CN114369664B - 用于胰腺癌筛查的标志物、探针组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于胰腺癌筛查的标志物、探针组合物及其应用，所述标志物选自2个标志物的任一种。本发明使用所述的标志物，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测，并且，本发明所述的组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，降低了侵入性检测造成的危害，所述的组合物具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于胰腺癌筛查的标志物、探针组合物及其应用。
背景技术
在美国，胰腺癌近10年来以每年0.5％的速度上升，法国、日本、中国也都出现过类似的现象，据2014年我国癌症中心的数据显示，从发病数来看，胰腺癌的发病数并不是特别高，在2014年占各大癌症发病数排名第10位，约为9.2万例，但是它的死亡率特别高，死亡的人数达到了8.1万例，也就是发病率和死亡率接近1：1的比例。对于胰腺癌的病人，如果能够早发现、早诊断、早治疗，大部分早期的胰腺癌病人，通过根治性手术切除都是可以彻底治愈。中期的胰腺癌病人，手术治疗的同时需要配合化疗、放疗、靶向药物治疗控制病情，防止复发。晚期的胰腺癌病人，一般是不适合手术治疗，需要通过化疗、放疗、靶向药物治疗、干细胞移植治疗等等控制病情，减轻症状，延长寿命。胰腺癌的早期诊断的检查手段包括胰腺的CT和增强CT检查、胰腺的核磁共振以及胰腺的增强核磁共振检查，必要的时候还可以做全身的PET-CT检查。但这些手段在灵敏性和特异性方面各参差不齐。目前，DNA甲基化已被证明具有组织特异性,可用于早期癌症检测，并可根据循环肿瘤DNA(ctDNA)甲基化特征追踪到肿瘤原发部位。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种检测胰腺癌的标志物以及探针组合物，可以用于胰腺癌的筛查，所述的标志物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，以及癌症患者的预后检测，降低了侵入性检测造成的危害，并且具有更高的灵敏度和准确性。
本发明具体技术方案如下：
1.一种用于检测胰腺癌的标志物，所述标志物为SPESP1或KIAA1328。
2.根据项1所述的标志物，所述标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，优选所述标志物为甲基化后的标志物。
3.一种探针组合物，所述探针组合物包含靶向甲基化后的标志物的探针；
所述标志物为项1或2所述的标志物。
4.根据项3所述的探针组合物，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的低甲基化的区域杂交；
优选的，所述第一探针组合物包括n个探针，所述n个探针与经重亚硫酸盐转化的高甲基化的区域的正义链和/或反义链的每个核苷酸杂交；
优选的，所述第二探针组合物包括m个探针，所述m个探针与经重亚硫酸盐转化的低甲基化的区域的正义链和/或反义链的每个核苷酸杂交；
优选的，n和m均是1-10中的任意整数；
优选的，第n-1个探针和第n个探针之间有x1个核苷酸重叠，优选的，x1为0-100中的任意整数；
优选的，第m-1个探针和第m个探针之间有x2个核苷酸重叠，优选的，x2为0-100中的任意整数；
进一步优选的，所述第一探针组合物包括如SEQ ID NO:3-6中的一种或两种，所述第二探针组合物包括如SEQ ID NO:7-10中的一种或两种。
5.标志物在制备用于检测胰腺癌的试剂盒中的用途，所述标志物为SPESP1或KIAA1328。
6.根据项5所述的用途，所述标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，优选所述标志物为甲基化后的标志物；
优选的，所述探针组合物用于靶向胰腺癌的甲基化后的标志物；
优选的，所述探针组合物为项3或4所述的探针组合物。
7.一种用于胰腺癌检测的组合物，所述组合物包括用于检测甲基化后的SPESP1或KIAA1328的核酸。
8.根据项7所述的组合物，所述标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
9.根据项7或8所述的组合物，所述核酸包括项3或4所述的探针组合物；
优选的，所述核酸包括：
引物，所述引物为所述标志物的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列；
优选的，所述核酸还包括：
探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下与所述标志物的靶序列中的至少15个核苷酸片段杂交，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列；
优选的，所述组合物还包括将标志物的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂；
优选的，所述用于检测标志物的靶序列甲基化的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
10.一种试剂盒，包含用于检测项1或2所述的标志物的试剂或者项3或4所述的探针组合物或者项7-9中任一项所述的组合物。
11.一种芯片，包含项1或2所述的标志物或者项3或4所述的探针组合物或者项7或8所述的组合物。
本发明的发明人利用表观基因组和生物信息学技术，通过分析胰腺癌的基因组甲基化数据，寻找到了多个与胰腺癌相关的甲基化基因，并确定了胰腺癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且通过这个甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测。
本发明所述的组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，降低了侵入性检测造成的危害，所述的组合物具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。
