性结节组织 QPCR-D004 临近正常组织 女 62
55 QPCR-B005 甲状腺良性结节组织 QPCR-D005 临近正常组织 男 38
56 QPCR-B006 甲状腺良性结节组织 QPCR-D006 临近正常组织 女 52
57 QPCR-B007 甲状腺良性结节组织 QPCR-D007 临近正常组织 女 66
58 QPCR-B008 甲状腺良性结节组织 QPCR-D008 临近正常组织 女 51
59 QPCR-B009 甲状腺良性结节组织 QPCR-D009 临近正常组织 女 41
60 QPCR-B010 甲状腺良性结节组织 QPCR-D010 临近正常组织 女 28
61 QPCR-B011 甲状腺良性结节组织 QPCR-D011 临近正常组织 女 49
62 QPCR-B012 甲状腺良性结节组织 QPCR-D012 临近正常组织 女 55
63 QPCR-B013 甲状腺良性结节组织 QPCR-D013 临近正常组织 女 60
64 QPCR-B014 甲状腺良性结节组织 QPCR-D014 临近正常组织 女 39
65 QPCR-B015 甲状腺良性结节组织 QPCR-D015 临近正常组织 男 37
66 QPCR-B016 甲状腺良性结节组织 QPCR-D016 临近正常组织 女 51
67 QPCR-B017 甲状腺良性结节组织 QPCR-D017 临近正常组织 女 46
68 QPCR-B018 甲状腺良性结节组织 QPCR-D018 临近正常组织 女 51
69 QPCR-B019 甲状腺良性结节组织 QPCR-D019 临近正常组织 女 25
70 QPCR-B020 甲状腺良性结节组织 QPCR-D020 临近正常组织 女 41
71 QPCR-B021 甲状腺良性结节组织 QPCR-D021 临近正常组织 女 64
72 QPCR-B022 甲状腺良性结节组织 QPCR-D022 临近正常组织 女 49
73 QPCR-B023 甲状腺良性结节组织 QPCR-D023 临近正常组织 女 39
74 QPCR-B024 甲状腺良性结节组织 QPCR-D024 临近正常组织 男 55
75 QPCR-B025 甲状腺良性结节组织 QPCR-D025 临近正常组织 男 39
76 QPCR-B026 甲状腺良性结节组织 QPCR-D026 临近正常组织 女 32
77 QPCR-B027 甲状腺良性结节组织 QPCR-D027 临近正常组织 女 48
78 QPCR-B028 甲状腺良性结节组织 QPCR-D028 临近正常组织 女 33
79 QPCR-B029 甲状腺良性结节组织 QPCR-D029 临近正常组织 女 51
80 QPCR-B030 甲状腺良性结节组织 QPCR-D030 临近正常组织 女 44
81 QPCR-B031 甲状腺良性结节组织 QPCR-D031 临近正常组织 女 36
82 QPCR-B032 甲状腺良性结节组织 QPCR-D032 临近正常组织 女 49
83 QPCR-B033 甲状腺良性结节组织 QPCR-D033 临近正常组织 女 29
84 QPCR-B034 甲状腺良性结节组织 QPCR-D034 临近正常组织 女 55
85 QPCR-B035 甲状腺良性结节组织 QPCR-D035 临近正常组织 女 67
86 QPCR-B036 甲状腺良性结节组织 QPCR-D036 临近正常组织 女 47
87 QPCR-B037 甲状腺良性结节组织 QPCR-D037 临近正常组织 女 25
88 QPCR-B038 甲状腺良性结节组织 QPCR-D038 临近正常组织 男 49
89 QPCR-B039 甲状腺良性结节组织 QPCR-D039 临近正常组织 女 57
90 QPCR-B040 甲状腺良性结节组织 QPCR-D040 临近正常组织 女 32
91 QPCR-B041 甲状腺良性结节组织 QPCR-D041 临近正常组织 女 46
92 QPCR-B042 甲状腺良性结节组织 QPCR-D042 临近正常组织 女 58
93 QPCR-B043 甲状腺良性结节组织 QPCR-D043 临近正常组织 女 45
94 QPCR-B044 甲状腺良性结节组织 QPCR-D044 临近正常组织 女 27
95 QPCR-B045 甲状腺良性结节组织 QPCR-D045 临近正常组织 女 39
96 QPCR-B046 甲状腺良性结节组织 QPCR-D046 临近正常组织 男 44
97 QPCR-B047 甲状腺良性结节组织 QPCR-D047 临近正常组织 女 58
二、从组织样本中提取microRNA
采用TIANGEN miRcute miRNA isolation kit从手术组织和/或穿刺组织样本中提取microRNA，具体步骤下：
（1）0.1g手术组织和/或穿刺组织样本在液氮保护下研磨，将粉末转入1.5mL离心管中，然后加入1mL裂解液trizol振荡混合30秒；
（2）室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
（3）加入200μL氯仿，振荡器振荡15秒混匀，室温放置5min；
（4）4℃ 12000rpm离心10分钟，取上清，转入新的Rnase-free离心管中；
（5）加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入miRspincolumn中，室温12000rpm离心30s，弃废液；
（6）向miRspin column中加入500μL去蛋白液MRD，室温放置2min，12000rpm离心30s，弃废液；
（7）向miRspin column中加入700μL漂洗液RW，室温放置2min，12000rpm离心30s，弃废液；
（8）向miRspin column中加入500μL漂洗液RW，室温放置2min，12000rpm离心30s，弃废液；
（9）将miRspin column放入收集管中，12000rpm离心1min，去除残余液体；
（10）将miRspin column放在超净台上通风片刻，以充分晾干；
（11）将miRspin column转入新的1.5mL离心管中，加入30μL Rnase-free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min；
（12）将离心得到的microRNA溶液用Nanodrop检测浓度及纯度；
（13）将检测合格的microRNA溶液保存于-20℃冰箱，备用。
三、逆转录制备cDNA
以步骤二提取的microRNA为模板，用hsa-miR-146b-3p逆转录茎环引物SEQ IDNO.1和内参基因U68逆转录茎环引物SEQ ID NO.4为引物逆转录制备cDNA；
按照下面反应体系和扩增条件进行hsa-miR-146b-3p和内参基因U68逆转录：
试剂 体积
反转录反应液 6μL
Total microRNA 12μL
hsa-miR-146b-3p逆转录茎环引物 1μL
内参基因U68逆转录茎环引物 1μL
Total 20μL
扩增程序设置：
温度 时间 循环数
37 ˚C 60 min 1
85 ˚C 5min 1
将获得的cDNA作为扩增反应模板备用。
四、将制备好的cDNA进行定量PCR检测
hsa-miR-146b-3p定量PCR检测体系按照下列反应体系制备：
试剂 体积
PCR 反应液 12.5μL
hsa-miR-146b-3p正向引物 1μL
通用反向引物 1μL
cDNA模板 2μL
无核酸酶水 补足25μL
内参基因U68定量PCR检测体系按照下列反应体系制备：
试剂 体积
PCR 反应液 12.5μL
内参基因U68正向引物 1μL
通用反向引物 1μL
cDNA模板 2μL
无核酸酶水 补足25μL
按照下列扩增条件进行PCR扩增：
