CN117344015B - 一种胰腺癌诊断试剂盒、方法及其装置 - Google Patents

一种胰腺癌诊断试剂盒、方法及其装置 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子诊断领域，特别是涉及一种胰腺癌诊断试剂盒、方法及其装置。本发明中包含一种用于捕获胰腺癌相关基因片段ctDNA的差异甲基化区域的探针组合物，所述胰腺癌相关基因片段选自以下任一个或多个：ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段。本发明能够实现高精确度且无创的胰腺癌早期诊断，根据患者ctDNA中检测到的甲基化水平预测其患有I期和II期胰腺癌的可能性。

Description

一种胰腺癌诊断试剂盒、方法及其装置
技术领域
本发明涉及分子诊断领域，特别是涉及一种胰腺癌诊断试剂盒、方法及其装置。
背景技术
胰腺癌是最致命的恶性肿瘤之一，其主要原因在于难于早发现、早诊断，且对治疗反应不佳。五年生存率不到10％，使其成为全球第四大癌症相关死亡原因。胰腺癌的早期检测至关重要，可以显著改善预后和生存率。临床证据表明，如果在早期阶段检测到癌症并进行手术切除，生存率可以增加到20％-30％。
目前，胰腺癌的诊断包括结合医学史、体格检查和各种影像检查。影像检查包括计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、超声波、胆管胰管造影、正电子发射断层扫描(PET)和血管造影等。这些检查通过可视化影像，尽早发现可疑的癌症发生区域。此外，可通过血液检查评估肝功能并检测肿瘤标记物，如CA 19-9和癌胚抗原(CEA)。然而，上述检测亦或难以成为普遍筛查项目，亦或具有特异性不足的问题。胰腺癌的确诊往往需要进行活检确认，具有一定操作风险。
DNA甲基化作为一种生物过程和重要的生物标志物，在细胞发育、基因组印记和染色体稳定性中发挥关键作用。特定基因组区域的DNA甲基化率异常可被用于指示包括胰腺癌在内的多种癌症的发生发展。循环肿瘤DNA(ctDNA)是源自肿瘤细胞的碎片化DNA，存在于血液中。血液样本中的ctDNA甲基化状态可以为不同类型的癌症提供“分子指纹”。已有较多研究证实血液样本中特定的ctDNA甲基化状态检测是一种行之有效的非侵入性早期癌症检测方法
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种胰腺癌诊断试剂盒、方法及其装置，用于解决现有技术的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于捕获胰腺癌相关基因片段ctDNA的差异甲基化区域的探针组合物，其特征在于，所述胰腺癌相关基因片段选自以下任一个或多个：ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段。
优选地，所述ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示。
本发明还提供前述探针组合物在制备胰腺癌诊断试剂盒中的用途。
本发明还提供前述一种用于胰腺癌诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括前述探针组合物。
本发明还提供一种胰腺癌检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
S1，获取待测样本ctDNA中ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段和DBX1基因片段的定量聚合酶链式反应的荧光阈值数据即CT值；
S2，机器学习模型根据获取的荧光阈值数据判断并输出待测样本分别为健康样本或胰腺癌样本的概率，并根据概率截断值判断待测样本为健康样本或胰腺癌样本；所述机器学习模型通过下述方法构建：
S21，获取胰腺癌人群和健康人群的荧光阈值数据，并将所述荧光阈值数据分为训练验证数据集和测试数据集；
S22，利用训练验证数据集训练、验证机器学习模型，并评估获得的机器学习模型；
S23，利用测试数据集对S22获得的机器学习模型进行测试并调整，直至模型的判断与实际相符合为止，即获得最优模型。
本发明还提供一种胰腺癌检测装置，所述胰腺癌检测装置包括如下模块：
1)待测数据获取模块：用于获取待测样本ctDNA中ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段和DBX1基因片段的定量聚合酶链式反应的CT值，所述CT值前述探针组合物或前述试剂盒对待测样本进行定量聚合酶链式反应后获得；
