CN113249477A

CN113249477A - 结直肠癌早期诊断的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN113249477A
Application number: CN202110546689.8A
Authority: CN
Inventors: 陈彦利; 李明明; 蒲珏
Original assignee: Beijing Aikelun Medical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Aikelun Medical Technology Co ltd
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2021-08-13

Abstract

本文提供了一种在受试者中早期诊断结直肠癌状态的方法，包括：1)在来自所述受试者的生物样品中检测生物标志物基因BCAT1、SDC2和Septin9的甲基化水平并任选地检测KRAS基因的第二外显子第12或第13号密码子突变；以及2)将1)中检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平结果进行比较，并任选地联合密码子突变检测结果，以确定所述受试者的结直肠癌状态。本文还提供了用于早期诊断结直肠癌状态的试剂盒。本文所提供的方法和试剂盒为结直肠癌的筛查、预测、诊断和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径，也对结直肠癌患者用药治疗具有指导意义。

Description

结直肠癌早期诊断的方法和试剂盒

技术领域

本文涉及利用BCAT1、SDC2、Septin9基因甲基化水平并任选地联合KRAS基因突变来早期诊断结直肠癌状态的方法和试剂盒。

背景技术

结直肠癌是当今最常见的疾病之一，每年全球有约120万名患者被确诊为结直肠癌，而有超过60万名患者直接或间接死于结直肠癌。其在各地区的发病率有显著差异，这与生活饮食有密切联系，其中男性结直肠癌的发病率高于女性。此外，结直肠癌的发病率会随着年龄的增大而增加，比如发达国家的结直肠癌发病中位年龄为70岁。在过去的几十年中，很多国家的结直肠癌生存率都有所提高。尤其是在一些高收入国家，如在美国、澳大利亚、加拿大及一些欧洲国家的结直肠癌5年生存率已经达到了65％以上。但相对的，在一些低收入国家这个值还不到50％。结直肠癌的预计生存期会随着发病年龄的增大而减少。结直肠癌的疾病分期是最重要的预后因素，比如，2001年到2007年间，美国不同分期的结直肠癌患者的5年生存率分别为90.1％(I期)、69.2％(II期和III期)和11.7％(IV期)。

结直肠癌主要是由内镜取出的组织学标本来确诊的。2％-4％的患者在确诊结直肠癌后会被强制性进行完整的结肠镜或CT结肠成像检测来排除其他同步发生的肿瘤。对于直肠癌，诊断时精确的局部分期是必须的，这也是新辅助治疗的重要依据。除了到肛门口的准确距离，肿瘤侵袭的范围也是很重要的。超声内镜检查作为一种非侵入性的检查手段，可以区别肿瘤是否浸润。所以，超声内镜是局部肿瘤分期的可选方法之一。但由于新辅助治疗过程中辐射的影响，不管哪种方法检查的结果都不是百分百可靠。这些诊断技术并没有在很大程度上降低结直肠癌患者的死亡率，因此，如何提高结直肠癌患者的生存率，依赖于结直肠癌的早期诊断，筛选和挖掘有价值的早期结直肠癌的生物学标志物成为亟待解决的问题。由于影像学技术在结直肠癌早期筛查中未能显示出良好的效果，人们开始将目光转移向结直肠癌早期诊断的分子标志物，遗憾的是迄今为止没有发现一个敏感性和特异性较高的分子标志物。近年来结直肠癌表观遗传学研究进展较快，特别是DNA甲基化，研究发现在结直肠癌发生的早期就存在很多特有的肿瘤相关基因出现不同程度的甲基化状态改变，为结直肠癌早期诊断标志物的探索提供了新的契机。

