CN107868822B - 用于检测食道癌的组合物及其试剂盒和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测食道癌的组合物，所述组合物包括：1)用于检测目标基因的至少一个区域内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因为SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段；和2)用于检测SNCG蛋白在血清中的表达水平的试剂。通过对目标基因的甲基化状态和目标基因的蛋白表达水平来检测食道癌。本发明还提供了包括所述组合物的试剂盒。以及一种对食道癌进行体外检测的方法。因此，本发明利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，能方便地实现针对SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段的检测，并且能根据实时PCR的循环阈值(Ct)值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，进一步地，本发明通过检测待测样品中SNCG蛋白的浓度，提供了一种准确的体外检测方法。

Description

用于检测食道癌的组合物及其试剂盒和用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种组合物及其在疾病检测中的用途，具体地涉及一种用于检测食道癌的组合物及其相应的试剂盒和用途。
背景技术
癌症是一类严重危及公共健康的疾病。世界卫生组织下属的国际癌症研究机构公布的有关全球癌症状况的最新数据(GLOBOCAN2012)显示：2012年全球新增约1,410万例癌症病例，癌症死亡人数达820万；与2008年的数据相比，2012年新增癌症病例增加11％，癌症死亡人数增加8.3％。该机构根据现有数据预计，由于全球人口增长和老龄化，到2025年前，全球每年新增癌症病例数将高达1,930万例。
由于近年来人口老龄化和人们生活方式的改变，我国的癌症发病形势严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势。2013年全国肿瘤登记中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》的数据显示：中国每年新发癌症病例约350万，因癌症死亡约250万，全国每6分钟就有1人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有1人死于癌症。未来10年，中国的癌症发病率与死亡率仍将继续攀升；预计到2020年，中国每年的癌症死亡总数将达300万左右，患病总数将达660万。
食道癌是我国一种高发恶性肿瘤疾病。全国肿瘤防治办公室数据显示：2015年，我国食道癌新发病例47.8万人，死亡37.5万人，新发病例位居我国常见癌症的第三位，死亡病例位居我国常见癌症的第四位。食道癌的病死率(death-to-case ratio)接近80％，是一种恶性程度较高的癌症。造成食道癌死亡率较高的一个重要因素是早期食道癌的确诊率低。早期食道癌缺乏明显和特异性的症状，绝大部分患者确诊时属于晚期，病灶多已发生转移。临床研究发现，从食道癌病灶开始形成到患者出现临床症状的过程平均需要几年时间，这为发现早期食道癌、提高早期食道癌的确诊率提供了一个有效的窗口期。充分利用这个窗口期，有望提高食道癌治疗效果、降低食道癌死亡率。
目前用于食道癌诊断的技术在早期食道癌的检测和筛查方面的应用非常有限：1)影像学检测技术(食道镜、CT、MRI等)设备成本高，操作技术要求强，检测成本高；2)组织活检的侵入性强，不适于早癌的筛查；3)常用消化道肿瘤血清标识物(如：CEA、CA125、CA199和AFP等)作为食道癌的无创检测方法的灵敏度很低，无法满足临床检测需要。因此，开发灵敏、特异的新型食道癌标识物和检测技术是提高食道癌早癌检出率、改善食道癌治疗效果、降低食道癌死亡率的重要途径。
多年研究证明表观遗传学在癌症的发生、发展中起着极其重要的作用。作为表观遗传学的一种重要机制，DNA甲基化/去甲基化在多种肿瘤(肠癌、胃癌、肺癌等)中的调控得到了深入的研究。大量研究显示：基因甲基化的调控与染色质结构和基因表达调控等生物学机制相关联；细胞基因甲基化/去甲基化的变化发生在肿瘤形成的早期，并贯穿癌症的发生和发展过程；抑癌基因的甲基化和致癌基因的去甲基化是癌前病变组织转化为恶性肿瘤细胞的重要分子机制。研究证明，SEPT9基因在癌症如大肠癌、肺癌、胃癌等的细胞中，发生DNA甲基化，抑制SEPT9基因的表达，进而促进癌症的发生和发展；SNCG基因在癌症如乳腺癌、卵巢癌、胃癌的细胞中，发生DNA去甲基化，激活SNCG基因的表达，进而促进癌症的发生和发展。
然而，现有技术中，并没有将SEPT9基因和SNCG基因联合用于食道癌检测的相关研究或报道。
发明内容
因此，针对现有技术存在的对食道癌患者检测中存在的确诊率低的问题，本发明的目的是提供一种用于检测食道癌的组合物，本发明提供的组合物能够敏感和特异性地检测早期食道癌；本发明还提供了包含所述组合物的试剂盒以及其在检测食道癌中的用途。
本发明提供了一种用于体外检测食道癌的组合物、试剂盒及其用途，以及基于该试剂盒来执行检测的方法。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于体外检测食道癌的组合物，所述组合物包括：1)用于检测目标基因的至少一个区域内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因为SEPT9基因或其片段，和/或SNCG基因或其片段；和2)用于检测SNCG蛋白在血清中的表达水平的试剂。通过目标基因的甲基化状态以及目标蛋白的表达水平来检测食道癌。