2)检测模块：机器学习模型根据获取的CT值判断并输出待测样本分别为健康样本或胰腺癌样本的概率，并根据概率截断值判断待测样本为健康样本或胰腺癌样本。
本发明还提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现前述胰腺癌检测方法。
本发明还提供一种电子终端，包括：处理器、存储器、网络接口和用户接口；所述存储器用于存储计算机程序，所述处理器用于执行所述存储器存储的计算机程序，以使所述终端执行胰腺癌检测方法。
如上所述，本发明的一种胰腺癌诊断试剂盒、方法及其装置，具有以下有益效果：
本发明能够实现高精确度且无创的胰腺癌早期诊断，根据患者ctDNA中检测到的甲基化水平预测其患有I期和II期胰腺癌的可能性。
相较于NGS测序方法，本发明采用的qPCR操作更为简便，可更快速获得检测结果，更适合于临床诊断应用场景；检测目标明确，针对指定目标具有更高的检测灵敏度即更高的预测成功率；由此制备的检测试剂盒成本更为低廉。
附图说明
图1显示为本发明检测胰腺癌的基本流程图。
图2显示为本发明的装置检测胰腺癌的能力。
图3显示为本发明的检测胰腺癌装置的示意图。
图4显示为本发明的电子终端的示意图。
图5显示为本发明的装置测胰腺癌的准确性。
具体实施方式
本发明提供一种用于捕获胰腺癌相关基因片段ctDNA的差异甲基化区域的探针组合物，所述胰腺癌相关基因片段选自以下中任一个或多个：ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段。
所述差异甲基化区域为覆盖差异甲基化位点的基因组区域，所述差异甲基化位点为与癌症和非癌症分类最显著相关的甲基化位点。
所述差异甲基化位点或差异甲基化区域可以通过现有技术获得。
在本发明的某些实施方式中，所述差异甲基化区域通过以下方法获得：
采集多例临床诊断为胰腺癌患者的组织样本及其对应的正常样本，测量基因组中CpG位点的甲基化水平，从而在多个样本之间建立一个全面的甲基化水平矩阵。然后，基于每个位点的甲基化水平，以测序深度作为权重，样本类型作为响应变量，建立logistic回归模型。通过模型确定与癌症、非癌症分类最显著相关的甲基化位点即差异甲基化位点。通过合并相邻的差异甲基化位点，获得覆盖差异甲基化位点的基因组区域，得到最有效的特征差异甲基化区域。
在一些具体实施方式中，所述ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示。
在一些具体实施方式，所述ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段为非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段。
在一些具体实施方式中，所述非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。
在一些具体实施方式中，所述探针组合物包含扩增引物组和荧光探针。更具体地，所述扩增引物组为ARMS扩增引物组。
在一些具体实施方式中，所述扩增引物组中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-12所示。具体地，所述扩增引物组包含ADAMTS1基因片段扩增引物组、FBXL7基因片段扩增引物组或DBX1基因片段扩增引物组。所述ADAMTS1基因片段扩增引物组中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；所述FBXL7基因片段扩增引物组中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-10所示；所述DBX1基因片段扩增引物组中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示。
在一些具体实施方式中，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-15所示。具体地，所述荧光探针包含ADAMTS1基因片段荧光探针、FBXL7基因片段荧光探针或DBX1基因片段扩荧光探针。所述ADAMTS1基因片段荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述FBXL7基因片段荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；所述DBX1基因片段荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在一些具体实施方式中，所述探针组合物中所述扩增引物组和所述荧光探针组合使用。具体地，1个扩增引物组和1个或多个荧光探针组合使用；或，1个荧光探针和1个或多个扩增引物组组合使用。优选地，1个扩增引物组和1个荧光探针组合使用。更具体地，所述ADAMTS1基因片段扩增引物组和所述ADAMTS1基因片段荧光探针组合使用；所述FBXL7基因片段扩增引物组和所述FBXL7基因片段荧光探针组合使用；所述DBX1基因片段扩增引物组和所述DBX1基因片段荧光探针组合使用。
