CN106834426A - 用于检测胰腺癌的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测胰腺癌的组合物，所述组合物包括用于检测目标基因的至少一个区域内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因选自SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的至少两个及其片段。本发明还提供了包括所述组合物的试剂盒。以及所述组合物在制备体外检测胰腺癌的试剂盒中的用途。因此本申请提供了一种通过检测样本中的SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化状态来对胰腺癌进行体外检测的方法，从而提供了一种无创的、快速的胰腺癌筛查方法。

Description

用于检测胰腺癌的组合物及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种组合物及其在疾病检测中的用途，具体地涉及一种用于检测胰腺癌的组合物及其相应的试剂盒和用途。

背景技术

癌症是一类严重危及公共健康的疾病。世界卫生组织下属的国际癌症研究机构公布的有关全球癌症状况的最新数据(GLOBOCAN2012)显示：2012年全球新增约1,410万例癌症病例，癌症死亡人数达820万；与2008年的数据相比，2012年新增癌症病例增加11％，癌症死亡人数增加8.3％。该机构根据现有数据预计，由于全球人口增长和老龄化，到2025年前，全球每年新增癌症病例数将高达1,930万例。由于近年来人口老龄化和人们生活方式的改变，我国的癌症发病形势严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势。2013年全国肿瘤登记中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》的数据显示：中国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万，全国每6分钟就有1人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有1人死于癌症。未来10年，中国的癌症发病率与死亡率仍将继续攀升；预计到2020年，中国每年的癌症死亡总数将达300万左右，患病总数将达660万。

全国肿瘤防治办公室数据显示：我国胰腺癌发病率为7.28例/10⁵人，死亡率为6.61例/10⁵人，位居常见癌症的第七位。虽然胰腺癌的发病率和死亡率低于五大癌症，但是胰腺癌特别值得关注，因为胰腺癌是一种恶性程度很高，检测和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤。目前，胰腺癌患者的五年存活率仅为5％，胰腺癌的病死率(death-to-case ratio)达90％以上，堪称癌症中的“绝症”。尽管新发胰腺癌仅占全部新发癌症的2.5％，死于胰腺癌的人数占全部癌症死亡人数的6％。此外，新发胰腺癌病例逐年增加；在过去二十几年中，全球死于胰腺癌的人数从1990年的20万人上升到2012年的33万人；我国胰腺癌新发病例在2003-2009年期间增加30％以上。

胰腺癌死亡率较高，而治愈率很低，其中一个重要因素是胰腺癌早期的确诊率低。早期胰腺癌缺乏明显和特异性的症状，绝大部分患者确诊时属于晚期，病灶多已发生转移。临床研究发现，从胰腺癌病灶开始形成到患者出现临床症状的过程平均需要2-3年，这为发现早期胰腺癌、提高胰腺癌早期的确诊率提供了一个有效的窗口期。充分利用这个窗口期，有望提高胰腺癌治疗效果、降低胰腺癌死亡率。但是目前尚无简便、有效的筛查方法。常用血清肿瘤标识物(CEA，CA199等)对胰腺癌的检测灵敏度过低。而一些新型影像学检测技术，由于侵入性强，设备成本高，操作技术要求强，在胰腺癌的检测和诊断的使用非常有限(MRI：13.9％；PET/CT：1.8％；EUS：5.6％)。因此，研发方便、准确、灵敏的早期胰腺癌的体外诊断和检测技术，提高早期胰腺癌的发现率，是改善胰腺癌治疗效果、降低胰腺癌死亡率的重要途径。

多年研究证明表观遗传学在癌症的发生、发展中起着极其重要的作用。作为表观遗传学的一种重要机制，DNA甲基化在多种肿瘤(肠癌、胃癌、肺癌等)中的调控得到了深入的研究。大量研究显示：基因甲基化的调控与染色质结构和基因表达调控等生物学机制相关联；细胞基因甲基化的变化发生在肿瘤形成的早期，并贯穿癌症的发生和发展过程；抑癌基因的甲基化是癌前病变组织转化为恶性肿瘤细胞的重要分子机制。因此，甲基化的研究，为癌症的早期预测、分类、分级及预后评估提供了新的依据，是目前的研究热点之一。

发明内容

本发明提供了一种用于体外检测胰腺癌的组合物、试剂盒及其用途，以及基于该试剂盒来执行检测的方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于体外检测胰腺癌的组合物，所述组合物包括用于检测目标基因的至少一个区域内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因选自SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的至少两个及其片段，例如所述目标基因选自SEPT9基因和BNC1基因、SEPT9基因和ADAMTS1基因，或SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段，以通过对目标基因的甲基化检测结果来检测胰腺癌。

根据本发明的某些优选实施方式，所述组合物进一步包括用于检测目标基因的每一个的至少一个区域内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因选自SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的至少两个及其片段，例如所述目标基因选自SEPT9基因和BNC1基因、SEPT9基因和ADAMTS1基因，或SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段，通过综合所述目标基因的甲基化检测结果来检测胰腺癌。

进一步地，所述核酸包括选自所述目标基因的至少15个核苷酸的片段，其中所述核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列，CpG的甲基化状态表明所述疾病的检测结果，其中所述目标基因选自SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的至少两个及其片段，例如所述目标基因选自SEPT9基因和BNC1基因、SEPT9基因和ADAMTS1基因，或SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段。

优选地，所述核苷酸的片段包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25的至少15个核苷酸的片段及其互补序列。

进一步优选地，所述核苷酸的片段包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：26的序列及其互补序列。

所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。优选的试剂是亚硫酸氢盐。

根据本发明的第二个方面，还提供了包括所述组合物的试剂盒。

典型地，所述的试剂盒包括用于容纳患者生物样品的容器。

并且，所述的试剂盒也包括使用和解释试剂盒结果的说明。

根据本发明的第三个方面，还提供了所述组合物在制备用于体外检测胰腺癌的试剂盒中的用途。

根据本发明的第四个方面，还提供了一种对胰腺癌进行体外检测的方法，所述方法包括以下步骤：

1)分离待测生物样品中的目标基因，其中所述目标基因选自SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的至少两个及其片段，例如所述目标基因选自SEPT9基因和BNC1基因、SEPT9基因和ADAMTS1基因，或SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段；

2)确定所述目标基因中至少一个区域内的甲基化状态；

3)通过所述目标基因的甲基化检测结果来对胰腺癌进行体外检测。

在一个优选的实施方式中，所述方法包括以下步骤：

1)分离待测生物样品中的目标基因，其中所述目标基因选自SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的至少两个及其片段，例如所述目标基因选自SEPT9基因和BNC1基因、SEPT9基因和ADAMTS1基因，或SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段；

2)确定所述目标基因的每个的至少一个区域内的甲基化状态；

3)通过综合所述目标基因的甲基化检测结果来对胰腺癌进行体外检测。

根据某些优选实施方式，所述方法还包括以下步骤：

1)使用试剂将目标基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，转化后的碱基在杂交性能方面是可检测的；

2)将经步骤1)处理过的目标基因与扩增酶和引物接触，使得所述经处理的基因被扩增以产生扩增产物或不被扩增；

3)用探针检测扩增产物；以及

4)基于所述扩增物是否存在，确定所述目标基因的DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态；

其中，所述标基因选自SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的至少两个及其片段，例如所述目标基因选自SEPT9基因和BNC1基因、SEPT9基因和ADAMTS1基因，或SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段。

典型的引物包括所述目标基因的核苷酸的片段，所述目标基因的核苷酸的片段包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25的至少15个核苷酸的片段及其互补序列。

优选地，所述核苷酸的片段包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：26的序列及其互补序列。

并且，所述接触或扩增包括适用至少一种选自如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶、使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶、使用聚合酶链式反应(PCR)、产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。

其中，用人造甲基化模板和非甲基化模板筛选所述引物和探针；或者，用癌症和正常DNA做模板筛选所述引物和探针。

所述个体的生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。

优选的个体的生物样品为血浆。

根据某些优选实施方式，所述目标基因的DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定的，其中，所述目标基因选自SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的至少两个及其片段，例如所述目标基因选自SEPT9基因和BNC1基因、SEPT9基因和ADAMTS1基因，或SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段。

本申请中，通过实验发现胰腺癌患者的SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化状态和在正常人的所述基因的甲基化状态存在显著性差异：在胰腺癌患者人群中，SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因发生甲基化，而在正常人群中，SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因不发生甲基化。因此本申请提供了一种通过检测样本中的SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化状态来对胰腺癌进行体外检测的方法，从而提供了一种无创的、快速的胰腺癌筛查方法。

最后，通过利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因生物标记物的同时间的多通道检测，并且能根据实时PCR的循环阈值(Ct)值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，提供了一种无创性的快速的胰腺癌的体外检测方法。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。

本发明的其他特点和优势将由下面的具体说明和权利要求书作详细的描述。

附图说明

本发明的上述及其他特征将通过下面结合附图及其详细描述作进一步说明。应当理解的是，这些附图仅示出了根据本发明的若干示例性的实施方式，因此不应被视为是对本发明保护范围的限制。除非特别说明，附图不必是成比例的，并且其中类似的标号表示类似的部件。

图1示出了分别使用BNC1、ADAMTS1和ACTB的引物对甲基化基因组DNA和非甲基化基因组DNA的qPCR(SYBR Green法)检测的结果图。结果显示BNC1、ADAMTS1的引物(甲基化特异)可以对甲基化基因组DNA进行扩增，而对非甲基化基因组DNA不扩增；ACTB的引物(非甲基化特异)对甲基化基因组DNA和非甲基化基因组DNA均扩增。

