CN107513556A - 细胞周期调控基因fam114a2的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了细胞周期调控基因fam114a2的应用，经研究发现该基因具有细胞周期调控作用，抑制细胞增殖，因此可以作为细胞周期调控试剂使用，并作为肿瘤治疗的靶基因；并且该基因在肾癌、肝癌、胃癌及癌旁组织中特异性高表达，因此还可以作为肾癌、肝癌、胃癌的诊断标志物，对肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。

Description

细胞周期调控基因fam114a2的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及细胞周期调控基因fam114a2的应用。

背景技术

肿瘤被世界卫生组织界定为世界十大致命疾病之一，因其早期症状隐匿，肿瘤恶性程度高，病情恶化速度快，目前并没有彻底治疗肿瘤的有效方法。近年来，越来越多的研究表明，细胞周期调控相关基因的异常与多种疾病和恶性肿瘤密切相关，因此研究细胞周期调控基因与肿瘤的关系对于全面认识恶性肿瘤发生发展的机制以及对于今后恶性肿瘤的预防和治疗都有非常重要的意义。

细胞周期是一个高度有序的运转过程，这种高度有序的运转是通过细胞周期依赖性激酶复合物(Cyclin/CDKs)调节细胞周期来实现的。Cyclin/CDKs复合物的形成能够促进细胞的增殖，而对该复合物的调控路径十分复杂，其中有3点最为重要的调控方式：(1)CDKs的磷酸化；(2)CDI对CDKs的抑制；(3)cyclin的合成及降解。在细胞增殖的各个时期都存在着检测点，能够对细胞周期的进程进行检测。当细胞周期发生紊乱时，能够合成特异性的细胞周期抑制因子，调控Cyclin/CDKs的活性，阻止细胞周期的运行。细胞周期调控网络的异常与肿瘤的发生发展密切相关，肿瘤发生的标志就是细胞周期失去抑制能够无限的增殖。因此对细胞周期调控的深入研究不仅有助于肿瘤的临床诊断还将为肿瘤治疗开辟崭新的思路，并且为研制抗癌药物提供新的作用靶标而推动肿瘤治疗的发展。

目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗，虽然取得了不可估量的成效，但是距离彻底根治肿瘤还很遥远。随着肿瘤基因治疗方法的开发，人们看到了可能彻底根治肿瘤的希望。基因治疗是一种分子治疗技术，通过将一个治疗基因“捆绑”在“病毒”(经过人工改造的、不能传染、不能复制的病毒载体)上，随后将这种载有治疗基因的“病毒”感染肿瘤患者或肿瘤细胞，使治疗基因进入肿瘤细胞，进而“摧毁”肿瘤细胞。

因此基因治疗药物通常是一种基因工程改造的病毒颗粒，对机体神经系统、内分泌系统和免疫系统具有刺激作用，可综合调控机体的神经—内分泌—免疫网络，产生一系列的神经因子、激素及细胞因子，增强病人的免疫系统功能，有效促进NK细胞、CTL细胞对肿瘤细胞的杀灭；并能有效改善和增强病人各相关器官系统的生理功能，肿瘤病人(尤其是晚期病人)全身情况很快好转，如精神状况好转、食欲增强等。其作用原理是：通过转录调控多种功能不同的分子表达，对肿瘤细胞的生存与增殖信号途径、血管生成及物质能量代谢途径、放化疗抗性、浸润转移等多个方面的活性进行抑制，达到“此消彼长”的效果，协同正面攻势，一举导致细胞凋亡。

目前基因治疗有多种方式：(1)免疫基因治疗：肿瘤的免疫基因治疗是肿瘤基因治疗策略中研究最多的，具体方法有细胞因子基因转移肿瘤细胞、细胞因子基因转移免疫效应细胞、细胞因子基因转移成纤维细胞、人类白细胞抗原基因转移肿瘤细胞、共刺激因子基因转移肿瘤细胞、癌抗原基因瘤苗等；(2)抑癌基因治疗：在体内导入野生型抑癌基因，替代缺失或异常的抑癌基因表达，可以达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。目前研究较为深入的抑癌基因治疗主要运用p53、p16、RB基因等。此外利用核酶、反义技术及RNAi技术能特异地封闭、阻断和干扰致病基因的表达，抑制一些有害基因表达的功能；(3)自杀基因治疗：自杀基因转入肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生某些酶类，将原来无毒的抗病毒药物或化疗前体药物转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞。