本发明中探针组合物的检测原理如下：扩增引物组可以结合非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶后的ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段中发生了甲基化的区域，扩增所述的ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段。前述荧光探针结合所述扩增所述的ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段中发生了甲基化的区域后，发出可被检测的荧光，用机器读取荧光生成CT值。CT值小则说明ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段的甲基化水平高，CT值大则说明ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段或DBX1基因片段的甲基化水平低。
对本申请中的引物对具有的具体碱基序列而言，只要能够在PCR实施条件下特异性地识别各自的特异性识别区域(优选在单一的反应容器内使用的引物之间不发生退火及自退火)，则可以使1个或多个碱基替换为其他碱基，也可在3’端或5’端添加1个或多个碱基。此处，所谓多个，例如为2～3个。向引物添加1个或多个碱基的情况下，优选向引物的5’端添加。
将本申请中引物对具体的碱基序列中的1个或多个碱基取代为其他碱基而得到的碱基序列、与被取代前的碱基序列(即，序列号所示碱基序列)的同一性优选为70％以上，更优选为75％以上，更优选为80％以上，更优选为85％以上，更优选为90％以上，更优选为95％以上。
对于各引物的长度而言，只要能够特异性地识别对应的特异性识别区域、且引物之间不发生杂交即可，没有特别限制，优选为15个碱基以上且40个碱基以下。更优选的是，引物的长度的下限为16个碱基以上，进一步优选为17个碱基以上，进一步优选为18个碱基以上。更优选的是，引物的长度的上限为39个碱基以下，进一步优选为38个碱基以下，进一步优选为37个碱基以下。
所述荧光探针一端分别标记有荧光报告基团，另一端分别标记有荧光淬灭基团。较佳的，具体的，所述荧光报告基团选自以下中的一种：FAM、HEX、VIC、CY3、ROX、610、TEXASRED、CY5。具体的，所述荧光淬灭基团与荧光报告基团相对应，能够淬灭相应的荧光报告基团即可。例如，当荧光报告基团为FAM时，所述荧光淬灭基团选自以下中的一种：BHQ1、Dabcyl、TAMRA、MGB。
本发明还提供所述探针组合物在制备胰腺癌诊断试剂盒中的用途。
本发明中，所述胰腺癌选自胰腺腺泡细胞癌(PACC)或胰腺导管腺癌(PDAC)。所述胰腺癌诊断试剂盒为胰腺癌早期诊断试剂盒。所述胰腺癌早期诊断试剂盒是指I期或II期胰腺癌诊断试剂盒。
本发明还提供一种胰腺癌诊断试剂盒，所述试剂盒中包括所述探针组合物。
所述试剂盒中还包括ctDNA提取试剂。
所述ctDNA提取试剂可以是商品化的提取试剂。
所述试剂盒中还包括ctDNA前处理试剂，所述ctDNA前处理试剂为将DNA中的非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不变的试剂。
从患者的血样中提取的ctDNA携带着与肿瘤细胞相同的遗传和表观遗传变化，然后经过前处理试剂转化处理。所述ctDNA经前处理试剂前处理后，可以区分甲基化和非甲基化的DNA序列。经过前处理后的ctDNA用于制备测序文库。
所述ctDNA前处理试剂选自亚硫酸氢盐。所述亚硫酸氢盐例如为亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钾或亚硫酸氢铵中的任意一种或多种。所述亚硫酸氢盐的工作浓度为1mol/L～5mol/L。例如所述亚硫酸氢盐的工作浓度为1mol/L～2mol/L、2mol/L～3mol/L、3mol/L～4mol/L或4mol/L～5mol/L。
本发明还提供一种胰腺癌检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