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
五、hsa-miR-146b-3p表达量分析
使用2-ΔΔCt法计算甲状腺正常组织、甲状腺良性结节组织和甲状腺癌组织中hsa-miR-146b-3p表达量差异，结果表明（图1），与甲状腺正常组织相比，hsa-miR-146b-3p在甲状腺良性结节组织表达上调1.32倍，表达差异不显著；与甲状腺正常组织相比，hsa-miR-146b-3p在甲状腺癌组织表达上调18.29倍，表达差异显著；与甲状腺良性结节组织相比，hsa-miR-146b-3p在甲状腺癌组织表达上调13.86倍，表达差异显著。因此，与甲状腺正常组织和甲状腺良性结节组织相比，甲状腺癌组织中hsa-miR-146b-3p表达量上调。
实施例3 通过检测组织中hsa-miR-146b-3p表达量的变化进行甲状腺结节良恶性进行鉴别
检测结果判定包括如下步骤：
（1）判定检测体系是否合格：阳性质控品hsa-miR-146b-3p检测Ct值与内参基因U68检测Ct值均≤30（图3），阴性质控品hsa-miR-146b-3p和内参基因U68无检测信号或检测Ct值均>40（图4），则判定检测体系合格；
（2）判定样本是否合格：样本内参基因U68检测Ct值≤30，则判定样本合格；
（3）若hsa-miR-146b-3p检测Ct值-内参基因U68检测Ct值≤临界值，则判定该样本hsa-miR-146b-3p表达量增加，临床提示该样本可能为甲状腺癌的概率增加；
（4）若hsa-miR-146b-3p检测Ct值-内参基因U68检测Ct值>临界值，则判定该样本hsa-miR-146b-3p表达量降低，临床提示该样本可能为甲状腺癌的概率降低。
所述临界值根据大量甲状腺良性结节组织和大量甲状腺癌组织中的hsa-miR-146b-3p表达水平以及内参基因U68的表达水平进行设定，所述临界值为8.86。
实施例4 本发明组合物检测实际临床样本的结果
按照实施例2所述的检测方法，使用实施例1所述的组合物对经细胞病理确定的37例甲状腺癌组织样本和29例甲状腺良性结节组织样本进行检测，并使用实施例3所述的甲状腺结节良恶性鉴别方法对所检样本进行甲状腺结节良恶性鉴别。将使用本发明所得甲状腺结节良恶性鉴别结果与所检样本的细胞病理检测结果进行比较，具体如表2所示：
表2
序号 样本编号 细胞病理检测结果 本发明鉴别结果 一致性分析
1 LC-A001 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
2 LC-A002 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
3 LC-A003 甲状腺癌 甲状腺良性结节 不一致
4 LC-A004 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
5 LC-A005 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
6 LC-A006 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
7 LC-A007 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
8 LC-A008 甲状腺癌 甲状腺良性结节 不一致
9 LC-A009 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
10 LC-A010 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
11 LC-A011 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
12 LC-A012 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
13 LC-A013 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
14 LC-A014 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
15 LC-A015 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
16 LC-A016 甲状腺癌 甲状腺良性结节 不一致
17 LC-A017 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
18 LC-A018 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
19 LC-A019 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
20 LC-A020 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
21 LC-A021 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
22 LC-A022 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
23 LC-A023 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
24 LC-A024 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
25 LC-A025 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
26 LC-A026 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
27 LC-A027 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
28 LC-A028 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
29 LC-A029 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
30 LC-A030 甲状腺癌 甲状腺良性结节 不一致
31 LC-A031 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
32 LC-A032 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
33 LC-A033 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
34 LC-A034 甲状腺癌 甲状腺良性结节 不一致
35 LC-A035 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
36 LC-A036 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
37 LC-A037 甲状腺癌 甲状腺癌 一致
38 LC-B001 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
39 LC-B002 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
40 LC-B003 甲状腺良性结节 甲状腺癌 不一致
