CN113462763A - 靶向检测软组织肿瘤小圆细胞肿瘤融合基因panel设计试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因测序技术领域，公开了一种靶向检测福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒，包括：DNA提取试剂用于DNA提取；RNA提取和转录试剂用于cDNA获取；30基因的多重PCR引物及多重PCR扩增试剂用于30基因的特异性扩增；DNA纯化磁珠用于产物的纯化；建库试剂用于建立二代测序用的DNA/cDNA的文库。本发明合成30基因多重PCR引物，然后在相关生物公司合成引物，在最大限度地减少DNA熔解温度的不匹配得到的情况下完成进行多重PCR，完成目标融合基因的扩增的检测；本发明所用试剂均可通过购买的商业化试剂进行配制或直接购买。本发明可为软组织小圆细胞肿瘤中各类肿瘤的诊断及鉴别诊断提供直接遗传学依据。

Description

靶向检测软组织肿瘤小圆细胞肿瘤融合基因panel设计试 剂盒
技术领域
本发明属于基因测序技术领域，尤其涉及一种靶向检测软组织肿瘤小圆细胞肿瘤融合基因panel设计试剂盒。
背景技术
目前，临床工作中，软组织小圆细胞肿瘤,如骨外尤因肉瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、差分化性滑膜肉瘤等在形态学上有一定的相似性，诊断相对困难。近年来，随着分子检测手段的进步，一些特征性的融合基因在软组织小圆细胞肿瘤中相继被发现，为软组织小圆细胞肿瘤的诊断提供了有力的分子学依据。
但是，传统的外显子测序和全基因组测序价格昂贵，测序深度不够，针对性差，对样本要求高，且对特定融合基因的检出能力有限。因此，亟需一种新的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的试剂盒。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统的外显子测序和全基因组测序价格贵，测序深度不够，针对性差，对样本要求高，且对特定融合基因的检出能力有限。
解决以上问题及缺陷的难度为：为解决以上问题，本发明在传统二代测序的基础上进行了一定的更新和改进。首先本发明缩小了基因检测范围,靶向基因panel中基因较少，建库和后续分析均更具指向性；其次应用了靶向多重PCR扩增技术，在样本量较少时仍可使用；DNA和RNA双水平检测，增加检出率及可信度。
解决以上问题及缺陷的意义为：该技术若能广泛应用于临床，将大大提高病理科医生在软组织小圆细胞肿瘤中的诊断效率，降低病人就医成本，实现病理医生和患者的“共赢”。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒，具体涉及一种靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒及其构建方法。
本发明是这样实现的，一种靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒，所述靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒由DNA提取试剂、RNA提取及转录试剂、多重PCR引物、多重PCR扩增二代测序试剂、DNA纯化磁珠及扩增建库试剂组成。本发明的另一目的在于提供一种应用所述的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒的构建方法，所述靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒的构建方法包括以下步骤：
步骤一，确定软组织小圆细胞肿瘤30融合基因panel
首先，本发明总结了软组织的小圆细胞肿瘤，包括骨外尤文肉瘤、小蓝圆细胞未分化肉瘤(CIC-DUX4肉瘤+BCOR-CCNB3肉瘤)、神经母细胞瘤、嗅神经母细胞瘤、婴幼儿色素性神经外胚层瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、上皮样横纹肌肉瘤、差分化黏液样(圆细胞)脂肪肉瘤、恶性肾外横纹肌样瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、血管球瘤(包括非典性和恶性血管球瘤)、副神经节瘤、弥漫性腱鞘巨细胞瘤、骨外间叶性软骨肉瘤、富于细胞性骨外粘液样软骨肉瘤、骨外小细胞性骨肉瘤、差分化小细胞性滑膜肉瘤等。
然后查阅以上所有肿瘤的最新的文献资料(包括中英文文献，权威书籍)，确定在小圆细胞中已经报道的不同肿瘤诊断融合基因中涉及基因及其配对基因，并进行整理。整理结果如下：
WT1,SSX4,SSX2,SSX1,SS18,PAX7,PAX3,NR4A3,NOTCH,NFATC2,NCOA2,NCOA1,MIR143,HEY1,FUS,FOXO4,FOXO1,FLI1,FEV,EWSR1,ETV4,ETV1,ERG,DUX4,DD1T3,CSF1,COL6A3,CIC,CCNB3,BCOR。
步骤二，多重PCR引物设计
融合基因panel中所有涉及基因的多重PCR引物均使用NGS-PrimerPlex软件进行设计。(参考文献：Kechin A,Borobova V,Boyarskikh U,Khrapov E,Subbotin S,Filipenko M.NGS-PrimerPlex:High-throughput primer design for multiplexpolymerase chain reactions.PLoS Comput Biol.2020 Dec 30；16(12):e1008468)