但是基因治疗作为肿瘤治疗的手段目前尚不成熟。首先肿瘤的发生涉及很多基因的改变，很难想象只针对个别基因进行基因治疗就能彻底治愈肿瘤。另外，目前基因转移系统的效率尚不能达到肿瘤治疗的临床要求。病毒感染的细胞，通常不只一种。这样，当病毒载体携带基因进入人体，它们改变的不仅是靶细胞。当基因被加入DNA中时，也存在新基因加错地方的可能，因而导致其它损害的危险。此外治愈肿瘤就要使每一个肿瘤细胞都受到基因治疗的作用，否则有复发的可能性，但当前基因转移技术还达不到这一要求。相信随着人们对肿瘤发生与发展机制的深入探讨和基因转移手段进一步完善，这些问题都会找到突破口。同时，我们还应看到现有的有关基因疗法治疗癌症的研究成果显示了一种全新的高效低毒的抗肿瘤疗法的可喜前景。

肿瘤标志物(Tumor Marker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。因此，寻找更为明显方便的肿瘤标记物十分重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供胞周期调控基因fam114a2作为肿瘤诊断标志物或治疗靶基因中的应用；本发明的目的之二在于提供检测细胞周期调控基因fam114a2的试剂在制备诊断肿瘤试剂盒中的应用；本发明的目的之三在于提供细胞周期调控基因fam114a2在制备抑制细胞增殖活力的药物中的应用；本发明的目的之四在于提供干涉细胞周期调控基因fam114a2表达的试剂在制备增强细胞增殖活力的药物中的应用；本发明的目的之五在于提供家蚕细胞周期调控基因Bmfam114a2；本发明的目的之六在于提供家蚕细胞周期调控基因Bmfam114a2的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、细胞周期调控基因fam114a2作为肿瘤诊断标志物或治疗靶基因中的应用。本发明中所述细胞周期调控基因fam114a2可以为任何动物的fam114a2基因，优选为哺乳动物、昆虫、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、甲壳动物、原生动物、腔肠动物、扁形动物或线性动物；肿瘤优选为肾癌、肝癌和胃癌中的一种或多种。更优选的，所述哺乳动物为人类；所述昆虫为家蚕或草地夜蛾。其中家蚕细胞周期调控基因fam114a2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，人细胞周期调控基因fam114a2基因如SEQ ID NO.18所示。

2、检测细胞周期调控基因fam114a2的试剂在制备诊断肿瘤试剂盒中的应用。该试剂盒可以用于诊断的肿瘤优选为肾癌、肝癌和胃癌中的一种或多种；所述细胞周期调控基因fam114a2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.18所示。

3、细胞周期调控基因fam114a2在制备抑制细胞增殖活力的药物中的应用。本发明中，所述细胞周期调控基因fam114a2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.18所示；其中细胞可以为任何动物细胞，如家蚕卵巢细胞系、草地夜蛾细胞系，可以为正常细胞也可以为癌细胞，优选为癌细胞，如人肾透明细胞癌细胞系。

4、干涉细胞周期调控基因fam114a2表达的试剂在制备增强细胞增殖活力的药物中的应用。本发明中，所述细胞周期调控基因fam114a2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.18所示；其中细胞可以为任何动物细胞，如家蚕卵巢细胞系、草地夜蛾细胞系，可以为正常细胞也可以为癌细胞，优选为癌细胞，如人肾透明细胞癌细胞系。

5、本发明克隆了家蚕细胞周期调控基因Bmfam114a2，所述家蚕细胞周期调控基因Bmfam114a2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因ORF框为1731bp，由10个外显子组成，编码576个氨基酸，编码蛋白分子量为62.2kDa。

6、该基因具有调控细胞周期的功能，上调表达后能够抑制细胞增殖活力，下调表达后能够增强细胞增殖活力，因此可以用于制备调控细胞周期的试剂。优选的，所述调控细胞周期为细胞G2期比例减小。

