用于区分胰腺癌和慢性胰腺炎的组合物及其用途
技术领域
本发明属于医学检测领域,涉及一种组合物在疾病检测中的用途,具体地涉及一种组合物及其相应试剂盒在制备用于区分胰腺癌和慢性胰腺炎的装置中的用途。
背景技术
胰腺癌是一种恶性程度高,检测和治疗困难的消化道恶性肿瘤。胰腺癌死亡率高的原因是早期胰腺癌的确诊率极低。从胰腺癌病灶开始形成到患者出现临床症状的过程平均需要2-3年。充分利用这个窗口期,提高早期胰腺癌的确诊率,有望提高胰腺癌治疗效果、降低胰腺癌死亡率。申请号为201510884161.6的中国专利申请“用于检测胰腺癌的组合物及其用途”公开了一种用于检测胰腺癌的组合物及其相应的试剂盒和用途。这种组合物及其相应的试剂盒检测胰腺癌的灵敏性为78.9%,检测正常对照的特异性为75%。
胰腺癌的检测方法需要良好的敏感性和特异性,同时也需要能够区分胰腺癌和胰腺良性病变,如:慢性胰腺炎。慢性胰腺炎在胰腺癌检测时被误诊为胰腺癌,将会导致进一步的过度诊断,甚至过度治疗,给患者带来不必要的生理、心理和经济负担。但是现有的研究中,往往专注于胰腺癌检测的敏感性,忽略了其检测中可能存在的由于对胰腺炎的错误判断而导致的假阳性较高的问题,给患者带来不必要的生理、心理和经济负担。
基于此,提供一种能够有效区分胰腺癌和慢性胰腺炎辅助检测手段,以有效区分胰腺癌和慢性胰腺炎是十分必要的。
发明内容
基于以上目的,本发明提供了一种组合物和相应试剂盒,本发明还提供了该组合物和试剂盒在制备用于区分胰腺癌和慢性胰腺炎的装置中的用途。此外,本发明还提供了基于上述组合物及其相应的试剂盒来区分胰腺癌和慢性胰腺炎方法。
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种组合物在制备用于区分胰腺癌和慢性胰腺炎的装置中的用途,所述组合物包括:
1)用于检测目标基因的至少一个区域内甲基化水平的核酸,所述目标基因选自人类碱性核蛋白1基因(Basonuclin 1,BNC1)或其片段,和人类去解联金属蛋白酶1基因(ADAMmetallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 1,ADAMTS1)或其片段;
2)用于检测β-肌动蛋白基因(actin beta,ACTB)的至少一个区域的核酸;和
3)用于检测CA-199抗原在血清/血浆中的浓度的试剂。
根据本发明的某些优选的实施方案,所述组合物包括用于检测BNC1基因或其片段,和ADAMTS1基因或其片段中的每一个的至少一个区域内甲基化水平的核酸。通过对目标基因的甲基化检测结果来检测胰腺癌/慢性胰腺炎。优选地,所述BNC1基因或其片段的至少一个区域包括所述基因的至少15个核苷酸的片段,其中包含至少一个CpG二核苷酸序列;所述ADAMTS1基因或其片段的至少一个区域包括所述基因的至少15个核苷酸的片段,其中包含至少一个CpG二核苷酸序列。CpG的甲基化状态表明所述疾病的检测结果。
优选地,所述核酸选自引物和/或探针,优选地,所述引物和/或探针选自以下序列:
BNC1正向引物:
SEQ ID NO:1:AATAAGTGTTTTTAAGTTCGGCGGG
BNC1反向引物:
SEQ ID NO:2:AACGCAACTAAAACGAAACCGTAAC
BNC1探针:
SEQ ID NO:3:TTCGCGTCGGTCGTCGGCGT
ADAMTS1正向引物:
SEQ ID NO:4:GTGAGTAATATCGTAGTTAAGGCGG
ADAMTS1反向引物:
SEQ ID NO:5:CTAAAACAAAAAACGCTCTAAAACG
ADAMTS1探针:
SEQ ID NO:6:GGCGTTAGGTATTAATTTTCGCGTT
ACTB正向引物:
SEQ ID NO:7:GGTGATGGAGGAGGTTTAGTA
ACTB反向引物:
SEQ ID NO:8:CCAATAAAACCTACTCCTCCCTT
ACTB探针:
SEQ ID NO:9:CCACCACCCAACACACAATAACAAAC
优选地,所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。优选的试剂是亚硫酸氢盐。
优选地,所述用于检测CA-199抗原在血清/血浆中的浓度的试剂为酶联免疫吸附试剂(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA);其中,所述试剂包括CA-199抗原的特异性抗体;更优选地,所述试剂为“三明治式”酶联免疫吸附试剂;进一步优选地,所述试剂包括CA-199抗原的特异性抗体包被的反应板、CA-199抗原酶结合物、底物液、洗液、终止液。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种综合评估BNC1基因甲基化水平、ADAMTS1基因甲基化水平和CA-199抗原在血清/血浆中的浓度的方法,其采用包括上述组合物的装置,例如试剂盒对BNC1基因甲基化水平、ADAMTS1基因甲基化水平和CA-199抗原在血清/血浆中的浓度的检测结果,进行综合评估来区分胰腺癌和和慢性胰腺炎。
