CN108977544A - 用于鉴定胃癌和/或胃息肉的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于鉴定胃癌和/或胃息肉的试剂盒及其应用，试剂盒包括用于检测来自受试者的生物样品中生物标志物基因或相应片段的甲基化水平的引物对；引物对用于以经亚硫酸氢盐处理的生物标志物基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；生物标志物基因选自CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的一种或多种。本发明通过联合检测生物标志物基因或相应片段的甲基化水平，使得胃癌和/或胃息肉检测的灵敏度和特异性得到了提高，从而保证了检测结果的正确性和可靠性，为胃癌和/或胃息肉的预测、诊断和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径。

Description

用于鉴定胃癌和/或胃息肉的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定胃癌和/或胃息肉的试剂盒及其应用。

背景技术

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。根据WHO提供的数据：全球有超过150万的胃癌患者，其死亡率在全球癌症死亡中排名第三。胃癌最普遍发生于东亚以及东欧地区。全球新增胃癌病例和相关死亡人数中，中国占比均已超过40％，位居世界前列。加上日本和韩国，胃癌率约占全球患者的2/3。WHO附属机构国际癌症研究机构(IARC)推测东北亚三国的高胃癌发病率可能与人种(遗传)、饮食习惯、高龄化有关。就胃癌的发病率而言，男性通常是女性的2-3倍，且在35岁之后会快速增高。胃癌发病的最高中位年龄是50-60，并趋于年轻化。胃癌的疾病分期是最重要的预后因素，早期胃癌病人的5年生存率可达90％以上，而晚期则低于10％。然而胃癌病人在医疗机构就诊时疾病往往已进展到中晚期，其治疗效果与预后较差，例如在中国，临床发现的胃癌初期患者比率仅为22.1％，三期患者比率为38.5％，四期患者比率为15.4％，这直接导致了中国胃癌患者治疗的预后效果不佳。而全球大部分国家和地区胃癌的5年相对生存率也仅在20％左右。日本的I、II期胃癌5年生存率在70％以上，这与日本自上世纪60年代开始的人群胃癌筛查项目，且胃癌病中有较高比例的早期病例有关。

胃癌主要是由内镜取出的组织学标本来确诊的，但诊断技术并没有在很大程度上降低胃癌患者的死亡率，因此，如何提高胃癌患者的生存率，依赖于胃癌的早期诊断，筛选和挖掘有价值的早期胃癌的生物学标志物成为亟待解决的问题。由于影像学技术在胃癌早期筛查中未能显示出良好的效果，人们开始将目光转移至胃癌早期诊断的分子标志物，遗憾的是迄今为止没有发现一个敏感性和特异性较高的分子标志物。与影像学检查比较，内镜检查法可以直接观察病变形态，活检准确率高。ct模拟胃镜诊断早期胃癌的阳性符合率达到70％以上，最小可显示黏膜病灶的直径达到1厘米左右。但是胃镜检查的过程非常痛苦，真正能够做到定期内镜检查的病人不足10％。

近年来胃癌表观遗传学研究进展较快，特别是DNA甲基化，研究发现在胃癌发生的早期就存在很多特有的肿瘤相关基因出现不同程度的甲基化状态改变，为胃癌早期诊断标志物的探索提供了新的契机。

基因组的DNA甲基化异常与肿瘤的发生一直是医学界研究的热点之一，细胞周期、DNA修复、血管生成和凋亡等都涉及到相关基因的甲基化。DNA高甲基化最可能的调控作用是通过抑制关键基因的表达，从而决定该细胞的命运，如对于肿瘤细胞中DNA甲基化异常现象的研究已经在多种肿瘤中取得了许多重大的进展。哺乳动物中，甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶(CpG)，正常细胞中CpG双核苷酸的甲基化分布并不均一，大约50％的基因在启动子区域有CpG集中分布的CpG岛存在，长度0.5～2kb不等，该区域与基因的转录调控有着密切关系。人体某些基因调控区域的CpG岛甲基化在相关癌细胞组织中频繁出现，显示出与某些肿瘤的发病、病程进展和预后、用药敏感性等相关。迄今为止，已在大多数人类肿瘤中发现了基因甲基化异常，研究发现在癌细胞中表观遗传编码发生紊乱，首先表现在DNA甲基化水平紊乱，又称为甲基化重排。由于抑癌基因CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此，DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期诊断。癌症相关基因甲基化也是胃癌发生的早期事件，因此相关基因甲基化状态成为早期胃癌风险预测有效指标。尽管如此，目前仍缺乏对这些癌症相关基因的甲基化状态进行有效检测并对检测结果进行处理的手段。

当前，消化科肿瘤学领域中迫切需要的是最小侵入性地用于评估和预测胃癌存在的临床测试。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种用于鉴定胃癌和/或胃息肉的试剂盒，试剂盒包括用于检测来自受试者的生物样品中生物标志物基因或相应片段的甲基化水平的引物对；引物对用于以经亚硫酸氢盐处理的生物标志物基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；生物标志物基因选自CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的一种或多种。需要说明的是，从生物样品提取DNA并以亚硫酸氢盐处理，使得DNA中的未甲基化胞嘧啶残基脱氨基，而甲基化的胞嘧啶残基保持不变。

生物标志物基因选自CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的2种或2种以上；优选地，生物标志物基因选自CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的5种或5种以上；优选地，胃癌为胃癌I期或II期时，生物标志物基因为DAPK和/或Septin9；胃癌为腺癌时，生物标志物基因为PAX5、SDC2和/或Septin9；胃癌为粘液腺癌时，生物标志物基因为RASSF1A和/或SDC2；胃癌为未分化癌时，生物标志物基因为RNF180和/或TCF4；胃息肉的生物标志物基因为RUNX3和/或SDC2。

引物对包括第一引物组、第二引物组、第三引物组、第四引物组、第五引物组、第六引物组、第七引物组、第八引物组、第九引物组、第十引物组、第十一引物组、第十二引物组、第十三引物组、第十四引物组、第十五引物组、第十六引物组、第十七引物组、第十八引物组、第十九引物组、第二十引物组、第二十一引物组、第二十二引物组和第二十三引物组中的一组或多组；每个引物组都包括上游引物、下游引物、封闭引物和探针；其中，第一引物组包括序列表中序列11-14所示的DNA组成的引物；第二引物组包括序列表中序列15-18所示的DNA组成的引物；第三引物组包括序列表中序列19-22所示的DNA组成的引物；第四引物组包括序列表中序列23-26所示的DNA组成的引物；第五引物组包括序列表中序列27-30所示的DNA组成的引物；第六引物组包括序列表中序列31-34所示的DNA组成的引物；第七引物组包括序列表中序列35-38所示的DNA组成的引物；第八引物组包括序列表中序列39-42所示的DNA组成的引物；第九引物组包括序列表中序列43-46所示的DNA组成的引物；第十引物组包括序列表中序列47-50所示的DNA组成的引物；第十一引物组包括序列表中序列51-54所示的DNA组成的引物；第十二引物组包括序列表中序列55-58所示的DNA组成的引物；第十三引物组包括序列表中序列59-62所示的DNA组成的引物；第十四引物组包括序列表中序列63-66所示的DNA组成的引物；第十五引物组包括序列表中序列67-70所示的DNA组成的引物；第十六引物组包括序列表中序列71-74所示的DNA组成的引物；第十七引物组包括序列表中序列75-78所示的DNA组成的引物；第十八引物组包括序列表中序列79-82所示的DNA组成的引物；第十九引物组包括序列表中序列83-86所示的DNA组成的引物；第二十引物组包括序列表中序列87-90所示的DNA组成的引物；第二十一引物组包括序列表中序列91-94所示的DNA组成的引物；第二十二引物组包括序列表中序列95-98所示的DNA组成的引物；第二十三引物组包括序列表中序列99-102所示的DNA组成的引物。

需要说明的是，第一引物组和第二引物组用于检测CDH1基因的甲基化，第三引物组和第四引物组用于检测DAPK基因的甲基化，第五引物组和第六引物组用于检测PAX5基因的甲基化，第七引物组和第八引物组用于检测RASSF1A基因的甲基化，第九引物组和第十引物组用于检测Reprimo基因的甲基化，第十一引物组、第十二引物组和第十三引物组用于检测RNF180基因的甲基化，第十四引物组、第十五引物组和第十六引物组用于检测RUNX3基因的甲基化，第十七引物组、第十八引物组和第十九引物组用于检测SDC2基因的甲基化，第二十引物组和第二十一引物组用于检测Septin9基因的甲基化，第二十二引物组和第二十三引物组用于检测TCF4基因的甲基化。

不同引物组分别检测对应基因靶区域核酸序列中至少一段核酸序列的甲基化；其中，靶区域分别选自序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示、序列表的序列4所示、序列表的序列5所示、序列表的序列6所示、序列表的序列7、序列表的序列8、序列表的序列9、序列表的序列10所示的DNA序列中的连续的至少15个碱基长度的片段；核酸序列分别等同、互补或杂交于上述靶区域。试剂盒中，每种引物组均可以单独包装。

