CN113584155B

CN113584155B - 一种用于评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果的试剂盒

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Publication number: CN113584155B
Application number: CN202110894517.XA
Authority: CN
Inventors: 宋宁宏; 秦超; 季承建; 王仪春; 魏希夷; 张星雨; 丛戎; 姚亮宇; 张其杰; 周翔; 栾焦晨; 游泽斌; 陈杏林
Original assignee: Kizilsu Kirgiz Autonomous Prefecture People's Hospital; Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Current assignee: Kizilsu Kirgiz Autonomous Prefecture People's Hospital; Jiangsu Province Hospital First Affiliated Hospital With Nanjing Medical University
Priority date: 2021-08-05
Filing date: 2021-08-05
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2041-08-05
Also published as: CN113584155A

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果的试剂盒，所述试剂盒所含试剂通过测定精浆中hsa_circ_0000277、hsa_circ_0060394、hsa_circ_0007773这三种circRNAs的含量，利用逻辑回归将三个circRNAs联合构建一个具有更高的诊断价值的模型，用于评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果。本发明的有益效果在于：精浆中的睾丸来源的circRNA表达稳定，取材方便，可以用于动态反映睾丸内部的生精状态。经临床标本验证，精浆中睾丸来源的circRNA作为特发性NOA患者显微取精效果的评价标志物具有很高的诊断性价值。

Description

一种用于评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果的cirRNA标志物。

背景技术

无精子症是指患者连续三次射出的精液中都没有发现精子的一种状况，是男性不育的主要原因。根据睾丸是否具有生精功能，无精子症可分为两类：梗阻性无精子症(obstructive azoospermia,OA)和非梗阻性无精子症(Non-obstructive azoospermia,NOA)。目前，特发性NOA的发病原因尚不清楚，且发病人数日益增多。对于患有特发性NOA的患者，通过手术获得精子是帮助他们实现生育的唯一方法。

1993年，Craft等人第一次用睾丸切开取精术(testicular sperm extraction,TESE)为OA患者获得精子。自此以后，多种外科手术方法被开发用于无精子患者的治疗，包括经皮附睾精子抽吸术(percutaneous epididymal sperm aspiration,PESA)，睾丸精子抽吸术(testicular sperm aspiration,TESA)，TESE和睾丸显微取精术(microdissectiontesticular sperm extraction,micro-TESE)。其中，micro-TESE被临床医生认为是NOA患者的最佳手术选择。

与其他手术方法相比，micro-TESE具有明显的优势，如更小的手术创伤，更高的精子获取率和更少的术后并发症。然而，对于特发性NOA的患者，micro-TSES的成功精子获取率仍然不是很高。因此，有必要找到一种准确的标记物来筛选适合手术取精的患者。

在过去的几十年中，研究人员研究了临床指标(包括病因、年龄、睾丸体积、精液体积等)、实验室指标(包括促卵泡激素(FSH)、抑制素B、睾酮(T)、病理情况等)、辅助疗法和外科手术术式，以探索对NOA具有较高诊断性能的评价因子。然而，现有的变量始终不能很好地评价NOA患者的手术取精效果。此外，很少有研究提高特发性NOA患者中micro-TESE取精效果的研究。

环状RNA(circRNA)是通过前体RNA的从尾到尾的反向剪切形成的共价闭环结构。CircRNA不受RNA核酸外切酶的影响，因此在多种体液(血液、唾液、精液等)中保持稳定。而且，circRNA在不同的细胞和物种之间是高度保守的。血液中的CircRNA已成功用于某些疾病(包括肿瘤，精神分裂症，糖尿病等)的早期诊断。

已有研究表明，精浆中可以稳定地检测到睾丸来源的circRNA。此外，这些人类睾丸来源的circRNA在室温下非常稳定。因此，我们的研究旨在探讨精浆中睾丸来源的circRNA在提高特发性NOA患者micro-TESE效果方面的潜在价值。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种用于评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果的试剂盒，该试剂盒基于cirRNA标志物，用于提高特发性非梗阻性无精子症患者在显微取精手术中的取精效率。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：提供一种用于评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果的试剂盒。其特征在于，所述试剂盒所含试剂能够测定精浆中hsa_circ_0000277、hsa_circ_0060394、hsa_circ_0007773这三种circRNAs的含量，其中，hsa_circ_0000277核苷酸序列为：SEQ ID NO:1；hsa_circ_0060394核苷酸序列为SEQID NO:2；hsa_circ_0007773核苷酸序列为：SEQ ID NO:3。