根据本发明的某些优选的实施方案，所述组合物包括用于检测SEPT9基因或其片段，和SNCG基因或其片段的每一个的至少一个区域内甲基化状态的核酸。通过对目标基因的甲基化检测结果来检测食道癌。优选地，所述SEPT9基因或其片段的至少一个区域包括所述基因的至少15个核苷酸的片段，其中包含至少一个CpG二核苷酸序列；所述SNCG基因或其片段的至少一个区域包括所述基因的至少15个核苷酸的片段，其中包含至少一个CpG二核苷酸序列；CpG的甲基化状态表明所述疾病的检测结果。
优选地，用于检测SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段中至少一个区域内甲基化状态的核酸序列包括：等同于或互补于来自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少9个碱基长的连续序列片段，或在中等严紧或严紧条件下杂交于来自SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2的至少9个碱基长的连续序列片段；
优选地，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。优选的试剂是亚硫酸氢盐。
优选地，所述用于检测SNCG蛋白在血清中的表达水平的试剂为酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂；其中，所述试剂包括SNCG蛋白的特异性抗体；更优选的，所述试剂为“三明治式”酶联免疫吸附试剂；进一步优选地，所述试剂包括SNCG蛋白的特异性抗体包被的反应板、SNCG蛋白酶结合物、底物液、洗液和终止液。
根据本发明的第二个方面，还提供了包括所述组合物的试剂盒。
典型地，所述的试剂盒还包括用于容纳受试者生物样品的容器。并且，所述的试剂盒还包括使用和解释试剂盒结果的说明。
根据本发明的第三个方面，还提供了一种对食道癌进行体外检测的方法，所述方法包括以下步骤：
1)分离待测生物样品中目标基因的核酸，其中，所述目标基因为SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段；
2)检测所述目标基因中至少一个区域内的甲基化状态；
3)检测SNCG蛋白在待测生物样品的血清中的表达水平；
优选地，使用ELISA方法检测；
4)通过所述目标基因的甲基化检测结果和蛋白水平检测结果对食道癌进行体外检测。
在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
1)分离待测生物样品中的目标基因，其中所述目标基因为SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段；
2)确定所述目标基因的每个的至少一个区域内的甲基化状态；
3)检测SNCG蛋白在待测生物样品的血清中的表达水平；
4)通过所述目标基因的甲基化检测结果和蛋白水平检测结果对食道癌进行体外检测。
根据某些优选实施方案，所述方法还包括以下步骤：
1)使用试剂将目标基因的5’位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，转化后的碱基在杂交性能方面是可检测的；
2)将经步骤1)处理过的目标基因与扩增酶和引物接触，使得所述经处理的基因被扩增以产生扩增产物或不被扩增；
3)用探针检测扩增产物；以及
4)基于所述扩增物是否存在，确定所述目标基因的DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态；其中，所述目标基因为SEPT9和SNCG基因或其片段。
典型的引物和/或探针包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的至少15个核苷酸的片段及其互补序列。
SEPT9引物F1:
SEQ ID NO：3：CCCACCAACCATCATAT
SEPT9引物R1:
SEQ ID NO：4：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT
SEPT9探针P1:
SEQ ID NO：5：GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC
SEPT9探针P2:
SEQ ID NO：6：CGTTGATCGCGGGGTTC
SNCG引物F1:
SEQ ID NO：7：TTAATATTTTATTGGTGTTAATAGGAGGTA
SNCG引物R1:
SEQ ID NO：8：TCCCTACAAACTACAAACTTAAACT
SNCG探针P1:
SEQ ID NO：9：ACTCAAATACTACCACAACAACTATCCCCA
并且，所述接触或扩增包括适用至少一种选自如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶、使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶、使用聚合酶链式反应(PCR)、产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。
在一个优选的实施方案中，所述方法还包括通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测SNCG基因的蛋白在血清中的表达水平；
优选地，所述ELISA为“三明治法”；
更优选地，所述方法包括以下步骤：
1)使用SNCG单克隆抗体(鼠)对96孔板进行包被(1μg/孔)；
2)加入10倍稀释的临床血清样本和系列稀释(2.5ng/mL–0.04ng/mL)的人源SNCG蛋白溶液(50μl/孔)；
3)在每管中加入50μl的0.47μg/mL的辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的鼠抗人源SNCG的多抗(IgG)；
4)装有以上混合物的免疫反应板在室温、震荡条件下，孵育3小时；用洗液清洗个反应孔后，加入显色底物；
5)通过加入2M硫酸终止显色反应后，使用读板仪(如：Bio-RAD 550)在450nm光谱波段对各反应孔进行检测；
6)利用系列稀释的人源SNCG蛋白溶液的检测值建立标准曲线，并基于标准曲线对所述血清样本进行定量。