图2示出了分别使用BNC1、ADAMTS1和ACTB的引物和探针对甲基化基因组DNA和非甲基化基因组DNA的qPCR(Taqman法)检测。结果显示BNC1、ADAMTS1的引物和探针(甲基化特异)可以对甲基化基因组DNA进行扩增，而对非甲基化基因组DNA不扩增；ACTB的引物和探针(非甲基化特异)对甲基化基因组DNA和非甲基化基因组DNA均扩增。

图3示出了BNC1、ADAMTS1和ACTB的引物和探针对甲基化基因组DNA的qPCR扩增的标准曲线。数据显示在2模板拷贝/ul至10⁴模板拷贝/ul的模板浓度范围内(qPCR反应使用5ul模板DNA溶液)，BNC1、ADAMTS1和ACTB的引物和探针的qPCR的标准曲线呈直线，既扩增效率在此浓度范围内恒定。

图4示出了BNC1、ADAMTS1和ACTB的引物和探针分别以单重PCR和多重PCR对甲基化基因组DNA进行检测。检测结果显示BNC1、ADAMTS1和ACTB的引物和探针在单重PCR和多重PCR的条件下，检测结果基本一致。

图5示出了不同比例的非甲基化基因组DNA背景对BNC1、ADAMTS1和ACTB的引物和探针对甲基化基因组DNA的检测的影响。结果显示，不同比例的非甲基化基因组DNA背景对BNC1、ADAMTS1和ACTB的引物和探针对甲基化基因组DNA的检测没有影响。

图6示出了胰腺癌癌症和癌旁组织样品中SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化率。利用SEPT9、BNC1、ADAMTS1和ACTB的标准曲线对胰腺癌癌症和癌旁组织样品中SEPT9、BNC1、ADAMTS1和ACTB进行定量检测，以ACTB为总DNA量指标(ACTB检测甲基化和非甲基化DNA)，计算SEPT9、BNC1、ADAMTS1甲基化DNA在总DNA中的比率，既甲基化率。

图7示出了胰腺癌和正常志愿者血浆样品中SEPT9、BNC1和ADAMTS1基因甲基化检测的Ct值。

图8示出了胰腺癌和正常志愿者血浆样品中SEPT9、BNC1和ADAMTS1及其组合的基因甲基化检测的灵敏性和特异性。

图9示出了胰腺癌和正常志愿者血浆样品中SEPT9、BNC1和ADAMTS1组合和血清标识物CEA、CA199检测的灵敏性比较，以及使用甲基化基因组合和CA199联合检测的灵敏性。

具体实施方式

除非另有说明，本申请的实施将采用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和基因学技术，其均在本领域常规技术手段的范围内。在文献中对此类技术进行了详细说明如Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，1984版)；Animal CellCulture(R.I.Freshney，1987版)；Methods in Enzymology丛书(美国学术出版社有限公司)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等，1987版，和定期更新)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等，1994版)。本申请中使用的引物、探针和试剂盒可以采用本领域公知的标准技术制备。

除非另有定义，本申请所使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。Singleton等，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology，第二版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)，和March,AdvancedOrganic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure，第四版，John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)，针对本申请中使用的多个术语为本领域技术人员提供了一般性的指导。

定义

本申请的“对疾病进行体外检测”表示根据检测结果来确定疾病的存在。根据本申请，可以根据DNA甲基化的状态区分正常和疾病。例如，可以根据患者的样本所测的DNA甲基化状态，来区分正常和疾病。

本申请的“癌症”表示并包括任何恶性肿瘤(malignancy)、或恶性细胞分裂或恶性肿瘤(malignant tumour)，或具有不受控制的或不适当的细胞增殖的任何疾病状态，并且包括但不限于特征为不受控制的或不适当的细胞增殖的任何疾病。

本申请的“胰腺癌(pancreatic cancer)”表示胰腺或胰腺细胞的癌症。这些癌症可以是发生于胰腺头、体和尾部。

本申请的“胰腺癌细胞”表示具有胰腺癌特征的细胞，并且包括癌症前期细胞。

本申请的“癌症前期”表示处于转化为癌细胞的早期阶段或倾向于转化为癌细胞的细胞。这样的细胞可以表现出一种或多种具有癌细胞特征的表型性状。

本申请中的“生物标记物”指的是一种诸如基因的物质、与疾病相关的变量测定，可以作为那个疾病的指示因子或预测因子。疾病的存在或风险可以从生物标记物这个参数推断出来，不需要测定疾病本身。

本申请中的“核酸”、“核酸序列”等等，指的是聚核苷酸，可以是gDNA、cDNA或RNA，也可以是单链或双链的。术语也包括肽核酸(PNA)，或任何化学的DNA类或RNA类物质。“cDNA”指的是从天然生成的mRNA复制的DNA。“gDNA”指的是基因组DNA。也可以使这些物质的组合(即部分是gDNA和部分是cDNA的重组核酸)。

本申请中的“可操作地结合”、“可操作地连接”指的是功能上结合核酸序列。

本申请中的“严紧杂交条件”和“高度严紧”指的是探针与其靶子序列杂交的条件，典型的在核酸复杂的混合物中。严紧的条件是依赖于序列的，并且在不同的环境下是不同的。较长的序列在较高的温度中特异性的杂交。关于核酸杂交的详细的指导可以参考Tijssen，生物化学和分子生物学技术-核酸探针杂交，“杂交原理和核酸试验策略的回顾”。通常，严紧条件是在限定的离子强度pH下低于特定核酸的熔点(Tm)大约5-10℃。在Tm的温度(在所限定的离子强度，pH和核酸浓度)下，50％的和靶点互补的探针均衡地和靶点序列杂交。还可以通过增加去稳定剂来实现严紧条件。对于选择性或者特定的杂交，正信号为背景杂交的两倍，优选10倍。示例性的严紧杂交条件如下：在50％甲酰胺,5x SSC和1％的SDS的溶液中在42摄氏度杂交，或者在5x SSC和1％的SDS的溶液中在65摄氏度杂交，然后在0.2xSSC和0.1％SDS的溶液中在65摄氏度洗涤。

并且，如果核酸所编码的多肽是实质性相似的话，即使不能在严紧条件下杂交的核酸仍然是实质性相似的。这种情况下，典型地，核酸在中等严紧杂交条件下进行杂交。作为示例的，“中等严紧杂交条件”包括在40％甲酰胺,1M的氯化钠和1％的SDS的溶液中在37摄氏度杂交，并且在1xSSC的溶液中在45摄氏度洗涤。本领域的普通技术人员可以很显然地在现有技术中获得对于取得获得相同的严紧度的条件的指导。对于PCR而言,36摄氏度左右的温度典型地适用于低度严紧扩增，而基于引物的长度，退火温度的范围则在32摄氏度至48摄氏度之间。对于高度严紧的PCR扩增，一般是在62摄氏度，而基于引物的长度和特异性，高度严紧杂交的退火温度的范围则在50摄氏度至65摄氏度之间。对于高度严紧和低度严紧扩增的循环条件，典型的，包括：在90-95摄氏度下持续变性阶段30秒至2分钟，持续退火阶段30秒至2分钟，在约72摄氏度下持续扩展阶段1至2分钟。关于低度和高度严紧扩增反应的工具和指导可以在现有技术中获得。

本申请中的“核苷酸”指由两个或者两个以上的核苷酸构成的分子，优选为由三个以上的核苷酸构成的分子，其精确大小可以依靠许多因素，这些因素反过来又是由核苷酸的最终功能和用途决定的。在某些具体实施方式中，核苷酸可以包括10个核苷酸至100个核苷酸的长度。在某些具体实施方式中，核苷酸可以包括10个核苷酸至30个核苷酸的长度，或者可以具有20和25个核苷酸的长度。在一些特定的具体实施方式中，短于这些长度的核苷酸也是合适的。

本申请的“引物”表示当置于能诱发与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，即在核苷酸和诸如DNA或RNA聚合酶的诱发剂的存在下并且在合适的温度和pH下，能够作为合成起始点的核苷酸，无论它是纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的。引物可以是单链或双链的，并且必须足够长而使其在诱发剂的存在下能引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和所用的方法。例如，为了检测和预后应用，根据靶序列的复杂性，核苷酸引物通常含有至少或多于约10、或15、或20、或25或更多个核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。参与确定引物合适长度的因素是本领域技术人员熟知的。

本申请的“引物对”表示与靶DNA分子相反链杂交或与侧翼连接待扩增的核苷酸序列的靶DNA区域杂交的引物对。

本申请的“引物位点”表示引物杂交的靶DNA或其它核酸的区域。

本申请的“探针”，当涉及核酸序列时，以其通常含义使用，表示在规定条件下能与靶序列杂交并且可以用于检测该靶序列的存在的选择的核酸序列。本领域技术人员应当理解，在某些情况下，探针也可以用作引物，并且引物可以用作探针。

本申请的“DNA甲基化”是指甲基添加到胞嘧啶(C)的5位，这通常(但不必须)是在CpG(胞嘧啶之后为鸟嘌呤)二核苷酸的情况下。本文所用的“增加的甲基化状态”或“显著的甲基化状态”是指DNA序列中至少存在一个甲基化的C核苷酸，其中正常对照样品(例如从非癌细胞或组织样品提取的DNA样品或对DNA残基的甲基化进行处理的DNA样品)中的对应C是非甲基化的，在某些实施方案中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个C可以是甲基化的，其中对照DNA样品中的这些位置的C是非甲基化的。