根据本发明的某些优选的实施方案,所述目标基因的甲基化水平是通过测量目标基因甲基化DNA在总DNA中的含量来评估的。优选地,目标基因甲基化是利用上述核酸混合物,通过实时定量PCR对目标基因(BNC1和ADAMTS1)进行测量的;总DNA是利用上述核酸混合物,通过利用实时定量PCR对内参基因(ACTB)进行测量的;目标基因甲基化DNA在总DNA中的含量是通过目标基因PCR检测的循环阈值(Ct)和内参基因PCR检测的循环阈值(Ct)之差(delta-CT,ΔCT)来评估的。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种对胰腺癌和慢性胰腺炎进行体外区分的方法,所述方法包括以下步骤:
1)分离待测生物样品中BNC1基因、ADAMTS1基因和ACTB基因的核酸;
2)定量检测BNC1基因和ADAMTS1基因中至少一个区域内的甲基化水平;优选地,使用实时定量PCR方法;
3)定量检测ACTB基因;优选地,使用实时定量PCR方法;
4)检测CA-199抗原在血清/血浆中的浓度水平;优选地,使用ELISA方法检测;
5)通过所述BNC1、ADAMTS1和ACTB检测结果和CA-199抗原在血清/血浆中的浓度水平检测结果来对胰腺癌和慢性胰腺炎进行体外区分;
判断公式为Logit=Constant-A*ΔCT(BNC1)-B*ΔCT(ADAMTS1)+C*CA199;
其中,0.107<Constant<57.966、0.746<A<1.140、0.689<B<1.117、0.949<C<1.102;
优选的,Constant=2.495,A=0.922,B=0.877,C=1.023。优选地,对逻辑回归的结果的判读是通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,简称ROC曲线)来选择的;优选地,作为判读阈值的logit=0.80:当logit≥0.80,检测结果为阳性;当logit<0.80,检测结果为阴性。
利用多种标记物联合检测的常用方法为:定量(或定性)检测多种标记物指标,之后与各检测指标的评估阈值比较而得到各项检测的逻辑判断值,最后对多个逻辑判断值进行简单的逻辑组合,从而得到最后检测的结果。本发明人发现,通过对BNC1基因、ADAMTS1基因的甲基化水平和CA-199抗原在血清/血浆中的浓度水平的定量检测(其中,目标基因的甲基化水平是通过测量目标基因的甲基化DNA在DNA总量中的含量来评估的),利用逻辑回归计算方法,对目标基因甲基化水平和CA-199抗原血清/血浆水平进行优化组合,并且利用受试者工作特征曲线确定计算结果判读标准后,能够有效区分胰腺癌和和慢性胰腺炎,避免了对慢性胰腺炎的误判,提高了检测的准确性,有效增强了临床应用性。因此本发明,提供了一种无创、快速的胰腺癌的体外检测方法。
本发明的发明人研究发现,现有技术公开的甲基化基因标记物在慢性胰腺炎样品中存在较高水平的阳性率;此外,CEA、CA125等常用肿瘤血清标记物在慢性胰腺炎样品中也存在一定水平的阳性率。但是,肿瘤血清/血浆标记物CA-199抗原检测胰腺癌的灵敏度虽然偏低(52.6%),其对慢性胰腺炎患者的特异性很高(100%),因此慢性胰腺炎患者进行CA-199抗原的胰腺癌检测中不会出现假阳性。可以用于与甲基化标记物结合,特异性区分胰腺癌和慢性胰腺炎。
除非另外定义,本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料,本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下,以本说明书包括其中定义为准,另外,材料、方法和例子仅供说明,而不具限制性。
本发明的其他特点和优势将由下面的具体说明和权利要求书作详细的描述。
具体实施方案
下面结合具体实施方案对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
本发明提供了一种通过检测BNC1和ADAMTS1基因甲基化水平以及CA-199抗原在血清/血浆中的浓度水平区分胰腺癌和慢性胰腺炎的用途。本发明的发明人意外的发现,该组合物能够在保持对胰腺癌检测高灵敏的基础上,有效区分胰腺癌和慢性胰腺炎样本,是对现有胰腺癌体外检测方法的一项重要的补充,能够提高胰腺癌检测的准确性。
下述为本发明的实施例。可以理解,考虑到上文所提供的一般性描述,可以实施多种其他的实施方案。
在实施方案中,公开用于对胰腺癌患者进行体外检测的组合物,包括用于检测BNC1和ADAMTS1基因甲基化水平的核酸,以及用于检测CA-199抗原在血清/血浆中的浓度水平的试剂,通过检测BNC1和ADAMTS1基因甲基化水平和CA-199抗原在血清/血浆中的浓度水平对疾病进行体外检测。