本发明的有益效果在于：本发明通过克隆家蚕细胞周期调控基因Bmfam114a2，发现该基因具有调控细胞周期的功能，上调表达后能够抑制细胞增殖活力，下调表达后能够增强细胞增殖活力，并且该基因在草地夜蛾细胞系以及人肾透明细胞癌细胞系中具有相同的机制，因此可以将细胞周期调控基因fam114a2作为肿瘤诊断标志物或治疗靶基因，特别用于肾癌、肝癌和胃癌的诊断和治疗，对肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为Bmfam114a2基因结构图。

图2为fam114a2系统发生树构建(基于脊椎动物的Fam114a1(Noxp20)、Fam114a2和昆虫中Fam114a2蛋白序列和核苷酸序列的系统发生分析结果，黑色标注为家蚕fam114a2同源蛋白；使用邻接法构建系统发生树，蛋白模型为泊松模型，bootstrap值设置为1000；H.sapiens Noxp20：小鼠Noxp20，NP_612398.2；M.musculus Noxp20：人Noxp20，NP_080943.3；T.guttata Noxp20：斑胸草雀Noxp20，XP_002189709.2；P.sinensis Noxp20：中华鳖Noxp20：XP_014436646.1；L.chalumnae Noxp20：矛尾鱼(腔棘鱼)Noxp20，XP_014348997.1；X.tropicalis Noxp20：非洲爪蟾Noxp20，XP_012809232.1；D.rerio Noxp20：斑马鱼Noxp20，XP_009305588.1；D.rerio Fam114a2：斑马鱼Fam114a2，XP_001923116.1；T.guttata Fam114a2：斑胸草雀Fam114a2，XP_002195015.2；M.musculus Fam114a2：小鼠Fam114a2，NP_001162139.1；H.sapiens Fam114a2：人Fam114a2，XP_005268416.1；A.echinatior Fam114a2：顶切叶蚁FAM114A2，EGI66078.1；H.saltator Fam114a2：印度跳蚁Fam114a2，EFN90129.1；A.cerana ACCB06679：中华蜜蜂ACCB06679，AEY59981.1；B.moriFam114a2：家蚕Fam114a2；P.aegeria Fam114a2：斑点木蝶Fam114a2，JAA78504.1；T.castaneum AGAP004464-PA：赤拟谷盗AGAP004464-PA，XP_971021.1；C.quinquefasciatus Fam114a2：致倦库蚊Fam114a2，EDS40678.1；D.melanogasterCG9590：黑腹果蝇CG9590，NP_650488.1；C.capitata Fam114a2：地中海实蝇Fam114a2，JAC02332.1；A.suum Fam114a2：猪蛔虫Fam114a2，ADY43977.1；C.sinensis Fam114a2：华支睾吸虫Fam114a2，GAA30974.2；E.granulosus Fam114a2：细粒棘球绦虫Fam114a2，CDJ25268.1；H.microstoma Fam114a2：小口膜壳绦虫Fam114a2，CDJ08588.1)。

图3为将构建完成的融合flag标签表达质粒pIZ/V5-DsRed-flag-Bmfam114a2转染BmN-SWU1细胞，72小时后收集细胞，免疫共沉淀结果，最终在提取的蛋白中杂交获得特异银染条带如箭头标注。

图4为利用质谱技术对与fam114a2存在相互作用的蛋白进行了鉴定和分析。样品组Bmfam114a2中共得到谱图4313张，通过Mascot软件进行分析后，匹配到的谱图数量是24张，共鉴定到22个肽段，22个蛋白，对22个蛋白进行GO功能注释。

图5为pIZ/V5-His质粒骨架图以及构建干涉质粒的fam114a2干涉片段结构图。

图6为荧光定量PCR检测干涉或过表达后fam114a2基因的表达情况(A：干涉表达；B：过表达)。

图7为利用流式细胞术分析下调或过表达Bmfam114a2基因后对BmN-SWU1细胞周期的影响；细胞转染后培养72h，DAPI染色，流式细胞仪分选出转染阳性细胞，分析细胞周期变化；下调表达fam114a2后，G2期比例增大；而上调fam114a2后，G2期比例减小(A为对照，B为fam114a2基因过表达，C为fam114a2基因干涉表达)。

图8为流式细胞术分析下调或过表达Bmfam114a2基因后对草地夜蛾细胞系(Sf9)细胞周期的影响；下调表达fam114a2基因后，G2期比例增大，而上调fam114a2后，G2期比例减小(A为对照，B为fam114a2基因过表达，C为fam114a2基因干涉表达)。