在实施方案中，多种不同的方法可用于检测DNA甲基化改变。检测DNA甲基化的方法包括，例如，利用southern或聚合酶链反应(PCR)分析的甲基化敏感的限制性内切核酸酶(MSRE)测定、甲基化特异性或甲基化敏感的PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)、高分辨率熔解(HRM)分析、重亚硫酸盐测序、焦磷酸测序、甲基化特异性单链构象分析(MS-SSCA)、组合重亚硫酸盐限制分析(COBRA)、甲基化特异性变性梯度凝胶电泳(MS-DGGE)、甲基化特异性熔解曲线分析(MS-MCA)、甲基化特异性变性高效液相色谱(MS-DHPLC)、甲基化特异性微阵列(MSO)。这些测定可以是PCR分析、利用荧光标记的定量分析或southern印记分析。

本申请的“甲基化测定”指确定DNA序列内一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。

本申请的“生物样品”或“样品”包括诸如活检和尸检样品的组织切片、和为了组织学目的而获取的冷冻切片、或任何这些样品的处理后形式。生物样品包括血液和血液组分或产物(例如血清、血浆、血小板、红细胞等)，痰液或唾液，淋巴和舌组织，诸如原代培养物、外植体和转化的细胞的培养的细胞，粪便，尿液，胃活检组织等。生物样品通常获自真核生物，所述真核生物可以是哺乳动物，可以是灵长类并且可以是人类个体。

本申请的“活检”是指为了检测或预后评估取出组织样品的过程，并且也指组织样本自身。本领域已知的的任何活检技术可以用于本发明的检测和预后方法。所用的活检技术取决于待评估的组织类型(例如舌、结肠、前列腺、肾、膀胱、淋巴结、肝、骨髓、血细胞、胃组织等)等因素。代表性的活检技术包括但不限于切除活检、切去活检、针吸活检、手术活检和骨髓活检，并且可以包括结肠镜检查。多种活检技术是本领域技术人员公知的，他们需要进行很少的实验便可以从这些技术中选择并使用。

本申请的“分离的”核酸分子表示从通常与该分离的核酸分子相关联的其它核酸分子中分离出的核酸分子。因此，“分离的”核酸分子包括但不限于这样的核酸分子：其不具有在分离的核酸来源于的生物体的基因组中天然地侧翼连接该核酸的一个或两个末端的序列(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消化而产生的cDNA或基因组DNA片段)。通常将这样的分离的核酸分子引入载体(例如，克隆载体或表达载体)，以便于操控或产生融合核酸分子。此外，分离的核酸分子可以包括工程化的核酸分子，例如重组的或合成的核酸分子。存在于例如核酸文库(例如cDNA或基因组文库)或含有限制性消化的基因组DNA的凝胶(例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺)的一部分中的数百至数百万其它核酸分子中的核酸分子不被认为是分离的核酸。

本申请的“细胞”可以是分离的，可以被包含在细胞群体中，可以在培养物中，或可以被包含在活的个体中，并且可以是哺乳动物细胞，且可以是人的细胞。同样，“组织”可以包括任何数目的细胞，并且可以被包含在活的个体中或可以从其中被分离出。

本申请的“纯化的”或“基本纯化的”，当用来指核酸或多肽时，表示从它们的天然环境中分离出的核酸或多肽，使得它们占给定样品中全部核酸或多肽或有机化学物的至少约75％、80％、85％、90％或95％。本文中，可以通过SDS-PAGE和银染评估蛋白纯度。可以通过琼脂糖凝胶和EtBr染色评估核酸纯度。

本申请的“检测”表示观察生物样品中的标识物或标识物改变(例如标识物甲基化状态的改变或核酸或蛋白序列的表达水平)的任何过程，无论实际上是否检测到标识物或标识物改变。换言之，探测样品的标识物或标识物改变的行为是“检测”，即使标识物被测定为不存在或低于灵敏度水平。检测可以是定量、半定量或非定量观察，并且可以基于与一个或多个对照样品的比较。应当理解，检测本文公开的胰腺癌包括检测癌症前期细胞，所述癌症前期细胞开始发展为胰腺癌细胞或将要发展为胰腺癌细胞，或具有增加的发展为胰腺癌细胞的倾向。检测胰腺癌还可以包括检测可能的死亡概率或疾病条件的可能的预后。

本申请的“同源性”、“同一性”和“相似性”表示2个核酸分子之间的序列相似性。可以比较每个序列中的位置来测定“同源性”、“同一性”或“相似性”，为了比较的目的可以将所述序列进行比对。当比较的序列中的等同位置被相同碱基占据时，所述分子在该位置是相同的；当等同位点被相同或相似氨基酸(例如，在空间性质或带电性质上相似)残基占据时，所述分子可以称为在该位置是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性百分比的表达是指比较的序列所共享的位置上相同或相似氨基酸的数量的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本发明的序列共享小于40％同一性，优选小于25％同一性。在比较2个序列时，残基(氨基酸或核酸)的缺失或多余残基的存在也降低同一性和同源性/相似性。在具体实施方案中，对于两个或更多个序列或子序列，按照使用具有下文所述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法进行测定或通过例如国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information(NCBI))在线提供的手动比对和肉眼检查进行测定，当在比较窗或指定区域上为最大对应性进行比较和比对时，如果它们的序列在规定的区域上同一性为约60％，或约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高，可以认为是基本或显著同源的、相似的或同一的。该定义也涉及或可以用于测试序列的互补物。因此，在本文背景允许的程度下，例如，如果核苷酸序列可以被预测为天然存在于DNA双链体中，或可以以互补链中的一条或两条的形式天然存在，则与规定靶序列或其变体互补的核苷酸序列自身被视为与靶序列是“相似的”，并且当涉及“相似的”核酸序列时，包括单链序列、其互补序列、双链的链复合物、能够编码相同或相似多肽产物的序列、以及上述任意一项的任何容许的变体。相似性必须限制为单一核酸链序列的分析的情况可以包括例如细胞中特定RNA序列或编码序列的表达的检测和定量。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在实施方案中，同一性或相似性可以是在长度为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、10、21、22、23、24、25或更多核苷酸的区域上，或在长度为多于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或多于约100个核苷酸的区域上。

本申请的“扩增”表示由核酸的一个具体基因座得到多个拷贝的过程，所述核酸例如基因组DNA或cDNA。可以使用多种已知手段中的任何一种实现扩增，所述手段包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、基于转录的扩增和链置换扩增(SDA)。

本申请的“标准扩增条件”是指扩增反应混合物的基本组分和循环条件，所述循环条件包括模板核酸变性、核苷酸引物与模板核酸退火和通过聚合酶的引物延伸以产生扩增产物的多个循环。

本申请的“聚合酶链反应”或“PCR”表示这样的技术：变性、与引物的退火和与DNA聚合酶的延伸的循环被用于将靶DNA序列的拷贝数扩增至约10⁶倍或更多。用于扩增核酸的聚合酶链反应过程可参见美国专利第4,683,195号和第4,683,202号。

本申请的“基于荧光的实时PCR”表示这样的方法：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在该PCR技术中，有一个很重要的概念，循环阈值，也称为Ct值。C代表Cycle，t代表threshold(阈值，临界值)，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。例如，荧光阈值(threshold)的设定方法如下：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省(默认)设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

本申请的“实时PCR的cut off值”表示针对某一个生物标记物的判断样本阴阳性的一个临界Ct值。根据本申请的某些具体实时方式，"临界Ct值(Cut Off值)是根据一定数量的样本数据，基于统计学处理而得到的"，该临界Ct值可以根据所需要的灵敏度或特异性的要求不同而不同。在概述中，将对于该临界Ct值做进一步的举例说明。

本申请的“灵敏度”表示从一定癌症样本中检测出癌症的比例，其计算公式为：灵敏度＝(检测到的癌症/所有的癌症)，而“特异性”表示一定正常人样本中检测出正常的比例，其计算公式为特异性＝(未检测到的阴性/总的阴性)。

本申请的“标记”或“可检测的部分”是可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组分。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛或半抗原和可以被制备为可检测的蛋白，例如，通过将放射性标记并入肽或用于检测与肽特异性反应的抗体。

可以使用多种不同方法检测核酸分子。核酸检测方法包括，例如，PCR和核酸杂交(例如，Southern印迹、Northern印迹或原位杂交)。具体而言，能够扩增靶核酸的核苷酸(例如，核苷酸引物)可以用于PCR反应。PCR方法通常包括以下步骤：获得样品、从所述样品分离核酸(例如，DNA、RNA或两者)和使所述核酸与一种或多种核苷酸引物接触，所述引物在能使模板核酸扩增发生的条件下特异性地与模板核酸杂交。在模板核酸的存在下，产生扩增产物。核酸扩增和扩增产物检测的条件是本领域技术人员已知的。已开发出多种对于基础PCR技术的改进，包括但不限于，锚定PCR、RACE PCR、RT-PCR和连接酶链式反应(LCR)。扩增反应中的引物对必须与模板核酸的相对链退火，并且应该彼此保持合适的距离，使得聚合酶能有效地跨过区域进行聚合并使得可以例如使用电泳来容易地检测扩增产物。例如，可以使用诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.)的计算机程序来设计核苷酸引物，以助于设计具有相似熔解温度的引物。通常，核苷酸引物长度为10-30或40或50个核苷酸(例如，长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)，但是核苷酸引物可以更长或更短，只要使用合适的扩增条件。

通常使用可检测的标记实现扩增产物或杂交复合物的检测。术语“标记”，当涉及核酸时，意图包括通过将可检测的物质偶联(即，物理连接)至核酸的核酸直接标记，以及通过与直接标记了可检测的物质的另一试剂进行反应的核酸间接标记。可检测的物质包括各种酶、辅基、荧光材料、冷光材料、生物冷光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯代三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；冷光材料的实例包括鲁米诺；生物冷光材料的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母蛋白。间接标记的实例包括用生物素将核酸进行末端标记，使得可以用荧光标记的抗生物素蛋白链菌素检测该核酸。