具体实施方式
下面对本发明做以详细说明。虽然显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明提供了一种检测胰腺癌的标志物，所述标志物为SPESP1或KIAA1328。
在一个实施方案中，所述标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，优选的，所述标志物为甲基化后的标志物。
其中，SPESP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；KIAA1328的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
其中，上述所述标志物的序列均是未经重亚硫酸盐转化的序列。
本发明提供了一种探针组合物，所述探针组合物包括靶向所述标志物甲基化的探针。
所述甲基化指的是发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，作为一种对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制，DNA甲基化时，基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉寂，因此它与肿瘤的发生关系密切。异常甲基化包括抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化、重复序列DNA的低甲基化、某些基因的印记丢失，其与多种肿瘤的发生有关。
本发明所述的甲基化可以为甲基化水平、甲基化程度或甲基化状态，当分析这样的靶序列的甲基化时，本领域技术人员可以使用定量测定方法来确定甲基化。
所述探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，其可利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合(杂交)，形成双链复合物(杂交体)。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果。在本申请中，与探针互补结合或杂交的区域为特异性靶区域，多个探针组合成探针组合物。
在一个实施方案中，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的低甲基化的区域杂交。
所述高甲基化指的是标志物经重亚硫酸盐转化后，碱基C变成碱基U，但是如果是碱基CG，则碱基C保持不变；
所述低甲基化指的是标志物经重亚硫酸盐转化后，所有的碱基CG都没有发生甲基化，碱基C均变成碱基U。
由于每个人的甲基化状态不同，标志物经重亚硫酸盐转化得到的序列也不同，在此示出了每个标志物的一种极端情况，即该区段所有的CG都处于高甲基化状态，并示出了其互补链的高甲基化状态序列：
SEQ ID NO:1的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:11所示；
SEQ ID NO:1互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:12所示；
SEQ ID NO:2的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:13所示；
SEQ ID NO:2互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:14所示；
同理，由于每个人的甲基化状态不同，在此示出了一种极端的情况，即所有的CG都处于低甲基化状态，也示出了其互补链的低甲基化状态序列：
SEQ ID NO:1的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:15所示；
SEQ ID NO:1互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:16所示；
SEQ ID NO:2的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:17所示；
SEQ ID NO:2互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:18所示。
在一个实施方案中，所述第一探针组合物包括n个探针，所述n个探针与经重亚硫酸盐转化的高甲基化的正义链和/或反义链的区域每个核苷酸杂交。
所述第二探针组合物包括m个探针，所述m个探针与经重亚硫酸盐转化的低甲基化的区域的正义链和/或反义链的每个核苷酸杂交。
对于第一探针组合物和第二探针组合物中探针的个数，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，m和n可以为1-10中的任意整数，m和n既可以是相同的，也可以是不同的。
例如，m和n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的任意整数，优选的，m＝n＝2。
在一个实施方案中，第n-1个探针和第n个探针之间有x1个核苷酸重叠，优选的，x1为0-100中的任意整数；
优选的，第m-1个探针和第m个探针之间有x2个核苷酸重叠，优选的，x2为0-100中的任意整数。
其中，x1和x2可以是相同的，也可以是不同的，当x1为0时，表明第n-1探针的尾部与第n个探针的首部相连接，同理，当x2为0时，表明第m-1探针的尾部与第m个探针的首部相连接。
本发明通过将探针组合物与经过重亚硫酸盐转化的标志物进行杂交，其中，高甲基化的第一探针组合物与高甲基化的区域杂交，低甲基化的第二探针组合物与低甲基化的区域杂交，从而能够高效准确地检测靶序列的甲基化水平，进而能够用于胰腺癌筛查。
在一个实施方案中，所述高甲基化的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:3-6中的一种或两种。
所述低甲基化的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:7-10中的一种或两种。
其中，用于与SPESP1甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列；