试剂盒还包括内参基因ACTB(NCBI基因库序列号：NM_001101.3)引物组，内参基因ACTB引物组用于以生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的ACTB基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；内参基因ACTB引物组包括序列表中序列103-105所示的DNA组成的引物。

优选地，试剂盒还包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂，亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢钠；

优选地，试剂盒还包括阐述试剂盒使用方法以及以逻辑回归对检测结果进行处理的说明书。

本发明还保护试剂盒在制备鉴定胃癌和/或胃息肉产品中的应用。

优选地，胃癌和/或胃息肉包括胃癌和/或胃息肉易感性，胃癌和/或胃息肉的存在、进展、亚型和/或分期。

本发明还保护一种检测CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的一种或多种基因及其片段的甲基化的方法，包括步骤：S1：采集受试者的生物样品；S2：采用试剂盒检测生物样品中生物标志物基因的甲基化水平；其中，所述生物标志物基因选自CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的一种或多种；S3：将检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较。

优选地，还包括在受试者接受医疗处理后，重复步骤S1和S2，然后将两次获得的甲基化水平检测结果进行比较，以确定受试者中胃癌和/或胃息肉的变化情况。

优选地，S1中，生物样品选自受试者的血液、血清、血浆、粪便、淋巴、脑脊液、腹水、尿和组织活检中的一种或多种。

优选地，S2中，包括检测生物标志物基因内靶区域的甲基化水平的步骤，靶区域分别为生物标志物基因内至少15个碱基长度的核苷酸序列或其互补序列。

需要说明的是，本发明还保护一种鉴定胃癌和/或胃息肉的方法，包括步骤：S1：采集受试者的生物样品；S2：采用试剂盒检测生物样品中生物标志物基因的甲基化水平，其中生物标志物基因选自基因CDH1、DAPK、PAX5、TCF4、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的一种或多种；S3：将检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，根据生物标志物基因的甲基化水平基于逻辑回归来判断受试者中的胃癌和/或胃息肉。

本发明提供的技术方案，通过联合利用检测CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4基因中一个或更多个基因或其片段的甲基化水平，使得胃癌和/或胃息肉检测的灵敏度和特异性得到了提高，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。并且，通过检测样本中的生物标志物基因甲基化DNA的方法，能方便地实现针对CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4基因这10个生物标记物的检测，利用逻辑回归方程分析，快速、便捷地判断样本是否呈阳性及风险值，提供了一种快速的检测癌症的试剂盒。本申请所提供的方法和试剂盒为胃癌和/或胃息肉的预测、诊断、和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例4中10种生物标志物基因甲基化水平的受试者工作特征(ROC)曲线图；

图2为发明实施例4中6种生物标志物基因CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo和RNF180的甲基化在不同胃癌分期中的水平分布图；

图3为发明实施例4中4种生物标志物基因RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4的甲基化在不同胃癌分期中的水平分布图；

图4为发明实施例4中6种标志物基因CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo和RNF180的甲基化在胃息肉及不同胃癌亚型中的水平分布图；

图5为发明实施例4中4种标志物基因RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4的甲基化在胃息肉及不同胃癌亚型中的水平分布图；

图6为发明实施例4中采用10种标志物基因构建的逻辑回归模型的受试者工作特征(ROC)曲线图；

图7为发明实施例4中采用5种最有特征性标志物基因构建的逻辑回归模型的受试者工作特征(ROC)曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明采用的生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：CDH1(E-cardherin)、DAPK(Death-associated protein kinase-1)、PAX5(Paired box 5)、RASSF1A(Ras-association domain family 1isoform A)、Reprimo、RNF180(Ring finger protein180)、RUNX3(Runt-related transcription factor3)、SDC2(Syndecan 2)、Septin9和TCF4(Transcription factor 4)。

本发明所用的术语“受试者”指患有或者怀疑患有某种疾病的个体(优选人)，或者，在预测易感性时“受试者”也可包括健康个体。该术语通常可以和与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。

本发明所用的术语“群体”一般指健康人群。在提及特定疾病(如胃癌)时，“群体”可以包括不患有该特定疾病但可能患有其它疾病的人体。另外，还可以根据年龄、性别、健康状况、是否吸烟等特征仅选择部分个体来作为“群体”。“群体中正常甲基化水平”可以通过对足够多的个体进行检测而得到，或者可以在已有的临床文献中找到。在一些情况下，该正常水平指无甲基化。

本发明所用的术语“胃癌和/或胃息肉”包括受试者对胃癌和/或胃息肉的易感性以及胃癌和/或胃息肉的存在、进展、亚型和/或分期。在一些实施方案中，可以根据受试者中生物标志物基因的甲基化水平来预测该受试者对胃癌和/或胃息肉的易感性。在另一些实施方案中，可以根据受试者中生物标志物基因的甲基化水平来鉴定该受试者中是否存在胃癌和/或胃息肉；并且如果存在胃癌的话，鉴定其亚型和/或分期。胃癌亚型可包括腺癌、粘液腺癌、未分化癌和其它胃癌。胃癌分期可以包括I期(IA、IB或IC)、II期、III期和IV期。在一些实施方案中，胃癌是I期胃癌。在一些实施方案中，胃癌是II期胃癌。在一些实施方案中，胃癌是III期胃癌。在另一些实施方案中，胃癌是IV期胃癌。

在本发明的方法中，还可以基于胃癌的分期来安排对受试者的治疗，例如，包括对受试者进行更多的测试、进行外科手术、进行药物治疗以及不采取进一步的行动。在另一些实施方案中，本发明的方法还包括在受试者经治疗后，再次测量受试者中CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4基因中的一种或更多种生物标志物基因或其片段的甲基化水平；并且使测量结果与胃癌和/或胃息肉相关联，以鉴定治疗是否导致受试者中胃癌和/或胃息肉的改变。在一些实施方案中，关联通过软件分类算法来进行。

本发明中，对甲基化水平的检测包括从生物样品中提取DNA，并以亚硫酸氢盐处理，随后使用甲基化特异的引物对进行PCR扩增反应。其中亚硫酸氢盐处理造成DNA双链分子中未甲基化的胞嘧啶残基脱氨基，成为尿嘧啶；而甲基化的胞嘧啶残基保持不变。这样，在随后的PCR扩增反应中，模板上甲基化的胞嘧啶残基位点作为胞嘧啶残基与引物中的鸟嘌呤残基配对，而未甲基化的胞嘧啶残基位点作为尿嘧啶残基与引物中的腺嘌呤残基配对。发明人针对每种生物标志物基因设计了多个引物对，以检测每种生物标志物基因内靶区域的甲基化水平，其中靶区域分别选自序列表中序列1-10所示DNA中连续的至少15个碱基长度的片段；而引物对的核酸序列分别等同、互补或杂交于上述靶区域。本发明提供的引物对利用该甲基化差异来检测生物标志物基因内靶区域的甲基化水平。当生物标志物基因的靶区域未甲基化时，所用的引物对不能在PCR扩增反应中与作为模板的靶区域(经亚硫酸氢盐处理)有效地配对结合，不能(或极少)生成扩增产物；而当生物标志物基因的靶基因被甲基化时，所用的引物对能够在PCR扩增反应中与作为模板的靶区域(经亚硫酸氢盐处理)有效地配对结合，从而生成扩增产物。这种扩增反应的差异可以在扩增反应进行过程中实时监测，或者可以通过检测扩增产物来判断。本发明人经过多次试验，筛选出了针对生物标志物基因的多个引物对，它们单独或者联合使用，可帮助鉴定受试者中的胃癌和和/或胃息肉。

本发明在提及检测甲基化水平时经常会使用术语“生物标志物基因或其片段”，是由于在PCR扩增反应中，所用的引物对在模板的选择上并不会区分是整个基因还是其片段，只要模板的长度不小于待扩增区域的长度即可(事实上，在提取DNA以及随后的亚硫酸氢盐处理过程中，通常会导致基因断裂成不同大小的片段)。

在一些优选实施方案中，本发明使用HeavyMethyl方法测量标志物基因甲基化，所以除了设计普通Taqman引物外，还设计了封闭引物。封闭引物在核苷酸序列上设计为与相应引物对所扩增区域内的一段模板序列配对结合。另外，封闭引物在3’-OH引入化学修饰，导致DNA聚合酶无法扩增，该化学修饰例如为C3间臂(C3Spacer)、C6间臂(C6Spacer)、反转3’末端(inverted 3’end)、3’磷酸(3’P)等。在本发明方法的实施方案中，将封闭引物的核苷酸序列设计为与未甲基化的模板(经亚硫酸盐处理)结合，而不与甲基化的模板(经亚硫酸盐处理)结合。因而，在封闭引物所对应的区域内没有发生甲基化时，其可阻止相应扩增反应进行，从而提高本发明检测方法的特异性。