其中,BNC1基因为人类碱性核蛋白1基因(Basonuclin 1),位于染色体15q25.2的NC_000015.10片段内。
ADAMTS1基因为人类去解联金属蛋白酶1基因(ADAM metallopeptidase withthrombospondin type 1motif 1),位于染色体21q21.2的NC_000021.9片段内。
CA-199是一种糖基抗原,是一种肿瘤标识物。
在一个优选的实施方案中,用于检测BNC1和ADAMTS1基因甲基化水平的核酸序列包括SEQ ID NO:1-9所示的核酸序列。其中SEQ ID NO:1-3提供了检测BNC1基因的甲基化水平的核酸序列;SEQ ID NO:4-6提供了检测ADAMTS1基因的甲基化水平的核酸序列;SEQ IDNO:7-9提供了检测内参基因ACTB的核酸序列。
在某些具体实施方案中,所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测的不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。例如,该试剂可以是亚硫酸氢盐。DNA的亚硫酸氢盐修饰为已知的用于评估CpG甲基化水平的工具。在真核细胞的DNA中,5-甲基胞嘧啶是最常见的共价碱基修饰,在调节转录、遗传印迹以及肿瘤发生中起作用。因此确认5-甲基胞嘧啶作为遗传信息组分有相当大的意义。但是,5-甲基胞嘧啶不能通过测序来鉴定,因为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为。此外,例如在PCR扩增过程中,5-甲基胞嘧啶携带的表观遗传信息则完全丢失。最常用于分析DNA中胞嘧啶甲基化水平的方法是基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应,由此在随后的碱性水解后,胞嘧啶被转变为在配对行为上对应胸腺嘧啶的尿嘧啶。但重要的是,在这些条件下5-甲基胞嘧啶保持不被修饰。结果,最初的DNA以此方式被转变,使得原来在其杂交行为上不能与胞嘧啶区分开的甲基胞嘧啶现在可作为仅剩的胞嘧啶被常规的已知分子生物学技术检测到,例如通过扩增和杂交。所有这些技术都基于不同的碱基配对特性,现在可被充分利用了。因此,典型地,本发明提供了亚硫酸氢盐技术与一种或多种甲基化测定的联合使用,用于确定BNC1和ADAMTS1基因序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化水平。基因组CpG二核苷酸可被甲基化或未被甲基化。但是,本发明的方法适于分析异质的生物样品,例如血液或粪便中的低浓度肿瘤细胞。因此,当分析这种样品中CpG位置的甲基化水平时,本领域技术人员可以使用定量测定法来确定特定CpG位置所处的甲基化水平(例如百分比、份数、比率、比例或程度),而不是甲基化水平。
并且,典型地,所述接触或扩增包括适用至少一种选自如下的方法:使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶;使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶;使用聚合酶链式反应(PCR);产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。即,优选地用PCR方式来测定甲基化水平,诸如“基于荧光的实时PCR技术”、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸反应(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(MSP)、和甲基化CpG岛扩增(MCA)等测定方法被用于测定BNC1和ADAMTS1基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化水平。其中,“基于荧光的实时PCR”测定为高通量定量甲基化测定,其使用基于荧光的实时PCR(TaqMan)技术,在PCR步骤后不需要进一步的操作。简言之,“基于荧光的实时PCR”方法以基因组DNA的混合样品开始,该混合样品根据标准操作(亚硫酸氢盐过程将未甲基化的胞嘧啶残基转变成尿嘧啶)在亚硫酸氢钠反应中被转变为甲基化依赖的序列差异的混合池。随后在“偏移的(biased)”反应(采用重叠已知CpG二核苷酸的PCR引物)中进行基于荧光的PCR。可在扩增过程水平以及在荧光检测过程水平上产生序列差别。“基于荧光的实时PCR”测定可以用作基因组DNA样品中甲基化模式的定量测试,其中序列区分发生在引物和(或)探针杂交水平上。在该定量方式中,在重叠特定的甲基化位点的引物和(或)荧光探针存在下,PCR反应提供了甲基化特异的扩增。“基于荧光的实时PCR”方法可与任何适合的探针一起使用,如“TaqMan”、“Lightcycler”等等。