CN112195232B

CN112195232B - 一种与原发性非梗阻性无精子症诊断相关的血浆外泌体miRNA标志物及其应用

Info

Publication number: CN112195232B
Application number: CN202011023356.9A
Authority: CN
Inventors: 朱作斌; 李颖; 韩从辉
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2040-09-25
Also published as: CN112195232A

Abstract

本发明公开了一种与原发性非梗阻性无精子症诊断相关的血浆外泌体miRNA标志物及其应用。该标志物为hsa‑miR‑513c‑5p和hsa‑miR‑202‑5p，hsa‑miR‑513c‑5p的序列为SEQ ID NO.1，hsa‑miR‑202‑5p的序列为SEQ ID NO.2。该标志物对非梗阻性无精子症具有特异性和灵敏性，可用于制备非梗阻性无精子症的诊断试剂盒。本发明的两个血浆外泌体标志物hsa‑miR‑202‑5p和hsa‑miR‑513c‑5p在非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症患者血浆中差异表达，其能够较好地诊断性非梗阻性无精子症，并能够预测无精子症取精结果，其效果优于常用的血浆卵泡刺激素水平及睾丸体积等指标。

Description

一种与原发性非梗阻性无精子症诊断相关的血浆外泌体 miRNA标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物诊断和医药领域，具体涉及一种与原发性非梗阻性无精子症诊断相关的血浆外泌体miRNA标志物及其应用。

背景技术

无精子症的发生率占男性不育症的10％-20％。根据睾丸中有无精子可分为两类：一类是睾丸具有正常精子发生的阻塞性无精子症(obstructive azoospermia, OA)。另一类是睾丸精子发生障碍的非阻塞性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)。对非阻塞性无精症的准确诊断可以为临床医生提供有价值的指导。尽管精液中的常规生化标志物，例如柠檬酸，酸性磷酸酶，果糖和α- 葡萄糖苷酶等可用于辅助诊断OA患者；睾丸体积，血清卵泡刺激素(FSH)水平等可辅助诊断NOA患者，但是仍有一部分患者无法利用这些指标进行正确的诊断。

睾丸活检的病理诊断是确定睾丸精子发生状态的“金标准”。然而，侵入性手术不仅给患者带来痛苦，而且还可能引起生精管的进行性和不可逆转的破坏。睾丸穿刺取精进行辅助生殖是治疗无精子症患者的重要手段，然而睾丸穿刺取精成功率并不高，通过准确、无创的术前评估对提高睾丸穿刺取精成功率具有重要意义。本专利旨在鉴定可以准确评估睾丸精子提取成功率的生物标志物。外泌体是大多数细胞分泌的细胞外囊泡，直径为30-150nm，具有脂质双层膜结构。非阻塞性无精子症患者睾丸不能产生精子，其组织结构与能够产生精子的阻塞性无精子症患者的睾丸组织显着不同。因此，NOA患者和OA患者产生的血浆中的外泌体也不同。因此，血浆外泌体是区分睾丸病理和生理状况的潜在生物标记物的重要来源。

血浆外泌体富含miRNA，miRNAs(19-22个核苷酸)在转录后水平负调控基因表达，影响mRNA的稳定性和翻译。研究表明，miRNAs在细胞增殖、分化、凋亡和癌变等多种生物过程中发挥着重要作用。另外，miRNAs在脊椎动物分化和发育尤其是胚胎中的睾丸分化、雄性种系发育和精子发生过程中起到重要的调控作用。miRNAs不仅存在于细胞中，也存在于细胞外环境中，特别是在不同的生物液体中。外泌体中miRNAs相对于游离miRNA较为稳定，不容易受环境中RNA酶的影响。因此，血浆中的miRNAs是人类疾病的理想的非侵入性生物标记物。

发明内容

本发明的目的之一在于克服已有无创诊断指标不能有效诊断非梗阻行无精子症的不足，提供一种与原发性非梗阻性无精子症诊断相关的血浆外泌体 miRNA标志物。

本发明的目的之二在于提供上述血浆外泌体miRNA标志物的特异性引物。

本发明的目的之三在于提供一种含有上述血浆外泌体miRNA标志物的特异性引物的非梗阻性无精子症诊断试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供一种与非梗阻性无精子症诊断相关的血浆外泌体miRNA标志物，该标志物为hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p， hsa-miR-202-5p的序列为：UUCCUAUGCAUAUACUUCUUUG(SEQ ID NO.1)； hsa-miR-513c-5p的序列为：UUCUCAAGGAGGUGUCGUUUAU(SEQ ID NO.2)。