用于与KIAA1328甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:5-6所示的核苷酸序列；
用于与SPESP1甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:7-8所示的核苷酸序列；
用于与KIAA1328甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:9-10所示的核苷酸序列；
本发明提供了标志物在制备用于检测胰腺癌的试剂盒中的用途，所述标志物为SPESP1或KIAA1328。
在一个实施方案中，所述标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，优选所述标志物为甲基化后的标志物。
本发明提供了探针组合物在制备用于检测胰腺癌的试剂盒中的用途，所述探针组合物用于靶向胰腺癌甲基化后的标志物。
在一个实施方案中，所述探针组合物为上述所述的探针组合物。
本发明提供了一种用于胰腺癌检测的组合物，所述组合物包括用于检测甲基化后的SPESP1或KIAA1328的核酸，优选的，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2。
在一个实施方案中，所述核酸包括上述所述的探针组合物。
在一个实施方案中，所述核酸包括：
引物，所述引物为所述标志物的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
其中，如果使用重亚硫酸盐对待测样本NDA进行转化，则用于检测标志物的靶序列甲基化的核酸包括对标志物的靶序列进行重亚硫酸盐转化后的序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述核酸还包括：
探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下与所述标志物的靶序列中的至少15个核苷酸片段杂交，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述所述组合物还包括将标志物的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂，例如试剂可以为重亚硫酸盐等；优选的，所述用于检测标志物的靶序列甲基化的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
所述阻断剂是为了提高PCR扩增引物的扩增特异性，阻断剂核苷酸序列的5’端与正向或反向引物的3’端核苷酸序列有大于或等于5个核苷酸的重叠区域，阻断剂与正向或反向引物互补与目标基因靶序列DNA的同一条链，阻断剂的解链温度高于正向或者反向引物超过(包括)5℃，阻断剂的核苷酸序列包含至少一个CpG二核苷酸序列，并与重亚硫酸盐转化后的未发生甲基化的目标基因靶序列DNA的序列互补。因此，当所要检测的生物样本的基因组DNA是处于甲基化和非甲基化状态的混合物时，尤其是处于甲基化状态的DNA远远少于处于非甲基化状态的DNA的情况下，处于非甲基化状态的DNA经重亚硫酸盐转化后，会优先与阻断剂相结合，从而以及DNA模板与PCR义务结合，因而不发生PCR扩增，而处于甲基化状态的DNA不与阻断剂相结合，因而与引物集合，发生PCR扩增，之后直接或间接地检测通过扩增获得的片段。
本发明提供了一种试剂盒，其包括上述所述的标志物或者上述所述的探针组合物或者上述所述的组合物。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于容纳受试者生物样品的容器。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括使用和解释检测结果的说明。
所述生物样品例如可以为外周血全血、血浆或血清。
本发明对于使用上述试剂盒检测靶序列甲基化水平的方法，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如本发明提供了一种使用上述所述的试剂盒检测标志物靶序列甲基化水平的方法，其包括下述步骤：
采集受试者样品；
提取纯化所述样品中的DNA；
针对纯化的DNA样品构建用于测序的DNA文库；
用重亚硫酸盐转化所述构建的DNA文库；
预PCR扩增所述经重亚硫酸盐转化的DNA文库；
利用探针组合物对经预PCR扩增的样品进行杂交捕获；
利用PCR扩增经杂交捕获后的产物；
对PCR扩增后的经杂交捕获后的产物进行高通量二代测序；
对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平；
基于已有样本的甲基化情况计算每个标志物的阈值，基于所述样本的某个标志物甲基化水平判读所述患者的患病情况，如果样本的某个标志物的甲基化水平超过阈值为癌症样本，如果低于阈值为健康人样本。
还例如，本发明提供了一种使用上述所述的试剂盒检测标志物的靶序列甲基化水平的方法，其包括下述步骤：
(1)抽取受试者外周血，分离血浆或血清；
(2)抽取血浆或血清中的游离DNA；
(3)使用试剂处理步骤(2)所得到的游离DNA，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转为为尿嘧啶或其他碱基，即标志物的靶序列的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其他碱基，转化后的碱基在杂交性能方面不同于5位未甲基化的胞嘧啶碱基，并且是可检测的；
(4)将经步骤(3)处理过的游离DNA与DNA聚合酶和所述标志物的靶序列的引物接触，使得所述经处理的标志物的靶序列被扩增以产生扩增产物或不被扩增；所述经处理的标志物的靶序列如果发生DNA聚合反应，会产生扩增产物；所述经处理的标志物的靶序列如果不发生DNA聚合反应，则不被扩增；
(5)用探针检测扩增产物；
(6)基于所述扩增产物是否存在，确定所述标志物的靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态，从而确定标志物的靶序列的甲基化水平。
本发明提供了一种芯片，其包含上述所述的标志物或者上述所述的探针组合物或者上述所述的组合物。
所述芯片又称为基因芯片，其测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。