概述

本申请提供了一种通过检测SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因组合的甲基化状态来对疾病进行体外检测的方法以及相应的组合物、试剂盒以及核酸序列，从而以非侵入性地方式、高效灵敏地检测癌症，例如胰腺癌。

下述为本申请的组合物、试剂盒、核酸序列以及检测方法的实施例。可以理解，考虑到上文所提供的一般性描述，可以实施多种其他的实施方式。

在第一组实施方案中，公开用于对个体的疾病进行体外检测的组合物，包括用于检测SEPT9基因、BNC1基因或ADAMTS1基因及其片段或其组合中至少一个区域内甲基化状态的核酸，以通过所述甲基化检测结果来对疾病进行体外检测。优选的，所述组合物包括用于检测SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段中至少一个区域内是否存在甲基化的核酸序列。

以下，将首先介绍SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因：

SEPT9基因，即人类Septin 9基因(也称为MLL septin样融合蛋白、MLLseptin样融合蛋白MSF-A、Slpa、Eseptin、Msf、septin样蛋白卵巢/乳腺septin(Ov/Brseptin)以及Septin D1)位于染色体17q25，位于叠连群AC068594.15.1.168501内，为Septin基因家族的成员。

例如，SEQ ID No：25提供了SEPT9基因的富含CpG的序列。

SEQ ID NO：25序列：

GGGAGTTGGTGGCCTCTCGCTGGTGCCATGGGACTCGCATGTTCGCCCTGCGCCCCTCGGCTCTTGAGCCCACAGGCCGGGATCCTGCCTGCCAGCCGCGTGCGCTGCCGTTTAACCCTTGCAGGCGCAGAGCGCGCGGCGGCGGTGACAGAGAACTTTGTTTGGCTGCCCAAATACAGCCTCCTGCAGAAGGACCCTGCGCCCGGGGAAGGGGAGGAATCTCTTCCCCTCTGGGCGCCCGCCCTCCTCGCCATGGCCCGGCCTCCACATCCGCCCACATCTGGCCGCAGCGGGGCGCCCGGGGGGAGGGGCTGAGGCCGCGTCTCTCGCCGTCCCCTGGGCGCGGGCCAGGCGGGGAGGAGGGGGGCGCTCCGGTCGTGTGCCCAGGACTGTCCCCCAGCGGCCACTCGGGCCCCAGCCCCCCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCCGCCCGGGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCCATTCATTCAGCTGAGCCAGGGGGCCTAGGGGCTCCTCCGGCGGCTAGCTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTGGATGGGATCATTTCGGACTTCGAAGGTGGGTGCTGGGCTGGCTGCTGCGGCCGCGGACGTGCTGGAGAGGACCCTGCGGGTGGGCCTGGCGCGGGACGGGGGTGCGCTGAGGGGAGACGGGAGTGCGCTGAGGGGAGACGGGACCCCTAATCCAGGCGCCCTCCCGCTGAGAGCGCCGCGCGCCCCCGGCCCCGTGCCCGCGCCGCCTACGTGGGGGACCCTGTTAGGGGCACCCGCGTAGACCCTGCGCGCCCTCACAGGACCCTGTGCTCGTTCTGCGCACTGCCGCCTGGGTTTCCTTCCTTTTATTGTTGTTTGTGTTTGCCAAGCGACAGCGACCTCCTCGAGGGCTCGCGAGGCTGCCTCGGAACTCTCCAGGACGCACAGTTTCACTCTGGGAAATCCATCGGTCCCCTCCCTTTGGCTCTCCCCGGCGGCTCTCGGGCCCCGCTTGGACCCGGCAACGGGATAGGGAGGTCGTTCCTCACCTCCGACTGAGTGGACAGCCGCGTCCTGCTCGGGTGGACAGCCCTCCCCTCCCCCACGCCAGTTTCGGGGCCGCCAAGTTGTGCAGCCCGTGGGCCGGGAGCACCGAACGGACACA

Septin基因家族的成员与从膜泡运输到胞质分裂的多种细胞功能相关。破坏SEPT9基因的作用将导致不完全的细胞分裂，Septin 9和其它的蛋白已显示为原癌基因MLL的融合伴侣分子(fusion partner)，这表明了在肿瘤发生中的作用。

用于检测SEPT9基因及其片段中至少一个区域内是否存在甲基化的核酸序列包括：等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：25的连续序列的至少9个碱基的核酸序列。

例如根据SEQ ID NO：26设计的引物和/或探针：

SEQ ID NO：26：

CCCACCAACCATCATATCGAACCCCGCGATCAACGCGCAACTAAATAAAATCATTTCGAACTTCGAAAATAAATACTAAACTAACTACTAC

BNC1基因，即人类BNC1基因，中文名称为碱性核蛋白1，英文名称为basonuclin 1,缩写为BNC1、BNC、BSN1、或HsT19447。该基因位于个体染色体15q25.2内，为锌指蛋白(zincfinger protein)基因家族的成员。BNC1共有2种转录产物：transcript variant 1(NM_001717.3)(简称为BNC1v1)和transcript variant 2(NM_001301206.1)(简称为BNC1v2)；这两种转录产物的主要区别在于转录起始位点相距1259bp，导致两种转录产物的1号外显子(Exon 1)序列不同。在BNC1的v1转录产物的转录起始位点的上游，存在一个长度为359bp的富含CpG序列的片段，如SEQ ID NO：10-12所示。

SEQ ID NO：10(BNC1 v1转录开始位点的-512bp至-154bp):

TGAGTTCTTAAGAAAACCTCCTGGCGACCCCCTTCTTCCACATCCCAAGACGCTCGTCCCGCACTTTCTCGGGAATGAGGTTTCTGCAGGCGAGGGCGGCGCTGCCTTCTTCCTCCGCGGCAGTGAGACCCCGAGGGCGCCCCAGGGTAGGAGGGGAGGCCGAATCATCTCCTGAGAAGAGCGCCAGAGAACTTCAGAGCGTTTCGCCCTTCCCCGGGAGAGGCAAACACCGACACGTCTGTGTCTTTTACCAACAAGTGCCTTCAAGCCCGGCGGGGGCAGACACCTCCGCGCCGGCCGCCGGCGAGGTCTCCGCGGTCTGCGGGGGCCACGGCCTCGCCTCAGCTGCGCTGATTTAG

SEQ ID NO：11(SEQ ID NO:10的互补序列):

CTAAATCAGCGCAGCTGAGGCGAGGCCGTGGCCCCCGCAGACCGCGGAGACCTCGCCGGCGGCCGGCGCGGAGGTGTCTGCCCCCGCCGGGCTTGAAGGCACTTGTTGGTAAAAGACACAGACGTGTCGGTGTTTGCCTCTCCCGGGGAAGGGCGAAACGCTCTGAAGTTCTCTGGCGCTCTTCTCAGGAGATGATTCGGCCTCCCCTCCTACCCTGGGGCGCCCTCGGGGTCTCACTGCCGCGGAGGAAGAAGGCAGCGCCGCCCTCGCCTGCAGAAACCTCATTCCCGAGAAAGTGCGGGACGAGCGTCTTGGGATGTGGAAGAAGGGGGTCGCCAGGAGGTTTTCTTAAGAACTCA

SEQ ID NO：12(SEQ ID NO:10亚硫酸盐处理后的序列):

TGAGTTTTTAAGAAAATTTTTTGGCGATTTTTTTTTTTTATATTTTAAGACGTTCGTTTCGTATTTTTTCGGGAATGAGGTTTTTGTAGGCGAGGGCGGCGTTGTTTTTTTTTTTCGCGGTAGTGAGATTTCGAGGGCGTTTTAGGGTAGGAGGGGAGGTCGAATTATTTTTTGAGAAGAGCGTTAGAGAATTTTAGAGCGTTTCGTTTTTTTTCGGGAGAGGTAAATATCGATACGTTTGTGTTTTTTATTAATAAGTGTTTTTAAGTTCGGCGGGGGTAGATATTTTCGCGTCGGTCGTCGGCGAGGTTTTCGCGGTTTGCGGGGGTTACGGTTTCGTTTTAGTTGCGTTGATTTAG

经研究发现，BNC1基因是一个抑癌基因，其甲基化与多种癌症相关。用于检测BNC1基因及其片段中至少一个区域内是否存在甲基化的核酸序列包括：等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：10-12的连续序列的至少9个碱基的核酸序列

ADAMTS1基因，即人类ADAMTS1基因，中文名称为整合素样金属蛋白酶与凝血酶1型1，英文名称为ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1motif,1,缩写为ADAMTS1、C3-C5、或METH1。该基因位于人类染色体21q21.2内，为整合素样金属蛋白酶与凝血酶(ADAM metallopeptidase with thrombospondin motif)基因家族的成员。ADAMTS1转录起始位点的上下游，存在一个长度为457bp的富含CpG序列的片段，如SEQ ID NO：22-24所示。

SEQ ID NO：22(ADAMTS1转录起始位点的-204bp至254bp)