根据本申请的具体实施方式，基于一定数量的食道癌样本和正常样本的SNCG基因的血清蛋白水平，确定相对于SNCG基因血清蛋白水平的食道癌和正常的临界值。
所述个体的生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。
优选的个体的生物样品为血浆。
根据某些优选实施方案，所述目标基因的DNA序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定的，其中，所述目标基因为SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段。
本申请中，发明人出乎意料的发现，在食道癌患者中SEPT9基因和SNCG基因的甲基化状态与在正常人中所述基因的甲基化状态存在显著性差异：在食道癌患者中，SEPT9基因处于甲基化状态，SNCG基因处于去甲基化状态；而在正常人群中，SEPT9基因处于去甲基化状态，SNCG基因处于甲基化状态；同时，SEPT9基因DNA甲基化和SNCG基因DNA去甲基化在食道癌中具有突出的互补性，二者联检大大提高了食道癌的检出率；此外，由于SNCG是一种可溶性小分子蛋白，可在外周血中检测到，同时由于酶联免疫吸附测定(ELISA)技术与基因甲基化DNA检测技术相比，操作简单、快捷，检测成本较低；因此，通过测定外周血中SNCG基因蛋白含量对间接检测SNCG基因的甲基化状态有实际应用价值。进一步地，本发明人通过实验发现，食道癌患者的SNCG蛋白的表达水平和在正常人中该蛋白的表达水平确实存在显著性差异：在食道癌患者人群中SNCG基因去甲基化，SNCG蛋白表达水平上升，显著高于正常人的SNCG基因的蛋白水平。因此本申请提供了一种通过检测样本中的SEPT9基因和/或SNCG基因的甲基化状态，和检测样本中的SNCG基因的蛋白水平，来对食道癌进行体外检测的方法，从而提供了一种无创的、快速的食道癌筛查方法，即利用实时PCR分析血浆样本中的DNA的方法，实现针对SEPT9基因和/或SNCG基因的检测，根据实时PCR的循环阈值(Ct)值判断样本是否呈阳性，同时，利用ELISA分析血浆样本中的蛋白水平，实现针对SNCG基因蛋白水平的检测，根据蛋白水平定量检测来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，从而提供了一种无创性的快速的食道癌的体外检测方法。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。
本发明的其他特点和优势将由下面的具体说明和权利要求书作详细的描述。
附图说明
本发明的上述及其它特征将通过下面结合附图及其详细描述作进一步说明。应当理解的是，这些附图仅示出了根据本发明的若干示例性的实施方式，因此不应被视为是对本发明保护范围的限制。除非特别说明，附图不必是成比例的，并且其中类似的标号表示类似的部件。
图1显示了食道癌个体和正常个体中SEPT9基因的甲基化状态。
图2显示了食道癌个体和正常个体的血浆样品中SNCG蛋白水平的比较，其中图2A为食道癌个体和正常个体的血浆样品中SNCG蛋白的散点图，图2B为SNCG蛋白的ROC曲线分析(B)。
图3显示了食道癌个体和正常个体血浆样品中SNCG蛋白水平检测结果。
图4显示了SEPT9基因甲基化检测、SNCG基因蛋白水平检测、和SEPT9基因甲基化+SNCG基因蛋白水平联检对80例食道癌样本的检测结果(A)，和检测结果的文氏图(VennDiagram)(B)。
图5显示了常规肿瘤标识物(如：CEA、CA125、CA199和AFP等)、SEPT9基因甲基化检测、SNCG基因蛋白水平检测、和SEPT9基因甲基化+SNCG基因蛋白水平联检对63道癌样本的检测结果。
具体实施方式
本申请提供了一种通过检测SEPT9基因和/或SNCG基因的甲基化状态和SNCG蛋白表达水平来对食道癌进行体外检测的方法，其灵敏性高于目前临床常用的癌症血清标识物，如：CEA、CA125、CA199和AFP等，是对现有食道癌体外检测方法是一项重要的补充，能够有效提高食道癌体外检测的检出率。
下述为本申请的组合物、试剂盒、核酸序列以及检测方法的实施例。可以理解，考虑到上文所提供的一般性描述，可以实施多种其他的实施方式。
在实施方案中，公开用于对食道癌患者进行体外检测的组合物，包括用于检测SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段至少一个区域内甲基化状态的核酸，以及用于检测SNCG基因蛋白水平的试剂，以通过检测SEPT9基因和/或SNCG基因的甲基化状态和血清蛋白水平对疾病进行体外检测。
其中，SEPT9基因为人类Septin9基因，位于染色体17q25的AC068594内，为Septin基因家族的成员，与膜泡运输到胞质分裂的多种细胞功能相关。
SNCG基因为人类Synnuclein gamma基因，位于染色体10q23.2-q23.3的NG_008783.1内，为神经蛋白synnuclein基因家族的成员，与神经退行性病变相关。
用于检测SEPT9基因和/或SNCG基因或其片段中至少一个区域内是否存在甲基化的核酸序列包括：等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：1和/或2的连续序列的至少9个碱基的核酸序列。
SEQ ID No：1提供了SEPT9基因的富含CpG的序列；
SEQ ID No：2提供了SNCG基因的富含CpG的序列。
SEQ ID NO：1序列：