TaqMan探针为荧光报道物(Reporter)和淬灭分子(Quencher)双标记的,并被设计为特异于相对高GC含量区,以至于其在PCR循环中以比正向或反向引物高约10℃的温度熔解。这使得TaqMan探针在PCR退火/延伸步骤中保持充分杂交。当Taq聚合酶在PCR中酶合成新链时,其最终会遇到退火的TaqMan探针。Taq聚合酶5’至3’内切酶活性随后将通过消化TaqMan探针而顶替它,从而释放荧光报道物分子用于采用实时荧光检测系统定量检测其现在未被淬灭的信号。用于“基于荧光的实时PCR”分析的典型试剂(例如,可以在基于“基于荧光的实时PCR”的试剂盒中找到的)可以包括,但不限于:用于特定基因(或亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物;TaqMan或Lightcycler探针;优化的PCR缓冲液以及脱氧核苷酸;以及Taq聚合酶。
并且,具体而言,在优选的实施方案中,所述方法包括以下步骤:
在第一步中,获得待分析的组织样品。
该来源可以是任何适合的来源,例如细胞系、组织学切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清/血浆、全血、分离的血细胞、从血液分离的细胞及其所有可能的组合。优选地,DNA的所述来源为粪便或体液,选自结肠流出物、尿、血浆、血清/血浆、全血、分离的血细胞、分离自血液的细胞。然后从所述样品分离基因组DNA。可通过现有技术中的任何标准手段来分离,包括使用可商购的试剂盒。简言之,当目的DNA被包裹在细胞膜中时,该生物样品必须被破碎并通过酶、化学或机械手段被裂解。随后例如通过蛋白激酶K的消化而清除蛋白和其它的污染物。接着从溶液回收基因组DNA。这可以通过各种方法来实现,包括盐析、有机提取或将DNA结合到固相支持物。对方法的选择会受到多种因素的影响,包括时间、费用和所需的DNA的量。当所述样品DNA未被包裹在细胞膜中时(例如来自血液样品的循环DNA),可以使用现有技术中分离和/或纯化DNA的标准方法。这些方法包括使用蛋白降解试剂,例如离液盐,如盐酸胍或脲;或去污剂,如十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化氰。其它方法包括但不限于乙醇沉淀或丙醇沉淀、通过离心的真空浓缩等。本领域技术人员也可以利用装置,例如诸如超滤的滤器,硅表面或膜,磁性颗粒,聚苯乙烯颗粒,聚苯乙烯表面,带正电荷的表面以及带阳性电荷的膜,带电膜,带电表面,带电转换膜,带电转换表面。
一旦核酸被提取,就将基因组双链DNA用于分析。
在所述方法的第二步中,将所述基因组DNA样品处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。这应被理解为本文所述的“预处理”或“处理”。这优选通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现。术语“亚硫酸氢盐试剂”指包括亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐(disulfite)、酸式亚硫酸盐或其组合的试剂,如这里所公开的可用于区分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。优选地,该亚硫酸氢盐处理在变性溶剂存在下进行,所述变性溶剂诸如但不限于正烷基二醇,尤其是二乙二醇二甲基醚(DME),或者在二噁烷或二噁烷衍生物存在下进行。在优选的实施方案中,所述变性溶剂以1%至35%(v/v)的浓度使用。还优选该亚硫酸氢盐反应在清除剂存在下进行,例如但不限于色原烷衍生物,如6-羟基-2,5,7,8,-四甲基色原烷2-羧酸或三羟基苯甲酸及其衍生物,例如没食子酸。该亚硫酸氢盐转变优选在30℃至70℃的反应温度下进行,其中在反应期间温度短时间地增加至超过85℃。经亚硫酸氢盐处理的DNA优选在定量之前进行纯化。这可通过任何现有技术中已知的方法来进行,例如但不限于超滤,优选通过Microcon(TM)柱(由Millipore(TM)生产)进行。
在所述方法的第三步中,采用本发明的引物核苷酸以及扩增酶扩增经处理的DNA的片段。可在同一个反应容器中同时进行几种DNA片段的扩增。通常,该扩增反应采用聚合酶链式反应(PCR)进行。优选地,所述扩增产物的长度为100至2,000个碱基对。对于BNC1和ADAMTS1基因及其片段的甲基化的检测,利用针对BNC1和ADAMTS1基因的引物和探针。通过扩增获得的片段可携带有可直接或间接地检测的标记物。优选的是,标记物为荧光标记物、放射性核素或可附着的分子片段的形式。对扩增产物的检测是通过实时检测探针来进行。在本发明中,可以利用各种商业用实PC仪器设备上根据现有技术的标准操作进行实时PCR的检测。根据某些具体实施方案,在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR的检测。