图9为对转染成功的家蚕卵巢细胞系进行MTT试验结果。

图10为GV248载体骨架结构图。

图11为干涉fam114a2基因后通过细胞克隆形成技术检测786-o细胞系和HEK293T的增殖活力。

图12为过表达人fam114a2基因后通过细胞克隆形成技术检测HEK293T的增殖活力。

图13为10种不同癌组织的癌旁组织及对应癌组织(肺鳞癌，肺腺癌，甲状腺癌，乳腺癌，食管癌，胰腺癌，直肠癌，肾癌，肝癌，胃癌)中通过免疫组化检测fam114a2蛋白的表达(A：肾癌；B：肝癌；C：胃癌)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、Bmfam114a2基因获得与分析

Bmfam114a2基因来自于西南大学家蚕基因库(Silkworm Gene Bank)的短体蚕(Squab，Sq)突变体的定位克隆，具体方法是：利用基因芯片、品系间多态性等分析，排除了连锁不交换区域内其它基因作为短体蚕候选基因的可能，最终将染色体片段异常区域内的4个基因纳入短体蚕候选基因进行研究，其中一个基因是Bmfam114a2，然后从家蚕基因组中获取了Bmfam114a2基因的完整序列，Bmfam114a2基因长度约为12.3kb，ORF框为1731bp(SEQID NO.1)，由10个外显子组成，编码576个氨基酸，编码蛋白分子量为62.2kDa(图1)。序列比对和结构域分析表明Bmfam114a2蛋白存在一个DUF719(DUF指Domain of unknownfunction)结构域。该基因的结构域在不同物种中具有较高的保守性，但其具体功能仍然未知。

为分析家蚕Bmfam114a2与其他物种fam114a2基因的是否同源，对不同物种的fam114a2核酸序列以及蛋白序列的分析，构建fam114a2系统进化发生树，如图2所示。结果显示，fam114a2在动物中的进化是比较保守的。

根据Bmfam114a2基因ORF，设计克隆Bmfam114a2基因的引物，其引物序列如下：

Bmfam114a2基因上游引物：5’-atggctacaagtgatagtgaa-3’(SEQ ID NO.2)；

Bmfam114a2基因下游引物：5’-ttacacggcacctatttgta-3’(SEQ ID NO.3)；

然后以短体蚕(Squab，Sq)突变体基因组cDNA为模板，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列为引物进行PCR扩增，扩增产物克隆至pMD19-T载体中，经测序验证正确后提取质粒作为后续构建表达载体的PCR模板，-20℃保存备用。

实施例2、构建融合标签表达质粒及Bmfam114a2蛋白功能分析

根据克隆获得Bmfam114a2的全长ORF设计引物，具体引物如下：

5’-tgctctagaatggattacaaggatgacgacgataagatggctacaagtgatagtgaa-3’(SEQID NO.4)，下划线表示Xba I酶切位点；

5’-ccgctcgagttacttatcgtcgtcatccttgtaatccacggcacctatttgta-3’(SEQ IDNO.5)，下划线表示Xho I酶切位点；

然后以含Bmfam114a2基因ORF的pMD19-T载体为模板，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列为引物进行PCR扩增，扩增产物用Xba I和Xho I双酶切，然后连接到PIZ/V5-dsRed载体。转化后挑选单克隆菌斑，经菌液电泳，菌液PCR及双酶切实验验证，送交公司进行测序以确定序列正确性，即获得Bmfam114a2基因融合标签表达质粒。