GGGAGTTGGTGGCCTCTCGCTGGTGCCATGGGACTCGCATGTTCGCCCTGCGCCCCTCGGCTCTTGAGCCCACAGGCCGGGATCCTGCCTGCCAGCCGCGTGCGCTGCCGTTTAACCCTTGCAGGCGCAGAGCGCGCGGCGGCGGTGACAGAGAACTTTGTTTGGCTGCCCAAATACAGCCTCCTGCAGAAGGACCCTGCGCCCGGGGAAGGGGAGGAATCTCTTCCCCTCTGGGCGCCCGCCCTCCTCGCCATGGCCCGGCCTCCACATCCGCCCACATCTGGCCGCAGCGGGGCGCCCGGGGGGAGGGGCTGAGGCCGCGTCTCTCGCCGTCCCCTGGGCGCGGGCCAGGCGGGGAGGAGGGGGGCGCTCCGGTCGTGTGCCCAGGACTGTCCCCCAGCGGCCACTCGGGCCCCAGCCCCCCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCCGCCCGGGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCCATTCATTCAGCTGAGCCAGGGGGCCTAGGGGCTCCTCCGGCGGCTAGCTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTGGATGGGATCATTTCGGACTTCGAAGGTGGGTGCTGGGCTGGCTGCTGCGGCCGCGGACGTGCTGGAGAGGACCCTGCGGGTGGGCCTGGCGCGGGACGGGGGTGCGCTGAGGGGAGACGGGAGTGCGCTGAGGGGAGACGGGACCCCTAATCCAGGCGCCCTCCCGCTGAGAGCGCCGCGCGCCCCCGGCCCCGTGCCCGCGCCGCCTACGTGGGGGACCCTGTTAGGGGCACCCGCGTAGACCCTGCGCGCCCTCACAGGACCCTGTGCTCGTTCTGCGCACTGCCGCCTGGGTTTCCTTCCTTTTATTGTTGTTTGTGTTTGCCAAGCGACAGCGACCTCCTCGAGGGCTCGCGAGGCTGCCTCGGAACTCTCCAGGACGCACAGTTTCACTCTGGGAAATCCATCGGTCCCCTCCCTTTGGCTCTCCCCGGCGGCTCTCGGGCCCCGCTTGGACCCGGCAACGGGATAGGGAGGTCGTTCCTCACCTCCGACTGAGTGGACAGCCGCGTCCTGCTCGGGTGGACAGCCCTCCCCTCCCCCACGCCAGTTTCGGGGCCGCCAAGTTGTGCAGCCCGTGGGCCGGGAGCACCGAACGGACACA
SEQ ID NO：2序列：
ACGCAGGGCTGGCTGGGCTCCAGCTGGCCTCCGCATCAATATTTCATCGGCGTCAATAGGAGGCATCGGGGACAGCCGCTGCGGCAGCACTCGAGCCAGCTCAAGCCCGCAGCTCGCAGGGAGATCCAGCTCCGTCCTGCCTGCAGCAGCACAACCCTGCACACCCACCATGGATGTCTTCAAGAAGGGCTTCTCCATCGCCAAGGAGGGCGTGGTGGGTGCGGTGGAAAAGACCAAGCAGGGGGTGACGGAAGCAGCTGAGAAGACCAAGGAGGGGGTCATGTATGTGGG
根据SEQ ID NO：1-2设计的引物和/或探针：
SEPT9引物F1:
SEQ ID NO：3：CCCACCAACCATCATAT
SEPT9引物R1:
SEQ ID NO：4：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT
SEPT9探针P1:
SEQ ID NO：5：GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC
SEPT9探针P2:
SEQ ID NO：6：CGTTGATCGCGGGGTTC
SNCG引物F1:
SEQ ID NO：7：TTAATATTTTATTGGTGTTAATAGGAGGTA
SNCG引物R1:
SEQ ID NO：8：TCCCTACAAACTACAAACTTAAACT
SNCG探针P1:
SEQ ID NO：9：ACTCAAATACTACCACAACAACTATCCCCA
在某些具体实施方式中，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测的不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。例如，该试剂可以是亚硫酸氢盐。DNA的亚硫酸氢盐修饰为已知的用于评估CpG甲基化状态的工具。在真核细胞的DNA中，5-甲基胞嘧啶是最常见的共价碱基修饰，在调节转录、遗传印迹以及肿瘤发生中起作用。因此确认5-甲基胞嘧啶作为遗传信息组分有相当大的意义。但是，5-甲基胞嘧啶不能通过测序来鉴定，因为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为。此外，例如在PCR扩增过程中，5-甲基胞嘧啶携带的表观遗传信息则完全丢失。最常用于分析DNA中胞嘧啶甲基化状态的方法是基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应，由此在随后的碱性水解后，胞嘧啶被转变为在配对行为上对应胸腺嘧啶的尿嘧啶。但重要的是，在这些条件下5-甲基胞嘧啶保持不被修饰。结果，最初的DNA以此方式被转变，使得原来在其杂交行为上不能与胞嘧啶区分开的甲基胞嘧啶现在可作为仅剩的胞嘧啶被常规的已知分子生物学技术检测到，例如通过扩增和杂交。所有这些技术都基于不同的碱基配对特性，现在可被充分利用了。因此，典型地，本申请提供了亚硫酸氢盐技术与一种或多种甲基化测定的联合使用，用于确定SEPT9基因和/或SNCG基因序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化状态。基因组CpG二核苷酸可被甲基化或未被甲基化。但是，本发明的方法适于分析异质的生物样品，例如血液或粪便中的低浓度肿瘤细胞。因此，当分析这种样品中CpG位置的甲基化状态时，本领域技术人员可以使用定量测定法来确定特定CpG位置所处的甲基化水平(例如百分比、份数、比率、比例或程度)，而不是甲基化状态。相应地，术语甲基化状况或甲基化状态还应被认为是指反映CpG位置处甲基化程度的值。
