CN116287282A - 一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用，外泌体miRNA分子标志物包括ssc‑miR‑192、ssc‑miR‑146a‑5p和ssc‑miR‑149，单独使用血清外泌体miRNA诊断区分早期妊娠与未妊娠母猪时，ROC曲线下面积(AUC)分别为0.863、0.885、0.857；ssc‑miR‑192、ssc‑miR‑146a‑5p联合AUC为0.921；ssc‑miR‑192、ssc‑miR‑149联合AUC为0.902；ssc‑miR‑146a‑5p、ssc‑miR‑149联合AUC为0.910，ssc‑miR‑192、ssc‑miR‑146a‑5p、ssc‑miR‑149三种miRNA联合时，其AUC为0.959，可见，本发明提供的外泌体miRNA分子标志物在早期母猪妊娠诊断中具有高灵敏度及高特异性，使用多个miRNA标志物联合，具有优越的诊断性能。
Description
本申请是分案申请，原申请的发明专利名称为“一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用”，原申请的申请日为2020-06-10，原申请的申请号为202010525872.5。
技术领域
本发明属于生物技术诊断领域，具体的，本发明涉及一种用于母猪妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用。
背景技术
外泌体(Exosomes)是细胞产生释放到细胞外环境大小为30-100nm的囊泡，普遍存在于动物的唾液、血液、尿液及乳汁等流体中。microRNAs(miRNA)是短链非编码RNA，其长度约为19-22个核苷酸，通过与mRNA的3'-UTR区内部分或全部序列互补发挥调控作用，导致靶基因转录抑制，从而参与动物的胚胎发育。miRNA存在于外泌体的独特形式使之成为理想的生物标志物。研究表明，Exosomes作为细胞外miRNA的一种运载形式，可以保护其内miRNA免受核糖核酸酶的降解，使得miRNA在Exosomes中高度稳定表达。Exosome中的miRNA拥有独特的介导细胞间通信的作用，可以特异性抑制细胞中与其对应靶基因的表达。Exosomes中miRNA的在体液中独特稳定性和时空特异性使之成为理想的新型生物标志物逐渐进入人们的视野中。
母猪的妊娠诊断一直以来都受到企业的重视，因为早期妊娠的准确诊断不仅可以缩短母猪的非生产天数(NPD)，而且还可以提高年产窝仔数和增加窝均断奶仔猪数。如何通过有效而准确的诊断方法发现未妊娠母猪，缩短胎次间隔以及减少非生产天数(NPD)一直困扰着养猪业。
现有的妊娠诊断方法存在着各自的缺陷，如超声波诊断受使用者的经验程度及其检测天数较长的影响；依据母猪发情周期以及妊娠征状诊断，可能会存在假发情现象；激素测定则存在一定的危险性。目前还没有一种能在妊娠早期(特别是妊娠21天以内，即配种后未妊娠母猪能再次发情的时间)进行妊娠诊断的有效方法进入实用阶段。鉴于以上诊断方法存在的缺陷，我们迫切的需要找到一种更为简单准确的妊娠诊断方法应用于生产管理。
目前关于母猪妊娠早期妊娠外泌体miRNA的研究较少，普遍存在特异性和灵敏度低、诊断价值低的问题，如何通过研究外泌体miRNA，对血清外泌体miRNA作为妊娠诊断分子标志物的研究对养殖业具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物的特异性和灵敏度低、诊断价值低的技术问题，本发明旨在于提供一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物。本发明收集了14天配种妊娠与未妊娠母猪外周血样本，通过采用新一代高通量测序技术，结合系统的生物信息学分析方法，对妊娠与未妊娠母猪样本中差异外泌体miRNA进行筛选，最终获得了3个与母猪早期妊娠密切相关的外周血中外泌体miRNA，即ssc-miR-192、ssc-miR-149和ssc-miR-146a-5p，选择3个外泌体miRNA中的任意一个或两个以上的组合，在配种后妊娠与未妊娠母猪血清样本中的表达量均存在显著差异并通过Real-time PCR验证，最终证明本发明提供的ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149与母猪早期妊娠高度相关，能够作为快速检测母猪早期妊娠的标志物，该种血清外泌体miRNA标志物具有良好的诊断指标的特性。
本发明中，ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p和ssc-miR-149的RNA序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.1：CCGACAGUUAAGUAUCCAGUC；
SEQ ID NO.2：UUGGGUACCUUAAGUCAAGAGU；
SEQ ID NO.3：UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC。
本发明中，ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p和ssc-miR-149的正向引物分别如SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示：
SEQ ID NO.4：TCCCTGACCTATGAATTGACAGC；