取构建完成的Bmfam114a2基因融合标签表达质粒，转染细胞培养瓶中的家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1细胞，转染后48h应用荧光显微镜观察，对转染比较理想的细胞再用含Zeocin的培养基培养24h后，去除培养液，用PBS洗一遍，加入1000μL RIPA裂解液(P0013D，碧云天)及12μL PMSF(ST506，碧云天)，在水平摇床冰浴裂解30min，4℃、12000g离心10min，取上清，一组样品再分别取500μL裂解液和10μg抗体FLAG加入到离心后的上清中，在4℃摇晃孵育过夜，取上清同预处理的50μL Protein A/G琼脂糖珠(碧云天)在4℃缓慢摇晃孵育4h，使抗体与Protein A/G琼脂糖珠偶联。免疫沉淀后，在4℃、3000g离心5min，将琼脂糖珠离心至管底，吸去上清，琼脂糖珠用1mL裂解液轻轻冲洗，在4℃、3000g离心5min，重复洗3-4次，最后加入10μL 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水煮5min，进行SDS-PAGE及WesternBlot分析。一抗用兔源Flag-tag抗体(1：1000，碧云天)检测用HA-tag抗体沉淀的BmIAP蛋白；另一组样品用鼠源Flag-tag抗体沉淀flag-fam114a2蛋白，方法同上，结果如图3所示。结果显示，运用免疫共沉淀技术寻找到与Bmfam114a2有潜在作用的蛋白，即与Bmfam114a2存在特异性作用的蛋白条带。

切取特异蛋白条带，进行质谱鉴定并分析与Bmfam114a2存在潜在相互作用的蛋白。具体方法为：SDS-PAGE电泳后，用洁净刀片切下目的条带，双蒸水浸泡，-20℃保存，胶条提交至华大基因公司进行后续的质谱分析。蛋白质胶条鉴定的信息分析主要流程：首先对原始质谱文件转换成质谱峰文件，然后与数据库中的序列进行搜索匹配，并对搜索结果作一些过滤和质量控制，最后给出可信的蛋白鉴定结果。基于蛋白鉴定结果，进行GO，COG，Pathway等功能注释分析。结果显示，根据免疫共沉淀得到的目的蛋白条带有22条氨基酸序列与Bmfam114a2存在潜在作用，然后对蛋白质的功能进行GO功能注释，得到该基因可能在生物体中行使的功能如图4所示，对Bmfam114a2而言，这些蛋白中数量较多的是物质代谢和转运相关的蛋白，值得注意的是其中部分蛋白参与mRNA翻译调控、核糖体组成及蛋白合成后修饰以及细胞骨架等相关作用，因此推测Bmfam114a2可能参与调控细胞周期，并且对肿瘤的发生发展具有重要作用。

实施例3、构建干涉质粒和过表达质粒及转染

根据免疫共沉淀技术得到的可能存在潜在作用的蛋白，对fam114a2进行功能分析的结果，构建了Bmfam114a2昆虫干涉载体以及Bmfam114a2过表达载体。

构建干涉载体：通过在线分析工具BLOCK-iT^TM RNAi Designer预测候选基因的siRNA序列，同时在家蚕基因组数据库中进行比对，排除具有非特异性结合能力的siRNA序列，结果获得fam114a2基因干涉靶序列，具体序列分别为：

靶序列1：5’-tagagatgctatcccggcaagtgaa-3’(SEQ ID NO.6)；

靶序列2：5’-cagagaatacggagcaaatacataa-3’(SEQ ID NO.7)；

根据靶序列合成fam114a2干涉片段，其核酸序列如SEQ ID NO.8所示序列，结构如图5所示。序列中第1～3位为保护碱基，第4～9位为BamH I酶切位点，第46～70位为靶序列1，第86～110位为靶序列1反向互补序列，第172～196位为靶序列2，第212～236位为靶序列2反向互补序列，第267～272位为EcoR I酶切位点，第273位～275位为保护碱基，其余序列为5’端序列，骨架序列和3’端序列。

然后将PIZ/V5-DsRed质粒用BamH I和EcoR I进行双酶切，回收载体骨架，其中，PIZ/V5-DsRed质粒(也称为PIZv₅-DsRed)由PIZ/V5-His质粒多克隆酶切位点5’端处连入DsRed表达框，DsRed表达框中A4启动子驱动DsRed的表达，在紫外光激发下可发出红色荧光，以此指示质粒是否成功转入细胞，在DsRed表达框3’UTR区域插入家蚕actin3的内含子序列，然后在其中插入Sma I、Asc I和Kpn I酶切位点以及T7测序引物序列，结构参见潘彩霞.家蚕BmGBP基因的鉴定及其对BmNPV复制的影响.西南大学硕士学位论文.2015年11月2日)。然后使用T4DNAligase将fam114a2干涉片段与PIZ/V5-DsRed载体骨架连接过夜，获得重组载体，命名为pIZ/V5-Bmfam114a2-miRNA-dsRed，其构建过程其结构如，然后将重组载体转化TransT-1感受态细胞，筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切及测序验证序列正确性。