S1，获取待测样本ctDNA中ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段和DBX1基因片段的定量聚合酶链式反应(qPCR)的CT值；
S2，机器学习模型根据获取的CT值判断并输出待测样本分别为健康样本或胰腺癌样本的概率，并根据概率截断值判断待测样本为健康样本或胰腺癌样本；所述机器学习模型通过下述方法构建：
S21，获取胰腺癌人群和健康人群的CT值，并将所述CT值分为训练验证数据集和测试数据集；
S22，利用训练验证数据集训练、验证机器学习模型，并评估获得的机器学习模型；
S23，利用测试数据集对S22获得的机器学习模型进行测试并调整，直至模型的判断与实际相符合为止，即获得最优模型。
在一些具体实施方式中，通过利用所述探针组合物或所述试剂盒获取待测样本ctDNA中ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段和DBX1基因片段的定量聚合酶链式反应(qPCR)的CT值。
在一些具体实施方式中，所述待测样本选自组织样本或血液样本。
在一些具体实施方式中，所述待测样本为血浆样本。所述待测样本中包括从血浆分离的ctDNA。
在一些具体实施方式中，所述定量聚合酶链式反应中不含荧光染料。
在一些具体实施方式中，所述机器学习模型选自逻辑回归模型。
逻辑回归模型是一种机器学习算法，可用于分类和回归分析。在本发明中，逻辑回归模型用于基于特定基因组位点的甲基化状态，将ctDNA待测样本分类为健康样本或胰腺癌样本。逻辑回归模型通过使用来自临床诊断为胰腺癌的患者和健康个体的ctDNA样本数据集进行训练。特定基因组位点的甲基化状态由定量聚合酶链式反应(qPCR)的CT值确定，作为逻辑回归模型的输入特征。该模型通过学习特定的甲基化模式以区分胰腺癌和正常的ctDNA样本。该逻辑回归模型的独特之处在于它能够基于ctDNA的甲基化模式准确预测胰腺癌的存在。
在一些具体实施方式中，逻辑回归模型通过定量聚合酶链式反应(qPCR)的CT值生成概率得分，基于所述概率得分构建接受者操作特征曲线(ROC曲线)，用于在区分PDAC和正常样本方面具有较高的准确性。
在一些具体实施方式中，逻辑回归模型概率得分的概率截断值为0.4。这意味着概率得分高于0.4的样本被分类为恶性(PDAC)即胰腺癌样本，而概率得分低于0.4的样本被分类为良性(正常)即健康样本。选择该概率截断值是为了在灵敏度(测试正确识别阳性病例的能力)和特异度(测试正确识别阴性病例的能力)之间找到平衡点，从而尽量减少假阳性和假阴性。这进一步增强了该模型的临床实用性，为PDAC的早期检测提供了可靠的工具。
本发明还提供一种胰腺癌检测装置，所述检测装置包括如下模块：
1)待测数据获取模块：用于获取待测样本ctDNA中ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段和DBX1基因片段的定量聚合酶链式反应的CT值；
2)检测模块：机器学习模型根据获取的CT值判断并输出待测样本分别为健康样本或胰腺癌样本的概率，并根据概率截断值判断待测样本为健康样本或胰腺癌样本。
在本发明的某些实施方式中，所述机器学习模型包括下述子模块：
1)数据集获取子模块：用于获取胰腺癌人群和健康人群的ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段和DBX1基因片段的定量聚合酶链式反应的CT值，并将所述CT值分为训练验证数据集和测试数据集；
2)模型构建子模块：用于利用训练验证数据集训练、验证机器学习模型，并评估获得的机器学习模型；
3)模型优化子模块：用于利用测试数据集对S22获得的机器学习模型进行测试并调整，直至模型的判断与实际相符合为止，即获得最优模型。
由于所述胰腺癌检测装置与前述方法的原理基本相同，在上述方法和装置实施例中，对相同特征的定义、计算方法、实施方式的列举及优选实施方式的列举阐述可以互用，不再重复赘述。
需要说明的是，应理解以上装置的各个模块的划分仅仅是一种逻辑功能的划分，实际实现时可以全部或部分集成到一个物理实体上，也可以物理上分开。且这些模块可以全部以软件通过处理元件调用的形式实现；也可以全部以硬件的形式实现；还可以部分模块通过处理元件调用软件的形式实现，部分模块通过硬件的形式实现。例如，数据获取模块可以为单独设立的处理元件，也可以集成在上述装置的某一个芯片中实现，此外，也可以以程序代码的形式存储于上述装置的存储器中，由上述装置的某一个处理元件调用并执行以上数据获取模块的功能。其它模块的实现与之类似。此外这些模块全部或部分可以集成在一起，也可以独立实现。这里所述的处理元件可以是一种集成电路，具有信号的处理能力。在实现过程中，上述方法的各步骤或以上各个模块可以通过处理器元件中的硬件的集成逻辑电路或者软件形式的指令完成。