在某些实施方式中，本申请的方法具体包括：提取待测样品的基因组DNA；使所述经试剂处理的SEPT9基因和/或SNCG基因或其片段与扩增酶和引物接触，使得所述经处理的基因或片段被扩增以产生扩增产物或不被扩增；用探针检测扩增产物；以及基于所述扩增物是否存在，确定SEPT9基因和/或SNCG基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。
并且，典型地，所述接触或扩增包括适用至少一种选自如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶；使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶；使用聚合酶链式反应(PCR)；产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。即，优选地用PCR方式来测定甲基化状态，诸如“基于荧光的实时PCR技术”、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸反应(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(MSP)、和甲基化CpG岛扩增(MCA)等测定方法被用于测定SEPT9基因和/或SNCG基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。其中，“基于荧光的实时PCR”测定为高通量定量甲基化测定，其使用基于荧光的实时PCR(TaqMan)技术，在PCR步骤后不需要进一步的操作。简言之，“基于荧光的实时PCR”方法以基因组DNA的混合样品开始，该混合样品根据标准操作(亚硫酸氢盐过程将未甲基化的胞嘧啶残基转变成尿嘧啶)在亚硫酸氢钠反应中被转变为甲基化依赖的序列差异的混合池。随后在“偏移的(biased)”反应(采用重叠已知CpG二核苷酸的PCR引物)中进行基于荧光的PCR。可在扩增过程水平以及在荧光检测过程水平上产生序列差别。“基于荧光的实时PCR”测定可以用作基因组DNA样品中甲基化模式的定量测试，其中序列区分发生在引物和(或)探针杂交水平上。在该定量方式中，在重叠特定的甲基化位点的引物和(或)荧光探针存在下，PCR反应提供了甲基化特异的扩增。“基于荧光的实时PCR”方法可与任何适合的探针一起使用，如“TaqMan”、“Lightcycler”等等。TaqMan探针为荧光报道物(Reporter)和淬灭分子(Quencher)双标记的，并被设计为特异于相对高GC含量区，以至于其在PCR循环中以比正向或反向引物高约10℃的温度熔解。这使得TaqMan探针在PCR退火/延伸步骤中保持充分杂交。当Taq聚合酶在PCR中酶合成新链时，其最终会遇到退火的TaqMan探针。Taq聚合酶5’至3’内切酶活性随后将通过消化TaqMan探针而顶替它，从而释放荧光报道物分子用于采用实时荧光检测系统定量检测其现在未被淬灭的信号。用于“基于荧光的实时PCR”分析的典型试剂(例如，可以在基于“基于荧光的实时PCR”的试剂盒中找到的)可以包括，但不限于：用于特定基因(或亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物；TaqMan或Lightcycler探针；优化的PCR缓冲液以及脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。
并且，具体而言，在优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
在第一步中，获得待分析的组织样品。
该来源可以是任何适合的来源，例如细胞系、组织学切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液分离的细胞及其所有可能的组合。优选地，DNA的所述来源为粪便或体液，选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、分离自血液的细胞。然后从所述样品分离基因组DNA。可通过现有技术中的任何标准手段来分离，包括使用可商购的试剂盒。简言之，当目的DNA被包裹在细胞膜中时，该生物样品必须被破碎并通过酶、化学或机械手段被裂解。随后例如通过蛋白激酶K的消化而清除蛋白和其它的污染物。接着从溶液回收基因组DNA。这可以通过各种方法来实现，包括盐析、有机提取或将DNA结合到固相支持物。对方法的选择会受到多种因素的影响，包括时间、费用和所需的DNA的量。当所述样品DNA未被包裹在细胞膜中时(例如来自血液样品的循环DNA)，可以使用现有技术中分离和/或纯化DNA的标准方法。这些方法包括使用蛋白降解试剂，例如离液盐，如盐酸胍或脲；或去污剂，如十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化氰。其它方法包括但不限于乙醇沉淀或丙醇沉淀、通过离心的真空浓缩等。本领域技术人员也可以利用装置，例如诸如超滤的滤器，硅表面或膜，磁性颗粒，聚苯乙烯颗粒，聚苯乙烯表面，带正电荷的表面以及带阳性电荷的膜，带电膜，带电表面，带电转换膜，带电转换表面。
一旦核酸被提取，就将基因组双链DNA用于分析。
在所述方法的第二步中，将所述基因组DNA样品处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。这应被理解为本文所述的“预处理”或“处理”。这优选通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现。术语“亚硫酸氢盐试剂”指包括亚硫酸氢盐、亚硫酸氢盐(disulfite)、酸式亚硫酸盐或其组合的试剂，如这里所公开的可用于区分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。优选地，该亚硫酸氢盐处理在变性溶剂存在下进行，所述变性溶剂诸如但不限于正烷基二醇，尤其是二乙二醇二甲基醚(DME)，或者在二噁烷或二噁烷衍生物存在下进行。在优选的实施方案中，所述变性溶剂以1％至35％(v/v)的浓度使用。还优选该亚硫酸氢盐反应在清除剂存在下进行，例如但不限于色原烷衍生物，如6-羟基-2,5,7,8,-四甲基色原烷2-羧酸或三羟基苯甲酸及其衍生物，例如没食子酸。该亚硫酸氢盐转变优选在30℃至70℃的反应温度下进行，其中在反应期间温度短时间地增加至超过85℃。经亚硫酸氢盐处理的DNA优选在定量之前进行纯化。这可通过任何现有技术中已知的方法来进行，例如但不限于超滤，优选通过Microcon^(TM)柱(由Millipore^(TM)生产)进行。