(2)构建过表达质粒：根据克隆获得Bmfam114a2的全长ORF设计引物，具体引物如下：

5’-tgctctagaatggctacaagtgatagtgaa-3’(SEQ ID NO.9)，下划线表示Xba I酶切位点；

5’-ccgctcgagttacacggcacctatttgta-3’(SEQ ID NO.10)，下划线表示Xho I酶切位点；

然后以含Bmfam114a2基因ORF的pMD19-T载体为模板，SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示序列为引物进行PCR扩增，扩增产物用Xba I和Xho I双酶切，然后连接到pIZ/v5-His载体。转化后挑选单克隆菌斑，经菌液电泳，菌液PCR及双酶切实验验证，送交公司进行测序以确定序列正确性，即获得Bmfam114a2基因过表达质粒。

提取Bmfam114a2基因干涉质粒及过表达质粒，普纯质粒的提取采用全式金试剂盒，操作方法按照相应说明书操作；提取超纯质粒按照EndoFree Mini Plasmid Kit II(离心柱型)(TianGen Biotech(Beijing)Co.,LTD)试剂盒说明书提取无内毒素超纯质粒，用于转染细胞。

昆虫细胞培养和转染，当细胞在细胞培养瓶生长到密度为80％后，将细胞传至放有24孔圆口盖玻片(爬片，Fisher公司)的24孔板中。取Bmfam114a2基因干涉质粒及过表达质粒的超纯质粒各800ng与2μL(质粒和脂质体是3:1的关系)脂质体在无抗生素的细胞培养基中孵育30min，转染BmN-SWU1细胞；提取转染后72h收集细胞使用Trizol reagent或微量RNA抽提试剂盒抽提RNA，经反转录后合成cDNA，用于qRT-PCR检测Bmfam114a2基因的表达水平，同时以转染pIZ/V54-DsRed质粒的细胞作为对照，荧光定量检测引物如下：

qRT-PCR上游引物：5'-gcactactcggcttagctcctg-3'(SEQ ID NO.11)；

qRT-PCR下游引物：5'-gcatctcacataactcagcaacct-3'(SEQ ID NO.12)；

检测结果如图6所示。结果显示，转染过表达载体的细胞Bmfam114a2基因被成功过表达，转染干扰质粒的细胞Bmfam114a2基因被成功干扰表达，表明构建的过表达和干涉质粒均能在家蚕卵巢细胞系(NS)中有效地上调或下调Bmfam114a2的表达水平。

实施例4、Bmfam114a2基因功能分析

1、Bmfam114a2基因后对家蚕卵巢细胞系(BmN-SWU1)细胞周期的影响

为分析在BmN-SWU1中上调或下调Bmfam114a2基因后对细胞周期的影响，使用流式细胞术检测BmN-SWU1的细胞周期变化，具体方法如下：转染后的BmN-SWU1细胞，培养72h，使用2％PFA固定13min，PBS洗3次，使用含0.1％Triton 100和5ng/L的DAPI孵育10min，PBS洗3次。经流式细胞检测，使用550nm光波激发DsRed分选出转染阳性细胞，使用340nm光波激发DAPI分析DNA含量。并以转染pIZ/V5-DsRed质粒后的BmN-SWU1细胞作为对照组，结果如图7所示。结果显示，下调Bmfam114a2能影响细胞周期，即导致G1期细胞减少，促使细胞向G2其转化，而上调各基因表达水平则抑制细胞增殖，即G1期细胞增多，而S期和G2期细胞相对减少。

2、Bmfam114a2基因后对草地夜蛾细胞系Sf9细胞周期的影响

为了验证Bmfam114a2对细胞作用的保守性，在草地夜蛾细胞系Sf9中上调和下调Bmfam114a2(使用质粒与家蚕卵巢细胞系中相同)。细胞转染24h后，使用含zeocin的培养基培养细胞48h，然后提取RNA并合成cDNA，以转染pIZ/V54-DsRed质粒的细胞作为对照，荧光定量PCR检测干涉或过表达fam114a2、基因表达情况。结果表明构建的过表达和干涉在均能有效地上调或下调草地夜蛾细胞系Sf9的fam114a2的表达水平。然后使用流式细胞术检测草地夜蛾细胞系(Sf9)转染后细胞培养72h后的细胞周期情况，具体方法与家蚕卵巢细胞系相同，同时以转染pIZ/V5-DsRed质粒的细胞系作为对照，结果如图8所示。结果显示，草地夜蛾细胞系Sf9中fam114a2基因表达下调后能影响细胞周期，即导致G1期细胞减少，促使细胞向G2其转化，而上调fam114a2表达则抑制细胞增殖，即G1期细胞增多，而S期和G2期细胞相对减少。表明fam114a2基因对鳞翅目昆虫细胞周期的作用具有保守性。