所述芯片的制备主要是以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。
本发明所述芯片是基于重亚硫酸盐处理后的DNA序列杂交的信号探测，重亚硫酸盐处理是将非甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，然后再将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶，最后进行芯片杂交；最后根据荧光颜色判断加入碱基的类型，进而确定该位点是否被甲基化。
本发明提供了一种胰腺癌筛查的方法，其包括：
检测标志物的甲基化水平，以及
基于所述甲基化水平来判断受试者罹患胰腺癌的风险，所述标志物为SPESP1或KIAA1328。
实施例
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1筛选标志物
1)样本搜集：下载TCGA中450k甲基化芯片癌组织数据，共涉及26种肿瘤7769个癌组织样本，其中包括肾上腺皮质癌(80)、膀胱尿路上皮癌(409)、急性髓细胞样白血病(140)、脑低级别胶质瘤(654)、乳腺癌(740)、宫颈癌(286)、结直肠癌(348)、食管癌(183)、葡萄膜黑色素瘤(80)、头颈鳞状细胞癌(527)、肾癌(660)、肝癌(377)、肺腺癌(425)、肺鳞癌(372)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(29)、卵巢浆液性囊腺癌(10)、胰腺癌(184)、间皮瘤(116)、前列腺癌(488)、皮肤黑色素瘤(104)、肉瘤(117)、胃癌(397)、睾丸癌(134)、胸腺癌(94)、甲状腺癌(506)、子宫内膜癌(309)。针对健康人群，博尔诚搜集38例健康人的血浆，进而进行全基因组甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS)。
2)候选标志物筛选：针对健康血浆样本，计算对应450K对应区域的每个探针β值第三四分位数(Q3)，又称"较大四分位数"，筛选Q3<0.02的位点，结果为List1。针对450K芯片组织数据，计算对应450K对应区域的每个探针β值第一四分位数(Q1)，Q1又称"较小四分位数"，筛选Q1>0.1的位点，结果为List2。取List1和List2交集得到65739个差异甲基化区域。
3)标志物选择：在上述标志物中选择胰腺癌特有的标志物，得到9个标志物。同时要求，TCGA中450k芯片胰腺癌组织(184)与癌旁组织(10)的甲基化水平的差值大于0.2，最终得到7个差异甲基化区域。
4)标志物验证：针对上述的7个差异甲基化区域设计探针捕获，利用博尔诚血浆样本数据(胰腺癌样本个数＝16,健康人样本个数＝38)进行验证，最终得到2个能区分开胰腺癌与健康人的标志物，其序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
根据所得到的靶序列区域，定制探针组合物(panel)，其包括高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，其中，针对每个marker，第一探针组合物包括两个探针，对于SEQ ID NO:1，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:2，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:5-6所示的核苷酸序列；第二探针组合物包括两个探针，其中，对于SEQ ID NO:1，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:7-8所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:2，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:9-10所示的核苷酸序列；然后在血浆样本中验证，其实验检测方法如下：
1.1.cfDNA提取纯化
1.1.1.血浆样本制备：
4℃、2000g离心血液样本10min,将血浆转移到一个新的离心管中。4°C、16000g离心血浆样本10min,根据使用的收集管类型，执行下一步,本实验中使用的收集管类型为其他。
表1
1.1.2.裂解和结合
1.1.2.1.按照下表准备结合溶液/珠子混合物，然后彻底混匀。
表2
加入适量体积的血浆样品。
1.1.2.2.彻底混匀血浆样品和结合溶液/珠子混合物。
1.1.2.3.在旋转混匀仪上充分地结合10min，使cfDNA结合到磁珠上。
1.1.2.4.将结合管放在磁力架上5min，直到溶液变得澄清，磁珠完全吸附在磁力架上。
1.1.2.5.用移液管小心地弃去上清，继续保持管子在磁力架上几分钟，用移液管移去残留上清。
1.1.3.洗涤
1.1.3.1.将珠子重悬在1ml洗涤溶液中。
1.1.3.2.将重悬液转移到新的无吸附1.5ml离心管中。保留结合管。
1.1.3.3.将含有珠子重悬液的离心管置于磁力架上，20s。
1.1.3.4.将分离得到的上清，吸出洗涤结合管，将清洗后的残留珠子再次收集到重悬液中，弃掉裂解/结合管。
1.1.3.5.管子置于磁力架上2min，直到溶液变得澄清，珠子聚集在磁力架，用1ml移液器移除上清。
1.1.3.6.管子留在磁力架上，用200μL移液器尽可能移除残留的液体。
1.1.3.7.将管子从磁力架取下来，加入1ml洗涤溶液，涡旋30s。
1.1.3.8.置于磁力架2min，直到溶液澄清，珠子聚集在磁力架上，用1ml移液管移除上清。
1.1.3.9.管子留在磁力架上，用200μL移液器彻底移除残留液体。
1.1.3.10.将管子从磁力架取下，加入1ml80％乙醇，涡旋30s。
1.1.3.11.置于磁力架上2min，溶液变得澄清，用1ml移液器移去上清。
1.1.3.12.管子留在磁力架上，用200μL移液器移去残留液体。
1.1.3.13.用80％乙醇重复上述1.1.3.10.-1.1.3.12.步骤一次，尽可能除去上清。
1.1.3.14.管子留在磁力架上，空气中干燥珠子3～5分钟。
1.1.4.洗脱cfDNA
1.1.4.1.按照下表加入洗脱液。
表3