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25-40ng和300-600nM引物、150-300nM探针、1UTaq聚合酶、50-400uM的各个dNTP、1至10mM的MgCl2和2XPCR缓冲至最终的2ul至100ul的体积。在85至99℃持续3-60分钟,以用预循环扩增样品,紧接着在50至72℃进行1至30秒的35-55个循环的退火,在45至80℃下退火5至90秒,在85至99℃下变性5至90秒。通过仅仅在甲基化的SEPT9基因片段和(或)去甲基化的SNCG基因片段上观测扩增,用与含5-甲基胞嘧啶的BNC1和ADAMTS1基因的CpG岛区域的特异性的探针检测所述基因片段。并且,在某些具体实施方案中,以β-肌动蛋白基因(ACTB)作为PCR的内参,通过使用与β-肌动蛋白基因序列互补的引物来创建β肌动蛋白基因扩增子,并且用特定的探针检测β肌动蛋白基因扩增子。每个样品进行至少一次的实时PCR,在某些具体实施方案中,进行两次或三次实时PCR检测。本发明使用delta-Ct或dCT,肌动蛋白Ct作为PCR内部对照,BNC1和ADAMTS1基因的Ct减去肌动蛋白的Ct得到BNC1和ADAMTS1基因的dCT值。
在所述方法的第四步中,通过酶联免疫吸附剂测定技术(ELISA)检测CA-199抗原血清/血浆水平。此ELISA检测技术是通过“三明治法”实现对CA-199抗原血清/血浆水平的检测:首先以CA-199单克隆抗体(鼠)对96孔板进行包被(1ug/孔);之后加入10倍稀释的临床血清/血浆样本和系列稀释(2.5ng/mL–0.04ng/mL)的人源CA-199溶液(50ul/孔);然后在每管中加入50ul的0.47ug/mL的辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的鼠抗人源CA-199的多抗(IgG)。装有以上混合物的免疫反应板在室温、震荡条件下,孵育3小时;用洗液清洗个反应孔后,加入显色底物。通过加入2M硫酸终止显色反应后,使用读板仪(如:Bio-RAD 550)在450nm光谱波段对各反应孔进行检测。最后,利用系列稀释的人源抗原的检测值建立标准曲线,并基于标准曲线对临床血清/血浆样本进行定量。
在所述方法的第五步中,对上述检测结果(包括BNC1基因的dCT,ADAMTS1基因的dCT,和CA-199抗原的血清/血浆浓度),使用逻辑回归公式计算:Logit=Constant-A*deltaCT(BNC1)-B*delta CT(ADAMTS1)+C*CA199;其中,0.107<Constant<57.966,0.746<A<1.140,0.689<B<1.117,0.949<C<1.102;优选的,Constant=2.495,A=0.922,B=0.877,C=1.023。最后对计算出来的Logit进行判读,作为判读阈值的logit=0.80。
综上所述,本发明通过以上所述的组合物和相应试剂盒,和上述检测方法,实现了对慢性胰腺炎和胰腺癌的体外区分,实现了分辨胰腺癌和胰腺良性病变,如:慢性胰腺炎,避免了对慢性胰腺炎的误判,提高了胰腺癌检测的准确性,有效增强了临床应用性
以下将详述具体的实施例。本实施例包括以下步骤:
实施例一
得到19例胰腺癌患者、15例慢性胰腺炎、和16例正常人的血浆样本。所有样品来源于博尔诚公司。然后提取胰腺癌、慢性胰腺炎、和正常人的基因组DNA,并对所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中,通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。所述DNA的提取和处理可以采用现有技术中的任何标准手段来进行,具体而言,在本实施例中,所有的样品DNA的提取和亚硫酸氢盐DNA修饰是通过使用博尔诚公司的血浆处理试剂盒提取的。然后,上述经过处理的19例胰腺癌患者、15例慢性胰腺炎、和16例正常人的DNA样本中加入上述的BNC1和ADAMTS1基因引物、探针组合和内参基因ACTB基因引物、探针组合,通过PCR检测BNC1、ADAMTS1和ACTB基因。其中,本实验例中采取的PCR扩增条件为:在LifeTechnologies仪器(7500)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200μm的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2×PCR缓冲液组成至最终的30μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品,紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火,在55.5℃下退火35秒,在93℃下变性30秒。最后,分别测得19例胰腺癌患者、15例慢性胰腺炎、和16例正常人的DNA样本的BNC1、ADAMTS1和ACTB基因的实时PCR的Ct,将BNC1、ADAMTS1基因的Ct与ACTB基因的Ct相减,得到BNC1、ADAMTS1基因的ΔCt。