41 LC-B004 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
42 LC-B005 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
43 LC-B006 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
44 LC-B007 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
45 LC-B008 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
46 LC-B009 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
47 LC-B010 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
48 LC-B011 甲状腺良性结节 甲状腺癌 不一致
49 LC-B012 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
50 LC-B013 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
51 LC-B014 甲状腺良性结节 甲状腺癌 不一致
52 LC-B015 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
53 LC-B016 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
54 LC-B017 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
55 LC-B018 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
56 LC-B019 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
57 LC-B020 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
58 LC-B021 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
59 LC-B022 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
60 LC-B023 甲状腺良性结节 甲状腺癌 不一致
61 LC-B024 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
62 LC-B025 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
63 LC-B026 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
64 LC-B027 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
65 LC-B028 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
66 LC-B029 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致
针对这66例实际临床样本，将使用本发明所得甲状腺结节良恶性鉴别结果与所检样本的细胞病理检测结果进行比较，应用统计学方法计算得出：本发明试剂盒的敏感度达到了86.49%，特异性达到了86.21%，阳性预测值达到了88.89%，阴性预测值达到了83.33%，准确性达到了86.36%，达到了预期目标。
实施例5 本发明组合物能有效提升hsa-miR-146b-5p检测实际临床样本的准确性
按照文献已报道的hsa-miR-146b-5p检测方法及甲状腺结节良恶性鉴别方法，对实施例4中所述37例甲状腺癌组织样本和29例甲状腺良性结节组织样本进行检测并鉴别甲状腺结节良恶性，使用hsa-miR-146b-5p检测所得甲状腺结节良恶性鉴别结果与所检样本的细胞病理检测结果进行比较，结果见下表，敏感度89.19%，特异性89.66%，阳性预测值91.67%，阴性预测值86.67%，准确性达到了89.39%。
同时，使用本发明组合物结合hsa-miR-146b-5p共同作为甲状腺结节良恶性鉴别分子标志物对上述临床样本进行甲状腺结节良恶性鉴别，并与所检样本的细胞病理检测结果进行比较，结果见下表，敏感度97.30%，特异性86.21%，阳性预测值90.00%，阴性预测值96.15%，准确性达到了92.42%。
由此可见，本发明组合物能进一步有效提升hsa-miR-146b-5p进行甲状腺结节良恶性鉴别的准确性。
表3
序号 样本编号 细胞病理检测结果<sup>a</sup> miRNA-146b-5p判别结果<sup>b</sup> a\b一致性分析 本发明组合物结合miR-146b-5p判别结果<sup>c</sup> a/c一致性分析
1 LC-A001 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
2 LC-A002 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
3 LC-A003 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
4 LC-A004 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
5 LC-A005 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
6 LC-A006 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
7 LC-A007 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
8 LC-A008 甲状腺癌 甲状腺良性结节 不一致 甲状腺良性结节 不一致
9 LC-A009 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
10 LC-A010 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
11 LC-A011 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
12 LC-A012 甲状腺癌 甲状腺良性结节 不一致 甲状腺癌 一致
13 LC-A013 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
14 LC-A014 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
15 LC-A015 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
16 LC-A016 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
17 LC-A017 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
18 LC-A018 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