1.1.4.2.涡旋5min，置于磁力架上2min，溶液变得澄清，吸取上清液中的cfDNA。
1.1.4.3.纯化的cfDNA立即使用，或者将上清转移至新的离心管中，-20℃保存。
1.2.gDNA打断与纯化：
1.2.1.按照Qubit浓度，取2μggDNA，加水补至125μl，加入到covaris130μl打断管中，设置程序：50W，20％，200个循环，250s。
1.2.2.打断结束后取1μl样品使用Agilent2100进行片段检测，正常打断后样品检测主峰约在150bp-200bp。
对于cfDNA样品，Agilent2100进行片段检测，直接Qubit用于后续的实验。
1.3.末端修复、3’端加“A”：
1.3.1.取20ng打断后的gDNA或cfDNA至PCR管中，用无核酸酶水补至50μl，加入以下试剂，涡旋混匀：
表4
1.3.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：热盖温度85℃。
表5
| 温度 | 时间 |
| 20℃ | 30min |
| 65℃ | 30min |
| 4℃ | ∞ |
1.4.接头连接及纯化：
1.4.1.参照下表将接头提前稀释成合适的浓度：
表6
| 每50μlER和AT反应的片段化的DNA | 接头浓度 |
| 1μg | 10μM |
| 500ng | 10μM |
| 250ng | 10μM |
| 100ng | 10μM |
| 50ng | 10μM |
| 25ng | 10μM |
| 10ng | 3μM |
| 5ng | 5μM |
| 2.5ng | 2.5μM |
| 1ng | 625nM |
1.4.2.按下表配制以下试剂，轻轻吸打混匀，短暂离心：
表7
| 组分 | 体积 |
| 末端修复、加“A”反应产物 | 60μl |
| 接头 | 5μl |
| 无核酸酶水 | 5μl |
| 连接缓冲液 | 30μl |
| DNA连接酶 | 10μl |
| 总体积 | 110μl |
1.4.3.设置以下程序在PCR仪上进行反应：无热盖。
表8
| 温度 | 时间 |
| 20℃ | 30min |
| 4℃ | ∞ |
1.4.4.按照以下体系，加入纯化磁珠进行实验(AgencourtAMPureXP磁珠提前拿至室温震荡混合均匀备用)：
表9
| 组分 | 体积 |
| 接头连接产物 | 110μl |
| AgencourtAMPureXP珠子 | 110μl |
| 总体积 | 220μl |
1.4.4.1.轻轻吸打混匀6次。
1.4.4.2.室温静置孵育5-15min，将PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。
1.4.4.3.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s。
1.4.4.4.移除上清，再向PCR管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。
1.4.4.5.室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发。
1.4.4.6.加入22μl的无核酸酶水，把PCR管从磁力架取下，轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min。
1.4.4.7.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。
1.4.4.8.用移液器吸取20μl上清液，转移到新的PCR管。
1.5重亚硫酸盐处理及纯化：
1.5.1.预先拿出所需要的试剂，并溶解。根据下表加入各试剂：
表10
| 组分 | 高浓度样品(1ng-2μg)体积 | 低浓度样品(1-500ng)体积 |
| 接头连接纯化产物 | 20μl | 40μl |
| 重亚硫酸盐溶液 | 85μl | 85μl |
| DNA保护缓冲液 | 35μl | 15μl |
| 总体积 | 140μl | 140μl |
1.5.2.DNA保护缓冲液加入液体变成蓝色。轻轻吸打混匀，然后分成两管置于PCR仪上。
1.5.3.设置以下程序，并运行：热盖105℃。
表11
| 温度 | 时间 |
| 95℃ | 5min |
| 60℃ | 10min |
| 95℃ | 5min |
| 60℃ | 10min |
| 4℃ | ∞ |
1.5.4.简短离心将两管相同样本合并至同一个干净的1.5ml离心管中。
1.5.5.每个样本中加入310μl缓冲液BL(样本量少于100ng加入1μl的载体RNA(1μg/μl))，涡旋混匀，简短离心。
1.5.6.加入250μl无水乙醇到每个样本中，涡旋混匀15s，简短离心，将混合液加入到准备好的对应的离心柱中。
1.5.7.静置1min，离心1min，将收集管中的液体重新转移到离心柱中，离心1min，弃去离心管的液体。
1.5.8.加入500μl缓冲液BW(注意是否加入无水乙醇)，离心1min，弃去废液。
1.5.9.加入500μl缓冲液BD(注意是否加入无水乙醇)，盖好管盖，室温放置15min。离心1min，弃去离心下的液体。
1.5.10.加入500μl缓冲液BW(注意是否加入无水乙醇)，离心1min，弃去离下来的液体，再重复一次，共2次。
1.5.11.加入250μl无水乙醇，离心1min，将离心柱放置到新的2ml收集管中，弃掉全部剩余液体。
1.5.12.将离心柱放置到干净的1.5ml离心管中，加入20μl无核酸酶水到离心柱膜中心，轻轻盖上管盖，室温放置1min，离心1min。
1.5.13.将收集管中的液体重新转移至离心柱中，室温放置1min，离心1min。
1.6.杂交前预扩增及纯化：
1.6.1.按下列表格配制反应体系，吹打混匀，短暂离心：
表12
1.6.2.设置以下程序并启动PCR程序：热盖105℃
表13
1.6.3.PCR循环数根据投入DNA的量不同进行调整，参考数据如下所示：
表14
1.6.4.向反应结束后的PCR管中加入50μlAgencourtAMPureXP磁珠，用移液器吹打混匀，避免产生气泡(AgencourtAMPureXP提前室温混匀并平衡)。
1.6.5.室温孵育5-15min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。