3、Bmfam114a2基因后对BmN-SWU1细胞增殖活力的影响

为进一步明确Bmfam114a2基因对BmN-SWU1的增殖活力是否有影响，对转染成功的家BmN-SWU1进行MTT试验，然后检测细胞OD值的变化，结果如图9所示。结果显示，转染过表达载体的BmN-SWU1细胞OD值较对照组低，而转染干扰质粒的干涉载体的BmN-SWU1细胞OD值较对照组高。表明下调Bmfam114a2基因表达后细胞的增殖活力增强；而上调Bmfam114a2基因表达后细胞增殖活力减弱。

实施例5、fam114a2基因在人类细胞中的作用

鉴于fam114a2可以调控鳞翅目昆虫细胞周期，而细胞周期的改变与肿瘤的发生与发展息息相关，在人体细胞中是否存在相同的机制需要进一步验证。因此我们构建了fam114a2-shRNA人类干涉载体，载体骨架使用GV248，结构如图10所示，干涉靶序列如下：5’-gagtaaatcagaacctgta-3’(SEQ ID NO.13)，然后根据靶序列设计shRNA，正向序列为5’-ccgggagagtaaatcagaacctgtactcgagtacaggttctgatttactctctttttg-3’(SEQ ID NO.14)；反向序列为：5’-aattcaaaaa gagagtaaatcagaacctgtactcgagtacaggttctgatttactctc-3’(SEQ ID NO.15)，将干涉靶序列连入GV248载体(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)的EcoRⅠ和Agel酶切位点处，然后将该载体转染人肾透明细胞癌细胞系(786-o)和HEK293T细胞系，人肾透明细胞癌细胞系786-o和HEK293T细胞系采用如下方法培养：(1)加适量的HEPES、抗生素(青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)，置于37℃、5％CO₂混合气体的无菌恒温培养箱中培养；(2)取对数生长期的各组细胞，分别用质量分数为0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10％胎牛血清的DMEM培养液中备用；(3)将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL经37℃预温培养液的培养皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃、5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周；(4)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。(5)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数，最后计算克隆形成率。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％，结果如图11所示。由于细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。结果显示，构建人源干涉载体fam114a2-shRNA，转染人肾透明癌细胞系(786-o)和HEK293T细胞系干涉该基因后786-o细胞系和HEK293T细胞系活力增强。根据实验结果，可以预测fam114a2在癌细胞中高表达后，可以抑制癌细胞增殖，是否具有此效果通过以下实验进行验证。

根据报道的人fam114a2基因序列(Genbank：NM_018691)设计克隆人fam114a2基因编码区的引物，具体如下：

FAM114A2(18891-1)-P1：5’-taccggactcagatctcgagcgccaccatgtcagataaagatgatattg-3’(SEQ ID NO.16)，下划线表示XhoI酶切位点；

FAM114A2(18891-1)-P2：5’-gatcccgggcccgcggtaccgtatgttctaacaaaggtttctggc-3’(SEQ ID NO.17)，下划线表示KpnI酶切位点；

然后以SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17为引物，人cDNA为模板进行PCR扩增，获得人fam114a2编码区序列，其中人fam114a2基因ORF如SEQ ID NO.17所示，然后经获得的序列经XhoI/KpnI酶切后连入同样经XhoI/KpnI酶切的GV203载体上(GV203载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司)，获得人fam114a2过表达载体。然后按照上述相同方法转染HEK293T细胞系，然后计算克隆形成率，结果如图12所示。结果显示，fam114a2过表达能够抑制癌细胞增殖，表明fam114a2在人类细胞中存在相同的机制，因此fam114a2可以作为肿瘤基因治疗的潜在靶标。