肿瘤发生发展的重要因素是细胞增殖、分化失控、细胞凋亡障碍及血管生成通路异常，是一个多基因改变的积累过程。近年来研究显示KRAS基因活性物与细胞增殖、凋亡之间关系密切。突变KRAS基因使本应该正常死亡的细胞的生存期延长，KRAS基因过度表达还能增加抗药物和紫外光诱导的凋亡，因此对KRAS基因突变的检测将有助于控制肿瘤细胞生长和凋亡制定出有效的治疗方案。大约70％的肿瘤在不同程度上都与KRAS基因第二外显子的第12和第13位密码子突变有关，其它密码子突变不常见，在61位上。该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤。美国国家癌症综合网络(NCCN)2010年版的临床指南4中明确指出，KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。NCCN指出KRAS突变会使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物(西妥昔单抗、帕尼单抗)产生耐药。所以NCCN指出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。NCCN在2020年版的临床指南中也明确指出，伴有任何已知KRAS突变的患者不应该给予西妥昔单抗的治疗。欧盟也明确规定，帕尼单抗的适应症为KRAS野生型的结直肠癌患者。因此KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。

基因组的DNA甲基化异常与肿瘤的发生一直是医学界研究的热点之一，细胞周期、DNA修复、血管生成和凋亡等都涉及到相关基因的甲基化。DNA高甲基化最可能的调控作用是通过抑制关键基因的表达，从而决定该细胞的命运，如对于肿瘤细胞中DNA甲基化异常现象的研究已经在多种肿瘤中取得了许多重大的进展。哺乳动物中，甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶(CpG)，正常细胞中CpG双核苷酸的甲基化分布并不均一，大约50％的基因在启动子区域有CpG集中分布的CpG岛存在，长度0.5～2kb不等，该区域与基因的转录调控有着密切关系。人体某些基因调控区域的CpG岛甲基化在相关癌细胞组织中频繁出现，显示出与某些肿瘤的发病、病程进展和预后、用药敏感性等相关。迄今为止，已在大多数人类肿瘤中发现了基因甲基化异常，研究发现在癌细胞中表观遗传编码发生紊乱，首先表现在DNA甲基化水平紊乱，又称为甲基化重排。由于抑癌基因CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此，DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期诊断。癌症相关基因甲基化也是结直肠癌发生的早期事件，因此相关基因甲基化状态成为早期结直肠癌风险预测有效指标。尽管如此，目前仍缺乏对这些癌症相关基因的甲基化状态进行有效检测并对检测结果进行处理的手段。

当前，消化科肿瘤学领域中迫切需要的是最小侵入性地用于评估和预测结直肠癌状态的临床检测。

发明内容

为了解决上述问题，在一方面，本文提供了在受试者中早期诊断结直肠癌状态的方法，其包括：1)在来自所述受试者的生物样品中检测生物标志物基因BCAT1、SDC2和Septin9的甲基化水平；以及2)将1)中检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，以确定所述受试者的结直肠癌状态。

在一些实施方案中，步骤1)中还包括检测来自所述受试者的生物样品中的KRAS基因的第二外显子第12或第13号密码子突变，并且步骤2)中包括将所述甲基化水平与所述突变联合来确定所述受试者的结直肠癌状态。

在一些实施方案中，所述第二外显子第12或第13号密码子突变为G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C或G13D突变。

在一些实施方案中，所述结直肠癌状态包括结直肠癌的存在、分型、分期和/或分级。

在一些实施方案中，步骤1)中包括从所述生物样品提取DNA并以亚硫酸氢盐处理，使得所述DNA中的未甲基化胞嘧啶残基脱氨基，而甲基化的胞嘧啶残基保持不变，接着使用甲基化特异性引物对以所述生物标志物基因或其片段为模板进行扩增反应来确定所述甲基化水平。

在一些实施方案中，步骤1)中用于BCAT1基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQ ID NO：8和9或引物SEQ ID NO：12和13；用于SDC2基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQ ID NO：16和17或引物SEQ ID NO：20和21；用于Septin9基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQ ID NO：24和25或引物SEQ ID NO：28和29。