在本发明方法中，优选还包括利用荧光探针来实时监测和/或定量PCR扩增反应。所用探针5’端报告荧光基团可以为FAM、JOE、TET、HEX、Cy3、Texas Red、Rox或Cy5；3’端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL或MGB。

本发明方法中对生物标志物基因的甲基化水平的检测包括检测生物标志物基因中是否存在甲基化、以及对该甲基化进行定量和定性检测。

本发明采用的生物样品选自提取自受试者的流体或组织，包括血液、血清、血浆、粪便、淋巴、脑脊液、腹水、尿和组织活检等，优选血浆、血清和粪便。

在本发明的方法中，还可以考虑受试者的年龄，用来预测受试者中的胃癌和/或胃息肉。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括提供胃癌和/或胃息肉预测的书面报告或电子报告的步骤，并且任选地，报告包括关于受试者中胃癌和/或胃息肉存在与否或其可能性或者关于受试者胃癌的等级化风险的预测。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括为医师建立生物标志物基因甲基化相对水平的报告和通过邮寄、传真、邮箱等传输这样的报告。在一个实施方案中，通过互联网传输包含生物标志物基因甲基化水平的报告的数据流。

在一些实施方案中，采用统计方法构建基于生物标志物基因的甲基化水平的诊断模型，统计方法选自以下方法：多元线性回归，查找表、决策树、支持向量机、Probit回归、逻辑回归、聚类分析、邻域分析、遗传算法、贝叶斯和非贝叶斯方法等。

在另一些实施方案中，提供了基于生物标志物基因甲基化水平的预测或诊断模型。模型可以是软件代码、计算机可读格式的形式或书面说明的形式，用于评价生物标志物基因的相对甲基化水平。

利用本发明的方法可得到新的且重要的额外信息，其协助医师对患者患胃癌和/或胃息肉的风险进行分级并计划接下来将采取的诊断步骤。本发明提供的方法类似地还可用于评估无症状高风险患者中的胃癌和/或胃息肉风险，以及对于一般群体用作筛查工具。考虑本发明的方法可被临床医师用作其它预测性和诊断性指标的全面评估的一部分。

本发明的方法可用于评估现有化学治疗剂和候选化学治疗剂以及其它类型癌症治疗手段的治疗效力。例如，可以在受试者治疗前后或者在治疗期间从受试者取得生物样品，并且按上文进行生物标志物基因甲基化水平的检测，通过检测结果鉴定受试者中癌症状态的变化，从而确定治疗效力。

本发明的方法还可用于鉴定受试者是否潜在地正在发生癌症。在随时间取自受试者的生物样品中检测生物标志物基因甲基化相对水平，从而将指向癌症特征的生物标志物甲基化水平改变解释为朝发生癌症方向进展。

生物标志物基因的组合提供了用于在胃癌进展不同分期中预测胃癌和/或胃息肉存在或检测胃癌和/或胃息肉的敏感、特异且准确的手段。对生物样品中甲基化水平的评价也可与患者的恶性肿瘤前或临床前病症的存在具有相关性。因此，所公开的方法可用于预测或检测样品中胃癌和/或胃息肉的存在、胃癌的阶段、胃癌的亚型、胃癌的良性或恶性、胃癌的转移可能性、与胃癌有关的赘生物的组织学类型、癌症的无痛性或攻击性，以及与预防、诊断、表征和治疗患者胃癌有关的其它胃癌特征。

本发明的方法还可用于评估候选药物抑制胃癌的效力，评估胃癌疗法的效力，监测胃癌的进展，选择抑制胃癌癌的药剂或疗法，监测胃癌患者的治疗，监测患者中胃癌的抑制状况，以及通过检测测试化合物暴露后测试动物内生物标志物基因的甲基化水平，来评估测试化合物的致癌潜力。

本发明还提供了用于检测胃癌和/或胃息肉的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒可包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂。DNA提取试剂可包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。裂解缓冲液通常由蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。结合缓冲液通常由蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B：清洗缓冲液A由蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、去垢剂、pH缓冲剂和乙醇组成；清洗缓冲液B由核酸酶抑制剂、pH缓冲剂和乙醇组成。洗脱缓冲液通常由核酸酶抑制剂和pH缓冲剂组成。蛋白变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍和尿素中的一种或多种；去垢剂选自Tween20、IGEPAL CA-630、Triton X-100、NP-40和SDS中的一种或多种；pH缓冲剂选自Tris、硼酸、磷酸盐、MES和HEPES中的一种或多种；核酸酶抑制剂选自EDTA、EGTA和DEPC中的一种或多种。亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液。其中，亚硫酸氢盐选自重亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵和亚硫酸铵中的一种或多种；保护缓冲液由氧自由基清除剂组成，氧自由基清除剂选自对苯二酚、维生素E、维生素E衍生物、Trolox、三羟基苯甲酸和三羟基苯甲酸衍生物中的一种或几种。

本发明的试剂盒包括用于CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4基因中一种或多种进行甲基化特异性PCR扩增反应的引物对。这些引物对分别检测对应基因靶区域核苷酸序列中至少一段核苷酸序列的甲基化。

本发明的试剂盒还可包括与上述引物对联合使用的封闭引物和探针。

在某些实施方案中，试剂盒还可包括使用试剂盒提取生物样品DNA和以亚硫酸氢盐试剂处理DNA的说明书。在另一些实施方案中，试剂盒还包括使用试剂盒内试剂测量受试者中生物标志物水平的说明书。在又一些实施方案中，试剂盒包含使用该试剂盒以确定受试者中胃癌和/或胃息肉的说明书。

本发明还保护利用试剂盒检测生物标志物基因或其片段的甲基化水平的方法，包括如下步骤：采用DNA提取试剂提取生物样品内的DNA，将提取得到的DNA采用亚硫酸氢盐试剂进行处理；以及以处理后的DNA为模板，利用所提供的引物对来检测生物标志物基因甲基化水平。

生物标志物基因甲基化水平测量方法可选自以下方法中一种或多种：实时荧光PCR、数字PCR、重亚硫酸盐测序、甲基化特异性PCR、限制性内切酶分析法、高分辨溶解曲线技术、基因芯片技术和飞行时间质谱。

下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。

实施例1：DNA提取

DNA提取试剂由裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液组成。裂解缓冲液由蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。结合缓冲液由蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B，清洗缓冲液A由蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、去垢剂、pH缓冲剂和乙醇组成；清洗缓冲液B由核酸酶抑制剂、pH缓冲剂和乙醇组成。洗脱缓冲液由核酸酶抑制剂和pH缓冲剂组成。其中蛋白变性剂为：盐酸胍；去垢剂为：Tween20；pH缓冲剂为：Tris-HCl；核酸酶抑制剂为：EDTA。

本实施例以胃癌患者血浆样品为例，提取血浆DNA。提取方法包括如下步骤：

(1)取1ml血浆，加入相同体积的裂解缓冲液，再加入蛋白酶K和Carrier RNA，使其终浓度分别为100mg/L和1μg/ml，震荡混匀，55℃温育30min；

(2)加入100μl磁珠(购自Life technologies公司，货号：37002D)，振荡孵育1小时；

(3)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(4)加入1ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；

(5)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；

(6)加入1ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；

(7)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(8)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；

(9)将装有磁珠的离心管开盖放置在55℃的金属浴上，晾干10min；

(10)加入100μl洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；

(11)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记；

(12)洗脱后的DNA存放于4℃冰箱待用，或者保存于-20℃冰箱长期保存。

实施例2：亚硫酸氢盐处理DNA

亚硫酸氢盐处理DNA是采用亚硫酸氢盐试剂进行处理，亚硫酸氢盐试剂由亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液组成；亚硫酸氢盐缓冲液为亚硫酸氢钠和水的混合液体；保护缓冲液为氧自由基清除剂对苯二酚和水的混合液体。

本实施例以实施例1提取得到的DNA为处理对象，采用亚硫酸氢盐处理DNA，具体步骤包括：

(1)配制亚硫酸氢盐缓冲液：称取1g亚硫酸氢钠粉末，加水配制成3M缓冲液；

(2)配制保护缓冲液：称取1g对苯二酚试剂，加水配置成0.5M保护缓冲液；

(3)将100μl DNA溶液、200μl亚硫酸氢盐缓冲液和50μl保护液混合，震荡混合均匀；

(4)热循环：95℃5min，80℃60min，4℃10min；

(5)将1ml DNA结合缓冲液加入到亚硫酸氢盐处理后的DNA溶液中，再加入50μl磁珠，震荡孵育1h；

(6)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(7)加入0.5ml清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；

(8)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；

(9)加入0.5ml清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；

(10)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(11)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；