步骤三，提取并纯化FFPE样本DNA和RNA，逆转RNA为cDNA
1,提取FFPE样本中DNA
(1)准备样本：根据组织大小不同切取10μm厚的石`蜡组织切片10张(肿瘤组织)。
(2)脱蜡：将切取的石蜡组织切片置入1.5ml收集管中，加入1ml二甲苯，涡旋混匀；室温下，离心2min(12000rpm)；离心结束后，弃掉上部清亮液体；加入1ml无水酒精，再次充分振荡，离心2min(12000rpm)；弃掉上部液体(切记勿动下部组织)；室温下打开管盖，静置5-6min至所有残余酒精全部挥发。
(3)消化：加入180μl蛋白酶K缓冲液及20μl蛋白酶K，充分振荡；将收集管放入56℃的金属浴仪器中，孵育至组织消化完全(3～5h)；取出后放入90℃金属浴锅内，孵育1h；取出并低速离心，将2ml收集管盖子以及侧壁的液体甩入瓶中。
(4)去除RNA:待标本冷却至室温时，加入2μl RNase A，用以去除溶液中残存的RNA
(5)DNA纯化：加入180μl蛋白酶K缓冲液和500ml无水乙醇，吹打混匀；将DNA提取用离心柱放入2ml收集管，将得到的混合物转移至DNA提取用离心管柱；离心1min(8000rpm)后，弃掉收集管中液体。加入500μl清洗液1，离心1min(8000rpm)，弃掉收集管中液体；将离心柱转移至一个新的2ml收集管。加入500μl清洗液2，离心3min(14000rpm)离心，弃掉废液及收集管；将离心柱转移到一个新的1.5ml收集管。最大转速离心1min。
(6)收集DNA.将离心柱转移到一个新的1.5ml收集管。小心打开离心柱，加入50-200μ无DNA酶的水，室温孵育1-5min，离心1min(8000rpm)。测浓度，储存至-20℃冰箱。
2,提取FFPE样本中RNA
(1)～(3)同1.(1)～(3)。
(4)去除DNA:待标本冷却至室温时，加入2μl DNAase I及18μl DNAase I，用以去除溶液中残存的DNA；
(5)RNA纯化：加入180μl蛋白酶K缓冲液和500ml无水乙醇，吹打混匀；将RNA提取用离心柱放入2ml收集管，将得到的混合物转移至RNA提取用离心管柱；其余步骤同DNA提取步骤。
(6)收集RNA.将离心柱转移到一个新的1.5ml收集管。小心打开离心柱，加入50-200μ无RNA酶的水，室温孵育1-5min，离心1min(8000rpm)。测浓度，储存至-80℃冰箱。
3,逆转RNA至cDNA
(1)取1-2μg RNA,加入无RNA/DNA酶的水,逆转录酶，dNTP，缓冲液等配成相应体系。
(2)上机，程序：37℃15min，85℃5sec，4℃∞。
步骤四,多重PCR靶向扩增并纯化目的基因的DNA/cDNA
(1)使用商业化的多重PCR体系：加入DNA/cDNA模板，引物混合物，商业化PCR混合试剂，无RNA酶的水。配成多重PCR扩增体系。整个过程最好在冰上进行。
(2)使用标准多重PCR流程：
首先是设置程序95℃，15min激活DNA多聚酶。
然后按照94℃(30s)+40×[57–63℃(90s)+72℃(90s)]+72℃(10min)程序上机，获得目标产物。
(3)纯化：使用商业化纯化磁珠及试剂纯化目标产物。
步骤五：建立目标DNA/cDNA文库
(1)末端修复，加尾及连接：使用商业化体系：纯化后多重PCR产物，扩增酶，商业化试剂，无DNA酶的水配成一定反应体系设置程序25℃，30min，上机，获得目标
DNA/cDNA文库。
(2)纯化：使用商业化纯化磁珠及试剂纯化目标产物。
步骤六,Illumina二代测序平台进行测序
选用Illumina Miseq测序平台进行测序，上机，测序深度1000×
步骤七,测序分析软件进行分析
(1)去除无效数据：如长度小于50bp的数据。
(2)联合应用BWA(v0.6.2)28和BLAT(v35)29将结果序列hg19参考基因库比对分析融合基因。数据处理原则：a.融合基因嵌合序列旁至少要分别有两个配对基因的25个碱基的非嵌合序列。b.嵌合基因旁两个配对子序列必须隶属于不同的基因。
本发明的另一目的在于提供一种所述的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒在靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明的试剂盒的结构包括：(1)DNA提取试剂用于DNA提取；(2)RNA提取和转录试剂用于cDNA获取；(3)30基因的多重PCR引物及多重PCR扩增试剂用于30基因的特异性扩增；(4)DNA纯化磁珠用于产物的纯化；(5)建库试剂用于建立二代测序用的DNA/cDNA的文库。本发明的试剂盒的制备：本发明使用NGS-PrimerPlex软件设计30基因多重PCR引物，然后在相关生物公司(如北京擎科生物科技有限公司)合成引物；本发明所用试剂均可通过购买的商业化试剂进行配制或直接购买。
本发明的试剂盒组分创新：(1)首次确定了针对软组织小圆细胞肿瘤诊断的融合基因panel，此融合基因panel中30基因对软组织小圆细胞肿瘤有极强的靶向性，可为软组织小圆细胞肿瘤中各类肿瘤的诊断及鉴别诊断提供直接遗传学依据。(2)采用NGS-PrimerPlex软件进行引物多重引物设计，可用专有算法来设计出最佳的多路引物集，最大限度地减少DNA熔解温度的不匹配，以设计出熔解温度最为匹配且扩增效率较高的多重PCR引物。