在一些实施方案中，步骤1)中检测KRAS基因的第二外显子第12或第13号密码子突变包括使用引物组合进行扩增反应，所述引物组合包括：用于检测G12D突变的正向引物SEQID NO：35或36；用于检测G12A突变的正向引物SEQ ID NO：37或38；用于检测G12V突变的正向引物SEQ ID NO：39或40；用于检测G12S突变的正向引物SEQ ID NO：41或42；用于检测G12R突变的正向引物SEQ ID NO：33或44；用于检测G12C突变的正向引物SEQ ID NO：45或56；用于检测G13D突变的正向引物SEQ ID NO：47或48；以及通用反向引物SEQ ID NO：49。

在一些实施方案中，步骤1)中还包括利用引物对SEQ ID NO：1和2和/或SEQ IDNO：32和33对内参基因ACTB进行检测。

在一些实施方案中，步骤2)中确定所述受试者的结直肠癌状态是根据所述生物标志物基因的甲基化水平通过逻辑回归进行的，或步骤2)中确定所述受试者的结直肠癌状态是根据所述生物标志物基因的甲基化水平联合所述第二外显子第12或第13号密码子突变通过逻辑回归进行的。

在一些实施方案中，所述生物样品选自所述受试者的血液、血清、血浆、粪便、淋巴、脑脊液、腹水、尿和活检组织。

另一方面，本文提供了在受试者中早期诊断结直肠癌状态的试剂盒，包括用于检测来自所述受试者的生物样品中生物标志物基因BCAT1、SDC2和Septin9的甲基化水平的试剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测来自所述受试者的生物样品中的KRAS基因的第二外显子第12或第13号密码子突变的试剂。

在一些实施方案中，用于检测甲基化水平的所述试剂包括用于通过扩增反应来确定所述甲基化水平的甲基化特异性引物对以及任选的亚硫酸氢盐。

在一些实施方案中，用于BCAT1基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQ IDNO：8和9或引物SEQ ID NO：12和13；用于SDC2基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQID NO：16和17或引物SEQ ID NO：20和21；用于Septin9基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQ ID NO：24和25或引物SEQ ID NO：28和29。

在一些实施方案中，用于检测来自所述受试者的生物样品中的KRAS基因的第二外显子第12或第13号密码子突变的试剂包括用于通过扩增反应来检测所述突变的引物组合。

在一些实施方案中，所述引物组合包括：用于检测G12D突变的正向引物SEQ IDNO：35或36；用于检测G12A突变的正向引物SEQ ID NO：37或38；用于检测G12V突变的正向引物SEQ ID NO：39或40；用于检测G12S突变的正向引物SEQ ID NO：41或42；用于检测G12R突变的正向引物SEQ ID NO：33或44；用于检测G12C突变的正向引物SEQ ID NO：45或56；用于检测G13D突变的正向引物SEQ ID NO：47或48；以及通用反向引物SEQ ID NO：49。

在一些实施方案中，上述试剂盒还包括阐述以逻辑回归对所述甲基化水平的检测结果进行处理以确定所述结直肠癌状态的说明书，或者阐述以逻辑回归对所述甲基化水平和所述突变的检测结果进行处理以确定所述结直肠癌状态的说明书。

本文所提供的方法和试剂盒为早期结直肠癌的筛查、预测、诊断、和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径。

附图简要说明

图1显示了“BCAT1+SDC2+Septin9”组合的受试者工作特征(ROC)曲线。

图2显示了“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合的受试者工作特征(ROC)曲线。

具体实施方式

除非另有说明，本申请中使用的技术术语具有本发明所属领域技术人员所通常理解的含义。

本文在一方面涉及鉴定受试者中早期结直肠癌状态的方法，其包括以下步骤：1)从所述受试者采集生物样品；2)检测所述生物样品中生物标志物基因的甲基化水平；以及3)将所述甲基化水平与群体中正常甲基化水平进行比较，以确定所述受试者是否患有结直肠癌或结直肠癌状态，其中所述生物标志物基因为BCAT1(Branched Chain Amino acidTransaminase 1)、SDC2(Syndecan 2)和Septin9基因。在优选的实施方案中，还包括检测所述受试者是否具有KRAS基因突变，并将该KRAS基因突变与上述甲基化水平的检测结果结合，用于确定所述受试者的结直肠癌状态。优选地，该KRAS基因突变KRAS基因第二外显子第12、13号密码子突变，包括G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型。