血浆外泌体miRNA标志物hsa-miR-202-5p的特异性引物的序列为：

GSP：5’GGGGGTTCCTATGCATATACT3’(SEQ ID NO.3)；

R：5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’(SEQ ID NO.4)；

血浆外泌体miRNA标志物hsa-miR-513c-5p的特异性引物的序列为：

GSP：5’GGGGTTCTCAAGGAGGTGTC3’(SEQ ID NO.5)；

R：5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’(SEQ ID NO.6)。

本发明还提供一种非梗阻性无精子症诊断试剂盒，该试剂盒含有上述血浆外泌体miRNA标志物hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p的特异性引物。

本发明首先从血浆中分离了外泌体，并制备了miRNA文库用于高通量测序，并通过RT-qPCR验证miRNA作为生物标志物的价值。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、睾丸组织来源的外泌体能够真实反映睾丸组织的病理状态，本发明的两个血浆外泌体标志物hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p在非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症患者血浆中差异表达，其能够较好地诊断性非梗阻性无精子症，并能够预测无精子症取精结果，其效果优于常用的血浆卵泡刺激素水平及睾丸体积等指标，并且血浆外泌体hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p的表达水平相对于血液FSH水平及睾丸体积对非梗阻性无精子症、梗阻性无精子症及健康人群的区分度更好。

2、本发明的标志物hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p在梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症患者睾丸组织样本中也有表达差异，以进一步确定其作为诊断非梗阻性无精子症的可行性。进一步表明hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p是一个可用于诊断非梗阻性无精子症的优良指标，且具有作为靶标治疗非梗阻性无精子症的潜在价值。

附图说明

图1为高通量筛选具有诊断非梗阻性无精子症患者的生物标志物的研究策略。图中：NOA:睾丸活检取精失败的20-40岁非梗阻性无精子症症患者；OA: 睾丸活检取精成功的20-40随梗阻性无精子症患者；Ctrl：已育且精液常规正常的20-40岁健康个体；IO：重度精子发生障碍患者。

图2为外泌体形态的透射电子显微镜照片。

图3为外泌体粒径分析：横坐标表示粒径大小，纵坐标表示粒径浓度分布。

图4为hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p在非梗阻性无精子症(NOA)、梗阻性无精子症(OA)及精液常规正常的健康人的血浆外泌体中的差异表达情况：纵坐标表示hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p相对于内参U6基因的相对表达量。统计学分析采用双尾T检验，***P<0.001。

图5为ROC曲线下面积(AUC)。

图6为血浆外泌体hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p、血浆FSH水平及睾丸体积对NOA、OA及Ctrl的验证样本的区分度散点图。

图7为hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p在非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症睾丸组织中差异表达。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

如图1所示：本发明首先通过分析非梗阻性无精子症、梗阻性无精子症和健康对照人群血浆外泌体中的差异miRNA，然后对选择的差异miRNA在更多非梗阻性无精子症、梗阻性无精子症、严重生精功能障碍患者及健康对照人群样本中进行实时荧光定量PCR验证，最后确定筛选到的miRNA是否在梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症患者睾丸组织样本中是否有表达差异，以进一步确定其作为诊断非梗阻性无精子症的可行性。各具体方案实施如下：

1、血浆样本收集

本发明中样本使用说明：无精子症的诊断标准为：禁欲一周后，3次或3次以上精液离心(WHO推荐转速3000r/min，离心15分钟)后镜检未发现精子，同时排除不射精和逆行射精等即诊断为无精子症。非梗阻性无精子症：对需要进行辅助生殖的无精子症且符合手术指标的患者在知情同意的情况下进行睾丸活检取精，本发明中睾丸活检仍未取到精子的20-40岁无精子症患者作为睾丸活检取精失败的非梗阻性无精子症患者，能够取到足量可以应用于辅助生殖的精子的 20-40岁患者为梗阻性无精子症患者。重度生精功能不良患者样本：禁欲1周后，精液常规分析3次以上者，精子密度低于500万而查不出任何病因的20-40岁患者作为生精功能不良患者。健康对照人群样本：已育的30-40岁健康男性且精液常规正常的个体。

2、外泌体提取

本发明首先从血浆中分离了外泌体。禁欲一周后取4ml血液样本3000r/min，离心15分钟，取上层血浆2ml左右并使用

外泌体分离试剂盒(Umibio, Cat：UR52130，中国)进行外泌体分离。简介如下，每个样品在3000xg 4℃条件下离心10分钟，取上清然后在10000xg 4℃条件下离心20分钟，去除细胞和碎片，然后加入相应的试剂量(样本：试剂＝1:1)。混合物在4℃条件下涡流并孵育2小时，然后在4℃下10000xg离心60分钟以沉淀外泌体。用1×PBS重悬外泌体，然后于外泌体纯化过滤器中在3000xg 4℃下纯化10分钟。对外泌体进行分析时对纯化后的外泌体按照1:100的浓度进行稀释使用。与此同时本发明也通过透射电子显微镜观察外泌体的形态(图2)和