例如，以上这些模块可以是被配置成实施以上方法的一个或多个集成电路，例如：一个或多个特定集成电路(Application Specific Integrated Circuit，简称ASIC)，或，一个或多个微处理器(digital signal processor，简称DSP)，或，一个或者多个现场可编程门阵列(Field Programmable Gate Array，简称FPGA)等。再如，当以上某个模块通过处理元件调度程序代码的形式实现时，该处理元件可以是通用处理器，例如中央处理器(Central Processing Unit，简称CPU)或其它可以调用程序代码的处理器。再如，这些模块可以集成在一起，以片上系统(system-on-a-chip，简称SOC)的形式实现。
为本发明实施例提供的电子终端400的一个可选的硬件结构示意图，具体如图4所示，该终端400可以是移动电话、计算机设备、平板设备、个人数字处理设备、工厂后台处理设备等。电子终端400包括：至少一个处理器401、存储器402、至少一个网络接口404和用户接口406。装置中的各个组件通过总线系统405耦合在一起。可以理解的是，总线系统405用于实现这些组件之间的连接通信。总线系统405除包括数据总线之外，还包括电源总线、控制总线和状态信号总线。但是为了清楚说明起见，在图4中将各种总线都标为总线系统。
其中，用户接口406可以包括显示器、键盘、鼠标、轨迹球、点击枪、按键、按钮、触感板或者触摸屏等。
可以理解，存储器402可以是易失性存储器或非易失性存储器，也可包括易失性和非易失性存储器两者。其中，非易失性存储器可以是只读存储器(ROM，Read Only Memory)、可编程只读存储器(PROM，Programmable Read-Only Memory)，其用作外部高速缓存。通过示例性但不是限制性说明，许多形式的RAM可用，例如静态随机存取存储器(SRAM，StaticRandom Access Memory)、同步静态随机存取存储器(SSRAM，Synchronous StaticRandomAccess Memory)。本发明实施例描述的存储器旨在包括但不限于这些和任意其它适合类别的存储器。
本发明实施例中的存储器402用于存储各种类别的数据以支持电子终端400的操作。这些数据的示例包括：用于在电子终端400上操作的任何可执行程序，如操作系统4021和应用程序4022；操作系统4021包含各种系统程序，例如框架层、核心库层、驱动层等，用于实现各种基础业务以及处理基于硬件的任务。应用程序4022可以包含各种应用程序，例如媒体播放器(MediaPlayer)、浏览器(Browser)等，用于实现各种应用业务。实现本发明实施例提供的胚系位点变异致病性预测方法可以包含在应用程序4022中。
上述本发明实施例揭示的方法可以应用于处理器401中，或者由处理器401实现。处理器401可能是一种集成电路芯片，具有信号的处理能力。在实现过程中，上述方法的各步骤可以通过处理器401中的硬件的集成逻辑电路或者软件形式的指令完成。上述的处理器401可以是通用处理器、数字信号处理器(DSP，Digital Signal Processor)，或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件等。处理器401可以实现或者执行本发明实施例中的公开的各方法、步骤及逻辑框图。通用处理器401可以是微处理器或者任何常规的处理器等。结合本发明实施例所提供的方法的步骤，可以直接体现为硬件译码处理器执行完成，或者用译码处理器中的硬件及软件模块组合执行完成。软件模块可以位于存储介质中，该存储介质位于存储器，处理器读取存储器中的信息，结合其硬件完成前述方法的步骤。
在示例性实施例中，电子终端400可以被一个或多个应用专用集成电路(ASIC，Application Specific Integrated Circuit)、DSP、可编程逻辑器件(PLD，ProgrammableLogic Device)、复杂可编程逻辑器件(CPLD，Complex Programmable LogicDevice)，用于执行前述方法。
在本发明的一些实施例中，还提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时实现前述检测方法。