这里所用的术语“甲基化水平”指受试者生物样品中特定基因或其基因片段被甲基化的程度，既可以是定性(即是否存在甲基化)的，也可以是定量的。对于单条DNA序列而言，甲基化水平可以是该DNA序列中被甲基化位点与全部可甲基化位点的比值。更普遍地，例如对于生物样品中的特定基因或基因片段(通常数量众多)来说，该甲基化水平可以是特定甲基化位点被甲基化的程度，例如该位点具有甲基化的基因片段与含有该位点的全部基因片段的比值。对于关注基因的特定位点(例如位于启动子区域内)的甲基化而言，甲基化水平也通常具有后者的含义。就本文的目的而言，在一个具体实例中，例如通过采用甲基化特异性引物对通过扩增反应(例如PCR扩增反应)对生物样品中的目的基因片段的“甲基化水平”进行检测时，甲基化水平可以为扩增反应的Ct值，或者是经内参基因校正后的Ct值。

这里所用的术语“基因突变”指相对于野生型基因而言，来自受试者的生物样品中的该相应基因存在序列差异。在本文中，我们关注的KRAS基因突变为KRAS基因第二外显子第12或13号密码子突变，包括G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型。在这里，我们以氨基酸变化来指代编码核苷酸序列中的相应核苷酸改变(见背景技术中的说明)。对于将该突变用于结直肠癌状态的判断来说，即可以利用其定性检测结果，也可以采用其定量检测结果(即突变水平或突变频率)。在优选的实施方案中，将该突变的突变水平(例如以PCR扩增反应中获得的Ct值表示)与上述甲基化水平联合来确定结直肠癌状态。

这里所用的术语“受试者”指患有或者怀疑患有某种疾病的个体(优选人)，或者，在预测易感性时“受试者”也可包括健康个体。该术语通常可以和与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。

这里所用的术语“群体”一般指健康人群。在提及特定疾病(如结直肠癌)时，“群体”也可以包括不患有该特定疾病但可能患有其它疾病(例如肠炎、息肉、腺瘤等)的个体。另外，还可以根据年龄、性别、健康状况、是否吸烟等特征仅选择部分个体来作为“群体”。群体中基因“野生型”和群体中“正常甲基化水平”可以通过对足够多的个体进行检测而得到，或者可以在已有的临床文献中找到。野生型指无所述基因突变。在一些情况下，正常甲基化水平指无甲基化。

在一些实施方案中，可以根据受试者中所述生物标志物的甲基化水平来鉴定该受试者中是否患有结直肠癌或结直肠癌状态。在更优选的实施方案中，可以根据受试者中所述生物标志物的甲基化水平以及KRAS基因突变来鉴定该受试者中是否患有结直肠癌或结直肠癌状态。在一些实施方案中，可通过与内参基因的检测值进行比较来消除样品间差异(例如样品量、浓度等)。

在本发明的方法中，还可以基于所述结直肠癌的分期来安排对受试者的治疗，例如，包括对受试者进行更多的测试、进行外科手术、进行药物治疗以及不采取进一步的行动。

在一些实施方案中，对KRAS基因突变的检测包括从生物样本中提取DNA，随后使用能特异性扩增基因突变位点的引物对进行PCR扩增反应。在一些实施方案中，对甲基化水平的检测包括从生物样品中提取DNA，并以亚硫酸氢盐处理，随后使用甲基化特异的引物对进行PCR扩增反应。其中亚硫酸氢盐处理造成DNA双链分子中未甲基化的胞嘧啶残基脱氨基，成为尿嘧啶；而甲基化的胞嘧啶残基保持不变。这样，在随后的PCR扩增反应中，模板上甲基化的胞嘧啶残基位点作为胞嘧啶残基与引物中的鸟嘌呤残基配对，而未甲基化的胞嘧啶残基位点作为尿嘧啶残基与引物中的腺嘌呤残基配对。