SEQ ID NO.5：TTGAGAACTGAATTCCATGGGTT；
SEQ ID NO.6：TCTGGCTCCGTGTCTTCACTC。
反向引物为TIANGEN公司设计并合成的通用下游引物，该引物包含在TIANGEN公司的miRcute Plus miRNA qPCR Kit(SYBR Green)试剂盒中。
本发明中，采用ssc-U6作为内参基因，其中，内参引物ssc-U6-F、ssc-U6-R序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示：
SEQ ID NO.7:CGCTTCGGCAGCACATATACTA；
SEQ ID NO.8：ATGGAACGCTTCACGAATTTGC。
同时，本发明提供一种外泌体miRNA标志物的检测试剂盒，该种试剂盒包括用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物和PCR技术常用的试剂，外泌体miRNA标志物选择ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149三种miRNA标志物的组合。
优选的，试剂盒中的检测试剂包括2×miRNA RT Reaction Buffer、miRNA RTEnzyme Mix、RNase-Free ddH2O、2×miRcute Plus miRNAPreMix、Reverse Primer、miRNA第一链cDNA、50×ROX Reference Dye、75％乙醇、血清外泌体裂解液、氯仿和无水乙醇，上述检测试剂用于检测ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149表达量。
优选的，试剂盒中的特异性引物为检测ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149表达量的特异性引物。
优选的，试剂盒中的特异性引物的RNA序列如SEQ ID NO.4-SEQ IDNO.6所示。
进一步的，本发明提供外泌体miRNA标志物ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149中的任意一种或两种以上的组合在制备母猪早期妊娠诊断试剂盒中的应用，在母猪配种14天采集血样，采用Real-time PCR检测血清中ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149的表达水平，若能检测显著低表达，则该母猪应当进行下一次人工授精配种，以达到缩短胎次间隔以及减少非生产天数(NPD)，进而能有效降低母猪非生产天数，提高养猪企业的经济效益。
本发明原理：申请人发现ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149在妊娠早期母猪血清外泌体中相对于配种未妊娠母猪表达量显著更高，所以本发明重点分析了早期妊娠母猪血清ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149的成熟体(SEQ ID NO：1-SEQID NO：3所示)的表达情况，首次发现血清ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149可以单独或者组合作为快速检测母猪早期妊娠分子标志物，并进行应用。
本发明获得的有益效果：
(1)本发明针对母猪早期妊娠诊断，筛选外泌体miRNA分子，通过收集14天配种妊娠与未妊娠母猪外周血样本，从而对妊娠与未妊娠母猪样本中差异表达的外泌体miRNA进行筛选和检测，获得3个在未妊娠与妊娠差异显著且妊娠14天后显著升高的外泌体miRNA，最终得到与母猪早期妊娠相关的差异性外泌体的miRNA，即：ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149，从而证明3个miRNA可以单独使用或者组合对母猪早期妊娠诊断。
(2)本发明提供外泌体miRNA标志物ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149中的任意一种或两种以上的组合在制备母猪早期妊娠诊断试剂盒中的应用，在母猪配种14天采集血样，采用Real-time PCR检测血清外泌体中ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149的表达水平，若能检测显著低表达，则该母猪应当进行下一次人工授精配种，以达到缩短胎次间隔以及减少非生产天数(NPD)，进而能有效降低母猪非生产天数，提高养猪企业的经济效益。
(3)本发明公开的3个外泌体miRNA标志物中，miR-192在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪对照组中表达量差异显著，miR-146a-5p在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪对照组中表达量差异显著，miR-149在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪对照组中表达量差异显著。