本领域普通技术人员可以理解：实现上述各方法实施例的全部或部分步骤可以通过计算机程序相关的硬件来完成。前述的计算机程序可以存储于一计算机可读存储介质中。该程序在执行时，执行包括上述各方法实施例的步骤；而前述的存储介质包括：ROM、RAM、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
在本发明的一些实施例中，还提供了一种计算机处理设备，包括处理器及前述的计算机可读存储介质，所述处理器执行所述计算机可读存储介质上的计算机程序，实现前述方法的步骤。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
需要说明的是，在下述描述中，参考附图，附图描述了本申请的若干实施例。应当理解，还可使用其他实施例，并且可以在不背离本申请的精神和范围的情况下进行机械组成、结构、电气以及操作上的改变。下面的详细描述不应该被认为是限制性的，并且本申请的实施例的范围仅由公布的专利的权利要求书所限定。这里使用的术语仅是为了描述特定实施例，而并非旨在限制本申请。空间相关的术语，例如“上”、“下”、“左”、“右”、“下面”、“下方”、“下部”、“上方”、“上部”等，可在文中使用以便于说明图中所示的一个元件或特征与另一元件或特征的关系。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”、“固持”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
再者，如同在本文中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文中有相反的指示。应当进一步理解，术语“包含”、“包括”表明存在所述的特征、操作、元件、组件、项目、种类、和/或组，但不排除一个或多个其他特征、操作、元件、组件、项目、种类、和/或组的存在、出现或添加。此处使用的术语“或”和“和/或”被解释为包括性的，或意味着任一个或任何组合。因此，“A、B或C”或者“A、B和/或C”意味着“以下任一个：A；B；C；A和B；A和C；B和C；A、B和C”。仅当元件、功能或操作的组合在某些方式下内在地互相排斥时，才会出现该定义的例外。
实施例
差异甲基化区域筛选：
基于收集的经临床诊断为胰腺癌的患者的癌组织样本和相应的癌旁正常样本，测定基因组的CpG位点甲基化水平，计算公式为meth ratio＝C/(C+T)。整合成多样本甲基化水平矩阵。
对测序深度低于10的位点当做缺失值，过滤缺失值大于40％的位点，并用K最近邻方法对其余位点的缺失值进行填充。根据每个甲基化位点的甲基化水平，以及以测序深度为权重，以样本类型为响应变量，构建逻辑回归(logistic Regression)模型。该模型可以识别与癌症/非癌症分类最显著相关的甲基化位点。筛选出与癌/癌旁分类最显著相关的甲基化位点，其甲基化水平在癌和癌旁样本具有显著差异。通过合并相邻的甲基化位点，提取出覆盖差异甲基化位点的基因组区域，得到最有效的特征性差异甲基化区域。
本发明所涉及的三个基因的检测区域序列如下表所示：
血液ctDNA提取并进行亚硫酸盐转化：
1.样本处理
1.1全血采集：采用EDTA抗凝管或游离DNA采血管收集5ml静脉血。使用普通EDTA真空采血管采集后的血样应立即分离血浆，若不能立即分离血浆，应在2～8℃保存，保存时间不超过4小时；使用游离DNA采血管采集后的血浆可以室温保存4天。不得冰冻血样。
1.2血浆样本的制备：离心装有全血的采血管12分钟，离心力1350±150rcf。血浆样本可以在-20±5℃下保存不超过30天。血浆样本可以在2～8℃存放不超过12小时。
1.3亚硫酸盐转化的DNA(BisDNA)：按照Qiagen QIAamp Circulating NucleicAcid Kit核酸提取试剂盒说明书提取、按照Thermo Scientific EpiJET试剂盒说明书进行亚硫酸盐转化。若BisDNA不立即使用，在2～8℃保存16小时，或在-20±5℃保存4天。
采用亚硫酸氢盐处理DNA，具体方法包括：
(1)配制亚硫酸氢盐缓冲液，称取1g亚硫酸氢钠粉末，加水配制成3M缓冲液。
(2)配制保护缓冲液，称取1g对苯二酚试剂，加水配置成0.5M保护缓冲液。
(3)将100μl DNA溶液(DNA含量100ng)、200μl亚硫酸氢盐缓冲液和50μl保护液混合，震荡混合均匀。
(4)热循环：95℃5min，50℃30min，95℃5min，50℃2h，95℃5min，50℃5h，4℃。
(5)将1ml DNA结合缓冲液加入到亚硫酸氢盐处理后的DNA溶液中，再加入50μl磁珠，震荡孵育1h。
(6)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液。