1.6.6.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s。
1.6.7.移除上清，再向PCR管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。
1.6.8.室温静置5min，使残留乙醇彻底挥发。
1.6.9.加入30μl的无核酸酶水，将离心管从磁力架取下，使用移液器，轻轻吸打重悬磁珠。
1.6.10.室温静置2min，将200μl PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。
1.6.11.用移液器将上清液转移到新的200μl PCR管中(置于冰盒上)，在反应管上标记好样本号，准备下一步反应。
1.6.12.取1μl样品使用Qubit进行文库浓度测定，记录文库浓度。
1.6.13.取1μl样品使用安捷伦2100进行文库片段长度测定，文库长度约在270bp-320bp之间。
1.7.样品与探针杂交：
1.7.1.按照以下体系将样品文库与各种Hyb阻断物混匀，标记为B：
表15
| 组分 | 体积 |
| 预扩增产物 | 750ng对应体积 |
| Hyb人阻断物 | 5μl |
| 接头阻断物 | 6μl |
| 增强剂 | 5μl |
1.7.2.将准备好的样品和Hyb阻断物混合物放入真空浓缩离心机，打开PCR管盖，启动离心机，打开真空泵开关，开始浓缩。
1.7.3.将抽干的样品重新溶在约9μl无核酸酶水中，总体积10μl，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用，标记为B。
1.7.4.将Hyb缓冲液置于室温融化，融解之后会有沉淀出现，混匀后置于65℃水浴锅内预热，完全溶解后(无沉淀及浑浊物)取20μlHyb缓冲液置于新的200μl PCR管内，盖好管盖，标记为A，继续置于65℃水浴锅内孵育待用。
1.7.5.通过艾吉泰康生物科技(北京)有限公司合成之前所述的甲基化探针序列：
1.7.6.取5μl RNA酶阻断物与2μl探针组合物置于200μl PCR管内，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用，标记为C。
1.7.7.设置PCR仪参数，热盖100℃，95℃，5min；65℃，保持。
1.7.8.将PCR管B置于PCR仪上，运行以上程序。
1.7.9.PCR仪温度降至65℃时，将PCR管A置于PCR仪上孵育，盖上PCR仪热盖。
1.7.10. 5min后，将C置于PCR上孵育，盖上PCR仪热盖。
1.7.11.将PCR管C放置入PCR仪2min后，把移液器调至13μl，从PCR管A中吸取13μlHyb缓冲液移至PCR管C中，吸取全部PCR管B中样品移至PCR管C中，轻轻吸打10次，充分混匀，避免产生大量气泡，密封管盖，盖上PCR仪热盖，65℃孵育过夜(16-24h)。
1.8.捕获目标区域DNA文库：
1.8.1.捕获磁珠的准备
1.8.1.1.将磁珠(DynabeadsMyOneStreptavidinT1磁珠)从4℃取出，涡旋震荡重悬。
1.8.1.2.取50μl磁珠置于新的PCR管内，置于磁力架上1min使溶液澄清，移除上清。
1.8.1.3.从磁力架上取下PCR管，加入200μL结合缓冲液轻轻吸打数次混匀，重悬磁珠。
1.8.1.4.置磁力架上1min，移除上清。
1.8.1.5.重复步骤3-4两次，共清洗磁珠3次。
1.8.1.6.从磁力架上取下PCR管，加入200μL结合缓冲液轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
1.8.2.捕获目标DNA文库
1.8.2.1.保持杂交产物PCR管C在PCR仪上，将准备好的200μL捕获磁珠加入到杂交后的产物PCR管C中，用移液器吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min(转速最好不要超过10转/min)。
1.8.2.2.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液。
1.8.2.3.向PCR管C内加入200μL的洗涤缓冲液1(23.5ml无核酸酶水，1.25ml20×SSC，250μl10％SDS)，轻轻吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上清洗15min(转速最好不要超过10转/min)，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清。
1.8.2.4.加入200μl的65℃预热后的洗涤缓冲液2(24.6ml无核酸酶水，125μl20×SSC，250μl10％SDS)，轻轻吸打6次混匀，置于混匀仪上65℃孵育10min，转速800转/min进行清洗。
1.8.2.5.短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，移除上清。使用洗涤缓冲液2再重复2次清洗，共计3次。最后一次彻底移除洗涤缓冲液2。
1.8.2.6.PCR管继续置于磁力架上，向PCR管内加入200μl80％乙醇，静置30s后彻底移除乙醇溶液，室温晾干2min。
1.8.2.7.向PCR管加入30μL无核酸酶水，从磁力架上取下PCR管，轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
1.9.捕获后扩增及纯化
1.9.1.根据下表配制反应体系进行捕获文库的富集，轻轻吹打混匀后，短暂离心：
表16
1.9.2.设置以下程序，将样品置于PCR仪中，运行程序：热盖105℃。
表17
1.9.3.PCR结束后向样品加入55μlAgencourtAMPureXP磁珠，用移液器轻轻吸打混匀。
1.9.4.室温孵育5min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。
1.9.5.移除上清，PCR管继续置于磁力架上，加入200μl80％无水乙醇，静置30s。
1.9.6.移除上清，再向PCR管内加入200μl80％无水乙醇，静置30s后彻底移除上清。
1.9.7.室温放置5min，使得残留乙醇彻底挥发。
1.9.8.加入25μl无核酸酶水，将PCR管从磁力架拿下，轻轻吹打混匀重悬磁珠，室温放置2min。