(12)将装有磁珠的离心管放置在55℃的金属浴上，开盖晾干10min；

(13)加入50μl洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；

(14)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记。

实施例3：实时荧光PCR检测DNA甲基化及引物组验证

本实施例以实时荧光PCR为例测量生物标志物基因的甲基化水平。检测基因为CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4基因，内参基因为ACTB。本实施例采用实施例2经过亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增。待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照均进行3个复孔检测。

对于CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4基因，可以设计很多套引物和探针的组合，而每一套探针引物组合的性能可能存在差别，所以需要通过实验进行验证。

因此，本发明针对CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4基因设计了多种引物和探针，其分别等同于、互补于或杂交于序列表的序列1-10所示的序列的至少15个核苷酸及其互补序列；再用甲基化和非甲基化核酸序列作为模板验证引物和探针的有效性。本发明过实时荧光PCR扩增结果筛选出以下最佳的引物组和内参基因ACTB的引物组：

第一引物组(CDH1引物组1)

引物1：SEQ ID NO 11:5’-AGGGTTATCGCGTTTATGCG-3’

引物2：SEQ ID NO 12:5’-CCACAACCAATCAACAAC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 13:5’-TGTGTTTATGTGAGGTTGGGTGGGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 14:5’-HEX-AAACGAAACTAACGACCCGCC-BHQ1-3’

第二引物组(CDH1引物组2)

引物1：SEQ ID NO 15:5’-GTCGTTAGTTTCGTTTTG-3’

引物2：SEQ ID NO 16:5’-CGTACCGCTAATTAACTAA-3’

封闭引物：SEQ ID NO 17:5’-TGTTAGTTTTGTTTTGGGGAGGGGTTTGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 18:5’-HEX-ACCGACCACAACCAATCAACAAC-BHQ1-3’

第三引物组(DAPK引物组1)

引物1：SEQ ID NO 19:5’-GGATAGTCGGATCGAGTT-3’

引物2：SEQ ID NO 20:5’-GACCCCAAACCCTACC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 21:5’-TGGATTGAGTTAATGTTGGGGATTTTGTTTTTTTTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 22:5’-TexasRed-TACGAATTACCGAATCCCCTCCG-BHQ2-3’

第四引物组(DAPK引物组2)

引物1：SEQ ID NO 23:5’-CGGAGGGAAATTTGGTTTC-3’

引物2：SEQ ID NO 24:5’-GACACAAAACGCCTAATC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 25:5’-GGTTTTGGGGAGAAGTGTGATTGTAGTTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 26:5’-TexasRed-AACCGACGCCACCTATTCTCA-BHQ2-3’

第五引物组(PAX5引物组1)

引物1：SEQ ID NO 27:5’-TAAAAATTCGGTTTGCGTTC-3’

引物2：SEQ ID NO 28:5’-GACCCTCTACGCTATACG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 29:5’-TGGTTTGTGTTTGTTTAAGTAGTGGGG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 30:5’-TexasRed-ACATCTCCATATACAAACCCCGCTACT-BHQ2-3’

第六引物组(PAX5引物组2)

引物1：SEQ ID NO 31:5’-GGGTTCGTTACGTTTGG-3’

引物2：SEQ ID NO 32:5’-CGACCCGAAACGAAAA-3’

封闭引物：SEQ ID NO 33:5’-TGTTATGTTTGGTGTGTTGAGTAGGTTTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 34:5’-TexasRed-CGACCGAACCTACTCAACGC-BHQ2-3’

第七引物组(RASSF1A引物组1)

引物1：SEQ ID NO 35:5’-GCGTTGAAGTCGGGGTTCG-3’

引物2：SEQ ID NO 36:5’-CCGATTAAACCCGTACTTC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 37:5’-TTGGGGTTTGTTTTGTGGTTTCGTTTGGTTTGT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 38:5’-FAM-CGCTAACAAACGCGAACCGA-BHQ1-3’

第八引物组(RASSF1A引物组2)

引物1：SEQ ID NO 39:5’-GGGAGTTTGAGTTTATTGA-3’

引物2：SEQ ID NO 40:5’-GATACGCAACGCGTTAACACG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 41:5’-CACATTAACACACTCCAACCAAATACAACCCTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 42:5’-FAM-CGCCCAACGAATACCAACTCC-BHQ1-3’

第九引物组(Reprimo引物组1)

引物1：SEQ ID NO 43:5’-GCGTTTAGTTCGGTATTTGTT-3’

引物2：SEQ ID NO 44:5’-CGCAAAAACGAACGAACG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 45:5’-TGTTTAGTTTGGTATTTGTTTTTTTAGTGTTGTTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 46:5’-TexasRed-CGCGAACGACGCGAATCCGAA-BHQ2-3’

第十引物组(Reprimo引物组2)

引物1：SEQ ID NO 47:5’-TTTAGGTAATTAGACGGACG-3’

引物2：SEQ ID NO 48:5’-ACGCCTAAATACAACAAC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 49:5’-GATGGATGTGGTGGGTTTGTTTTTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 50:5’-TexasRed-TCCAACGCCTCGCTACTATTAACC-BHQ2-3’

第十一引物组(RNF180引物组1)

引物1：SEQ ID NO 51:5’-TACGGTTTCGTTTGGTTCG-3’

引物2：SEQ ID NO 52:5’-CACGTCTACGAATTCCCAC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 535’-TGTTTGGTTTGTGGTGTTTGTTTGTTTGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 54:5’-JOE-CGTAAACGACGCCGAACTTTAACC-BHQ1-3’

第十二引物组(RNF180引物组2)

引物1：SEQ ID NO 55:5’-GCGTTTGTTTGTTTGCG-3’

引物2：SEQ ID NO 56:5’-TCTACGAATTCCCACCCG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 57:5’-TGTTTGGTTTGTGGTGTTTGTTTGTTTGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 58:5’-JOE-CGTAAACGACGCCGAACTTTAACCC-BHQ1-3’

第十三引物组(RNF180引物组3)

引物1：SEQ ID NO 59:5’-GGTCGTTGGTTGTGGC-3’

引物2：SEQ ID NO 60:5’-GAACTATACCTACAACCCCG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 615’-TGTTGGTTGTGGTGGGTGAGTGTTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 62:5’-JOE-CCCGCGACCTCGAACGTAACG-BHQ1-3’

第十四引物组(RUNX3引物组1)

引物1：SEQ ID NO 63:5’-TTCGGGTATTCGGTTTAG-3’

引物2：SEQ ID NO 64:5’-CCTACAAAACGCATCCAA-3’

封闭引物：SEQ ID NO 65:5’-TGGGTATTTGGTTTAGTTTGGTTGTGTGTTTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 66:5’-HEX-CGAAACGCCGAAATCCCGAAA-BHQ1-3’

第十五引物组(RUNX3引物组2)

引物1：SEQ ID NO 67:5’-CGTTGTAATAAGACGTTGTTC-3’

引物2：SEQ ID NO 68:5’-CCACTACTCCCGAAACTC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 69:5’-TGTTGTTTGTTGTTTTTAAGGTGAGTGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 70:5’-HEX-AACTCCCGCAACTCAAACGC-BHQ1-3’

第十六引物组(RUNX3引物组3)

引物1：SEQ ID NO 71:5’-CGCGTCGTTTCGTAAAAG-3’

引物2：SEQ ID NO 72:5’-CCCGAACAAACGTCTAAA-3’

封闭引物：SEQ ID NO 73:5’-TGTTTTGTAAAAGTTTTTTGTTTATATTTTTGGGTTTTTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 74:5’-HEX-CGACCTAACGCCGTCCGATA-BHQ1-3’

第十七引物组(SDC2引物组1)

引物1：SEQ ID NO 75:5’-CGGCGTAGTTATAGCGCGG-3’

引物2：SEQ ID NO 76:5’-CCGAACTCCCCTAAACGACTAAA-3’

封闭引物：SEQ ID NO 77:5’-AGTTATAGTGTGGAGTTGTGGTGTTTATTGGTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 78:5’-FAM-TACAAAATTACACGCCGATTAACAACTCCG-BHQ1-3’

第十八引物组(SDC2引物组2)

引物1：SEQ ID NO 79:5’-CGTAGGAGGAGGAAGCG-3’

引物2：SEQ ID NO 80:5’-GCACACGAATCCGAAAC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 81:5’-GGAGGAAGTGAGTGTTTTTGAGTTTTGAG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 82:5’-FAM-AATACCGCAACGATTACGACTCAAACTCG-BHQ1-3’

第十九引物组(SDC2引物组3)

引物1：SEQ ID NO 83:5’-CGAGTTTGAGTCGTAATCGTTG-3’

引物2：SEQ ID NO 84:5’-CAACCAAAACAAAACGAAACC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 85:5’-TGTAATTGTTGTGGTATTTTGTTTTGGATTTGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 86:5’-FAM-AACGCTCGACGCAACCCGCGC-BHQ1-3’

第二十引物组(Septin9引物组1)