(7)加入0.5ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min。
(8)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清。
(9)加入0.5ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min。
(10)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液。
(11)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液。
(12)将装有磁珠的离心管放置在55℃的金属浴上，开盖晾10min。
(13)加入50μl洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗10min。
(14)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记。
ADAMTS1基因片段域C到T转换后序列：
SEQ ID NO.4：
5’-AGACGATTTTGTGAGGGTTCGGTTTATATTTTTGGAATGGGTGATTTGGGACGC GGTTTAATTTTTTAGAGTATAAGGAGGGAATTGCGCTT-3’
FBXL7基因片段域C到T转换后序列：
SEQ ID NO.5：
5’-GGACGTGCGTCGTAGTTATGGAGTGTTTCGGGAGACGGCGGGTATGACGGTTATAGGATGGGCGCGAATA-3’
DBX1基因片段域C到T转换后序列：
SEQ ID NO.6：
5’-TGGGTAGGGTTTGTTCGCGATAGTTTTCGTTAGATAGGAGTTCGCGTTTTTTGGAGTTTCGTTATTTTATGCGTCGGTTTTGG-3’
ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段和DBX1基因片段的qPCR检验
反应液配制：
设计ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段和DBX1基因片段的甲基化特异性引物和探针。
ADAMTS1基因片段扩增引物组中引物和荧光探针的核苷酸序列：
正向扩增引物：SEQ ID No.7：GACGATTTTGTGAGGGTTCG
反向扩增引物：SEQ ID No.8：AAGCGCAATTCCCTCCTTAT
荧光探针：SEQ ID No.13：TGATTTGGGACGCGGTTTA
FBXL7基因片段扩增引物组中引物和荧光探针的核苷酸序列：
正向扩增引物：SEQ ID No.9：GGACGTGCGTCGTAGTTATG
反向扩增引物：SEQ ID No.10：TATTCGCGCCCATCCTATAA
荧光探针：SEQ ID No.14：AGTGTTTCGGGAGACGGC
DBX1基因片段扩增引物组中引物和荧光探针的核苷酸序列：
正向扩增引物：SEQ ID No.11：TGGGTAGGGTTTGTTCGC
反向扩增引物：SEQ ID No.12：CCAAAACCGACGCATAAAAT
荧光探针：SEQ ID No.15：TTCGTTAGATAGGAGTTCGCG
扩增反应体系的终浓度组成为：1×PCR缓冲液(购自NEB公司)、0.5mM dNTPs(购自NEB公司)、0.5μM目的基因检测引物、0.2μM目的基因荧光探针、0.3μM内参基因引物、0.3μM内参基因荧光探针、2ng/μl模板DNA、0.10U/μl热启动TaqDNA聚合酶(购自NEB公司)。引物和探针均购自上海生工公司，dNTPs中包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP和10mM dGTP，PCR缓冲液中包含50mM Tris-HCl、20mM氯化钾、10mM硫酸铵和2mM氯化镁。
将预反应液加至PCR管的管孔中，加入BisDNA至PCR管对应的孔中用管盖密封，1000±100rcf离心1分钟，使混合液全部流入管底并且无气泡出现。
上机检测：按照反应程序设置反应过程，进行PCR反应。荧光定量PCR扩增反应的具体过程为：95℃预变性10分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，95℃变性10s，60℃退火延伸60s，并进行50个循环。
分析运行结果，设定阈值线和读取Ct值
基于逻辑回归的胰腺癌预测模型的建立