发明人针对KRAS基因突变的检测设计了多个引物对，以检测KRAS基因靶区域的突变，其中所述靶区域为覆盖突变位点的选自SEQ ID NO：4所示序列中连续的至少15个碱基长度的片段；而所述引物对中至少一个引物(例如正向引物)的核酸序列等同、互补或杂交于上述靶区域。本文提供的检测KRAS基因突变的引物对是针对特定位点突变设计的特异性引物对，当KRAS基因的靶区域(靶位点)未突变时，所用引物对不能在PCR扩增反应中与作为模板的靶区域(靶位点)有效地配对结合，不能生成扩增产物，即没有突变的野生型理论上不会有扩增。而当KRAS基因的靶区域(靶位点)突变时，所用的引物对能够在PCR扩增反应中与作为模板的靶区域(靶位点)有效地配对结合，从而生成扩增产物。

发明人针对生物标志物基因的甲基化检测也设计了多个引物对，以检测每种生物标志物基因内靶区域的甲基化水平，其中所述靶区域分别选自SEQ ID NO：1-3(分别对应BCAT1、SDC2和Septin9 DNA序列)所示序列中连续的至少15个碱基长度的片段；而所述引物对的核酸序列分别等同、互补或杂交于上述靶区域。本文提供检测甲基化水平的引物对利用甲基化差异来检测生物标志物基因内靶区域的甲基化水平，当所述生物标志物基因的靶区域未甲基化时，所用的引物对不能在PCR扩增反应中与作为模板的靶区域(经亚硫酸氢盐处理)有效地配对结合，不能(或极少)生成扩增产物；而当所述生物标志物基因的靶基因被甲基化时，所用的引物对能够在PCR扩增反应中与作为模板的靶区域(经亚硫酸氢盐处理)有效地配对结合，从而生成扩增产物。这种扩增反应的差异可以在扩增反应进行过程中实时监测，或者可以通过检测扩增产物来判断。本发明人经过多次试验，筛选出了针对所述生物标志物基因的多个引物对(见下文)，它们单独或者联合使用，可帮助鉴定所述受试者是否患有结直肠癌。

本文在提及检测甲基化水平时会使用术语“生物标志物基因或其片段”，是由于在PCR扩增反应中，所用的引物对在模板的选择上并不会区分是整个基因还是其片段，只要模板的长度不小于待扩增区域的长度即可(事实上，在提取DNA以及随后的亚硫酸氢盐处理过程中，通常会导致基因断裂成不同大小的片段)。

在一些优选实施方案中，可利用特异引物对和Taqman探针对DNA模板进行PCR扩增反应，可特异性地区分一个碱基差异的突变，以检测基因突变。

在一些优选的实施方案中，在检测基因突变时，还使用了封闭引物。封闭引物在核苷酸序列上设计为与相应引物对所扩增区域内的一段模板序列配对结合。封闭引物可以在3’-OH引入化学修饰，导致DNA聚合酶无法扩增，该化学修饰例如为C3间臂(C3 Spacer)、C6间臂(C6 Spacer)、反转3’末端(inverted 3’end)、3’磷酸(3’P)等。在本发明方法的一些实施方案中，将封闭引物的核苷酸序列设计为与KRAS基因野生型的模板结合，而不与任一位点突变型的模板结合。封闭引物的使用，可以有效降低检测基因位点突变时的非特异扩增。