(4)本发明公开的3个外泌体miRNA标志物中，ssc-miR-192在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.863(95％CI0.727-1.000,P<0.001)，ssc-miR-146a-5p在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.885(95％CI,0.745-1.000,P<0.001)，ssc-miR-149在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.857(95％CI,0.715-0.997,P<0.001)，由此可见，3个外泌体miRNA标志物均可单独用于早期母猪妊娠诊断，并且具有较高的诊断价值。
(5)当ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149三种miRNA两两相互联合时，即ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p联合在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.921(95％CI，0.823-1.000,P<0.001)；ssc-miR-192、ssc-miR-149联合在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.902(95％CI，0.791-1.000,P<0.001)；ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149联合在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.910(95％CI，0.790-1.000,P<0.001)；当ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149三种miRNA联合时，在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.959(95％CI，0.884-1.000,P<0.001)，高于单个血清外泌体miRNA作为诊断模型的特异性与敏感性，表明该血清外泌体miRNA组合时对于早期母猪妊娠诊断的价值最高，且其组合后的诊断准确性更高，可见，本发明具有较好的生产应用价值和广阔的应用前景。
附图说明
图1为非妊娠母猪血清外泌体Small RNA各组分及其占比。
图2为妊娠母猪血清外泌体Small RNA各组分及其占比。
图3为miR-192在妊娠与非妊娠母猪血清外泌体中表达水平差异图。
图4为miR-146a-5p在妊娠与非妊娠母猪血清外泌体中表达水平差异图。
图5为miR-149在妊娠与非妊娠母猪血清外泌体中表达水平差异图。
图6为miR-192单独诊断妊娠与非妊娠母猪的ROC曲线。
图7为miR-146a-5p单独诊断妊娠与非妊娠母猪的ROC曲线。
图8为miR-149单独诊断妊娠与非妊娠母猪的ROC曲线。
图9为miR-192、miR-146a-5p联合诊断妊娠与非妊娠母猪的ROC曲线。
图10为miR-192、miR-149联合诊断妊娠与非妊娠母猪的ROC曲线。
图11为miR-146a-5p、miR-149联合诊断妊娠与非妊娠母猪的ROC曲线。
图12为三种miRNA联合诊断妊娠与非妊娠母猪的ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图1-12，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例使用仪器如下：
仪器：4℃低温离心机(MIKRO 220R,UNIVERSAL 320R,德国Hettich科学仪器公司)、LightCycler96实时Real-time PCR仪(罗氏公司)、超净工作台(BJ-1CD，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)、常规PCR仪(Labcycler，德国SENSO公司)。
实施例一：外泌体miRNA的筛选试验
本实施例通过外周血分离纯化所得的外泌体miRNA，利用生物信息技术筛选出与母猪早期妊娠相关的特异性外泌体的miRNA，具体步骤如下：
S1、血清样品的制备：收集14天配种妊娠与未妊娠母猪外周血样本，在采血管(促凝管，南昌市赣达医疗器械有限公司)中加入促凝剂，采集完外周血后，将采血管缓慢颠倒混匀，混匀的全血4℃4000×g离心15min，上层黄色半透明液体即为待收集的血清，吸出血清时贴着液面逐渐往下吸，切勿吸出细胞成分；收集到的血清可直接用于后续实验或分装好-80℃冰箱保存。
S2、外泌体RNA的提取与送检：按照QIAGEN exoRNeasy Serum/Plasma StarterKit试剂盒(供应商：QIAGEN公司，商品号：77144)提取步骤与要求进行实验操作：
(1)使用0.8μm过滤器预处理血清。
(2)将XBP缓冲液与样品等体积混匀，轻轻翻转5-6次。
(3)吸取步骤(2)的混合液加入exoEasy中，以500g离心1min后倒弃废液，若柱中残留有液体，以500g再离心1min。
(4)加入3.5ml XWP于离心柱中，以5000g的转速离心5min，将离心后的液体后倒掉，随后将离心柱放在新的EP管中。
(5)移液器向吸附膜正中滴加700μl QIAzol，5000g离心5min并收集离心后的裂解液，随后将裂解液转移至2ml无酶EP管中。
(6)旋涡震荡上一步的裂解液，室温15–25℃条件下放置5min，此步骤为了促进蛋白复合物的解离。