CCCTAGATTGACGAGCAGTGGCGTGGAGCCAGCGCGGAGGCTGCCCCCTCCCCCTCCCGAGCCCGCAGCGCGGAGCGCGGTTTAGCACCAACGGAGCCGGGGGCGGCGTCTTTGGGATGGAAAAGGGCCAAAGGGGAGGAGTGGGGTGGGGGTGGGGGTTTCACTGGTCCACTATAAAAGGACCGCTCGGCTGCCCGGTTCTTGCACTCGCTGGAAAGCGGCTCCGAGCCAGGGGCTATTGCAAAGCCAGGGTGCGCTACCGGACGGAGAGGGGAGAGCCCTGAGCAGAGTGAGCAACATCGCAGCCAAGGCGGAGGCCGAAGAGGGGCGCCAGGCACCAATCTCCGCGTTGCCTCAGCCCCGGAGGCGCCCCAGAGCGCTTCTTGTCCCAGCAGAGCCACTCTGCCTGCGCCTGCCTCTCAGTGTCTCCAACTTTGCGCTGGAAGAAAAACTTCCC

SEQ ID NO：23(SEQ ID NO：22的互补序列):

GGGAAGTTTTTCTTCCAGCGCAAAGTTGGAGACACTGAGAGGCAGGCGCAGGCAGAGTGGCTCTGCTGGGACAAGAAGCGCTCTGGGGCGCCTCCGGGGCTGAGGCAACGCGGAGATTGGTGCCTGGCGCCCCTCTTCGGCCTCCGCCTTGGCTGCGATGTTGCTCACTCTGCTCAGGGCTCTCCCCTCTCCGTCCGGTAGCGCACCCTGGCTTTGCAATAGCCCCTGGCTCGGAGCCGCTTTCCAGCGAGTGCAAGAACCGGGCAGCCGAGCGGTCCTTTTATAGTGGACCAGTGAAACCCCCACCCCCACCCCACTCCTCCCCTTTGGCCCTTTTCCATCCCAAAGACGCCGCCCCCGGCTCCGTTGGTGCTAAACCGCGCTCCGCGCTGCGGGCTCGGGAGGGGGAGGGGGCAGCCTCCGCGCTGGCTCCACGCCACTGCTCGTCAATCTAGGG

SEQ ID NO：24(SEQ ID NO：22亚硫酸盐处理后的序列):

TTTTAGATTGACGAGTAGTGGCGTGGAGTTAGCGCGGAGGTTGTTTTTTTTTTTTTTCGAGTTCGCAGCGCGGAGCGCGGTTTAGTATTAACGGAGTCGGGGGCGGCGTTTTTGGGATGGAAAAGGGTTAAAGGGGAGGAGTGGGGTGGGGGTGGGGGTTTTATTGGTTTATTATAAAAGGATCGTTCGGTTGTTCGGTTTTTGTATTCGTTGGAAAGCGGTTTCGAGTTAGGGGTTATTGTAAAGTTAGGGTGCGTTATCGGACGGAGAGGGGAGAGTTTTGAGTAGAGTGAGTAATATCGTAGTTAAGGCGGAGGTCGAAGAGGGGCGTTAGGTATTAATTTTCGCGTTGTTTTAGTTTCGGAGGCGTTTTAGAGCGTTTTTTGTTTTAGTAGAGTTATTTTGTTTGCGTTTGTTTTTTAGTGTCTTTAATTTTGCGTTGGAAGAAAAATTTTTT

而根据一种具体实施方式，用于检测ADAMTS1基因及其片段中至少一个区域内是否存在甲基化的核酸序列可以包括：等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于由如下所示的ADAMTS1基因的启动子区域SEQ ID NO：22-24的至少15个核苷酸序列及其互补序列。

根据某些优选实施方式，可以基于SEQ ID NO：10-12和SEQ ID NO：22-24的序列，设计引物和探针。其中适用于作为PCR扩增的引物和探针的序列，可以包括任何合适的长度，例如可以包括至少15个的核苷酸，或者可以包括至少20、25、30、35、40、45个或者多于50个的核苷酸。在这些具体实施方式中，核酸序列可以和SEQ ID NO：10-12和SEQ ID NO：22-24的序列或者其互补序列具有约95％、96％、97％、98％或99％的相似性。

因此，可以设计TaqMan探针和引物用于检测SEPT9基因富含CpG的序列区域的DNA甲基化。

可以设计TaqMan探针和引物用于检测BNC1基因启动子区域(BNC1 v1转录开始位点的-512bp至-154bp)的DNA甲基化，优选检测的启动子区域是BNC1 v1转录起始位点的-476bp至-277bp，更优选检测的启动子区域是BNC1 v1转录起始位点的-260bp至-161bp。

可以设计TaqMan探针和引物用于检测ADAMTS1基因启动子区域(ADAMTS1转录起始位点的-204bp至254bp)的DNA甲基化，优选检测的启动子区域是ADAMTS1转录起始位点的-14bp至116bp，更优选检测的启动子区域是ADAMTS1转录起始位点的87bp至189bp。

根据申请，可以设计很多套探针和引物的组合，而每一套探针和引物的组合的性能可能存在差别。为了筛选高效的引物和探针，本申请通过以下步骤利用甲基化基因组DNA(甲基化转移酶处理的白细胞基因组DNA)和非甲基化基因组DNA(白细胞基因组DNA)，以及癌症(例如胰腺癌癌)和癌旁组织DNA做模板，对所设计的多套探针和引物组合进行了筛选：

1.设计SEPT9、BNC1基因和ADAMTS1基因启动子区域CpG富集区域的引物和探针。

2.利用甲基化基因组DNA和非甲基化基因组DNA筛选引物和探针；筛选条件为：甲基化基因组DNA的PCR反应生成扩增产物，非甲基化基因组DNA的PCR不生成扩增产物。

3.利用癌症(例如胰腺癌癌)和癌旁组织中提取的DNA筛选引物和探针。筛选条件为：癌症基因组DNA的PCR反应生成扩增产物，癌旁组织基因组DNA的PCR不生成扩增产物。

4.利用临床研究阶段正常血浆中提取的外周血游离DNA筛选引物和探针。筛选条件为：在临床研究阶段正常血浆中没有扩增或扩增很少。

通过上述筛选，构建了以下序列SEQ ID NO：1-9、SEQ ID NO：13-21以及SEQ IDNO：27-30作为引物和探针：

SEPT9引物F1:

SEQ ID NO：27：CCCACCAACCATCATAT

SEPT9引物R1:

SEQ ID NO：28：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT

SEPT9探针P1:

SEQ ID NO：29：GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC

SEPT9探针P2:

SEQ ID NO：30：CGTTGATCGCGGGGTTC

BNC1引物F1:

SEQ ID NO：1:TGAGTTTTTAAGAAAATTTTTTGGC

BNC1探针P1:

SEQ ID NO：2:FAM-TTCGGCGGGGGTAGATATTTTCG-BHQ1

BNC1引物R1:

SEQ ID NO：3:CTAAATCAACGCAACTAAAACGAA

BNC1引物F2:

SEQ ID NO：4:TTTATATTTTAAGACGTTCGTTTCGT

BNC1探针P2:

SEQ ID NO：5:FAM-TTCGCGGTAGTGAGATTTCGA-BHQ1

BNC1引物R2：

SEQ ID NO：6:GTATCGATATTTACCTCTCCCGAA

BNC1引物F3:

SEQ ID NO：7:AATAAGTGTTTTTAAGTTCGGCGGG

BNC1探针P3:

SEQ ID NO：8:FAM-TTCGCGTCGGTCGTCGGCGT-BHQ1

BNC1引物R3：

SEQ ID NO：9:AACGCAACTAAAACGAAACCGTAAC

ADAMTS1引物F1:

SEQ ID NO：13:TTTTAGATTGACGAGTAGTGGCGTG

ADAMTS1探针P1:

SEQ ID NO：14:ROX-AACGGAGTCGGGGGCGGCGTTTTTGGGA-BHQ2

ADAMTS1引物R1:

SEQ ID NO：15:GAAAAATTTTTCTTCCAACGCAAA

ADAMTS1引物F2:

SEQ ID NO：16:GTTGTTCGGTTTTTGTATTCGTT

ADAMTS1探针P2：

SEQ ID NO：17:ROX-AAGTTAGGGTGCGTTATCGGACGGA-BHQ2

ADAMTS1引物R2：

SEQ ID NO：18:GACCTCCGCCTTAACTACGATAT

ADAMTS1引物F3:

SEQ ID NO：19:GTGAGTAATATCGTAGTTAAGGCGG

ADAMTS1探针P3:

SEQ ID NO：20:ROX-GGCGTTAGGTATTAATTTTCGCGTT-BHQ2

ADAMTS1引物R3：

SEQ ID NO：21:CTAAAACAAAAAACGCTCTAAAACG

引物和探针的组合及扩增片段为:

BNC1 v1转录开始位点的-512bp至-154bp:SEQ ID NO：1、2和3，即BNC1的引物F1，R1以及探针P1；

BNC1 v1转录起始位点的-476bp至-277bp:SEQ ID NO：4、5和6，即BNC1的引物F2，R2以及探针P2；

BNC1 v1转录起始位点的-260bp至-161bp:SEQ ID NO：7、8和9，即BNC1的引物F3，R3以及探针P3；

ADAMTS1转录起始位点的-204bp至254bp:SEQ ID NO：13、14和15，即ADAMTS1的引物F1，R1以及探针P1；

ADAMTS1转录起始位点的-14bp至116bp:SEQ ID NO：16、17和18，即ADAMTS1的引物F2，R2以及探针P2；

ADAMTS1转录起始位点的87bp至189bp:SEQ ID NO：19、20和21，即ADAMTS1的引物F3，R3以及探针P3；

在某些具体实施方式中，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。例如，该试剂可以是亚硫酸氢盐。

此类试剂盒可以包括被分隔成用于密封收纳一个或多个容器如小瓶、小管等的载体，每个容器均包括将在所述方法中使用的一个独立元件。例如，其中一个容器可以包括探针，其是或者可能是可检测标记的。

