CN108728528B - 基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒 - Google Patents

基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其应用，该试剂盒包括检测肾小管上皮细胞特异性基因BBOX1以及内参基因B2M的上下游引物及探针。本发明荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于检测尿液、组织中BBOX1基因表达水平的快速检测。同时在检测过程中mRNA逆转录及荧光定量一步完成，均在单管中进行，勿需打开管盖，荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，故不存在非特异性扩增现象。从而可快速、特异、灵敏地检测BBOX1基因的mRNA表达水平。

Description

基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量 PCR一步法试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒。
背景技术
肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cell,RTEC)为被覆于肾小管内侧的上皮细胞，由中胚层后肾间充质细胞在胚胎第5周转分化而来。正常RTEC代谢活性旺盛，具有重吸收和排泌等多种生理功能。既往研究认为肾小球炎症和硬化是肾脏疾病进展的主要推动者,而肾小管病变仅仅是肾小球病变的受累者,其本身在疾病进展中的作用并不突出。然而，近年来大量研究证据表明,在多种损伤因素刺激下(缺氧、中毒、细胞炎症因子、血浆蛋白或葡萄糖等)，RTEC可发生一系列损伤、活化及表型转化等改变，并释放多种炎症因子和生长因子，促进肾脏疾病的发生发展。不仅如此，肾小管间质病变程度与肾功能下降严重程度和疾病预后密切相关。因此，目前认为RTEC损伤是肾脏疾病的核心病理生理环节之一。
RTEC受到损伤后可脱落入尿液，导致尿液中RTEC计数显著增加，并可作为多种肾脏疾病的生物标志物。然而，由于形态学上的相似性，RTEC与来自于下尿路的上皮细胞极难鉴别。信使核糖核酸(mRNA)由DNA的一条链作为模板转录而来的、能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。我们最近的研究发现，在众多尿路细胞中，RTEC特异性表达BBOX1 mRNA。检测尿液中相应mRNA水平对提示肾小管损伤以及肾脏疾病的诊断、预后监测具有独特价值。
基于Taqman探针的荧光定量PCR技术通过Taqman探针与模板的特异性杂交来鉴别模板，具有很高的准确性，假阳性率低，特异性好。
发明目的
发明内容：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒。该荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于尿液、组织中BBOX1基因表达水平的快速检测。
本发明还提供该基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR试剂盒的应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，包括检测BBOX1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1-3所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4-6所示。
其中，所述PCR试剂盒还包括PCR酶混合液和MasterMix。
所述PCR酶混合液为m-mlv逆转录酶和RNase inhibitor混合液。其中，m-mlv逆转录酶浓度为1000U/ul，RNase inhibitor浓度为600U/ul。
所述MasterMix包含浓度为100mM的KCl，浓度为6mM的MgCl2，浓度为80mM、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为0.6mM的dNTPs，浓度为0.06U/ul的热启动Taq酶，以及0.2M的PCR增强剂。
其中，所述BBOX1和B2M基因的探针连接的荧光基团为：FAM-BHQ 1。
进一步地，所述探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端连接淬灭基团。
更进一步地，所述淬灭基团为BHQ 1非荧光淬灭基团。
本发明所述的基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR试剂盒在分别检测基因BBOX1和B2M中的应用。尤其是尿液、组织中BBOX1基因表达水平的快速检测的应用。
所述检测基因时PCR反应体系为10ul，包括提取的样本RNA 1ul，上下游引物和探针混合液3.5ul，PCR酶混合液0.5ul，MasterMix 5ul。其中，上下游引物和探针混合液中上下游引物浓度0.2uM，探针浓度为0.2uM；PCR酶混合液中m-mlv逆转录酶浓度为1000U/ul，RNase inhibitor浓度为600U/ul。MasterMix包含浓度为100mM的KCl，浓度为6mM的MgCl2，浓度为80mM、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为0.6mM的dNTPs，浓度为0.06U/ul的热启动Taq酶，以及0.2M的PCR增强剂。
所述检测基因时荧光定量PCR反应条件为：42℃5min；95℃10min；95℃20s；60℃退火/延伸45s，循环45次；40℃冷却30s。
本发明根据NCBI上的BBOX1以及B2M(内参基因)基因全序列，并据此设计特异性引物和TaqMan探针，设计特点如下：1、引物的设计通过跨内含子设计引物的方式最大程度避免了基因组的干扰；2、引物和探针都和全转录组、全基因组进行细致比对，有效避免了非特异的结合；3、引物和探针结构都进行了小心的设计，避免互相之间的干扰；4、引物尽量覆盖目标基因的各种转录本，以达到最佳检测效果。最后采用荧光定量PCR快速技术检测基因表达。
有益效果：与现有技术相比，本发明可以快速、准确评估尿液、组织中BBOX1基因表达水平，且本荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点。同时在检测过程中mRNA逆转录及荧光定量一步完成，均在单管中进行，勿需打开管盖，荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，故不存在非特异性扩增现象。从而可快速、特异、灵敏地检测肾小管上皮细胞特异性基因的mRNA表达水平。
附图说明
图1是本发明的荧光定量PCR试剂盒检测BBOX1 mRNA在糖尿病肾脏病(DKD)患者及健康对照(HC)人群尿液中的差异表达示意图；
图2是本发明的荧光定量PCR试剂盒检测DKD患者及HC人群尿液BBOX1mRNA表达水平与尿微量白蛋白/肌酐(ACR)的相关性分析示意图；
图3是BBOX1荧光扩增曲线；
图4是B2M荧光扩增曲线。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种基于Taqman探针的慢性肾脏病相关基因检测荧光定量PCR试剂盒，包括检测BBOX1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1-3所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4-6所示。序列SEQ ID NO 1-6如下表1所示：
表1引物序列和探针序列
Figure GDA0003076194720000031