纳米颗粒跟踪分析器分析外泌体的粒径(图3)确认了所测miRNA来源于外泌体。

3、TRIZOL法提取外泌体RNA。

3.1、外泌体匀浆。在离心收集得到的外泌体样品中加入1ml TRIZOL试剂裂解细胞，裂解时用枪吸打几次。

3.2、两相分离。匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每1ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心 15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。

3.3、RNA沉淀。将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL试剂的此时加0.5 ml的异丙醇。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

3.4、RNA清洗。移去上清液，每1ml TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。

3.5、重新溶解RNA沉淀。去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的RNA 溶液保存于-70℃。

4、反转录反应

4.1、在无核酸酶的200μL PCR管加入下列反应物：

4.2、热循环仪50℃孵育1小时，然后立即在冰上冷却，反应产物可直接用于PCR扩增反应。

注意：如果未打算立即进行PCR扩增，热循环仪70℃孵育15分钟以终止RT 反应。然后将样本置于-20℃冰箱保存。

5、高通量测序筛选差异表达miRNA

5.1、首先进行文库制备。采用琼脂糖电泳检测提取外泌体的总RNA的完整性，然后在NanoDrop ND-1000仪器上进行核酸定量。质量合格的外泌体总RNA 进行一下操作：1)RNA片段选择:将Total RNA使用PAGE电泳切胶分离18-30nt 的RNA。2)3’接头连接:使用5-adenylated，3-blocked的单链DNA接头连接到(1)中RNA的3’端。3)逆转录引物退火：将RT引物加入(2)体系中，与连接在RNA上的3’接头杂交，并与多余的游离3’接头杂交。4)5’接头连接:5’接头连接至(3)中产物的5’端，由于接头优先连接于单链分子，而不与3’接头和RT引物的杂交链连接，极大减少了接头自连。5)一链cDNA 合成:以(3)中RT引物进行逆转录延伸，合成一链cDNA。6)PCR扩增:使用高敏聚合酶对cDNA进行扩增，富集同时连接有3’接头和5’接头的cDNA，放大文库产量。7)文库片段选择:使用PAGE电泳分离100-120bp范围PCR产物，有效去除引物二聚体等副产物。8)最后用安捷伦2100生物分析仪对完成的文库进行定量分析。根据定量结果将等量的文库混合，用于仪器上的测序。

5.2、制备的外泌体cDNA文库测序。首先将混合良好的文库中的DNA片段用0.1MNaOH变性，生成单链DNA分子，并以1.8pM的浓度加载到NextSeq 500/550V2 kit(#FC-404-2005,Illumina)试剂盒上。利用Illumina NextSeq 500测序平台测序，测序运行50个周期。

5.3、数据分析。对测定的原始数据进行过滤处，步骤是：1)去除测序质量较低的tag；2)去除有5’接头污染的tag；3)去除没有3’接头序列的tag；4) 去除没有插入片段的tag；5)去除包含polyA的tag；6)去除小于18nt的tag。利用Solexa pipeline v1.8软件进行图像及碱基读取分析，利用FastQC软件对测序数据进行质控分析，利用bowtie软件将碱基序列与miRDeep2数据库进行比对。 miRNA的表达量根据测序的reads数计算。

5.4、差异miRNA筛选(DEGseq)。RNA测序是一个随机的过程，每一条序列都是均匀随机的来自各自的样品。基于这样的假设，可以认为每一个基因(转录本)的表达量服从二项分布(或者泊松分布)。采用上述模型，DEGseq基于 MA-plot计算差异表达。假设C_1，C_2分别是两个样品的比对上的reads总数，服从二项分布。定义textit{M}＝log2C1-log2C2，A＝(log2C1+log2C2)/2。可以证明在随机抽样的条件下M的分布服从A＝a，符合近似正态分布。每个基因的p 值再用Qvalue进行多重假设检验校正，对于符合差异在两倍及以上且Q-value 值小于等于0.001，认为是显著的差异表达基因。

6、实时荧光定量PCR验证

本发明通过高通测序后通过生物信息学分析最终确定了hsa-miR-202-5p和 hsa-miR-513c-5p可以作为非梗阻性无精子症诊断标志物。实时荧光定量PCR实施条件如下：