上一步的数据用于逻辑回归模型的训练和测试，ADAMTS1基因片段、FBXL7基因片段和DBX1基因片段的定量聚合酶链式反应的CT值在逻辑回归模型中作为预测变量或特征。该模型使用此数据集进行训练，将个体的已知健康状态(癌症或健康)作为响应变量。将三个基因的Ct值依次记作x1，x2，x3，逻辑回归的模型可以表述为
logit(P)＝β0+β1*x1+β2*x2+β3*x3
其中：P为预测为罹患胰腺癌的概率；β0是截距，代表了当所有预测变量为零时结果的对数几率；β1，β2和β3分别是预测变量x1，x2和x3的系数，这些系数代表了对应预测变量增加一单位时结果的对数几率的变化。逻辑回归模型通常使用最大似然估计进行估计。一旦模型被拟合，就可以根据新样本在三个PCR位点的Ct值预测结果的概率。
然后使用验证数据集进行预测，基于受试者工作特征曲线(ROC Curve)，划定P值使得验证集预测准确性达到最大值。
在训练阶段，模型学习区分甲基化水平与胰腺癌的存在与否之间的关系。
训练阶段结束后，模型经过验证阶段以确保其准确性和可靠性。这涉及使用与训练所用数据集不同的独立数据集。根据验证数据集中的甲基化水平，模型的预测与个体的实际健康状态进行比较。任何不一致之处都会被注意到，并相应地调整模型以提高其预测能力。此验证和调整的迭代过程将继续进行，直到模型的预测与实际结果相符合为止。
经过验证后，逻辑回归模型可在临床环境中应用。当提供来自新患者的ctDNA甲基化数据时，模型可以预测患者患有I期或II期胰腺癌的可能性。
良恶性评估
使用了一组包括20例胰腺导管腺癌(PDAC)样本和20例正常样本来对上述模型进行验证，用于测试建立的逻辑回归模型的预测能力。在这些样本中测量了三个特定基因位点的ctDNA甲基化水平，并输入到模型中。模型然后为每个样本生成一个概率得分，表示该样本为癌性的可能性。这些概率得分用于构建接受者操作特征曲线(ROC曲线)，展示该模型的预测能力，如图2。
ROC曲线显示的曲线下面积(AUC)约为0.90，表示在区分PDAC和正常样本方面具有较高的准确性。AUC为0.9表明该模型具有出色的预测能力。基于ROC曲线，确定了逻辑回归模型概率得分的截断值为0.4。这意味着得分高于0.4的样本被分类为恶性(PDAC)，而得分低于0.4的样本被分类为良性(正常)。选择该截断值是为了在灵敏度(测试正确识别阳性病例的能力)和特异度(测试正确识别阴性病例的能力)之间找到平衡点，从而尽量减少假阳性和假阴性。这进一步增强了该模型的临床实用性，为PDAC的早期检测提供了可靠的工具。
特异性评估
使用上述模型对20例胰腺癌样本、20例其他癌种样本、20例正常样本进行分类预测，所得预测值分布情况如下图5所示，胰腺癌样本的预测值分布和正常样本具有显著差异，而其他癌种样本和正常样本间不具有统计学区分度。因此，本发明所选择甲基化位点能将胰腺癌从其他非胰腺癌中区分出来。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种用于检测胰腺癌相关基因片段ctDNA的差异甲基化区域的引物及探针组合物，其特征在于，所述胰腺癌相关基因片段由核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的ADAMTS1基因片段、如SEQ ID No.2所示的FBXL7基因片段和如SEQ ID No.3所示的DBX1基因片段组成，所述引物及探针组合物包含扩增引物组和荧光探针，所述扩增引物组中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-12所示，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-15所示。
2.权利要求1所述的引物及探针组合物在制备胰腺癌诊断试剂盒中的用途。
3.一种用于胰腺癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述的引物及探针组合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括以下任一项或多项试剂：
a）ctDNA提取试剂；
b）ctDNA前处理试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述ctDNA前处理试剂为亚硫酸氢盐。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述亚硫酸氢盐为亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钾或亚硫酸氢铵中的任意一种或多种。
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