典型地，本申请的试剂盒将包括用于容纳患者生物样品的容器和/或使用和解释试剂盒结果的说明，具体而言，本申请的试剂盒包括从商业和用户的角度看所需的材料，包括用于容纳患者生物样品的容器、缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和插入包装中的使用说明书。可以在容器上使用标签，以便说明所述组分用于特定的治疗或非治疗应用，并且还可以说明是在体内或体外使用，如上文所述的那些。

本申请的试剂盒具有多种实施方式。一个典型的实施方式是试剂盒，其包括容器、在所述容器上的标签和在所述容器内的组分；其中所述组分包括用于检测SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段中至少一个区域内甲基化状态的核酸，在所述容器上的标签表明可以使用所述组分评估样品的DNA的甲基化状态，并对如何使用本试剂盒进行说明。该试剂盒可以进一步包括一组说明和用于制备组织样品和将本申请的组合物应用于样品的材料。该试剂盒可以包括用于将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂，例如亚硫酸氢盐。

典型地，根据本申请的方法还包括使用试剂以将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的步骤。

DNA的亚硫酸氢盐修饰为已知的用于评估CpG甲基化状态的工具。在真核细胞的DNA中，5-甲基胞嘧啶是最常见的共价碱基修饰。其例如在调节转录、遗传印迹以及肿瘤发生中起作用。因此确认5-甲基胞嘧啶作为遗传信息组分有相当大的意义。但是，5-甲基胞嘧啶不能通过测序来鉴定，因为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为。此外，例如在PCR扩增过程中，5-甲基胞嘧啶携带的表观遗传信息则完全丢失。

最常用于分析DNA中5-甲基胞嘧啶存在的方法是基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应，由此在随后的碱性水解后，胞嘧啶被转变为在配对行为上对应胸腺嘧啶的尿嘧啶。但重要的是，在这些条件下5-甲基胞嘧啶保持不被修饰。结果，原始的DNA以此方式被转变，使得原来在其杂交行为上不能与胞嘧啶区分开的甲基胞嘧啶现在可作为仅剩的胞嘧啶被常规的已知分子生物学技术检测到，例如通过扩增和杂交。所有这些技术都基于不同的碱基配对特性，现在可被充分利用了。

因此，典型地，本申请提供了亚硫酸氢盐技术与一种或多种甲基化测定的联合使用，用于确定SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因组合基因序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化状态。基因组CpG二核苷酸可被甲基化或未被甲基化(或者分别称为上和下甲基化(up-and down-methylated))。但是，本发明的方法适于分析异质的生物样品，例如血液或粪便中的低浓度肿瘤细胞。因此，当分析这种样品中CpG位置的甲基化状态时，本领域技术人员可以使用定量测定法来确定特定CpG位置处的甲基化水平(例如百分比、份数、比率、比例或程度)，而不是甲基化状态。相应地，术语甲基化状况或甲基化状态还应被认为是指反映CpG位置处甲基化程度的值。除非有明确说明，术语“超甲基化”或“上甲基化”应被认为是指甲基化水平超过特定的临界值，其中所述的临界值可以是代表给定群体的平均或中值甲基化水平的值，或优选为优化的临界水平。在本文中“临界”也可指“阈值”。在本发明的上下文中，对于在选自以下序列的基因或基因组序列内的或与其有关的(例如在启动子或调节区内)所有CpG位置来说，术语“甲基化的”、“超甲基化的”或“上甲基化的”应被认为是包括甲基化水平高于临界值零(0)％(或其等同值)甲基化，所述序列为上述的BNC1、ADAMTS1和SEPT9基因序列。

在某些实施方式中，本申请的方法具体包括：使所述经试剂处理的SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段与扩增酶和引物接触，使得所述经处理的基因或片段被扩增以产生扩增产物或不被扩增；用探针检测扩增产物；以及基于所述扩增物是否存在，确定BNC1基因、SEPT9基因和ADAMTS1基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。

并且，典型地，所述接触或扩增包括适用至少一种选自如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶；使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶；使用聚合酶链式反应(PCR)；产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。

即，优选地用PCR方式来测定甲基化状态，诸如“基于荧光的实时PCR技术”(Eads等人，Cancer Res.59：2302-2306，1999)、Ms-SNuPE TM(甲基化敏感的单核苷酸引物延伸)反应(Gonzalgo&Jones，Nucleic Acids Res.25：2529-2531，1997)、甲基化特异性PCR(“MSP”；Herman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-9826，1996；美国专利5,786,146)以及甲基化的CpG岛扩增(“MCA”；Toyota等人，Cancer Res.59：2307-12，1999)等测定方法被用于测定SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。

其中，“基于荧光的实时PCR”测定为高通量定量甲基化测定，其使用基于荧光的实时PCR(TaqMan)技术，在PCR步骤后不需要进一步的操作(Eads等人，Cancer Res.59：2302-2306,1999)。简言之，”基于荧光的实时PCR”方法以基因组DNA的混合样品开始，该混合样品根据标准操作(亚硫酸氢盐过程将未甲基化的胞嘧啶残基转变成尿嘧啶)在亚硫酸氢钠反应中被转变为甲基化依赖的序列差异的混合池。随后在“偏移的(biased)”反应(采用重叠已知CpG二核苷酸的PCR引物)中进行基于荧光的PCR。可在扩增过程水平以及在荧光检测过程水平上产生序列差别。

“基于荧光的实时PCR”测定可以用作基因组DNA样品中甲基化模式的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平上。在该定量方式中，在重叠特定的推定甲基化位点的荧光探针存在下，PCR反应提供了甲基化特异的扩增。用于输入DNA量的无偏移对照由以下反应提供：其中引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸。”基于荧光的实时PCR”方法可与任何适合的探针一起使用，如“TaqMan”、“Lightcycler”等等。

TaqMan_探针为荧光“报道物”和“淬灭”分子双标记的，并被设计为特异于相对高GC含量区，以至于其在PCR循环中以比正向或反向引物高约10℃的温度熔解。这使得TaqMan_探针在PCR退火/延伸步骤中保持充分杂交。当Taq聚合酶在PCR中酶合成新链时，其最终会遇到退火的TaqMan_探针。Taq聚合酶5’至3’内切酶活性随后将通过消化TaqMan_探针而顶替它，从而释放荧光报道物分子用于采用实时荧光检测系统定量检测其现在未被淬灭的信号。

用于“基于荧光的实时PCR”分析的典型试剂(例如，可以在基于“基于荧光的实时PCR”的试剂盒中找到的)可以包括，但不限于：用于特定基因(或亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物；TaqMan或Lightcycler探针；优化的PCR缓冲液以及脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。

并且，具体而言，在优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：

在第一步中，获得待分析的组织样品。该来源可以是任何适合的来源，例如细胞系、组织学切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液分离的细胞及其所有可能的组合。优选地，DNA的所述来源为粪便或体液，选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、分离自血液的细胞。

然后从所述样品分离基因组DNA。可通过现有技术中的任何标准手段来分离，包括使用可商购的试剂盒。简言之，当目的DNA被包裹在细胞膜中时，该生物样品必须被破碎并通过酶、化学或机械手段被裂解。随后例如通过蛋白激酶K的消化而清除蛋白和其它的污染物。接着从溶液回收基因组DNA。这可以通过各种方法来实现，包括盐析、有机提取或将DNA结合到固相支持物。对方法的选择会受到多种因素的影响，包括时间、费用和所需的DNA的量。

当所述样品DNA未被包裹在细胞膜中时(例如来自血液样品的循环DNA)，可以使用现有技术中分离和/或纯化DNA的标准方法。这些方法包括使用蛋白降解试剂，例如离液盐，如盐酸胍或脲；或去污剂，如十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化氰。其它方法包括但不限于乙醇沉淀或丙醇沉淀、通过离心的真空浓缩等。本领域技术人员也可以利用装置，例如诸如超滤的滤器，硅表面或膜，磁性颗粒，聚苯乙烯颗粒，聚苯乙烯表面，带正电荷的表面以及带阳性电荷的膜，带电膜，带电表面，带电转换膜，带电转换表面。

一旦核酸被提取，就将基因组双链DNA用于分析。

在所述方法的第二步中，将所述基因组DNA样品处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。这应被理解为本文所述的“预处理”或“处理”。

这优选通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现。术语“亚硫酸氢盐试剂”指包括亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐(disulfite)、酸式亚硫酸盐或其组合的试剂，如这里所公开的可用于区分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。所述处理在本领域中是已知的(例如PCT/EP2004/011715，通过参考将其整体并入本文)。优选地，该亚硫酸氢盐处理在变性溶剂存在下进行，所述变性溶剂诸如但不限于正烷基二醇，尤其是二乙二醇二甲基醚(DME)，或者在二噁烷或二噁烷衍生物存在下进行。在优选的实施方案中，所述变性溶剂以1％至35％(v/v)的浓度使用。还优选该亚硫酸氢盐反应在清除剂存在下进行，例如但不限于色原烷衍生物，如6-羟基-2,5,7,8,-四甲基色原烷2-羧酸或三羟基苯甲酸及其衍生物，例如没食子酸(参见：PCT/EP2004/011715，将其整体通过参考并入本文)。该亚硫酸氢盐转变优选在30℃至70℃的反应温度下进行，其中在反应期间温度短时间地增加至超过85℃(参见：PCT/EP2004/011715，将其整体通过参考并入本文)。经亚硫酸氢盐处理的DNA优选在定量之前进行纯化。这可通过任何现有技术中已知的方法来进行，例如但不限于超滤，优选通过Microcon^(TM)柱(由Millipore^(TM)生产)进行。