试剂盒中还包括PCR酶混合液和MasterMix。
试剂盒中配置好上下游引物和探针混合液、PCR酶混合液和MasterMix。其中，上下游引物和探针混合液中上下游引物浓度0.2uM，探针浓度为0.2uM；PCR酶混合液中m-mlv逆转录酶浓度为1000U/ul，RNase inhibitor浓度为600U/ul。MasterMix包含浓度为100mM的KCl，浓度为6mM的MgCl2，浓度为80mM、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为0.6mM的dNTPs，浓度为0.06U/ul的热启动Taq酶，以及0.2M的PCR增强剂。PCR反应体系为10ul，包括提取的样本RNA1ul，上下游引物和探针混合液3.5ul，PCR酶混合液0.5ul，MasterMix 5ul。
荧光定量PCR反应条件为：42℃5min；95℃10min；95℃20s；60℃退火/延伸45s，循环45次；40℃冷却30s。
实施例2
样本：选取2017年6月至2018年2月东南大学附属中大医院肾脏内科收治的49位DKD患者晨尿标本及相关临床资料为试验组，其中该组又按ACR水平分为三个亚组，即正常白蛋白尿组(NA)，微量白蛋白尿组(MA)以及大量白蛋白尿组(OA)。另随机选择来自东南大学附属中大医院32位健康体检者的尿液样本为对照组。
尿沉渣RNA提取：将留取的晨尿3000g离心30min得尿沉渣，参照TAKARA公司RNA提取操作流程提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，紫外分光光度计检测RNA纯度(A260/A280)。
配置PCR反应体系：RNA(浓度约100ug/ml)1ul；采用实施例1的试剂盒经行检测，每组基因上下游引物、探针混合液：3.5ul；PCR酶混合液0.5ul(m-mlv逆转录酶浓度为1000U/ul，RNase inhibitor浓度为600U/ul)；MasterMix:5ul(100mM的KCl，浓度为6mM的MgCl2，浓度为80mM、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为0.6mM的dNTPs，浓度为0.06U/ul的热启动Taq酶，0.2M的PCR增强剂)；PCR扩增时BBOX1以及B2M(内参基因)分别通过各自的上下游引物和探针分别进行扩增。
按如下反应条件进行逆转录PCR扩增：
42℃5min完成反转录，95℃预变性10min，95℃变性20s，60℃退火/延伸45s，变性和退火/延伸步骤循环45次，40℃冷却30s。
PCR扩增得到产物，收集荧光信号，检测Ct值。以B2M为内参基因，按公式2^(Ct内参基因-Ct检测基因)，分别计算检测DKD组和HC组的尿液BBOX1mRNA相对表达水平，结果如图1所示。同时，对尿液BBOX1 mRNA相对表达水平与ACR进行相关性分析，结果如图2所示。
图1结果表明DKD组与HC组相比，DKD患者尿液中BBOX1 mRNA水平显著升高，且部分患者在白蛋白尿出现前就已升高。同时图2的结果表明尿液BBOX1 mRNA相对表达水平与ACR水平呈显著正相关。
为进一步测试试剂盒的重复性及敏感性，分别用试剂盒检测了BBOX1及B2M在total RNA为500ng、50ng、5ng及0.5ng/10ul反应体系中的Ct值，并重复三次。BBOX1及B2M荧光扩增曲线分别如图3及图4所示。结果表明(表2)，实施例1的试剂盒可以在total RNA为0.5ng/10ul反应体系中检测到所述的2种mRNA，其平均变异系数为0.23％，说明本发明实施例1的试剂盒敏感性及重复性好，可满足临床检测的需要。
表2试剂盒重复性及敏感性验证
Figure GDA0003076194720000051
同时在检测过程中mRNA逆转录及荧光定量一步完成，均在单管中进行，勿需打开管盖，荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，故不存在非特异性扩增现象。从而可快速、特异、灵敏地检测肾小管上皮细胞特异性相关基因的mRNA表达水平。
序列表
<110> 东南大学
上海境象生物科技有限公司
<120> 基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcccgatgag cattacagtg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccaaagtgg gtagctggag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcaggccag agcaaagctc ca 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtctttcag caaggactgg 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aactatcttg ggctgtgaca aa 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catggttcac acggcaggca tact 24

Claims (9)

1.一种基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，其特征在于，包括检测BBOX1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1-3所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4-6所示。
2.根据权利要求1所述的基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR酶混合液和MasterMix。
3.根据权利要求2所述的基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，其特征在于，所述PCR酶混合液为m-mlv 逆转录酶和RNase inhibitor混合液。
4.根据权利要求1所述的基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，其特征在于，所述BBOX1和B2M基因的探针连接的荧光基团为FAM-BHQ 1。
5.根据权利要求1-4任一所述的基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，其特征在于，所述探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端连接淬灭基团。
6.根据权利要求4所述的基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，其特征在于，所述BHQ 1为非荧光淬灭基团。
7.一种权利要求1所述的基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒在制备检测基因BBOX1和B2M试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测基因时PCR反应体系为10ul，包括提取的样本RNA 1ul，上下游引物和探针混合液3.5ul，PCR酶混合液0.5ul，MasterMix 5ul。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测基因时荧光定量PCR反应条件为：42℃ 5min；95 ℃ 10min；95℃ 20s， 60℃退火/延伸45s，循环45次；40℃冷却30 s。
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