在所述方法的第三步中，采用本发明的引物核苷酸以及扩增酶扩增经处理的DNA的片段。可在同一个反应容器中同时进行几种DNA片段的扩增。通常，该扩增反应采用聚合酶链式反应(PCR)进行。优选地，所述扩增产物的长度为100至2,000个碱基对。对于SEPT9基因或其片段和/或SNCG基因或其片段的甲基化的检测，利用针对SEPT9基因和/或SNCG基因的引物和探针。例如：
SEPT9引物F1:
SEQ ID NO：3：CCCACCAACCATCATAT
SEPT9引物R1:
SEQ ID NO：4：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT
SEPT9探针P1:
SEQ ID NO：5：GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC
SEPT9探针P2:
SEQ ID NO：6：CGTTGATCGCGGGGTTC
SNCG引物F1:
SEQ ID NO：7：TTAATATTTTATTGGTGTTAATAGGAGGTA
SNCG引物R1:
SEQ ID NO：8：TCCCTACAAACTACAAACTTAAACT
SNCG探针P1:
SEQ ID NO：9：ACTCAAATACTACCACAACAACTATCCCCA
通过扩增获得的片段可携带有可直接或间接地检测的标记物。优选的是，标记物为荧光标记物、放射性核素或可附着的分子片段的形式。
在所述方法的第四步中，分析在所述方法的第三步中获得的扩增产物，以便确定处理之前CpG二核苷酸的甲基化状态。在第四步中，对扩增产物的检测是通过实时检测探针来进行。在本发明中，可以利用各种商业用实PC仪器设备上根据现有技术的标准操作进行实时PCR的检测。根据某些具体实施方式，在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR的检测。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25-40ng和300-600nM引物、150-300nM探针、1UTaq聚合酶、50-400μM的各个dNTP、1至10mM的MgCl2和2XPCR缓冲至最终的2μl至100μl的体积。在85至99℃持续3-60分钟，以用预循环扩增样品，紧接着在50至72℃进行1至30秒的35-55个循环的退火，在45至80℃下退火5至90秒，在85至99℃下变性5至90秒。通过仅仅在甲基化的SEPT9基因片段和(或)去甲基化的SNCG基因片段上观测扩增，用与含5-甲基胞嘧啶的SEPT9基因的CpG岛区域的特异性的探针、和不含5-甲基胞嘧啶的SNCG基因的CpG岛区域的特异性的探针检测所述基因片段。并且，在某些具体实施方式中，以β肌动蛋白基因(ACTB)作为PCR的内参，通过使用与β肌动蛋白基因序列互补的引物来创建β肌动蛋白基因扩增子，并且用特定的探针检测β肌动蛋白基因扩增子。每个样品进行至少一次的实时PCR，在某些具体实施方式中，进行两次或三次实时PCR检测。
在所述方法的第五步中，分别体现所述SEPT9基因和/或SNCG基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定，然后比较所测样本的SEPT9基因和/或SNCG基因所对应的PCR的Ct值与SEPT9基因和/或SNCG基因的预先设定的cut off值，从而确定基于SEPT9基因和/或SNCG基因的分析结果是否为阳性，结果确定所述样本的最终分析结果是正常、还是食道癌。
根据本申请的具体实施方式，基于一定数量的食道癌样本和正常样本的SEPT9基因和/或SNCG基因的平均Ct值，确定相对于SEPT9基因和/或SNCG基因的食道癌和正常的临界Ct值。并且，本申请还允许使用不同的方法学来分析Ct值。例如，使用ΔCt或dCT，肌动蛋白Ct作为PCR内部对照，SEPT9基因和/或SNCG基因的Ct减去肌动蛋白的Ct得到SEPT9基因和/或SNCG基因的dCT值。相应地，如果采用ΔCt或dCT作为检测标准，那么在所述方法的第五步中，分别体现所述SEPT9基因和/或SNCG基因的DNA靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值确定，然后比较所测样本的SEPT9基因和/或SNCG基因所对应的PCRΔCt值与SEPT9基因和/或SNCG基因的预先设定的Δcut值(即临界Ct值)，从而确定基于SEPT9基因和/或SNCG基因的分析结果是正常、还是食道癌，结果确定所述样本的最综分析结果是正常、还是食道癌。
在所述方法的第六步中，通过酶联免疫吸附剂测定技术(ELISA)检测SNCG基因的血清蛋白水平。此ELISA检测技术是通过“三明治法”实现对SNCG基因的血清蛋白水平的检测：首先以SNCG单克隆抗体(鼠)对96孔板进行包被(1μg/孔)；之后加入10倍稀释的临床血清样本和系列稀释(2.5ng/mL–0.04ng/mL)的人源SNCG蛋白溶液(50μl/孔)；然后在每管中加入50μl的0.47μg/mL的辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的鼠抗人源SNCG的多抗(IgG)。装有以上混合物的免疫反应板在室温、震荡条件下，孵育3小时；用洗液清洗个反应孔后，加入显色底物。通过加入2M硫酸终止显色反应后，使用读板仪(如：Bio-RAD 550)在450nm光谱波段对各反应孔进行检测。最后，利用系列稀释的人源SNCG蛋白溶液的检测值建立标准曲线，并基于标准曲线对临床血清样本进行定量。根据本申请的具体实施方式，基于一定数量的食道癌样本和正常样本的SNCG基因的血清蛋白水平，确定相对于SNCG基因血清蛋白水平的食道癌和正常的临界值。