在所述方法的第三步中，采用本发明的引物核苷酸以及扩增酶扩增经处理的DNA的片段。可在同一个反应容器中同时进行几种DNA片段的扩增。通常，该扩增反应采用聚合酶链式反应(PCR)进行。优选地，所述扩增产物的长度为100至2,000个碱基对。

对于SEPT9基因及其片段的甲基化的检测，利用针对SEPT9基因的引物和探针。例如：

SEPT9引物F1:

SEQ ID NO：27：CCCACCAACCATCATAT

SEPT9引物R1:

SEQ ID NO：28：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT

SEPT9探针P1:

SEQ ID NO：29：GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC

SEPT9探针P2:

SEQ ID NO：30：CGTTGATCGCGGGGTTC

对于BCN1基因及其片段的甲基化的检测，利用针对BCN1基因的经上述筛选方法所筛选的引物和探针。例如：

BNC1引物F3:

SEQ ID NO：7:AATAAGTGTTTTTAAGTTCGGCGGG

BNC1探针P3:

SEQ ID NO：8:FAM-TTCGCGTCGGTCGTCGGCGT-BHQ1

BNC1引物R3：

SEQ ID NO：9:AACGCAACTAAAACGAAACCGTAAC

对于ADAMTS1基因及其片段的甲基化的检测，利用针对ADAMTS1基因的经上述筛选方法所筛选的引物和探针。例如:

ADAMTS1引物F3:

SEQ ID NO：19:GTGAGTAATATCGTAGTTAAGGCGG

ADAMTS1探针P3:

SEQ ID NO：20:ROX-GGCGTTAGGTATTAATTTTCGCGTT-BHQ2

ADAMTS1引物R3：

SEQ ID NO：21:CTAAAACAAAAAACGCTCTAAAACG

通过扩增获得的片段可携带有可直接或间接地检测的标记物。优选的是，标记物为荧光标记物、放射性核素或可附着的分子片段的形式。

在所述方法的第四步中，分析在所述方法的第三步中获得的扩增产物，以便确定处理之前CpG二核苷酸的甲基化状态。

在第四步中，对扩增产物的检测是通过实时检测探针来进行。在本发明中，可以利用各种商业用实时PCR仪器设备上根据现有技术的标准操作进行实时PCR的检测。根据某些具体实施方式，在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR的检测。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25-40ng和300-600nM引物、150-300nM探针、1UTaq聚合酶、50-400uM的各个dNTP、1至10mM的MgCl2和2XPCR缓冲至最终的2ul至100ul的体积。在85至99℃持续3-60分钟，以用预循环扩增样品，紧接着在50至72℃进行1至30秒的35-55个循环的退火，在45至80℃下退火5至90秒，在85至99℃下变性5至90秒。

通过仅仅在甲基化的SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因片段上观测扩增，用与含5-甲基胞嘧啶的SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的CpG岛区域的特异性的探针检测所述基因片段。并且，在某些具体实施方式中，以β肌动蛋白基因(ACTB)作为PCR的内参，通过使用与β肌动蛋白基因序列互补的引物来创建β肌动蛋白基因扩增子，并且用特定的探针检测β肌动蛋白基因扩增子。每个样品进行至少一次的实时PCR，在某些具体实施方式中，进行两次或三次实时PCR检测。

在所述方法的第五步中，分别体现所述SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定，然后进一步包括以下步骤：

A)比较所测样本的SEPT9基因所对应的PCR的Ct值与SEPT9基因的预先设定的cutoff值；

B)比较所测样本的BNC1基因所对应的PCR的Ct值与BNC1基因的预先设定的临界Ct值(cut off Ct值)，从而确定基于BNC1基因的分析结果是否为阳性；

C)比较所测样本的ADAMTS1基因所对应的PCR的Ct值与ADAMTS1基因的预先设定的cut off值，从而确定基于ADAMTS1基因的分析结果是正常、还是胰腺癌；

D)综合所述A)、B)和C)步骤的结果确定所述样本的最终分析结果是正常、还是胰腺癌。

根据本申请的具体实施方式，基于一定数量的胰腺癌样本和正常样本的SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的平均Ct值，确定相对于SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的胰腺癌和正常的临界Ct值。

并且，本申请还允许使用不同的方法学来分析Ct值。例如，使用ΔCt或dCT，肌动蛋白Ct作为PCR内部对照，SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的Ct减去肌动蛋白的Ct得到SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的dCT值。相应地，如果采用ΔCt或dCT作为检测标准，那么在所述方法的第五步中，分别体现所述SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定，然后进一步包括以下步骤：

A)比较所测样本的SEPT9基因所对应的PCRΔCt值与BNC1基因的预先设定的Δcut值(即临界Ct值)，从而确定基于SEPT9基因的分析结果是正常、还是胰腺癌；

B)比较所测样本的BNC1基因所对应的PCRΔCt值与BNC1基因的预先设定的Δcut值，从而确定基于BNC1基因的分析结果是正常、还是胰腺癌；

C)比较所测样本的ADAMTS1基因所对应的PCRΔCt值与ADAMTS1基因的预先设定的Δcut值，从而确定基于ADAMTS1基因的分析结果是正常、还是胰腺癌；

D)综合所述A)、B)和C)步骤的结果确定所述样本的最综分析结果是正常、还是胰腺癌。

综上所述，本申请通过以上所述的组合物、核酸序列、试剂盒及其用途，以及上述检测方法，通过联合利用分别用于检测SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段的甲基化的核酸序列，实现了联合利用SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因甲基化生物标记物来对胰腺癌进行体外检测，从而使得疾病体外检测的灵敏度和特异性均得到了提高。

以下将详述具体的实施例。

实施例

实施例一：引物和探针的筛选

对于SEPT9使用的探针和引物，可以参照现有技术，例如在中国专利CN101160411A中记录的探针和引物(相当于本申请的SEQ ID NO：27-30)

BNC1基因和ADAMTS1基因，可以设计很多套探针和引物的组合，而每一套探针和引物的组合的性能可能存在差别。所以在以下实施例中对于探针和引物进行了筛选。

在本实施例中，先用甲基化基因组DNA和非甲基化基因组DNA对BNC1基因和ADAMTS1基因的引物和探针进行了筛选。本实施例包括以下步骤：

首先，设计BNC1基因和ADAMTS1基因的各种引物和探针，只要其能等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：12的至少15个核苷酸及其互补序列,和SEQ ID NO：22至SEQ ID NO：24的至少15个核苷酸及其互补序列。

然后，用甲基化基因组DNA和非甲基化基因组DNA作为模板，使用不同的探针和引物组合进行PCR扩增。其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(ABI7500)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30ul的体积。在94℃保持20分钟，紧接着45个循环：65℃保持30秒，在95℃保持15秒。

通过PCR试验结果，筛选、验证了以下6套合适的引物和探针均可用于BNC1基因和/或ADAMTS1基因的甲基化状态的检测；其中BNC1引物、探针组合3和ADAMTS1引物、探针组合3的分析灵敏性最佳，用于后续检测：

BNC1引物、探针组合1，BNC1 v1转录开始位点的-512bp至-154bp:

BNC1引物F1:

SEQ ID NO：1:TGAGTTTTTAAGAAAATTTTTTGGC

BNC1探针P1:

SEQ ID NO：2:FAM-TTCGGCGGGGGTAGATATTTTCG-BHQ1

BNC1引物R1:

SEQ ID NO：3:CTAAATCAACGCAACTAAAACGAA

BNC1引物、探针组合2：BNC1 v1转录起始位点的-476bp至-277bp:

BNC1引物F2:

SEQ ID NO：4:TTTATATTTTAAGACGTTCGTTTCGT

BNC1探针P2:

SEQ ID NO：5:FAM-TTCGCGGTAGTGAGATTTCGA-BHQ1

BNC1引物R2：

SEQ ID NO：6:GTATCGATATTTACCTCTCCCGAA

BNC1引物、探针组合3：BNC1 v1转录起始位点的-260bp至-161bp:

BNC1引物F3:

SEQ ID NO：7:AATAAGTGTTTTTAAGTTCGGCGGG

BNC1探针P3:

SEQ ID NO：8:FAM-TTCGCGTCGGTCGTCGGCGT-BHQ1

BNC1引物R3：

SEQ ID NO：9:AACGCAACTAAAACGAAACCGTAAC

ADAMTS1引物、探针组合1：ADAMTS1转录起始位点的-204bp至254bp:

ADAMTS1引物F1:

SEQ ID NO：13:TTTTAGATTGACGAGTAGTGGCGTG

ADAMTS1探针P1:

SEQ ID NO：14:ROX-AACGGAGTCGGGGGCGGCGTTTTTGGGA-BHQ2

ADAMTS1引物R1:

SEQ ID NO：15:GAAAAATTTTTCTTCCAACGCAAA

ADAMTS1引物、探针组合2：ADAMTS1转录起始位点的-14bp至116bp:

ADAMTS1引物F2:

SEQ ID NO：16:GTTGTTCGGTTTTTGTATTCGTT

ADAMTS1探针P2：

SEQ ID NO：17:ROX-AAGTTAGGGTGCGTTATCGGACGGA-BHQ2

ADAMTS1引物R2：

SEQ ID NO：18:GACCTCCGCCTTAACTACGATAT

ADAMTS1引物、探针组合3：ADAMTS1转录起始位点的87bp至189bp:

ADAMTS1引物F3:

SEQ ID NO：19:GTGAGTAATATCGTAGTTAAGGCGG

ADAMTS1探针P3:

SEQ ID NO：20:ROX-GGCGTTAGGTATTAATTTTCGCGTT-BHQ2

ADAMTS1引物R3：

SEQ ID NO：21:CTAAAACAAAAAACGCTCTAAAACG

结论：甲基化基因组DNA模板有扩增，非甲基化基因组DNA模板没有扩增，表明引物和探针的设计是正确的。六组引物和探针均能区别甲基化模板和非甲基化模板，分别可以用作BNC1基因和ADAMTS1基因试验中的引物和探针。虽然不同的探针和引物的组合，效果是不同的，但是以上六组探针均适用于作为BNC1基因和/或ADAMTS1基因试验中的引物和探针；其中BNC1引物、探针组合3和ADAMTS1引物、探针组合3的分析灵敏性最佳，继续用于本申请的后续检测，详见图1和图2，为使用BNC1引物、探针组合3和ADAMTS1引物、探针组合3对甲基化基因组DNA和非甲基化基因组DNA进行扩增的扩增曲线。进一步对BNC1引物、探针组合3和ADAMTS1引物、探针组合3进行分析发现，这两组引物和探针有好的线性扩增区间(图3)；在进行多重PCR反应是的检测结果与进行单重PCR的检测结果基本一致，可以用于多重PCR检测(图4)；使用不同比例的非甲基化基因组DNA和甲基化基因组DNA对BNC1基因和ADAMTS1基因的引物和探针组合进行检测，结果显示：不同比例的非甲基化基因组DNA和甲基化基因组对BNC1基因和ADAMTS1基因的引物和探针组合的甲基化检测没有影响(图5)。

接着，用癌症和癌旁组织DNA做模板进一步筛选和验证BNC1基因和ADAMTS1基因的引物和探针。

得到11对胰腺癌样品(编号为854852T、854908T、854999T、855378T、856214T、861884T、862477T、863067T、864061T、868477T、868488T)和癌旁组织样品(编号为854852N、854908N、854999N、855378N、856214N、861884N、862477N、863067N、864061N、868477N、868488N)，并提取组织样品基因组DNA。所有癌症样品来源于博尔诚公司。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有人样品DNA是通过使用博尔诚公司的组织基因组DNA提取试剂盒提取。

然后，将所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用EPi proColon PlasmaQuick Kit进行的。

接着，上述经过预处理的11对胰腺癌和癌旁组织样品的基因组DNA样本中加入上述SEPT9基因引物和探针组合、BNC1基因引物和探针组合、ADAMTS1基因引物和探针组合、和内参基因ACTB基因引物和探针组合，进行SEPT9基因、BNC1基因、ADAMTS1基因和ACTB基因PCR试验，在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(ABI7500)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30ul的体积。在94℃保持20分钟，紧接着45个循环：65℃保持30秒，在95℃保持15秒。

最后，测得11对胰腺癌和癌旁组织样品基因组DNA对于SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化率(图6)。从SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化率可以看出，SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因在癌症DNA有高度的甲基化，正常DNA有低度的甲基化。SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的引物和探针的特异性能区别癌症DNA和癌旁DNA(非癌对照)。

根据上述实施例，本申请设计的BNC1基因和ADAMTS1基因的引物和探针能区别癌症DNA和癌旁DNA(非癌对照)

实施例二：SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化DNA多重检测，对胰腺癌 和正常人进行检测

本实施例包括以下步骤：

首先，得到19例胰腺癌患者和16例正常人的血浆，并且提取胰腺癌和正常人的基因组DNA。所有样品来源于博尔诚公司。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA是通过使用Epigenomics公司的EPiproColon Plasma Quick Kit提取的。

然后，将所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用EPi proColon PlasmaQuick Kit进行的。

然后，上述经过预处理的19例胰腺癌患者和16例正常人的基因组DNA样本中加入上述的SEPT9基因引物、探针组合，BNC1基因引物、探针组合、ADAMTS1基因引物、探针组合、和内参基因ACTB基因引物、探针组合，通过多重PCR检测SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化状态。在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30ul的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

最后，分别测得19例胰腺癌患者和16例正常人的基因组DNA样本对于SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的实时PCR的Ct值。检测结果显示SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化在胰腺癌患者中明显高于正常人(图7)。

在该实施例中，当SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因以Ct值45为临界值时，胰腺癌检测的灵敏度是78.9％，特异性是75％(图8)。上述实验结果表明了通过本发明的SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化DNA多元检测，可以对癌症进行体外检测，比如可以对胰腺癌进行体外检测。

实施例三：SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因联合检测改善胰腺癌检测的灵敏 度

得到19例胰腺癌患者和16例正常人的样品。提取各样品中基因组DNA。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA是通过使用Epigenomics公司的EPi proColon Plasma Quick Kit提取。

然后，将所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用EPi proColon PlasmaQuick Kit进行的。

然后，上述经过预处理的基因组DNA样本中加入SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因引物、探针组合，并且加入ACTB基因的引物和探针，通过多重PCR检测SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化状态PCR试验，多元地检测SEPT9基因PCR试验、BNC1基因PCR试验、ADAMTS1基因PCR试验和ACTB基因PCR试验。在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30ul的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

最后，测得19例胰腺癌患者和16例正常人基因组DNA样本对于SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的实时PCR的Ct值。以CT<45为阳性判读标准，等到检测结果(图8)。结果显示，SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因联合检测的检出率高于单独使用SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因进行检测(三基因联合检测的检出率比单一基因的检出率提高近40％)。

实施例四：SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因甲基化联合血清标识物CA199检测 改善胰腺癌检测的灵敏度

得到19例胰腺癌患者和16例正常人的样品。提取各样品中基因组DNA。所述DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA是通过使用Epigenomics公司的EPi proColon Plasma Quick Kit提取。对血清进行常规CA199检测。

然后，将所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用EPi proColon PlasmaQuick Kit进行的。

然后，上述经过预处理的基因组DNA样本中加入SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因引物、探针组合，并且加入ACTB基因的引物和探针，通过多重PCR检测SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化状态PCR试验，多元地检测SEPT9基因PCR试验、BNC1基因PCR试验、ADAMTS1基因PCR试验和ACTB基因PCR试验。在经亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200um的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30ul的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。

最后，测得19例胰腺癌患者和16例正常人基因组DNA样本对于SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的实时PCR的Ct值。以CT<45为阳性判读标准，等到检测结果；与传统肿瘤血清学标识物CEA和CA199相比，甲基化基因检测对胰腺癌的灵敏性明显提高(图9)。此外，结果显示SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因甲基化联合CA199检测可以对胰腺癌的检出率进一步提高，达到接近90％的水平(图9)。

综上所述，本申请中，通过实验发现胰腺癌中的SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1的甲基化状态与正常个体之间存在较大的差异，SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因在胰腺癌中发生甲基化上升,所以本申请提供了一种通过测试样本中SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的甲基化状态来对胰腺癌进行体外检测的方法，从而提供了一种无创的、快速的胰腺癌筛选方法。

并且，1)通过联合利用SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因甲基化生物标记物来对胰腺癌进行体外检测，灵敏度可以得到提高。因此将SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因甲基化生物标识物结合在一起进行检测的话，能够改善胰腺癌检测的灵敏度；2)通过利用SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因甲基化联合CA199检测，来对胰腺癌进行体外检测，灵敏度可以得到提高。

通过利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对BNC1基因、SEPT9基因和ADAMTS1基因甲基化生物标识物的同时间的多通道检测，并且能根据实时PCR的CT值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，提供了一种无创性的快速的癌症的体外检测方法。

在说明书中提及的所有发表文献和专利申请表明与本发明相关领域内技术人员的水平。所有的发表文献和专利申请通过引用的方式结合到本文中，就如每个发表文献和专利申请被具体地、单个地注明通过引用的方式结合到本文中一样。仅仅对这些发表文献和专利申请的提及不能理解为成人它们相对于本申请是现有技术文献。

尽管在此公开了本发明的各个方面和实施例，但其他方面和实施例对于本领域技术人员而言也是显而易见的。在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的，而非限制目的。本发明的保护范围和主旨仅通过后附的权利要求书来确定。

除非另外明确指出，本文中所使用的术语和短语及其变体均应解释为开放式的，而不是限制性的。在一些实例中，诸如“一个或多个”、“至少”、“但不限于”这样的扩展性词汇和短语或者其他类似用语的出现不应理解为在可能没有这种扩展性用语的示例中意图或者需要表示缩窄的情况。

Claims (8)

1.一种用于体外检测胰腺癌的组合物，所述组合物包括用于检测目标基因的至少一个区域内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因选自SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因的至少两个及其片段；

优选地，所述组合物包括用于检测目标基因的每一个的至少一个区域内甲基化状态的核酸；

优选地，所述目标基因选自SEPT9基因和BNC1基因、SEPT9基因和ADAMTS1基因，或SEPT9基因、BNC1基因和ADAMTS1基因及其片段。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述核酸包括选自所述目标基因的至少15个核苷酸的片段，其中所述核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中，所述核苷酸的片段包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25的至少15个核苷酸的片段及其互补序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述核苷酸的片段包含基于SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25设计的探针和/或引物。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，所述核苷酸的片段包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：26的序列及其互补序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂，优选的试剂是亚硫酸氢盐。

7.一种用于体外检测胰腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-6中任一项所述的组合物；

优选地，所述的试剂盒包括用于容纳患者生物样品的容器；

更优选地，所述的试剂盒也包括使用和解释试剂盒结果的说明。

8.如权利要求1-6中任一项所述的组合物在制备用于体外检测胰腺癌的试剂盒中的用途。