(7)向上述裂解液中加入90μl氯仿，利用旋涡震荡其震荡15s，室温放置2-3min。
(8)置于4℃冷冻离心机中12000g离心15min，随后将离心机温度调至室温，接下来的步骤都采用室温离心。
(9)将上层液体转入新的收集管中，约400μl，加入2倍体积100％乙醇，反复吹打充分混匀，加入乙醇会有沉淀，对后续实验无影响。
(10)吸取700μl上述样品并转移至新的2ml吸附柱中(RNeasy MinElute)，室温条件下15-25℃12000rpm离心15s，倒弃废液，剩余样品重复此步骤(9)。
(11)向RNeasy MinElute吸附柱中加入700μl Buffer RWT，12000rpm离心15s，弃废液。
(12)加入500μl RPE至上述离心柱中，12000rpm，15s，倒弃离心后的液体。
(13)重复步骤(12)，小心取出吸附柱，注意不要接触废液避免乙醇污染，将RNeasyMinElute转移至新的Eppendorf管中，全速离心5min。
(14)将RNeasy MinElute离心柱置于新的1.5ml收集管中，向吸附柱膜中心加入14μl RNase-free water，静置1min随后全速离1min洗脱RNA。
(15)RNA提取完毕后，通过NanoDrop 2000测定RNA浓度以及纯度，选择测定结果质量较高的样品送往北京康普森公司，并利用Agilent 2100对送检RNA样品进行检测，然后根据质检结果选择建库方式，样本来源妊娠母猪及未妊娠母猪信息表参见表1。
表1：样本来源妊娠母猪及未妊娠母猪信息表
将表1的测序样本进行外泌体Small RNA测序，Small RNA测序采用的是illumina高通量测序，测序样本包括3对妊娠与非妊娠3个样本，合计6个样本，每个样本得到的测序序列不少于一百万条，将测序分析后的所有Small RNA与不同类别的RNA比对结果、注释结果进行统计分析，所得到的miRNA及其它不同种类的RNA分子所占比例，这些Small RNA序列也包含核糖体RNA，mRNA，小核/小核仁RNA，miscRNA，非妊娠母猪外泌体Small RNA各组分及其占比参见图1，妊娠母猪外泌体Small RNA各组分及其占比参见图2。
本实施例通过收集14天配种妊娠与未妊娠母猪外周血各三个样本，从而对妊娠与未妊娠母猪样本中差异表达的外泌体miRNA进行筛选和检测，获得3个在未妊娠与妊娠差异显著且妊娠14天后显著升高的外泌体miRNA，最终得到与母猪早期妊娠相关的差异性外泌体的miRNA，即：ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149，从而证明3个miRNA可以单独或者组合使用对母猪早期妊娠诊断。
实施例二：外泌体miRNA序列信息的比对
通过miRBase数据库公开的信息检索，将本申请中得到的三种miRNA序列信息整理，三种miRNA序列信息参见表2。
表2：三种miRNA序列信息
| miRNA序列信息 | 序列表名称 | 序列 |
| ssc-miR-192 | SEQIDNO.1 | CCGACAGUUAAGUAUCCAGUC |
| ssc-miR-146a-5p | SEQIDNO.2 | UUGGGUACCUUAAGUCAAGAGU |
| ssc-miR-149 | SEQIDNO.3 | UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC |
经过比对可知，三种miRNA序列信息与测序数据相符，从而证明本申请得到的ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149共3个miRNA的序列正确无误。
实施例三：外泌体miRNA标志物的检测试剂盒及其应用
本实施例提供一种外泌体miRNA标志物的检测试剂盒，该种试剂盒包括用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物和PCR技术常用的试剂，外泌体miRNA标志物选择ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149三种miRNA标志物的的组合。
优选的，试剂盒中的检测试剂包括2×miRNA RT Reaction Buffer、miRNA RTEnzyme Mix、RNase-Free ddH2O、2×miRcute Plus miRNAPreMix、Reverse Primer、miRNA第一链cDNA、50×ROX Reference Dye、75％乙醇、血清外泌体裂解液、氯仿和无水乙醇，上述检测试剂用于检测ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149表达量。
优选的，试剂盒中的特异性引物为检测ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149表达量的特异性引物。
优选的，试剂盒中的特异性引物的miRNA序列如SEQ ID NO.4-SEQ IDNO.6所示。
本实施例提供外泌体miRNA标志物ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149中的任意一种或两种以上的组合在制备母猪早期妊娠诊断试剂盒中的应用，在母猪配种14天采集血样，采用Real-time PCR检测血清中ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149的表达水平，若能检测显著低表达，则该母猪应当进行下一次人工授精配种，以达到缩短胎次间隔以及减少非生产天数(NPD)，进而能有效降低母猪非生产天数，提高养猪企业的经济效益。