19 LC-A019 甲状腺癌 甲状腺良性结节 不一致 甲状腺癌 一致
20 LC-A020 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
21 LC-A021 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
22 LC-A022 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
23 LC-A023 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
24 LC-A024 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
25 LC-A025 甲状腺癌 甲状腺良性结节 不一致 甲状腺癌 一致
26 LC-A026 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
27 LC-A027 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
28 LC-A028 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
29 LC-A029 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
30 LC-A030 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
31 LC-A031 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
32 LC-A032 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
33 LC-A033 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
34 LC-A034 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
35 LC-A035 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
36 LC-A036 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
37 LC-A037 甲状腺癌 甲状腺癌 一致 甲状腺癌 一致
38 LC-B001 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
39 LC-B002 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
40 LC-B003 甲状腺良性结节 甲状腺癌 不一致 甲状腺癌 不一致
41 LC-B004 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
42 LC-B005 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
43 LC-B006 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
44 LC-B007 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
45 LC-B008 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
46 LC-B009 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
47 LC-B010 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
48 LC-B011 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺癌 不一致
49 LC-B012 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
50 LC-B013 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
51 LC-B014 甲状腺良性结节 甲状腺癌 不一致 甲状腺癌 不一致
52 LC-B015 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
53 LC-B016 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
54 LC-B017 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
55 LC-B018 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
56 LC-B019 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
57 LC-B020 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
58 LC-B021 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
59 LC-B022 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
60 LC-B023 甲状腺良性结节 甲状腺癌 不一致 甲状腺癌 不一致
61 LC-B024 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
62 LC-B025 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
63 LC-B026 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
64 LC-B027 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
65 LC-B028 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
66 LC-B029 甲状腺良性结节 甲状腺良性结节 一致 甲状腺良性结节 一致
最后说明的是，以上所例举的实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明的技术方案的限制。本领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明的形式、内容和细节做出非意想不到的改变，而这些改变并没有偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海润安医学科技有限公司
润安医学科技（苏州）有限公司
<120> 一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物、试剂盒及其用途
<141> 2021-03-05
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaccaga 50
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agaggtgcaa acagcaagc 19