引物1：SEQ ID NO 87:5’-CGCGATTCGTTGTTTATTAG-3’

引物2：SEQ ID NO 88:5’-CACCTTCGAAATCCGAAA-3

封闭引物：SEQ ID NO 89:5’-AAAATCCAAAATAATCCCATCCAACTACACATTAAC-C3-3’

探针：SEQ ID NO 90:5’-FAM-CGCGTTAACCGCGAAATCCGACATAAT-BHQ1-3’

第二十一引物组(Septin9引物组2)

引物1：SEQ ID NO 91:5’-TAGCGTATTTTCGTTTCGC-3’

引物2：SEQ ID NO 92:5’-CGAACTTCGAAAATAAATACTAAAC-3

封闭引物：SEQ ID NO 93:5’-TTTGTTTTGTGTTAGGTTTATTTGTAGGGTTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 94:5’-FAM-AACTACTACGACCGCGAACGTA-BHQ1-3’

第二十三引物组(TCF4引物组1)

引物1：SEQ ID NO 95:5’-GGCGGGGAGGTAGTAG-3’

引物2：SEQ ID NO 96:5’-CCGAAACGACGTTCATATCTA-3’

封闭引物：SEQ ID NO 97:5’-TGGGGAGGTAGTAGGTGTGGGAGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 98:5’-HEX-CTACTCCTACGCCCGCTCCC-BHQ1-3’

第二十四引物组(TCF4引物组2)

引物1：SEQ ID NO 99:5’-GTGTGTTTGCGGATTTGTA-3’

引物2：SEQ ID NO 100:5’-ACGACGTTCATATCTAACC-3’

封闭引物：SEQ ID NO 101:5’-GTGGATTTGTAGTGGTGGTGGTGGTGGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 102:5’-HEX-CTACTCCTACGCCCGCTCCC-BHQ1-3’

内参基因ACTB引物组：

引物1：SEQ ID NO 103:5’-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’

引物2：SEQ ID NO 104:5’-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTT-3’

探针：SEQ ID NO 105:5’-Cy5-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ3-3’

多组引物和探针均能区分甲基化和非甲基化模板，分别可以作为检测CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4基因甲基化的引物和探针。虽然不同的引物和探针组合效果略有不同，但是以上引物和探针分别适用于CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4基因的甲基化检测。下表1和表2显示了采用各个引物和探针组合对上述基因的甲基化和非甲基化模板(经亚硫酸氢盐处理)的检测结果。显然，所设计的各个引物和探针组合是对于甲基化模板是高度特异性的。

表1所设计的引物组对甲基化和非甲基化模板的检测结果之一(Ct，均值)

表2所设计的引物组对甲基化和非甲基化模板的检测结果之二(Ct，均值)

此外，本发明采用不同癌症患者和健康人DNA作为模板进一步验证引物和探针组合的有效性。将5例胃癌、3例肝癌和5例健康人的血浆样本采用实施例1的DNA提取方法提取DNA，然后采用实施例2的方法，采用亚硫酸氢盐处理DNA模板。利用上述多个引物和探针组合，进行实时荧光PCR实验。分别测得癌症样本和健康人样本的各种标志物基因Ct值，结果见下表3和表4。

表3各引物组对已知胃癌个体(包括健康个体)中指定基因甲基化水平的检测结果之一

缩写词：GaCa：胃癌；HeCa：肝癌；Con：健康

表4各引物组对已知胃癌个体(包括健康个体)中指定基因甲基化水平的检测结果之二

从以上癌症患者和健康人样本的CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4基因甲基化检测的Ct值可以看出，以上各个引物和探针组合对胃癌甲基化DNA有高度特异性扩增，其它癌症和健康人无扩增或者扩增Ct值大于40。虽然不同组的引物和探针组合对胃癌样本的扩增Ct值有些差异，但都明显区别于其它癌症和健康人样本，因此以上各个引物组合均适用于胃癌检测。

实施例4：试剂盒检测胃癌患者、胃息肉患者、良性病症患者血浆的灵敏度和特异性

使用来自病理学上确定胃癌的患者的203个样品，胃息肉患者的83个样品和来自病理学上确定为良性病症的患者的178个样品(见表5)，所有样本都收集自中国人民解放军海军总医院。胃癌样品包括疾病的所有分期和常见亚型。胃癌及胃息肉患者都是通过影像学及病理学诊断确诊的，样本分期基于国际TNM分期标准，样本亚型依据组织活检及免疫组化方法确定。良性样品包括在整个研究群体中看到的良性病症的常见类型。在外科手术后得到完整临床病理学报告，包括患者年龄、吸烟史、人种、分期、亚型并且对每个样品编码收集地点。

表5所采集样品对象的胃癌分期以及其它特征

用实施例1的DNA提取方法提取DNA，然后采用实施例2的方法用亚硫酸氢盐处理DNA模板，再利用实施例3中提供的引物和探针组合(针对每个生物标志物基因都采用引物组1)进行实时荧光PCR实验，检测CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4基因和内参基因ACTB，最后得出健康人和胃癌患者样本各个基因的Ct值。如上文实施例3所描述的，可以通过该Ct值反映各基因的甲基化水平。

使用可商购软件包(IBM SPSS Statistics 24和MedCalc11.4.2.0，分别购自IBM和MedCalc)进行血浆生物标志物水平的描述性统计、受试者工作特征(ROC)曲线和图形展示。使用非参数Kruskal-Wallis检验(ANOVA)，然后使用Dunn's多重比较后检验确定了统计学差异。对于所有的统计学比较，P值<0.05视为统计学显著。

使用实时荧光PCR测定，在来自病理学确定胃癌的203名患者，胃息肉的83名患者和具有良性胃病的178名个体的血浆中，检测了上述10种标志物基因的甲基化水平。为了有助于确定这些生物标志物基因区分症状相似的癌症与良性胃病的能力，所有样品从相同的临床群体(基于存在胃息肉进行外科手术的患者)中得到。在任何介入之前和已知疾病状态之前就收集所有的样品。随后通过离体组织的病理学检查来确定疾病状态。使用单一的样品收集方案来收集血浆，监测顺从性。这确保了样品质量并且消除了样品集合中的任何收集、加工和生物偏倚的可能性。在该研究中没有使用正常的健康样品，原因是它们通常比良性病症更容易被区分。这些样本显示，患胃癌的个体中的平均患者年龄(58.5岁)比患良性病症(48.6岁)的那些个体高，并且都随疾病表现的分期进展而增加(表5)。总体上，胃癌亚型的分布与人群中所有胃癌病例所见分布相类似，其中腺癌的比例(88.2％)比其它胃癌高。研究中的良性对照代表常见良性胃部疾病，包括胃溃疡、胃炎等。

对于每种生物标志物的甲基化水平检测数据，使用MedCalc11.4.2.0软件，选择95％置信区间，产生ROC曲线并且计算其曲线下面积(AUC)值。相对于良性胃病，胃癌及胃息肉样品中10种生物标志物基因甲基化水平AUC均大于0.8(P值<0.05)，AUC在0.809-0.903之间(见图1和表6)。

表6 10种标志物基因受试者工作特征(ROC)曲线分析的曲线下面积(AUC)

在一些实施方案中，胃癌为胃癌I期或II期，生物标志物基因为DAPK和/或Septin9。在一些实施方案中，胃癌为腺癌，生物标志物基因为PAX5、SDC2和/或Septin9。在一些实施方案中，胃癌为粘液腺癌，生物标志物基因为RASSF1A和/或SDC2。在一些实施方案中，胃癌未分化癌，生物标志物基因为RNF180和/或TCF4。在一些实施方案中，胃息肉生物标志物基因为RUNX3和/或SDC2。

为了确定某些生物标志物基因是否对癌症的不同分期(特别是早期)具有更大的区分度，比较10种生物标志物基因(图2和图3)在I期和II期(标志物检测最重要时期)样品中的区分度。对于I期样品，Septin9和SDC2具有很高的区分度(P值<0.001)，然后以降序排列为DAPK、CDH1、RASSF1A Reprimo、RNF180、RUNX3和TCF4(P值0.001至0.01)，然后是PAX5(P值0.01至0.05)。对于II期样品，DAPK和Septin9二者具有很高的区分度(P值<0.001)，此外还有CDH1、RASSF1A和RNF180(P值<0.001)，然后是RUNX3、TCF4和SDC2(P值0.001至0.01)，然后是Reprimo(P值0.01至0.05)。PAX5没有显著性差异(P值>0.05)。