优选的，所述用于评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果的试剂盒包含测定精浆中hsa_circ_0000277、hsa_circ_0060394、hsa_circ_0007773这三种circRNAs含量的上下游引物。

优选的，所述试剂盒所包含的针对hsa_circ_0000277、hsa_circ_0060394、hsa_circ_0007773三种circRNAs检测的上下游引物，其序列分别如下所示：hsa_circ_0000277上、下游引物为：5'ACCAAGAATTTGGCATTTCAAGA 3'和5'GGCTTGGATCAGTCAGAAGA 3'；hsa_circ_0060394上、下游引物为：5'GCTGGACGTCAGCTCGATTG3'和5'TGATCAGCAGTTGAGAGCTTGT3'；hsa_circ_0007773上下游引物为：5'GCTGTTCAGAGCACACTGAT 3'和5'CCTTGGTCAACAGACTCAGAAT 3'。

优选的，所述试剂盒还包含反转录反应所需试剂、PCR反应所需试剂、DEPC处理水、阳性对照和阴性对照。

优选的，所述试剂盒选用了18s RNA作为内参。

所述试剂盒测定精浆中hsa_circ_0000277、hsa_circ_0060394、hsa_circ_0007773这三种circRNAs的含量所用试剂为定量RT-qPCR、半定量RT-qPCR、RNA印迹分析或溶液杂交检测方法测定circRNAs所需试剂。

本发明的有益效果在于：精浆中的睾丸来源的circRNA表达稳定，取材方便，可以用于动态反映睾丸内部的生精状态，可以作为一种准确的标记物来筛选适合手术取精的患者。经临床标本验证，精浆中睾丸来源的circRNA作为特发性NOA患者显微取精效果的评价标志物具有很高的诊断性价值。

附图说明

图1为RT-qPCR证实特发性NOA中显微取精成功组和失败组之间相关circRNA的差异性表达情况对比图；

图2为精浆中circRNA稳定性试验结果；

图3为circRNA的联合ROC图；

图4为采用本发明所述试剂盒进行评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果流程图。

具体实施方式

以下结合实施例及说明书附图对本发明进一步说明。

实施例1样本采集

(1)研究对象及实验设计

本发明所涉及的所有试验已通过南京医科大学第一附属医院批准(伦理审查号：2018-SRFA-035)。所有纳入研究的患者均对该研究知情同意。手术前，所有患者均已完成多普勒超声检查、性激素检查、染色体核型检查、AZF缺失检查等，以明确病因。6例特发性NOA患者(包括3例成功获得精子的患者和3例未能获得精子的患者)的睾丸组织被用于高通量转录组学第二代测序。

从2018年10月到2020年10月，研究共纳入52例特发性NOA患者。根据手术取精结果，将这些患者分为成功组(20例)和失败组(32例)。患者在进行显微取精之前，保证3-5天禁欲，然后通过手淫方式提供精液样品。

(2)样本的收集和处理

所有的睾丸组织在获得后被分成两部分，一部分储存在液氮中，用于后续的RNA提取。另一部分保存在固定剂中，用于后续的形态分析。

所有精液样本获得后先在室温下液化30-60分钟，然后将精液样品在4℃和1600g下离心10分钟。然后，取上层清亮部分在4℃和16000g下离心15分钟以获得精浆。最后将精浆保存在液氮中。

实施例2RNA的提取与circRNA的测序

采用TRIzol试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)来从睾丸组织和精浆中提取总RNA。然后，使用NanoDrop 200(Madison,WI,USA)来评估总RNA的浓度和纯度。