综上所述，本申请通过以上所述的组合物、核酸序列、抗体、试剂盒及其用途，以及上述检测方法，通过联合利用分别用于检测SEPT9基因和/或SNCG基因的甲基化状态和血清蛋白水平，实现了利用SEPT9基因和/或SNCG基因表观遗传学标记物来对食道癌进行体外检测，从而有效提高了食道癌体外检测的灵敏度和特异性。
以下将详述具体的实施例。
通过SEPT9基因甲基化状态和SNCG基因血清蛋白水平的检测，对食道癌和正常人进行检测。
实施例一SEPT9基因的甲基化检测
得到80例食道癌患者、10例正常人的血浆样本。所有样品来源于博尔诚公司。然后提取食道癌和正常人的基因组DNA，并对所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。所述DNA的提取和处理可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA的提取和亚硫酸氢盐DNA修饰是通过使用博尔诚公司的血浆处理试剂盒提取的。然后，上述经过处理的80例食道癌患者、10例正常人的DNA样本中加入上述的SEPT9基因引物、探针组合和内参基因ACTB基因引物、探针组合，通过PCR检测SEPT9基因的甲基化状态。其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200μm的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。最后，分别测得80例食道癌患者、10例正常人的DNA样本对于SEPT9基因的实时PCR的Ct值。检测结果显示：SEPT9基因的甲基化在食道癌患者中的阳性率为35％，显著高于正常人(p<0.05，费舍尔精确检验，Fisher’s Exact Test)(图1)
上述实验结果表明了SEPT9基因甲基化DNA是食道癌的一种标识物，同时也显示SEPT9在食道癌中的阳性率较低，单独作为食道癌标识物难以满足临床检测对灵敏度的要求。
实施例二SNCG蛋白的ELISA检测
SNCG是一种可溶性小分子蛋白，可在外周血中检测到。同时，酶联免疫吸附剂测定技术(ELISA)与基因甲基化DNA检测技术相比，操作简单、快捷，检测成本较低。因此，通过测定外周血中SNCG基因蛋白含量对间接检测SNCG基因的甲基化状态有实际应用价值。在该实施例中，我们建立了一种检测SNCG的ELISA技术。
得到80例食道癌患者、10例正常人的血浆样本。所有样品来源于博尔诚公司。首先，通过酶联免疫吸附剂测定技术(ELISA)检测SNCG基因的血清蛋白水平。此ELISA检测技术是通过“三明治法”实现对SNCG基因的血清蛋白水平的检测：首先以SNCG单克隆抗体(鼠)对96孔板进行包被(1μg/孔)；之后加入10倍稀释的临床血清样本和系列稀释(2.5ng/mL–0.04ng/mL)的人源SNCG蛋白溶液(50μl/孔)；然后在每管中加入50μl的0.47μg/mL的辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的鼠抗人源SNCG的多抗(IgG)。装有以上混合物的免疫反应板在室温、震荡条件下，孵育3小时；用洗液清洗个反应孔后，加入显色底物。通过加入2M硫酸终止显色反应后，使用读板仪(如：Bio-RAD 550)在450nm光谱波段对各反应孔进行检测。最后，利用系列稀释的人源SNCG蛋白溶液的检测值建立标准曲线，并基于标准曲线对临床血清样本进行定量。
样本检测结果以散点图的形式总结在图2A中；通过受试者工作特征(ROC)曲线方法(图2B)，确定SNCG基因血清水平在食道癌和正常个体中的临界值为2.0ng/mL。使用上述方法对80例食道癌患者、10例正常人的血浆样本进行SNCG的ELISA检测。检测结果显示：SNCG的ELISA检测在食道癌患者中的阳性率为38.75％，显著高于正常人(p<0.05，费舍尔精确检验，Fisher’s Exact Test)(图3)
上述实验结果表明了SNCG蛋白是食道癌的一种标识物，同时也显示SNCG的ELISA检测在食道癌中的阳性率较低，单独作为食道癌标识物难以满足临床检测对灵敏度的要求。
实施例三SEPT9基因甲基化DNA和SNCG基因血清蛋白联检
从实施例1和实施例2得到的数据，分析SEPT9基因DNA甲基化检测和SNCG蛋白检测数据，结果显示：尽管SEPT9基因甲基化DNA和SNCG蛋白单独作为食道癌标记物的检测灵敏度较低，但是如果对SEPT9基因甲基化DNA和SNCG蛋白联合进行食道癌检测，检测的阳性率有巨大的提升，灵敏度达到66.25％(图4A)。图4B显示：对食道癌进行SEPT9基因甲基化DNA和SNCG蛋白联检，检测阳性率的提升主要是由于SEPT9基因甲基化DNA和SNCG蛋白检测阳性结果的重复阳性很少，而互补的阳性很多，二者联检大大提高了食道癌的检出率。因此SEPT9甲基化DNA和SNCG蛋白联检对于食道癌的检测和筛查具有显著的临床应用价值。
实施例四SEPT9基因甲基化DNA和SNCG基因血清蛋白联检，并与常用肿瘤蛋白标记 物的对比
得到63例食道癌患者的血浆样本。所有样品来源于博尔诚公司。然后提取食道癌的基因组DNA，并对所述基因组DNA样品预处理以使得在5’位未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为上不用于胞嘧啶的另一碱基。在本实施例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。所述DNA的提取和处理可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA的提取和亚硫酸氢盐DNA修饰是通过使用博尔诚公司的血浆处理试剂盒提取的。然后，上述经过处理的63例食道癌患者的DNA样本中加入上述的SEPT9基因引物、探针组合和内参基因ACTB基因引物、探针组合，通过PCR检测SEPT9基因的甲基化状态。其中，本实验例中采取的PCR扩增条件为：在Life Technologies仪器(7500)上进行实时PCR。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板35ng和450nM引物、225nM探针、1UTaq聚合酶、200μm的各个dNTP、4.5mM的MgCl2和2XPCR缓冲液组成至最终的30μl的体积。在94℃保持20分钟用预循环扩增样品，紧接着在62℃进行5秒的45个循环的退火，在55.5℃下退火35秒，在93℃下变性30秒。