1.9.9.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。
1.9.10.用移液器吸23μl上清液转移到1.5ml离心管，标记样品信息。
1.9.11.取1μl文库使用Qubit进行定量，记录文库浓度。
1.9.12.取1μl样品使用Agilent2100进行文库片段长度测定。
1.9.13.使用Illumina高通量测序平台进行测序。
1.10.甲基化生信分析流程。大致如下：使用fastp质控软件查看测序质量，去除低质量的读段，然后采用Bismark比对软件将质控后的干净的数据比对到参考基因组上，采用Bismar_methylation_extractor软件提取相应的甲基化位点，最后，计算出每个标志物的甲基化水平。
1.11.基于从北京地区收集16例经临床诊断为胰腺癌的样本和从北京地区收集的38例健康人样本，利用前述甲基化建库方法，计算筛选到的2个甲基化生物标记物的甲基化水平，根据该2个甲基化生物标记物在胰腺癌样本和正常人样本数据集中的甲基化水平计算其阈值(以下简称位点或者marker)及独立区分的AUC值见表表18；
其中甲基化水平阈值计算方法为：根据数据集(包含每个样本的类型和甲基化水平)用R包pROC绘制ROC曲线，ROC曲线上的最佳阈值点所对应的混淆矩阵将是计算敏感度(sensitivity)、特异度(specificity)以及准确度等指标的依据。通常情况下会通过约登指数(Youdenindex)进行选择。约登指数也称正确指数，是指敏感度和特异度之和减去1：Youdenindex＝Sensitivity+Specificity-1。约登指数指数范围取值介于0-1之间，代表分类模型发现真正病人与非病人的总能力。约登指数越大，表示分类模型性能越好，每个标志物的阈值、敏感度和特异度如表18所示。
从表18可以看出，本发明所述标志物的AUC值较高。
表18 2个甲基化标记物的具体表现数据
| SEQ ID | 阈值 | 特异度 | 敏感度 | AUC |
| SEQ ID NO.1 | 0.17 | 0.93 | 0.87 | 0.91 |
| SEQ ID NO.2 | 0.15 | 0.82 | 0.94 | 0.92 |
实施例2
利用额外从北京地区收集3例胰腺癌样本(经临床诊断为胰腺癌)和从北京地区收集3例健康人样本，共6例人样本(S1-3为健康人样本，S4-6为胰腺癌患者样本)，采用本申请的甲基化标志物检测方法，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到每个标志物的甲基化水平，根据每个标志物的阈值，预测所述患者的患病情况，如果超过阈值为癌症样本，如果低于阈值为健康人样本，具体结果如表19：
其中判读结果，0代表分类为正常，即健康；1代表分类为异常，即肿瘤。
表19样本的甲基化值以及判读结果
综上所述，本发明的发明人获得了与胰腺癌相关的甲基化基因，并确定了胰腺癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且，通过这个甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测，并且本发明所述的组合物能够实现实时监测，具有更高的灵敏度和准确度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
本申请使用的序列表如表20：
表20
/>
/>
序列表
<110> 博尔诚（北京）科技有限公司
<120> 用于胰腺癌筛查的标志物、探针组合物及其应用
<130> PE02009
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 1
tttttcggcg tggttgcctt gggtattttt gaatcacatt aagttttaag agaccttaaa 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 2
ctgcccaccc tgtcagagtg cccccaggct gacttgagtg tgcggagcta gctcgaagtt 60
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 3
ataaatcgat aacccaataa acatcgaaac tttaaaatct cttaaaactt aatataattc 60
aaaaataccc aaaacaacca cgccgaaaaa ccaaaaaaaa aaactccaat taaaacctcc 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 4
aaaaactcta actaaaaccc tttctcctaa tttttcgacg taattacctt aaatattttt 60
aaatcacatt aaattttaaa aaaccttaaa accccgatac ccactaaatt accgacttac 120
<210> 5
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 5
ccctatccaa ccaacaccga ctcctccctc aacttcgaac taactccgca cactcaaatc 60
aacctaaaaa cactctaaca aaataaacaa aaaaacctcg aaaaaccatc tcaaccctaa 120
<210> 6
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 6
ccaaaactaa aataaccctc cgaaatccct ctacccaccc tatcaaaata cccccaaact 60
aacttaaata tacgaaacta actcgaaatt aaaaaaaaaa tcgatattaa ctaaacaaaa 120
<210> 7
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 7
ataaatcaat aacccaataa acatcaaaac tttaaaatct cttaaaactt aatataattc 60