6.1、引物：

hsa-miR-202-5p：GSP:5’GGGGGTTCCTATGCATATACT3’(SEQ ID NO.3)；

R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’(SEQ ID NO.4)。

hsa-miR-513c-5p：GSP:5’GGGGTTCTCAAGGAGGTGTC3’(SEQ ID NO.5)；

R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’(SEQ ID NO.6)。

内参hsa-miR-423-5p：GSP:5’TGAGGGGCAGAGAGCGA3’(SEQ ID NO.7)；

R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’(SEQ ID NO.8)。

6.2、实时荧光定PCR反应体系。体系配制如下：

轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。

6.3、加样

a.将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中。

b.再加入对应的2μl cDNA。

c.小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。

d.在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。

6.4、将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。

hsa-miR-423-5p&所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个PCR 循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。

为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃， 60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到95℃(仪器自动进行，升温速率为0.075℃/秒)。

6.5、结果与计算

各样品的目的miRNA和内参(hsa-miR-423-5p)分别进行Realtime PCR反应。数据采用2-△△CT法进行分析。

7、hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p诊断非梗阻性无精子症的效果评价。

利用GraphPad Prism6软件绘制受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristic curve，简称ROC曲线)，并计算其曲线下面积(Area Under Curve， AUC)、灵敏性和特异性。

以敏感性为纵坐标代表真阳性率，(1-特异性)为横坐标代表假阳性率，作图绘成ROC曲线，如图5所示。ROC曲线下面积AUC越大表明诊断效果越好。 hsa-miR-202-5p：AUC＝0.99，灵敏度＝100％，特异性＝95％，P<0.0001； hsa-miR-513c-5p：AUC＝0.95，灵敏度＝84％，特异性＝95％，P<0.0001；FSH： AUC＝0.81，灵敏度＝69％，特异性＝95％；睾丸体积：AUC＝0.90，灵敏度＝69％，特异性＝85％。说明常规非梗阻性无精子症的预测指标血液FSH水平和睾丸体积诊断非梗阻性无精子症的能力弱于血浆外泌体hsa-miR-202-5p和 hsa-miR-513c-5p。

图6A.血浆外泌体hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p对NOA、OA及Ctrl 样本的区分度散点图。纵坐标表示hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p相对于内参U6基因的相对表达量。图6B.血浆FSH水平及睾丸体积对NOA、OA及Ctrl 样本的区分度散点图。非梗阻性无精子症样本与梗阻性无精子症和健康对照人群区分度越好，表示该指标用于诊断非梗阻性无精子症效果更好。结果显示，血浆外泌体hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p的表达水平相对于血液FSH水平及睾丸体积对非梗阻性无精子症、梗阻性无精子症及健康人群的区分度更好。

分析5例非梗阻性无精子症患者和5例梗阻性无精子症患者睾丸组织中 hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p基因表达情况。结果显示，睾丸组织中 hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p基因表达情况与血浆中一致，进一步表明这两个标志物可以很好的反应睾丸的病理状态，是一种有价值的诊断非梗阻性无精子症的标志物。统计分析采用双尾T检验，*P<0.05，**P<0.01。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种与原发性非梗阻性无精子症诊断相关的血浆外泌体miRNA标志物及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 天然序列(Natural sequence)

<400> 1

uuccuaugca uauacuucuu ug 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 天然序列(Natural sequence)

<400> 2

uucucaagga ggugucguuu au 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggggttcct atgcatatac t 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgcgtgtcg tggagtcg 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggttctca aggaggtgtc 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgcgtgtcg tggagtcg 18

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaggggcag agagcga 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgcgtgtcg tggagtcg 18

Claims

1.血浆外泌体miRNA标志物的检测试剂在制备原发性非梗阻性无精子症诊断试剂中的应用，其特征在于，该标志物为hsa-miR-202-5p和hsa-miR-513c-5p，hsa-miR-202-5p的序列如SEQ ID NO.1所示，hsa-miR-513c-5p的序列如 SEQ ID NO.2所示。

2.一种与原发性非梗阻性无精子症诊断相关的血浆外泌体miRNA标志物的特异性引物，其特征在于，hsa-miR-202-5p的特异性引物的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；hsa-miR-513c-5p的特异性引物的上游引物序列如SEQ IDNO.5所示，其下游引物序列如SEQ ID NO.6所示。

3.权利要求2所述的特异性引物在制备原发性非梗阻性无精子症诊断试剂中的应用。

4.一种原发性非梗阻性无精子症诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求2所述的血浆外泌体miRNA标志物的特异性引物。