本发明还评价了上述生物标志物基因的甲基化水平在来自良性病症与胃息肉及各种亚型胃癌的样品之间是否有统计显著性差异(图4和5)。对于胃息肉，RUNX3和SDC2具有很高的区分度(P值<0.001)，然后以降序排列为CDH1、DAPK、PAX5和Septin9(P值0.001至0.05)，RASSF1A、Reprimo、RNF180和TCF4(P值0.01至0.05)。对于腺癌，CDH1、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、SDC2和Septin9具有很高的区分度(P值<0.001)，然后以降序排列为DAPK和TCF4(P值0.001至0.05)，RUNX3(P值0.01至0.05)。对于粘液腺癌，Reprimo、RUNX3、SDC2、DAPK、RASSF1A、Septin9和TCF4具有很高的区分度(P值<0.001)，然后以降序排列为PAX5和RNF180(P值0.001至0.05)，CDH1(P值0.01至0.05)。对于未分化癌，DAPK、PAX5、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4具有很高的区分度(P值<0.001)，然后以降序排列为RASSF1A(P值0.001至0.05)，CDH1(P值0.01至0.05)。对于其它胃癌，CDH1、DAPK、Reprimo、RNF180、RUNX3、Septin9和TCF4具有很高的区分度(P值<0.001)，然后以降序排列为PAX5和SDC2(P值0.001至0.05)，RASSF1A(P值0.01至0.05)。

就操作简单和降低成本而言，检测单个生物标志物基因的甲基化水平优于检测多种生物标志物基因的甲基化水平。然而，清楚的是，单个生物标志物基因的甲基化水平可能无法提供复杂疾病的固有多样性信息，所以经常还需要构建采用多标志物的诊断模型。多标志物诊断模型需要使用统计分析方法进行，以下以逻辑回归模型为例构建甲基化基因标志物诊断模型来检测胃癌。

逻辑回归模型的训练通过如下方式进行：将样本分成病例和对照，然后使用IBMSPSS Statistics 24软件来优化回归系数。对于每种标志物都有一个回归系数，加上一个偏差参数，使得逻辑回归模型用于训练数据的似然性最大化。

训练后，回归系数集合就限定了逻辑回归模型。通过将生物标志物的甲基化水平放入逻辑回归方程中，本领域技术人员可容易地使用这种类型的诊断模型来预测任何新样品鉴定为病例或对照的可能性。

上述10种标志物基因甲基化水平AUC均大于0.80，接下来我们使用逻辑回归组合了10种标志物基因，产生的AUC为0.956(标准误差：0.0121；95％CI：0.917-0.980；P值：<0.0001)(图6)。为了让监测分析方法更简单，再将AUC值较大的5种标志物基因组合并建立逻辑回归模型。得到的AUC值为0.924(标准误差：0.0214；95％CI：0.878-0.956；P值：<0.0001)(图7)。对于该样品集合，在65.2％的特异性下，给出了98.0％的灵敏度。通过在固定特异性值下确定模型的灵敏度和在固定灵敏度值下确定模型的特异性来进一步比较两种模型(表7和表8)。例如可以选择当方法的灵敏度高于约95％时，其灵敏度和特异性总和大于约160％；或者当方法的特异性高于约95％时，其灵敏度和特异性总和大于约165％。一般来说，10种标志物比5种标志物的逻辑回归模型的灵敏度和特异性稍好些，基于操作分析程序和成本考虑，5种标志物组合也是比较好的选择。

表7 5种最有特征性的标志物基因和10种标志物基因的逻辑回归模型在重要特异性阈值时的灵敏度

表8 5种最有特征性的标志物基因和10种标志物基因的逻辑回归模型在重要灵敏度阈值时的特异性

需要指出的是，本实施例提供的甲基化水平检测结果是采用针对各个生物标志物基因的引物组1得到的(例如，对于CDH1基因，采用CDH1引物组1；对于DAPK基因，采用DAPK引物组1，以此类推)，但采用本文提供的另外引物组，得到类似的检测结果(数据未示出)。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明说明书的范围中。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京艾克伦医疗科技有限公司