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcccugugga cucaguucug gu 22
<210> 7
<211> 133
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
auugcaccua aacccaagaa ucacuguuuc uuauagcggu gguuuaaaca gaggugcaaa 60
cagcaagcgg aucuugucgc cuuugggggg cuguggccgu gccccucaaa gugaauuugg 120
agguuccaca acu 133
<210> 8
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uauaccgaga gcccagcuga uuucgucuug guaauaagcu cgucauugag auuaucaccg 60
gguguaaauc agcuuggcuc ugguguc 87

Claims (10)

1.一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物，其特征在于，所述组合物包括：
hsa-miR-146b-3p逆转录茎环引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCAGA（SEQ ID NO.1）；
hsa-miR-146b-3p检测正向引物：
CCTGTGGACTCAGTTCTG（SEQ ID NO.2）；
通用反向引物：
ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG（SEQ ID NO.3）；
内参基因U68逆转录茎环引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTGTGG（SEQ ID NO.4）；
内参基因U68检测正向引物：
AGAGGTGCAAACAGCAAGC（SEQ ID NO.5）。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括阳性质控品和阴性质控品。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，阳性质控品为人工合成单链hsa-miR-146b-3p mimics：GCCCUGUGGACUCAGUUCUGGU（SEQ ID NO.6）和人工合成内参基因U68的RNAmimics：AUUGCACCUAAACCCAAGAAUCACUGUUUCUUAUAGCGGUGGUUUAAACAGAGGUGCAAACAGCAAGCGGAUCUUGUCGCCUUUGGGGGGCUGUGGCCGUGCCCCUCAAAGUGAAUUUGGAGGUUCCACAACU（SEQ ID NO.7）的混合物；阴性质控品为人工合成单链cel-mir-39-3p mimics：UAUACCGAGAGCCCAGCUGAUUUCGUCUUGGUAAUAAGCUCGUCAUUGAGAUUAUCACCGGGUGUAAAUCAGCUUGGCUCUGGUGUC（SEQ IDNO.8）。
4.如权利要求1~3所述的组合物在制备鉴别甲状腺结节良恶性的试剂盒中的用途，其特征在于，使用方法包括如下步骤：
（1）使用提取试剂盒从新鲜手术组织和/或穿刺组织样本中提取microRNA；
（2）以步骤（1）提取的microRNA为模板，用hsa-miR-146b-3p逆转录茎环引物和内参基因U68逆转录茎环引物为引物逆转录制备cDNA；
（3）将制备好的cDNA进行定量PCR检测；
（4）检测结果判定。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，检测结果判定包括如下步骤：
（1）判定检测体系是否合格：阳性质控品中hsa-miR-146b-3p和内参基因U68的检测Ct值均≤30，阴性质控品中hsa-miR-146b-3p和内参基因U68无检测信号或检测Ct值均>40，则判定检测体系合格；
（2）判定样本是否合格：样本内参基因U68检测Ct值≤30，则判定样本合格；
（3）若hsa-miR-146b-3p检测Ct值-内参基因U68检测Ct值≤临界值，则判定该样本hsa-miR-146b-3p表达量增加，临床提示该样本可能为甲状腺癌的概率增加；
（4）若hsa-miR-146b-3p检测Ct值-内参基因U68检测Ct值>临界值，则判定该样本hsa-miR-146b-3p表达量降低，临床提示该样本可能为甲状腺癌的概率降低。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述临界值为8.86。
7.一种鉴别甲状腺结节良恶性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3中任一项所述的组合物。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下microRNA逆转录反应所需试剂：RNA逆转录酶、5×缓冲液、0.1M DTT、dNTPs、RNA酶抑制剂。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下PCR反应所需试剂：DNA聚合酶、KCl、MgCl2、Tris-HCl、dNTPs、SYBR GREEN染料。
10.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，可以检测组织中hsa-miR-146b-3p表达量的变化。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113637748A (zh) * 2021-06-29 2021-11-12 复旦大学附属中山医院 一种用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒及其应用
CN116987791A (zh) * 2023-09-22 2023-11-03 润安医学科技(苏州)有限公司 一组血浆标志物在甲状腺结节良恶性鉴别中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNXIAO YU: "MicroRNA-146b-3p Promotes Cell Metastasis by Directly Targeting NF2 in Human Papillary Thyroid Cancer", 《THYROID》 *
SOUDEH GHAFOURI-FARD: "The role of microRNAs in the pathogenesis of thyroid cancer", 《NON-CODING RNA RESEARCH》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113637748A (zh) * 2021-06-29 2021-11-12 复旦大学附属中山医院 一种用于预测肿瘤患者顺铂敏感性的试剂盒及其应用
CN116987791A (zh) * 2023-09-22 2023-11-03 润安医学科技(苏州)有限公司 一组血浆标志物在甲状腺结节良恶性鉴别中的应用
CN116987791B (zh) * 2023-09-22 2023-12-22 润安医学科技(苏州)有限公司 一组血浆标志物在甲状腺结节良恶性鉴别中的应用

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