在一些优选实施方案中，本发明使用HeavyMethyl方法测量标志物基因甲基化，除了设计普通Taqman引物外，也设计了封闭引物。封闭引物在核苷酸序列上设计为与相应引物对所扩增区域内的一段模板序列配对结合。封闭引物可以在3’-OH引入化学修饰，导致DNA聚合酶无法扩增，该化学修饰例如为C3间臂(C3 Spacer)、C6间臂(C6 Spacer)、反转3’末端(inverted 3’end)、3’磷酸(3’P)等。在本发明方法的实施方案中，将封闭引物的核苷酸序列设计为与未甲基化的模板(经亚硫酸盐处理)结合，而不与甲基化的模板(经亚硫酸盐处理)结合。因而，在封闭引物所对应的区域内没有发生甲基化时，其可阻止相应扩增反应进行，从而提高本发明甲基化检测方法的特异性。

在优选的实施方案中，还包括利用荧光探针来实时监测和/或定量PCR扩增反应。所用探针5’端报告荧光基团可以为FAM、JOE、TET、HEX、Cy3、Texas Red、Rox、或Cy5；3’端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、或MGB。

本发明方法中对KRAS基因的基因突变的检测包括检测该基因中是否存在突变、以及对该突变进行定量和定性检测。类似地，本发明方法中对所述生物标志物基因的甲基化水平的检测包括检测所述生物标志物基因中是否存在甲基化、以及对该甲基化进行定量和定性检测。

所述生物样品选自提取自受试者的流体或组织，包括血液、血清、血浆、粪便、淋巴、脑脊液、腹水、尿和组织活检等，优选血浆、血清和粪便。

在本发明的方法中，还可以考虑受试者的年龄，用来预测所述受试者是否患有结直肠癌。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括提供结直肠癌预测的书面报告或电子报告的步骤，并且任选地，所述报告包括关于受试者中结直肠癌存在与否或其可能性或者关于受试者结直肠癌的等级化风险的预测。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括为医师建立KRAS基因突变和生物标志物基因甲基化相对水平的报告和通过邮寄、传真、邮箱等传输这样的报告。在一个实施方案中，通过互联网传输包含KRAS基因突变和生物标志物基因甲基化水平的报告的数据流。

在一些实施方案中，采用统计学方法根据生物标志物基因的甲基化水平以及更优选地还基于KRAS基因突变来构建诊断模型。所述统计方法可以选自以下方法：多元线性回归，查找表、决策树、支持向量机、Probit回归、逻辑回归、聚类分析、邻域分析、遗传算法、贝叶斯和非贝叶斯方法等。

在另一些实施方案中，本文还提供了基于KRAS基因突变和生物标志物基因甲基化水平的预测或诊断模型。所述模型可以是软件代码、计算机可读格式的形式或书面说明的形式。

利用本发明的方法可得到新的且重要的额外信息，其协助医师对患者患结直肠癌的风险进行分级并计划接下来将采取的诊断步骤。本文提供的方法类似地还可用于评估无症状高风险患者中的结直肠癌风险，以及对于一般群体用作筛查工具。考虑本发明的方法可被临床医师用作其它预测性和诊断性指标的全面评估的一部分。

本发明的方法可用于评估现有化学治疗剂和候选化学治疗剂以及其它类型癌症治疗手段的治疗效力。例如，可以在受试者治疗前后或者在治疗期间从所述受试者取得生物样品，并且按上文进行KRAS基因突变和生物标志物基因甲基化水平的检测，通过检测结果鉴定所述受试者中癌症状态的变化，从而确定所述治疗效力。

本发明的方法还可用于鉴定受试者是否潜在地正在发生癌症。在随时间取自受试者的生物样品中检测KRAS基因突变和生物标志物基因甲基化相对水平，从而将指向癌症特征的KRAS基因突变和生物标志物甲基化水平改变解释为朝发生癌症方向进展。

所述生物标志物基因的组合以及任选地联合KRAS基因突变提供了用于在结直肠癌进展不同分期中预测结直肠癌存在或检测结直肠癌的敏感、特异且准确的手段。对所述生物样品中甲基化水平以及任选地KRAS基因突变的检测也可与患者的恶性肿瘤前或临床前病症的存在具有相关性。因此，所公开的方法可用于预测或检测样品中结直肠癌的存在、结直肠肿瘤的良性或恶性、结直肠癌的转移可能性、与结直肠癌有关的赘生物的组织学类型、癌症的无痛性或攻击性，以及与筛查、预防、诊断、表征和治疗患者结直肠癌有关的其它结直肠癌特征。