<120> 用于鉴定胃癌和/或胃息肉的试剂盒及其应用

<130> 3

<160> 105

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 638

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

aaaagaactc agccaagtgt aaaagccctt tctgatccca ggtcttagtg agccaccggc 60

ggggctggga ttcgaaccca gtggaatcag aaccgtgcag gtcccataac ccacctagac 120

cctagcaact ccaggctaga gggtcaccgc gtctatgcga ggccgggtgg gcgggccgtc 180

agctccgccc tggggagggg tccgcgctgc tgattggctg tggccggcag gtgaaccctc 240

agccaatcag cggtacgggg ggcggtgcct ccggggctca cctggctgca gccacgcacc 300

ccctctcagt ggcgtcggaa ctgcaaagca cctgtgagct tgcggaagtc agttcagact 360

ccagcccgct ccagcccggc ccgacccgac cgcacccggc gcctgccctc gctcggcgtc 420

cccggccagc catgggccct tggagccgca gcctctcggc gctgctgctg ctgctgcagg 480

taccccggat cccctgactt gcgagggacg cattcgggcc gcaagctccg cgccccagcc 540

ctgcgcccct tcctctcccg tcgtcaccgc ttcccttctt ccaagaaagt tcgggtcctg 600

aggagcggag cggcctggaa gcctcgcgcg ctccggac 638

<210> 2

<211> 874

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

ccccggccgg cgtgggtgtg gggcgagtgg gtgtgtgcgg ggtgtgcgcg gtagagcgcg 60

ccagcgagcc cggagcgcgg agctgggagg agcagcgagc gccgcgcaga acccgcagcg 120

ccggcctggc agggcagctc ggaggtgggt gggccgcgcc gccagcccgc ttgcagggtc 180

cccattggcc gcctgccggc cgccctccgc ccaaaaggcg gcaaggagcc gagaggctgc 240

ttcggagtgt gaggaggaca gccggaccga gccaacgccg gggactttgt tccctccgcg 300

gaggggactc ggcaactcgc agcggcaggg tctggggccg gcgcctggga gggatctgcg 360

ccccccactc actccctagc tgtgttcccg ccgccgcccc ggctagtctc cggcgctggc 420

gcctatggtc ggcctccgac agcgctccgg agggaccggg ggagctccca ggcgcccggg 480

tgagtagcca ggcgcggctc cccggtcccc ccgacccccg gcgccagctt ttgctttccc 540

agccagggcg cggtggggtt tgtccgggca gtgcctcgag caactgggaa ggccaaggcg 600

gagggaaact tggcttcggg gagaagtgcg atcgcagccg ggaggcttcc ccagccccgc 660

gggccgggtg agaacaggtg gcgccggccc gaccaggcgc tttgtgtcgg ggcgcgagga 720

tctggagcga actgctgcgc ctcggtgggc cgctcccttc cctcccttgc tcccccgggc 780

ggccgcacgc cgggtcggcc gggtaacgga gagggagtcg ccaggaatgt ggctctgggg 840

actgcctcgc tcggggaagg ggagagggtg gcca 874

<210> 3

<211> 401

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

aaacaaaaac ccggcctgcg ctcgtctaag cagcggggtt tgcacatgga gatgtcacag 60

gccccgcgca cagcgcagag ggccgcgacc cccaagcgca tgtcttaata gaaggtgcgg 120

ctggaagacc cgggctcccg ggctccgctt cggtctgccc cttcccgtag gtgcgctggc 180

tagcgcccgg cgcaggctga agccttcctt ccctcccccc aacccctata aaagtctggg 240

gcggcgcggc agcagcactg ctgctctccc ggcttcccgc tctactccgg ccgggccggg 300

tccgccacgt ctggcgcgct gagcaggccc ggccgcgcag cgcctaccct ttcctcgctc 360

cgggccggca gtgtggggcg gcgcgctggg ggcgcggcgt g 401

<210> 4

<211> 443

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

ctgcgagagc gcgcccagcc ccgccttcgg gccccacagt ccctgcaccc aggtttccat 60

tgcgcggctc tcctcagctc cttcccgccg cccagtctgg atcctggggg aggcgctgaa 120

gtcggggccc gccctgtggc cccgcccggc ccgcgcttgc tagcgcccaa agccagcgaa 180

gcacgggccc aaccgggcca tgtcggggga gcctgagctc attgagctgc gggagctggc 240

acccgctggg cgcgctggga agggccgcac ccggctggag cgtgccaacg cgctgcgcat 300

cgcgcggggc accgcgtgca accccacacg gcagctggtc cctggccgtg gccaccgctt 360

ccagcccgcg gggcccgcca cgcacacgtg gtgcgacctc tgtggcgact tcatctgggg 420

cgtcgtgcgc aaaggcctgc agt 443

<210> 5

<211> 446

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

gagcgctcag cccggcacct gttcctccag cgccgccgcc ttcccacccc tcggacccgc 60

gccgctcgcg gcgcccgccc gttcctgcga tgaatccggc cctaggcaac cagacggacg 120

tggcgggcct gttcctggcc aacagcagcg aggcgctgga gcgagccgtg cgctgctgca 180

cccaggcgtc cgtggtgacc gacgacggct tcgcggaggg aggcccggac gagcgtagcc 240

tgtacataat gcgcgtggtg cagatcgcgg tcatgtgcgt gctctcactc accgtggtct 300

tcggcatctt cttcctcggc tgcaatctgc tcatcaagtc cgagggcatg atcaacttcc 360

tcgtgaagga ccggaggccg tctaaggagg tggaggcggt ggtcgtgggg ccctactgac 420

ccgccctctg cccccgcggc aaccgc 446

<210> 6

<211> 439

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

ggacaaggga gaccacaggg ataatttctg tggctctggt aaggggatga caagggagaa 60

aaactttccc acggttccgt ctggcccgcg gcgcttgtct gcctgcgcgg ggtcaaagcc 120

cggcgccgcc cacgcgcggc tcgggtggga acccgcagac gtggggcgag cagggccgct 180

ggctgtggcg ggcgagcgcc ggggcgccac gtccgaggcc gcggggtcgg ggctgcaggc 240

acagctcgag cgctttccgc ggggtttggc tcctgtcgct tcccgtctcg ccgaaccggc 300

atcgccgccg ccggagccgc agcgagtcct cagagcctgg ctgctggcgg ccgggagcgc 360

cgggacgggg cgcgaagccg gaggctccgg gacgtggata caggtaaagg ccggcgggtc 420

ggagtcgggc ggggcgcgg 439

<210> 7

<211> 901

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

cctccccggc cttcccctgc ggcggcggcg gcggcaagat gggcgagaac agcggcgcgc 60

tgagcgcgca ggcggccgtg gggcccggag ggcgcgcccg gcccgaggtg cgctcgatgg 120

tggacgtgct ggcggaccac gcaggcgagc tcgtgcgcac cgacagcccc aacttcctct 180

gctccgtgct gccctcgcac tggcgctgca acaagacgct gcccgtcgcc ttcaaggtga 240

gtgcgggacc cggggcggga gggcgccggc cctggggctc cgggcgtctg agctgcggga 300

gccagagcct cgggagcagt ggggatggga ggtgcccgag acgccgcggc gacacccggg 360

cacccggttc agtctggctg cgcgctcggc tccgggacct cggcgttccg ttttggatgc 420

gccctgcagg aatgactttt aacggggttg ccccgctcca cctgggtttt ggggcgcctt 480

gcgtagagac gttggtgcgg aaatgggcgg atggggtttt gcgcccccct aacccggatc 540

gctcagatac agccctgcgg gtaacggaga agaggatccc gggacagggg caaggacacc 600

gcgggtgggg tgcgaacggt gaaagggcct accctccgcc tccagcaccc ctcctcccgc 660

gccgcttcgc aaaagcttcc tgctcacacc ctcgggcttc cgaaatttta ccggacggcg 720

ctaggccggg atcggggcac tgctctccag acgtttgctc ggggatatta tgcgtcccga 780

atggcgagtt gagattgggg gacccctaac cctggcagcc cccagccatt tagaggacct 840

ttttctttat gccagggagt aggcgactgt ttcattttca tttttttaag ggggcagcga 900

g 901

<210> 8

<211> 828

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

cggtgagcag agccggcgca gccacagcgc ggagccgcgg cgcccactgg tcctcggagc 60

tgccaatcgg cgtgtaatcc tgtaggaatt tctcccgggt ttatctggga gtcacactgc 120

cgcctcctct ccccagtcgc ccaggggagc ccggagaagc aggctcagga gggagggagc 180

cagaggaaaa gaagaggagg agaaggagga ggacccgggg agggaggcgc ggcgcgggag 240

gaggaggggc gcagccgcgg agccagtggc cccgcttgga cgcgctgctc tccagatacc 300

cccggagctc cagccgcgcg gatcgcgcgc tcccgccgct ctgcccctaa acttctgccg 360

tagctccctt tcaagccagc gaatttattc cttaaaacca gaaactgaac ctcggcacgg 420

gaaaggagtc cgcggaggag caaaaccaca gcagagcaag aagagcttca gagagcagcc 480

ttcccggagc accaactccg tgtcgggagt gcagaaacca acaagtgaga gggcgccgcg 540

ttcccggggc gcagctgcgg gcggcgggag caggcgcagg aggaggaagc gagcgccccc 600

gagccccgag cccgagtccc cgagcctgag ccgcaatcgc tgcggtactc tgctccggat 660

tcgtgtgcgc gggctgcgcc gagcgctggg caggaggctt cgttttgccc tggttgcaag 720

cagcggctgg gagcagccgg tccctgggga atatgcggcg cgcgtggatc ctgctcacct 780

tgggcttggt ggcctgcgtg tcggcggagt cggtgagtgg gccaggcg 828

<210> 9

<211> 572

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

cggtgcgggt gcgggaacct gatccgcccg ggaggcgggg gcggggcggg ggcgcagcgc 60

gcggggaggg gccggcgccc gccttcctcc cccattcatt cagctgagcc agggggccta 120

ggggctcctc cggcggctag ctctgcactg caggagcgcg ggcgcggcgc cccagccagc 180

gcgcagggcc cgggccccgc cgggggcgct tcctcgccgc tgccctccgc gcgacccgct 240

gcccaccagc catcatgtcg gaccccgcgg tcaacgcgca gctggatggg atcatttcgg 300

acttcgaagg tgggtgctgg gctggctgct gcggccgcgg acgtgctgga gaggaccctg 360

cgggtgggcc tggcgcggga cgggggtgcg ctgaggggag acgggagtgc gctgagggga 420

gacgggaccc ctaatccagg cgccctcccg ctgagagcgc cgcgcgcccc cggccccgtg 480

cccgcgccgc ctacgtgggg gaccctgtta ggggcacccg cgtagaccct gcgcgccctc 540

acaggaccct gtgctcgttc tgcgcactgc cg 572

<210> 10

<211> 717

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

gaggtgttga gatttttttt ttttcccctc ggggtgggtg cgagggggat gcatcctagc 60

ctgcccgacc cggagcaagt cgcgtctccc cgccggagcc cccccaccca tttctttgct 120

gaacttgcaa ttccgtgcgc ctcggcgtgt ttccccctcc ccccttccct ccgtcccctc 180

ccctccccgg agaagagagt tggtgttaag agtcagggat cttggctgtg tgtctgcgga 240

tctgtagtgg cggcggcggc ggcggcggcg gggaggcagc aggcgcggga gcgggcgcag 300

gagcaggcgg cggcggtggc ggcggcggtt agacatgaac gccgcctcgg cgccggcggt 360

gcacggagag ccccttctcg cgcgcgggcg gtaggtaccg gcgcctgcgg ggctcggcgg 420

ggcggaggcg cccggcggcg cggggttcgg gctcggcggc cccgcacgcg gctccgcgcc 480

tcccgcgccg cgggctcccg gcgcccggcg ctcccagaag agacacccct tcccctcccg 540

ccgcttccct ccccctcgcc gccagccccc ccgcccctcc ccttgatgcc ccctcggagg 600

gaccgaggac tttgccaggg gcctgacttt aatttttata acccctttct ttcacaaatt 660

agggtgctgg acaattagag gacccgaccc tccactccgc tccccccaac cctgtca 717

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agggttatcg cgtttatgcg 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccacaaccaa tcaacaac 18

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgtgtttatg tgaggttggg tgggtg 26

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaacgaaact aacgacccgc c 21

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtcgttagtt tcgttttg 18

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgtaccgcta attaactaa 19

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgttagtttt gttttgggga ggggtttgtg 30

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

accgaccaca accaatcaac aac 23

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggatagtcgg atcgagtt 18

<210> 20

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gaccccaaac cctacc 16

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tggattgagt taatgttggg gattttgttt tttttg 36

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tacgaattac cgaatcccct ccg 23

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cggagggaaa tttggtttc 19

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gacacaaaac gcctaatc 18

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ggttttgggg agaagtgtga ttgtagttg 29

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aaccgacgcc acctattctc a 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

taaaaattcg gtttgcgttc 20

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gaccctctac gctatacg 18

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tggtttgtgt ttgtttaagt agtgggg 27

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

acatctccat atacaaaccc cgctact 27

<210> 31

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gggttcgtta cgtttgg 17

<210> 32

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgacccgaaa cgaaaa 16

<210> 33

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tgttatgttt ggtgtgttga gtaggtttg 29

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cgaccgaacc tactcaacgc 20

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gcgttgaagt cggggttcg 19

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ccgattaaac ccgtacttc 19

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ttggggtttg ttttgtggtt tcgtttggtt tgt 33

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cgctaacaaa cgcgaaccga 20

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gggagtttga gtttattga 19

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gatacgcaac gcgttaacac g 21

<210> 41

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

cacattaaca cactccaacc aaatacaacc ctt 33

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

cgcccaacga ataccaactc c 21

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gcgtttagtt cggtatttgt t 21

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cgcaaaaacg aacgaacg 18

<210> 45

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

tgtttagttt ggtatttgtt tttttagtgt tgttg 35

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

cgcgaacgac gcgaatccga a 21

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

tttaggtaat tagacggacg 20

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

acgcctaaat acaacaac 18

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gatggatgtg gtgggtttgt ttttg 25