用于测序的睾丸样品circRNA文库的构建包括以下步骤：1.去除核糖体RNA(rRNA)；2.使用RNase R去除线性RNA；3.使用片段缓冲液片段化RNA；4.通过RNA的逆转录合成互补DNA(cDNA)；5.在添加单个“A”碱基后，通过末端修复反应和衔接子连接来处理cDNA片段；6.通过质量检查筛选cDNA文库并选择合适大小的文库；7.委托RiboBio Co，Ltd(广州，中国)在Illumina测序平台上进行测序。

获得原始数据后，实施质量控制(包括重复检查和除去包含接头的读数，低质量读数，rRNA读数)以获得clean data。然后，使用Tophat2软件将clean data与参考基因组进行两次比较(unfusion and fusion)，并鉴定了circRNA。

然后，根据现有文献，将SRPBM值用作circRNA的表达水平

使用edgeR软件包分析成功组和失败组之间环状RNA的差异表达。同时满足|log2倍变化(FC)|>1和q值<0.05的circRNA被定义为显着差异表达的circRNA。睾丸组织测序发现，49个circRNAs在取精成功组和失败组之间存在明显的表达差异，其中，4个circRNAs在失败组是明显表达上调的，45个是明显下调的，结果见表1所示。

表1.取精成功组和失败组之间差异表达的circRNAs

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实施例3RT-qPCR验证特发性NOA中显微取精成功组和失败组之间相关circRNA的差异性

我们选取了5个差异最显著的circRNAs(hsa_circ_0025349,hsa_circ_0000277,hsa_circ_0060394,hsa_circ_0008226,hsa_circ_0007773)进行RT-qPCR的验证，根据反转录试剂盒说明书(PrimeScript^TMRT Master Mix，TaKaRa，日本)将睾丸和精浆的总RNA(500ng)反转录为cDNA。

然后，从circBase数据库获得上述5个circRNA的序列(hsa_circ_0025349核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；hsa_circ_0000277核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；has_circ_0060394核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；hsa_circ_0008226核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；hsa_circ_0007773核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)，并使用Primer5软件设计针对上述5个circRNA的RT-qPCR引物。这五种circRNAs的引物序列见表3.通过RT-qPCR融解曲线，对RT-qPCR产物的琼脂糖凝胶电泳和桑格测序确定引物的特异性。

表3.circRNAs的引物信息

以患者睾丸和精浆RNA的逆转录cDNA为模版，采用我们设计好的特异性引物，按照

Green Master Mix(中国Vazyme生物技术有限公司)的试验方案完成RT-qPCR反应。循环程序是在95℃下进行5分钟，然后进入40个循环，每个循环包括在95℃下进行10秒，在60℃下进行30秒。circRNA的相对表达通过△CT法(CT_{目的circRNA}–CT_18s)计算。验证结果发现无论在睾丸组织还是精浆组织中，hsa_circ_0000277、hsa_circ_0060394、hsa_circ_0007773这三种circRNA均在失败组低表达，在成功组高表达，结果如图1所示。

实施例4.睾丸组织的HE染色

固定好的睾丸组织先进行石蜡包埋。将需要进行病理形态分析的石蜡切片依次放入两个装有二甲苯的烧杯中，各放置20分钟，以实现脱蜡。然后，使用100％、90％、80％、70％的乙醇将脱蜡的样品重新水化。然后利用苏木精和曙红进行染色。苏木精的染色时间为1分钟，然后在曙红中染色5分钟。用梯度上述浓度的乙醇和二甲苯进行脱水。最后，样品用中性树脂密封。一共有52例患者被纳入该实验，样本共包括25例睾丸组织(10例来自成功组，15例来自失败组)和52例术前精浆(20例来自成功组，32例来自失败组)。睾丸的HE染色结果显示，这些患者的睾丸病理形态主要包括生精阻滞、精子发生低下、唯支持细胞综合症。我们同时收集了这些患者的临床资料(年龄、BMI、性激素水平等)，见表2。