接下来,通过酶联免疫吸附剂测定技术(ELISA)检测CA-199、CA125和CEA抗原的血清/血浆浓度。此ELISA检测技术是通过“三明治法”实现对CA-199、CA125和CEA抗原血清/血浆水平的检测:首先以CA-199、CA125和CEA单克隆抗体(鼠)对96孔板进行包被(1ug/孔);之后加入10倍稀释的临床血清/血浆样本和系列稀释(2.5ng/mL–0.04ng/mL)的人源CA-199、CA125和CEA蛋白溶液(50ul/孔);然后在每管中加入50ul的0.47ug/mL的辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的鼠抗人源CA-199、CA125和CEA的多抗(IgG)。装有以上混合物的免疫反应板在室温、震荡条件下,孵育3小时;用洗液清洗个反应孔后,加入显色底物。通过加入2M硫酸终止显色反应后,使用读板仪(如:Bio-RAD 550)在450nm光谱波段对各反应孔进行检测。最后,利用系列稀释的人源CA-199、CA125和CEA溶液的检测值建立标准曲线,并基于标准曲线对临床血清/血浆样本进行定量。
最后,对上述检测结果,使用逻辑回归公式计算:Logit(CA199联检)=2.495-0.922*delta CT(BNC1)-0.877*delta CT(ADAMTS1)+1.023*CA199;Logit(CA125联检)=0.328-0.0282*delta CT(BNC1)-0.140*delta CT(ADAMTS1)+0.137*CA125;Logit(CEA联检)=-2.34-0.0630*delta CT(BNC1)-0.0226*delta CT(ADAMTS1)+0.914*CEA。最后对计算出来的Logit进行判读,作为CA199联检判读阈值的logit=0.80;作为CA125联检判读阈值的logit=-1.2;作为CEA联检判读阈值的logit=-0.80;
检测结果显示:本发明的组合物能够在保持对胰腺癌的检测灵敏性的同时,有效分辨胰腺癌和慢性胰腺炎,所述组合物分辨胰腺癌和慢性胰腺炎的性能高于其他组合物,详见表1。
表1使用不同的组合物区分胰腺炎和胰腺癌
尽管在此公开了本发明的各个方面和实施例,但其他方面和实施例对于本领域技术人员而言也是显而易见的。在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的,而非限制目的。本发明的保护范围和主旨仅通过后附的权利要求书来确定。
序列表
<110> 博尔诚(北京)科技有限公司;博尔诚研究公司
<120> 用于区分胰腺癌和慢性胰腺炎的组合物及其用途
<130> DIC16110059
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BNC1引物 F1
<400> 1
aataagtgtt tttaagttcg gcggg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BNC1反向引物
<400> 2
aacgcaacta aaacgaaacc gtaac 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BNC1 探针
<400> 3
ttcgcgtcgg tcgtcggcgt 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADAMTS1正向引物
<400> 4
gtgagtaata tcgtagttaa ggcgg 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADAMTS1反向引物
<400> 5
ctaaaacaaa aaacgctcta aaacg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADAMTS1探针
<400> 6
ggcgttaggt attaattttc gcgtt 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACTB正向引物
<400> 7
ggtgatggag gaggtttagt a 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACTB反向引物
<400> 8
ccaataaaac ctactcctcc ctt 23
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACTB探针
<400> 9
ccaccaccca acacacaata acaaac 26