实施例四：三种外泌体miRNA标志物用于母猪早期妊娠诊断的效果验证试验
(1)三种miRNA的差异表达数据分析
本实施例对本申请中得到的三种miRNA进行反转录试验，并针对3个miRNA分别设计并合成特异正向引物(上海生工合成)，具体步骤如下：
S1、cDNA合成：
反转录采用的试剂盒是TIANGEN的miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit试剂盒(TIANGEN公司，商品号：KR211)，首先解冻2×miRNA RT Reaction Buffer并混匀，miRNA RT Enzyme Mix放于冰中备用，在冰上预冷RNase Free的反应管内加入以下试剂至总体积20μl，最后加入miRNA RT Enzyme Mix。
取8μl RNA，基于miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit逆转录试剂盒进行，加入10ul 2×miRNA RT Reaction Buffer、2ul miRNA RT Enzyme Mix，无酶水至20ul总体系，进行42℃的60min miRNA加A尾反应和逆转录反应，3min 95℃酶失活反应，反应结束后，每一个miRNA都要有一条特异的正向引物，因此，本申请针对3个miRNA分别设并合成特异正向引物序列(上海生工合成)，三种miRNA的特异正向引物序列参见表3，要求每一个miRNA的反转录反应都是独立进行的。
S2、cDNA产物进行Real-time PCR反应：
按照TIANGEN的miRcute Plus miRNA qPCR Kit(SYBR Green)试剂盒(TIANGEN公司，商品号：FP411)进行，采用ssc-U6作为内参引物(上海生工合成)，其中，内参引物序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8，所有反应均做3个复孔，10μl 2×miRcute Plus miRNAPreMix(SYBR&ROX)，上下游引物各0.4ul，2ul模板样品，灭菌水7.2ul，共计20ul反应体系，PCR反应条件按照两步法设定反应步骤。反应结束，根据熔解曲线和Ct值，按照公式得到目的基因在这一模板中的相对表达值后进行分析。为95℃，15min；95℃，20s；60℃，30s，45个循环，终点采集荧光，通过该反应可以得到各个miRNA在不同样本中的表达量，进而进行后续分析。
本实施例中，反向引物为通用引物序列，由TIANGEN公司提供，三种miRNA的特异正向引物序列参见表3，内参引物序列见表4，表4中的SEQID NO.7、SEQ ID NO.8分别为ssc-U6-F、ssc-U6-R的核心序列。
表3：三种miRNA的特异正向引物序列
| MicroRNA | 序列表名称 | 引物序列 |
| ssc-miR-192 | SEQIDNO.4 | TCCCTGACCTATGAATTGACAGC |
| ssc-miR-146a-5p | SEQIDNO.5 | TTGAGAACTGAATTCCATGGGTT |
| ssc-miR-149 | SEQIDNO.6 | TCTGGCTCCGTGTCTTCACTC |
表4：内参引物序列
| MicroRNA | 序列表名称 | 引物序列 |
| ssc-U6-F | SEQIDNO.7 | CGCTTCGGCAGCACATATACTA |
| ssc-U6-R | SEQIDNO.8 | ATGGAACGCTTCACGAATTTGC |
S3、数据分析：
本步骤中，Real-time PCR检测miRNA相对表达量，小核RNAU6用作内参基因，倍数变化计算方法是2-ΔΔCt，结果显示ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149具有显著性差异(P<0.05)。ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149差异表达(fold)的变化分别为5.778，3.243，3.396，这个结果与测序技术检测结果一致，说明测序技术检测结果是可靠的。
其次，将分析结果通过柱状图表示，P＜0.05时，有显著性差异，miR-192在妊娠与非妊娠母猪血清中表达水平差异图参见图3，由图3分析可知，miR-192在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪对照组中表达量差异显著；miR-146a-5p在妊娠与非妊娠母猪血清中表达水平差异图参见图4可知，miR-146a-5p在配种后14天妊娠与未妊娠母猪血清外泌体中表达量差异显著；miR-149在妊娠与非妊娠母猪血清中表达水平差异参见图5，由图5分析可知，miR-149在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪对照组中表达量差异显著。
(2)三种miRNA的ROC曲线及曲线下面积AUC数据分析