表2.纳入研究的患者的临床资料

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实施例5.稳定性试验

收集了三例正常精液样本用于探究精浆中circRNA的稳定性。标本均为精液质量检查废弃的标本，并获得标本来源的同意。分离精浆后，将每个样品分成四个等份，并在室温下保存0小时、12小时、24小时、48小时，然后，分别在0小时、12小时、24小时和48小时提取四个部分各自的总RNA。最后，使用RT-qPCR检测不同时间段精浆中circRNA的表达水平，稳定性试验表明，精浆中hsa_circ_0000277、hsa_circ_0060394、hsa_circ_0007773这三种circRNA在室温中放置48小时，均能保持在一个稳定的表达水平，结果如图2所示。

实施例6.统计学分析

本文使用的所有数据的统计分析均通过R软件(版本3.6.3)完成。差异表达的circRNA时，我们将差异同时满足q值<0.05和|log2(FC)|>1的circRNA作为明显差异表达的circRNA。t检验、卡方检验、Wilcoxon秩和检验分别被用于两组间连续型变量、分类变量和等级变量。逻辑回归被用于联合多个circRNAs的诊断分析。所有统计检验均为双面检验，P<0.05被认为具有统计学意义。利用逻辑回归分析，我们将hsa_circ_0000277、hsa_circ_0060394、hsa_circ_0007773这三种circRNA联合起来构建了一个诊断模型。模型的具体评分公式＝0.0740562818905781×hsa_circ_0000277的表达水平(△CT)+0.162670646692637×hsa_circ_0060394的表达水平(△CT)+0.0794649003606815×hsa_circ_0007773的表达水平(△CT)。该模型对评价特发性NOA患者睾丸显微取精效果的接受者操作特征曲线(ROC)分析发现，临界值为2.038647，AUC为0.9578，敏感性为0.95，特异性为0.875，结果如图3所示。

实施例7

本发明具体实施方法如图4所示，收集特发性NOA患者的精浆，提取精浆中RNA，利用RT-qPCR获得hsa_circ_0000277、hsa_circ_0060394、hsa_circ_0007773这三种circRNA各自的表达水平(△CT)，代入公式(0.0740562818905781×hsa_circ_0000277的表达水平(△CT)+0.162670646692637×hsa_circ_0060394(△CT)+0.0794649003606815×hsa_circ_0007773)的表达水平(△CT))，计算得到的数值如果大于2.038647，则该患者通过micro-TESE手术获取精子的可能性大，建议进行手术取精，如果得到的数值小于2.038647，则该患者通过micro-TESE手术获取精子的可能性小，不建议进行手术取精。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）

克孜勒苏柯尔克孜自治州人民医院

<120> 一种用于评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果的试剂盒

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1284

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaacaga tttggagttg aggctggtca atggagacgg tccctgctct gggacagtgg 60

aggtgaaatt ccagggacag tgggggactg tgtgtgatga tgggtggaac actactgcct 120

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cagatgctgg agtaatttgt tctg 1284

<210> 2

<211> 437

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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ttgctacctg ttgaacagtc ttcaaggtgg gatcgtaata atggcaaaag acctcaccaa 420

gaatttggca tttcaag 437

<210> 3

<211> 3010

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttctcttat tcaagtacct tccgttgaga gggggaaact tagtaaagtt cgcctgggtt 60

cgttgtcttt gaaaaaggaa ggagagagac aatgcttctt atttacaaaa cactttttaa 120

tatgtacaag aagttcagga gggaagcttc atctgctcaa gacaggtggg gttctgtctc 180

taatagactg cacattgatt gaggagccag atgcaagcga tgatgactct aaaggttctg 240

ggcaagtgtt tgggcacctg gattttaaaa tagtggtgga gcctcctgac gctgccgcct 300

tcactgttgt cttgttagca ccctcacgcc aggagaaagc tgcctggatg agtgacatca 360

gtcagtgtgt ggacaatata cgatgtaatg gtttaatgac tatagtgttt gaagagaatt 420

ccaaagtcac tgtgccacat atgattaagt ctgatgcccg tcttcataaa gacgacactg 480

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acatatacaa gaggcctttc acctccatcc ctgtcaggtc attggaattg ttttttgcta 720