本发明提供的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒，对样本要求低，石蜡样本，新鲜样本，血液样本均可用于检测；靶向扩增技术的应用，在样本量较少时仍可使用；靶向基因panel中基因较少，在后续分析中更具指向性；DNA和RNA双水平检测，增加检出率及可信度；省时，节约成本，能够小范围内靶向检测分析融合基因的情况，节省患者就医成本并更加高效的应用于临床诊断工作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是佐证本发明必要性的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的某知名国内公司涉及的425基因panel示意图，基因虽然很多，但多为上皮性肿瘤驱动基因，其中涉及到软组织肿瘤，尤其是软组织小圆细胞肿瘤相关的基因较少，不适合应用于软组织小圆细胞肿瘤融合基因的检测。此外，该425基因panel检测基因较多，成本偏大。目前测序公司提供基因panel多存在上述问题。
图3是本发明实施例提供的DNA检出但RNA水平未检测出融合基因，且一代测序验证仅发现DNA水平融合示意图，该发现提示我们双DNA和RNA水平检测的重要性，若仅行RNA检测不能说明其不存在该基因融合，而我们的试剂盒采用DNA和RNA双水平检测，可规避该问题。
图4是本发明实施例提供的DNA，RNA双水平融合基因，且一代测序验证发现RNA水平融合示意图，为我们的试剂盒DNA和RNA双水平检测提供了参考。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒由DNA提取试剂、RNA提取及转录试剂、多重PCR引物、多重PCR扩增二代测序试剂、DNA纯化磁珠及扩增建库试剂组成。
如图1所示，本发明实施例提供的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒的构建方法包括以下步骤：
S101，确定软组织小圆细胞肿瘤30融合基因panel；
S102,多重PCR引物设计；
S103，提取并纯化FFPE样本DNA和RNA，逆转RNA为cDNA；
S104，靶向扩增并纯化基因panel的DNA/cDNA；
S105，建立目标DNA/cDNA文库；
S106,使用Illumina二代测序平台进行测序；
S107，使用测序分析软件进行分析。
本发明实施例提供的30基因panel为SEQ ID NO：
Figure BDA0003030315800000061
Figure BDA0003030315800000071
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
1.现国内二代测序平台涉及平台多涉及为癌基因，专门做软组织肿瘤的公司较少，且价格昂贵，比如某知名国内公司涉及的425基因panel中，就不包括软组织肿瘤诊断过程中常涉及的基因如BCOR，EWSR1,USP6,HEY1,NACO1等(见图2)。本发明采取30基因panel，专门针对小圆细胞瘤。在某种程度上增强测序及数据分析靶向性，降低测序和分析成本，同时可为临床医生和病人提供更简单易懂的测序数据。
2.之前的测融合基因多推荐用RNA测序，但是由于国内石蜡储存样本问题，在之前的测序样本本发明通过二代测序并未测出融合基因，但是采用DNA和RNA双水平检测后均取得不错效果。
样本案例1：DNA检出但RNA水平未检测出融合基因，且一代测序验证仅发现DNA水平融合(见图3)。
样本案例2：图4是本发明实施例提供的DNA/RNA双水平融合基因，且一代测序验证发现RNA水平融合示意图。
(见图4)。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种靶向检测福尔马林固定石蜡包埋的软组织小圆细胞肿瘤软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒，其特征在于，所述靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒由DNA提取试剂、RNA提取及转录试剂、多重PCR引物、多重PCR扩增二代测序试剂、DNA纯化磁珠及扩增建库试剂组成。
2.一种应用如权利要求1所述的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒的构建方法，其特征在于，所述靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒的构建方法包括以下步骤：
步骤一，确定软组织小圆细胞肿瘤30融合基因panel；
步骤二，设计多重PCR引物；
步骤三，提取FFPE样本DNA和RNA，逆转RNA为cDNA；
步骤四，多重PCR靶向扩增目标基因的DNA/cDNA并纯化；
步骤五，建立目标基因DNA/cDNA文库；
步骤六，使用Illumina二代测序平台进行测序；
步骤七，使用测序分析软件进行分析。
3.如权利要求2所述的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒的构建方法，其特征在于，所述用于软组织小圆细胞肿瘤融合基因检测的30融合基因panel为：
WT1,SSX4,SSX2,SSX1,SS18,PAX7,PAX3,NR4A3,NOTCH,NFATC2,NCOA2,NCOA1,MIR143,HEY1,FUS,FOXO4,FOXO1,FLI1,FEV,EWSR1,ETV4,ETV1,ERG,DUX4,DD1T3,CSF1,COL6A3,CIC,CCNB3,BCOR。
4.一种如权利要求1所述的靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因的二代测序试剂盒在靶向检测软组织小圆细胞肿瘤融合基因中的应用。
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