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tccaacgcct cgctactatt aacc 24

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tacggtttcg tttggttcg 19

<210> 52

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

cacgtctacg aattcccac 19

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

tgtttggttt gtggtgtttg tttgtttgtg 30

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

cgtaaacgac gccgaacttt aacc 24

<210> 55

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

gcgtttgttt gtttgcg 17

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

tctacgaatt cccacccg 18

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

tgtttggttt gtggtgtttg tttgtttgtg 30

<210> 58

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

cgtaaacgac gccgaacttt aaccc 25

<210> 59

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

ggtcgttggt tgtggc 16

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

gaactatacc tacaaccccg 20

<210> 61

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

tgttggttgt ggtgggtgag tgttg 25

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

cccgcgacct cgaacgtaac g 21

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

ttcgggtatt cggtttag 18

<210> 64

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

cctacaaaac gcatccaa 18

<210> 65

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

tgggtatttg gtttagtttg gttgtgtgtt tg 32

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

cgaaacgccg aaatcccgaa a 21

<210> 67

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

cgttgtaata agacgttgtt c 21

<210> 68

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ccactactcc cgaaactc 18

<210> 69

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

tgttgtttgt tgtttttaag gtgagtgtg 29

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

aactcccgca actcaaacgc 20

<210> 71

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

cgcgtcgttt cgtaaaag 18

<210> 72

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

cccgaacaaa cgtctaaa 18

<210> 73

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

tgttttgtaa aagttttttg tttatatttt tgggtttttg 40

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

cgacctaacg ccgtccgata 20

<210> 75

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

cggcgtagtt atagcgcgg 19

<210> 76

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

ccgaactccc ctaaacgact aaa 23

<210> 77

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

agttatagtg tggagttgtg gtgtttattg gtt 33

<210> 78

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

tacaaaatta cacgccgatt aacaactccg 30

<210> 79

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

cgtaggagga ggaagcg 17

<210> 80

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

gcacacgaat ccgaaac 17

<210> 81

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

ggaggaagtg agtgtttttg agttttgag 29

<210> 82

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

aataccgcaa cgattacgac tcaaactcg 29

<210> 83

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

cgagtttgag tcgtaatcgt tg 22

<210> 84

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

caaccaaaac aaaacgaaac c 21

<210> 85

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

tgtaattgtt gtggtatttt gttttggatt tgtg 34

<210> 86

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

aacgctcgac gcaacccgcg c 21

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

cgcgattcgt tgtttattag 20

<210> 88

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

caccttcgaa atccgaaa 18

<210> 89

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

aaaatccaaa ataatcccat ccaactacac attaac 36

<210> 90

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

cgcgttaacc gcgaaatccg acataat 27

<210> 91

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

tagcgtattt tcgtttcgc 19

<210> 92

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

cgaacttcga aaataaatac taaac 25

<210> 93

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

tttgttttgt gttaggttta tttgtagggt tt 32

<210> 94

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

aactactacg accgcgaacg ta 22

<210> 95

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

ggcggggagg tagtag 16

<210> 96

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

ccgaaacgac gttcatatct a 21

<210> 97

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

tggggaggta gtaggtgtgg gagtg 25

<210> 98

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

ctactcctac gcccgctccc 20

<210> 99

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

gtgtgtttgc ggatttgta 19

<210> 100

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

acgacgttca tatctaacc 19

<210> 101

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

gtggatttgt agtggtggtg gtggtggtg 29

<210> 102

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

ctactcctac gcccgctccc 20

<210> 103

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

gtgatggagg aggtttagta agt 23

<210> 104

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

ccaataaaac ctactcctcc ctt 23

<210> 105

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims (10)

1.一种用于鉴定胃癌和/或胃息肉的试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒包括用于检测来自受试者的生物样品中生物标志物基因或相应片段的甲基化水平的引物对；

所述引物对用于以经亚硫酸氢盐处理的生物标志物基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

所述生物标志物基因选自CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的用于鉴定胃癌和/或胃息肉的试剂盒，其特征在于：

所述生物标志物基因选自CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的2种或2种以上；

优选地，所述生物标志物基因选自CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的5种或5种以上；

优选地，所述胃癌为胃癌I期或II期时，所述生物标志物基因为DAPK和/或Septin9；

优选地，所述胃癌为腺癌时，所述生物标志物基因为PAX5、SDC2和/或Septin9；

优选地，所述胃癌为粘液腺癌时，所述生物标志物基因为RASSF1A和/或SDC2；

优选地，所述胃癌为未分化癌时，所述生物标志物基因为RNF180和/或TCF4；

优选地，所述胃息肉的生物标志物基因为RUNX3和/或SDC2。

3.根据权利要求1所述的用于鉴定胃癌和/或胃息肉的试剂盒，其特征在于：

所述引物对包括第一引物组、第二引物组、第三引物组、第四引物组、第五引物组、第六引物组、第七引物组、第八引物组、第九引物组、第十引物组、第十一引物组、第十二引物组、第十三引物组、第十四引物组、第十五引物组、第十六引物组、第十七引物组、第十八引物组、第十九引物组、第二十引物组、第二十一引物组、第二十二引物组和第二十三引物组中的一组或多组；每个引物组都包括上游引物、下游引物、封闭引物和探针；

其中，所述第一引物组包括序列表中序列11-14所示的DNA组成的引物；所述第二引物组包括序列表中序列15-18所示的DNA组成的引物；所述第三引物组包括序列表中序列19-22所示的DNA组成的引物；所述第四引物组包括序列表中序列23-26所示的DNA组成的引物；所述第五引物组包括序列表中序列27-30所示的DNA组成的引物；所述第六引物组包括序列表中序列31-34所示的DNA组成的引物；所述第七引物组包括序列表中序列35-38所示的DNA组成的引物；所述第八引物组包括序列表中序列39-42所示的DNA组成的引物；所述第九引物组包括序列表中序列43-46所示的DNA组成的引物；所述第十引物组包括序列表中序列47-50所示的DNA组成的引物；所述第十一引物组包括序列表中序列51-54所示的DNA组成的引物；所述第十二引物组包括序列表中序列55-58所示的DNA组成的引物；所述第十三引物组包括序列表中序列59-62所示的DNA组成的引物；所述第十四引物组包括序列表中序列63-66所示的DNA组成的引物；所述第十五引物组包括序列表中序列67-70所示的DNA组成的引物；所述第十六引物组包括序列表中序列71-74所示的DNA组成的引物；所述第十七引物组包括序列表中序列75-78所示的DNA组成的引物；所述第十八引物组包括序列表中序列79-82所示的DNA组成的引物；所述第十九引物组包括序列表中序列83-86所示的DNA组成的引物；所述第二十引物组包括序列表中序列87-90所示的DNA组成的引物；所述第二十一引物组包括序列表中序列91-94所示的DNA组成的引物；所述第二十二引物组包括序列表中序列95-98所示的DNA组成的引物；所述第二十三引物组包括序列表中序列99-102所示的DNA组成的引物。

4.根据权利要求1所述的用于鉴定胃癌和/或胃息肉的试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒还包括内参基因ACTB引物组，所述内参基因ACTB引物组用于以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的ACTB基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

所述内参基因ACTB引物组包括序列表中序列103-105所示的DNA组成的引物；

优选地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂，所述亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢钠；

优选地，所述试剂盒还包括阐述所述试剂盒使用方法以及以逻辑回归对检测结果进行处理的说明书。

5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒在制备鉴定胃癌和/或胃息肉产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述胃癌和/或胃息肉包括胃癌和/或胃息肉易感性，胃癌和/或胃息肉的存在、进展、亚型和/或分期。

7.一种采用权利要求1-5任一项所述的试剂盒检测CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的一种或多种基因及其片段的甲基化的方法，其特征在于，包括步骤：

S1：采集受试者的生物样品；

S2：采用所述试剂盒检测所述生物样品中生物标志物基因的甲基化水平；其中，所述生物标志物基因选自CDH1、DAPK、PAX5、RASSF1A、Reprimo、RNF180、RUNX3、SDC2、Septin9和TCF4中的一种或多种；

S3：将检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

还包括在所述受试者接受医疗处理后，重复步骤S1和S2，然后将两次获得的甲基化水平检测结果进行比较，以确定所述受试者中胃癌和/或胃息肉的变化情况。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

S1中，所述生物样品选自受试者的血液、血清、血浆、粪便、淋巴、脑脊液、腹水、尿和组织活检中的一种或多种。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

S2中，包括检测所述生物标志物基因内靶区域的甲基化水平的步骤，所述靶区域分别为所述生物标志物基因内至少15个碱基长度的核苷酸序列或其互补序列。