ccagccagaa caacagaggt gaacatttgg tggatggcaa atccccacgt ctgtgtcgca 780

aattctcttc cccgccacca ctggctgtgt ccagaacatc ttccccagtg agggccagaa 840

agctgtcttt gacttctccc ttgaactcaa agataggagc attggacctg acaacttcca 900

gcagtcccac caccaccacc cagagtcccg ctgcgtctcc accaccacac actggtcaga 960

taccactgga tctcagcaga ggcctctctt ctccagagca aagcccggga acggtagaag 1020

agaatgtcga taacccacgc gtggatctgt gtaacaagct aaaacgaagt attcaaaaag 1080

cagtcctaga gtctgcacca gcggaccgag caggagtgga aagctcccct gcagcggaca 1140

ccacagaact ttcaccttgc agatccccct caactcctcg gcacctccgc tatcgacagc 1200

ctggaggaca gacggcggac aatgcccact gctctgtttc accggcttct gcttttgcaa 1260

tagccacagc tgcagcagga catgggagtc caccag 1296

<210> 5

<211> 1018

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgatgttct aatcatgtca gataaagatg atattgagac tccactgcta actgaagcag 60

cccccatcct tgaagatgga aactgtgagc cagccaagaa ttctgagtct gttgaccaag 120

gtgccaaacc agagagtaaa tcagaacctg tagtttccac tcggaaaaga ccagagacca 180

aaccttccag tgaccttgag acttcaaaag ttctccctat tcaggataat gtttccaaag 240

atgtacccca gaccagatgg ggttattggg ggagctgggg caagtccata ctctcctcag 300

cctcggctac agtagctaca gtaggacaag gcatttcaaa tgtcatcgag aaggcagaga 360

cttcccttgg aatccctggt cccagtgaaa tttcaactga agtcaagtat gtagcaggag 420

agacaaatgc caaagagaat gaaaactcct ccccagtggc tggggcattt ggtgtattct 480

ctaccatctc tactgctgtt cagagcacac tgatgttcta atcatgtcag ataaagatga 540

tattgagact ccactgctaa ctgaagcagc ccccatcctt gaagatggaa actgtgagcc 600

agccaagaat tctgagtctg ttgaccaagg tgccaaacca gagagtaaat cagaacctgt 660

agtttccact cggaaaagac cagagaccaa accttccagt gaccttgaga cttcaaaagt 720

tctccctatt caggataatg tttccaaaga tgtaccccag accagatggg gttattgggg 780

gagctggggc aagtccatac tctcctcagc ctcggctaca gtagctacag taggacaagg 840

catttcaaat gtcatcgaga aggcagagac ttcccttgga atccctggtc ccagtgaaat 900

ttcaactgaa gtcaagtatg tagcaggaga gacaaatgcc aaagagaatg aaaactcctc 960

cccagtggct ggggcatttg gtgtattctc taccatctct actgctgttc agagcaca 1018

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accaagaatt tggcatttca aga 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcttggatc agtcagaaga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctggacgtc agctcgattg 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgatcagcag ttgagagctt gt 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctgttcaga gcacactgat 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccttggtcaa cagactcaga at 22

Claims

1.一种用于评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所含试剂包含针对hsa_circ_0000277、 hsa_circ_0060394、 hsa_circ_0007773三种circRNAs的上、下游引物，其中，hsa_circ_0000277核苷酸序列为：SEQ ID NO:2；hsa_circ_0060394核苷酸序列为SEQ ID NO:3；hsa_circ_0007773核苷酸序列为：SEQ IDNO:5；所述针对hsa_circ_0000277的上、下游引物为：5'- ACCAAGAATTTGGCATTTCAAGA-3'和5'-GGCTTGGATCAGTCAGAAGA-3'；针对hsa_circ_0060394的上、下游引物为：5'-GCTGGACGTCAGCTCGATTG-3'和5' -TGATCAGCAGTTGAGAGCTTGT-3'；针对hsa_circ_0007773的上、下游引物为：5'- GCTGTTCAGAGCACACTGAT- 3'和5'- CCTTGGTCAACAGACTCAGAAT- 3'。

2.根据权利要求1所述的一种用于评价特发性非梗阻性无精子症患者睾丸显微取精效果的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒选用了18s RNA作为内参。