本领域中，ROC曲线以下的面积值代表着预测的准确率情况，称其为AUC值。显然，AUC越大，意味着预测准确率越高，反之说明预测准确率越低。AUC值介于0到1之间，关于AUC值的判断说明如下：AUC<0.5：不符合实际情况,预测诊断比随机性猜测还差，实际情况中不应该出现；AUC＝0.5：说明完全无预测诊断价值，预测准确率和猜测效果一样；0.5<AUC<0.7：预测诊断价值很低，此种情况相对较常见；0.7<＝AUC<0.9：具有一定的预测诊断价值，对于实际诊断有较大的实用性；AUC>＝0.9：说明预测诊断价值高，此种情况较好；AUC＝1，是完美预测没有瑕疵，绝大多数情况下，根本不存在完美的预测诊断。
由上述实施例可知，血清外泌体ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149在配种14天妊娠母猪与未妊娠之间比较有统计学意义(P<0.05)，采用ROC曲线及曲线下面积AUC进行评价，3个指标的ROC曲线分析结合二元逻辑回归操作。
下面通过ROC曲线及曲线下面积AUC的数据来判断及验证本发明中三种miRNA的诊断价值，具体步骤如下：
首先，将Real-time PCR分析3个候选miRNAs在扩大样本中表达，妊娠样本20例，未妊娠样本15例，均在配种14天妊娠母猪与未妊娠对照组表达分析，最终结果以2-ΔΔCt分析，采用SPSS软件进行统计分析，统计方法是配对t检验，妊娠与非妊娠样本之间的统计方法是Mann–Whitney test，数据展示平均值±标准差，结果参见图6-12。
由图6分析可知，ssc-miR-192在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC(95％CI)为0.863(0.727，1.000)，可见，ssc-miR-192外泌体miRNA单独用于早期母猪妊娠诊断是具有较高的诊断价值。
由图7分析可知，ssc-miR-146a-5p在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.885(95％CI，0.885-0.745，1.000)，可见，ssc-miR-146a-5p外泌体miRNA单独用于早期母猪妊娠诊断是具有较高的诊断价值。
由图8分析可知，ssc-miR-149在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.857(95％CI，0.715-0.997，P<0.001)，可见，ssc-miR-149外泌体miRNA单独用于早期母猪妊娠诊断是具有较高的诊断价值。
由图9分析可知，ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.921(95％CI,0.823-1.000,P<0.001)，可见，ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p外泌体miRNA联合用于早期母猪妊娠诊断是具有较高的诊断价值。
由图10分析可知，ssc-miR-192、ssc-miR-149在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的0.902(95％CI,0.791-1.000,P<0.001)，可见，ssc-miR-192、ssc-miR-149外泌体miRNA联合用于早期母猪妊娠诊断是具有较高的诊断价值。
由图11分析可知，ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.910(95％CI,0.790-1.000,P<0.001)，可见，ssc-miR-192、ssc-miR-149外泌体miRNA联合用于早期母猪妊娠诊断是具有较高的诊断价值。
由图12分析可知，当三种miRNA组合时，在配种14天妊娠母猪与未妊娠母猪的AUC为0.959(95％CI，0.771-1.000，P<0.001)，高于单个且高于两两联合血清外泌体miRNA作为诊断模型的特异性与敏感性，表明该血清外泌体miRNA组合时对于早期母猪妊娠诊断的价值最高，且其组合后的诊断准确性更高。
综上所述，ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149在母猪外周血外泌体中，采用Real-time PCR在妊娠母猪外周血20例样本与未妊娠母猪外周血15例样本中进一步验证得出，ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149在妊娠母猪14天与未妊娠母猪组血清中存在显著差异，因此将ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149其中的任意一种或其组合应用到快速检测母猪早期妊娠诊断技术领域时，都可作为无创检测母猪早期妊娠的分子标志物，该种外泌体标志物具有良好的诊断指标的特性，与现有的激素测定和超声波等诊断方法相比，本申请具有较好的特异性和灵敏度，能在配种后14天检测确定母猪是否妊娠。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (1)
1.一种外泌体miRNA标志物在制备母猪早期妊娠诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述外泌体miRNA标志物为ssc-miR-149，ssc-miR-149的序列如SEQ ID NO.3所示。
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2020
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