同时，对这63例食道癌患者的血清样本进行SNCG基因血清蛋白水平的检测。通过酶联免疫吸附剂测定技术(ELISA)检测SNCG基因的血清蛋白水平。此ELISA检测技术是通过“三明治法”实现对SNCG基因的血清蛋白水平的检测：首先以SNCG单克隆抗体(鼠)对96孔板进行包被(1μg/孔)；之后加入10倍稀释的临床血清样本和系列稀释(2.5ng/mL–0.04ng/mL)的人源SNCG蛋白溶液(50μl/孔)；然后在每管中加入50μl的0.47μg/mL的辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的鼠抗人源SNCG的多抗(IgG)。装有以上混合物的免疫反应板在室温、震荡条件下，孵育3小时；用洗液清洗个反应孔后，加入显色底物。通过加入2M硫酸终止显色反应后，使用读板仪(如：Bio-RAD 550)在450nm光谱波段对各反应孔进行检测。最后，利用系列稀释的人源SNCG蛋白溶液的检测值建立标准曲线，并基于标准曲线对临床血清样本进行定量。SNCG基因血清水平在食道癌和正常个体中的临界值为2.0ng/mL。
最后，利用罗氏公司(Roche)的电化学发光免疫检测系统分别测得63例食道癌患者样本中的常用癌症标识物的水平，包括：CEA、CA199、CA125、和AFP。
检测结果显示：食道癌患者中SEPT9基因DNA甲基化检测和SNCG蛋白检测食道癌的阳性率显著高于常用癌症标识物(如：CEA、CA199、CA125、和AFP)(图5)。同时，SEPT9基因DNA甲基化检测和SNCG蛋白检测两种技术对食道癌的检测具有突出的互补性，二者联检大大提高了食道癌的检出率。另外，SEPT9基因DNA甲基化检测和SNCG蛋白检测的互补性是独特的，常用癌症标识物(如：CEA、CA199、CA125、和AFP)并不具备这种特性。
尽管在此公开了本发明的各个方面和实施例，但其他方面和实施例对于本领域技术人员而言也是显而易见的。在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的，而非限制目的。本发明的保护范围和主旨仅通过后附的权利要求书来确定。

Claims (9)

1.一种组合物在制备用于辅助检测食道癌的试剂盒中的用途，其中，所述组合物包括：1)用于检测目标基因的至少一个区域内甲基化状态的核酸，其中所述目标基因为SEPT9基因或其片段；和2)用于检测SNCG蛋白在血清中的表达水平的试剂；
其中，所述核酸为探针和引物，并且所述探针和引物为以下的核酸序列：
SEPT9引物F1:
SEQ ID NO：3：CCCACCAACCATCATAT
SEPT9引物R1:
SEQ ID NO：4：GTAGTAGTTAGTTTAGTATTTATTTT
SEPT9探针P1:
SEQ ID NO：5：GTTCGAAATGATTTTATTTAGTTGC
SEPT9探针P2:
SEQ ID NO：6：CGTTGATCGCGGGGTTC。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶，或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的试剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述试剂是亚硫酸氢盐。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述用于检测SNCG蛋白在血清中的表达水平的试剂为酶联免疫吸附试剂；其中所述试剂包括SNCG蛋白的特异性抗体。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述试剂为“三明治式”酶联免疫吸附试剂。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述试剂包括SNCG蛋白的特异性抗体包被的反应板、SNCG蛋白酶结合物、底物液、洗液和终止液。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述试剂盒包括所述组合物。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述试剂盒还包括用于容纳受试者生物样品的容器。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其中，所述试剂盒还包括使用和解释试剂盒结果的说明。
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Noninvasive Detection of Esophageal Cancer by the Combination of mSEPT9 and SNCG;Lei Zhang等;《Genet Test Mol Biomarkers》;20220127;第26卷(第1期);全文 *
Opportunistic screening and survival prediction of digestive cancers by the combination of blood mSEPT9 with protein markers;Lele Song等;《Ther Adv Med Oncol》;20201016;全文 *
Prognostic CpG methylation biomarkers identified by methylation array in esophageal squamous cell carcinoma patients;I-Ying Kuo等;《Int J Med Sci》;20140530;第11卷(第8期);摘要、第782-783页 *

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