aaaaataccc aaaacaacca caccaaaaaa ccaaaaaaaa aaactccaat taaaacctcc 120
<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 8
aaaaactcta actaaaaccc tttctcctaa tttttcaaca taattacctt aaatattttt 60
aaatcacatt aaattttaaa aaaccttaaa accccaatac ccactaaatt accaacttac 120
<210> 9
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 9
ccctatccaa ccaacaccaa ctcctccctc aacttcaaac taactccaca cactcaaatc 60
aacctaaaaa cactctaaca aaataaacaa aaaaacctca aaaaaccatc tcaaccctaa 120
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 10
ccaaaactaa aataaccctc caaaatccct ctacccaccc tatcaaaata cccccaaact 60
aacttaaata tacaaaacta actcaaaatt aaaaaaaaaa tcaatattaa ctaaacaaaa 120
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 11
tttttcggcg tggttgtttt gggtattttt gaattatatt aagttttaag agattttaaa 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 12
tttaaggttt tttaaaattt aatgtgattt aaaaatattt aaggtaatta cgtcgaaaaa 60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 13
ttgtttattt tgttagagtg tttttaggtt gatttgagtg tgcggagtta gttcgaagtt 60
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 14
aatttcgagt tagtttcgta tatttaagtt agtttggggg tattttgata gggtgggtag 60
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 15
ttttttggtg tggttgtttt gggtattttt gaattatatt aagttttaag agattttaaa 60
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 16
tttaaggttt tttaaaattt aatgtgattt aaaaatattt aaggtaatta tgttgaaaaa 60
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 17
ttgtttattt tgttagagtg tttttaggtt gatttgagtg tgtggagtta gtttgaagtt 60
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 18
aattttgagt tagttttgta tatttaagtt agtttggggg tattttgata gggtgggtag 60
Claims (9)
1. 标志物在制备用于检测胰腺癌的试剂盒中的用途，所述标志物为SPESP1，所述SPESP1的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述标志物为甲基化后的标志物。
3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述标志物还包括KIAA1328，所述KIAA1328的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
4.一种用于胰腺癌检测的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于检测甲基化后的SPESP1的核酸；
所述SPESP1的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
所述核酸包括探针组合物，所述探针组合物用于靶向甲基化后的SPESP1基因；
所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG低甲基化的区域杂交；
所述第一探针组合物包括如SEQ ID NO:3-6所示的核苷酸序列；所述第二探针组合物包括如SEQ ID NO:7-10所示的核苷酸序列。
5. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述标志物还包括KIAA1328，所述KIAA1328的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括将标志物的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。
7.根据权利要求4或5所述的组合物，其特征在于，所述用于检测标志物的靶序列甲基化的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
8.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求4-7中任一项所述的组合物。
9.一种芯片，其特征在于，包含权利要求4-7所述的组合物。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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