鉴于fam114a2可以调控人类肿瘤细胞增殖，那么是否在临床肿瘤疾病中存在表达差异。因此在10种不同癌组织的癌旁组织及对应癌组织(肺鳞癌、肺腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、直肠癌、肾癌、肝癌、胃癌)中通过免疫组化检测fam114a2蛋白的表达。免疫组化方法如下：(1)常规病理组织固定、脱水、透明，石蜡包埋后制备4～8μm切片；(2)脱蜡步骤要求甚严：切片于烤片灯下烘烤15～20min后迅速移入二甲苯I中脱蜡20min，依次：二甲苯II 20min(必要时二甲苯III，20min)，无水乙醇5min，再用无水乙醇5min，90％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，清水漂净乙醇；(3)水化：PBS溶液漂洗切片三次，每次5min，对于胞浆型抗原染色，于第三次漂洗时换用0.2％Triton/PBS溶液漂洗5min；(4)内源性过氧化酶阻断：采用3％过氧化氢溶液37度封闭切片15min以阻断内源性过氧化酶；(30％过氧化氢：甲醇：水＝1：1：8)；(5)PBS漂洗三次，每次3min；(6)抗原修复：采用41ml A液+9mlB液终定容至500ml的pH 6.06的枸橼酸钠溶液微波修复切片，修复程序为：800W功率(或高火)2.5min至溶液沸腾后，调节功率为80W或(中低火)维持沸腾状态16min，修复完毕后，置于冰水中迅速降温至室温；(7)PBS漂洗切片三次，每次3min；(8)施加fam114a2一抗：抗体稀释从1：100开始摸取浓度。添加一抗后，37度孵育抗体1小时，后转入4度冰箱过夜；(9)次日，取出切片，室温复温后PBS漂洗切片三次，每次5min；(10)滴加二抗，方法同一抗，37度孵育切片30min；(11)滴加DAB，镜下显色后自来水适时终止显色反应；(12)苏木精衬染切片3min，盐酸酒精分化，热水蓝化；(13)切片脱水步骤：75％乙醇5min；80％乙醇5min；90％乙醇5min；无水乙醇I，5min；无水乙醇II 5min；烘干切片后，二甲苯树脂溶液封片。修复液A液和B液的配制：A液：枸橼酸钠称取14.7g，加入500ml去离子水溶解；B液：枸橼酸称取10.5g，加入500ml溶解即可。

结果如图13所示，结果显示fam114a2在肾透明细胞癌癌旁组织、肝癌癌旁组织以及胃癌癌旁组织中特异性高表达，而在其对应的癌组织中不表达或低表达，表明fam114a2可以作为肾透明细胞癌、肝癌、胃癌的鉴定标志物。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.细胞周期调控基因fam114a2作为肿瘤诊断标志物或治疗靶基因中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肾癌、肝癌和胃癌中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述细胞周期调控基因fam114a2选自哺乳动物、昆虫、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、甲壳动物、原生动物、腔肠动物、扁形动物或线性动物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述哺乳动物为人类；所述昆虫为家蚕或草地夜蛾。

5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于：所述细胞周期调控基因fam114a2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.18所示。

6.检测细胞周期调控基因fam114a2的试剂在制备诊断肿瘤试剂盒中的应用。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肾癌、肝癌和胃癌中的一种或多种。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述细胞周期调控基因fam114a2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.18所示。

9.细胞周期调控基因fam114a2在制备抑制细胞增殖活力的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述细胞周期调控基因fam114a2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.18所示。

11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述细胞为癌细胞。

12.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述细胞为家蚕卵巢细胞系、草地夜蛾细胞系或人肾透明细胞癌细胞系。

13.干涉细胞周期调控基因fam114a2表达的试剂在制备增强细胞增殖活力的药物中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述细胞周期调控基因fam114a2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.18所示。

15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述细胞为癌细胞。

16.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述细胞为家蚕卵巢细胞系、草地夜蛾细胞系或人肾透明细胞癌细胞系。

17.家蚕细胞周期调控基因Bmfam114a2，其特征在于：所述家蚕细胞周期调控基因Bmfam114a2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

18.权利要求17所述家蚕细胞周期调控基因Bmfam114a2在制备调控细胞周期的试剂中的应用。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于：所述调控细胞周期为细胞G2期比例减小。