本发明的方法可用于评估候选药物抑制结直肠癌的效力，评估结直肠癌疗法的效力，监测结直肠癌的进展，选择抑制结直肠癌癌的药剂或疗法，监测结直肠癌患者的治疗，监测患者中结直肠癌的抑制状况，以及通过检测测试化合物暴露后测试动物内KRAS基因突变和生物标志物基因的甲基化水平，来评估测试化合物的致癌潜力。

本发明还提供了用于结直肠癌早期诊断的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包括用于检测来自受试者的生物样品中生物标志物基因(即BCAT1、SDC2和Septin9)的甲基化水平的试剂，例如检测至少一段核苷酸序列甲基化的甲基化特异性引物对(见下文说明)。在优选的实施方案中，该试剂盒还包括用于检测来自受试者的生物样品中的KRAS基因是否存在第二外显子第12或第13号密码子突变(包括G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型)的试剂，例如能够与突变后基因或其片段结合的特异性引物对(见下文说明)。

在一些实施方案中，该试剂盒还可包括与上述引物对联合使用的封闭引物和探针(上文和下文有对这些封闭引物和探针的说明)。

在一些实施方案中，该试剂盒还可包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂。DNA提取试剂可包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。裂解缓冲液通常由蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。结合缓冲液通常由蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B：清洗缓冲液A由蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、去垢剂、pH缓冲剂和乙醇组成；清洗缓冲液B由核酸酶抑制剂、pH缓冲剂和乙醇组成。洗脱缓冲液通常由核酸酶抑制剂和pH缓冲剂组成。所述蛋白变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍和尿素中的一种或多种；去垢剂选自Tween20、IGEPAL CA-630、Triton X-100、NP-40和SDS中的一种或多种；pH缓冲剂选自Tris、硼酸、磷酸盐、MES和HEPES中的一种或多种；核酸酶抑制剂选自EDTA、EGTA和DEPC中的一种或多种。亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液。其中，亚硫酸氢盐选自重亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵和亚硫酸铵中的一种或多种；保护缓冲液由氧自由基清除剂组成，氧自由基清除剂选自对苯二酚、维生素E、维生素E衍生物、没食子酸、Trolox、三羟基苯甲酸和三羟基苯甲酸衍生物中的一种或几种。

在一些实施方案中，该试剂盒还可包括使用说明书。在一些实施方案中，该说明书阐述如何使用试剂盒提取生物样品DNA和以亚硫酸氢盐试剂处理DNA。在一些实施方案中，该说明书还阐如何使用试剂盒内试剂测量受试者中KRAS基因突变和/或生物标志物基因甲基化水平。在一些实施方案中，该说明书还阐述如何使用该试剂盒来确定受试者是否患有结直肠癌或结直肠癌状态，包括利用统计学模型例如逻辑回归模型来分析检测结果。

本发明还保护利用所述试剂盒检测KRAS基因或其片段的基因突变的方法，包括如下步骤：采用DNA提取试剂提取生物样品内的DNA，以处理后的DNA为模板，利用所提供的引物对来检测基因突变。本发明还保护利用所述试剂盒检测生物标志物基因或其片段的甲基化水平的方法，包括如下步骤：采用DNA提取试剂提取生物样品内的DNA，将提取得到的DNA采用亚硫酸氢盐试剂进行处理；以及以处理后的DNA为模板，利用所提供的引物对来检测生物标志物基因甲基化水平。

所述KRAS基因突变或甲基化水平测量方法可选自以下方法中一种或多种：实时荧光PCR、数字PCR、重亚硫酸盐测序、甲基化特异性PCR、限制性内切酶分析法、高分辨溶解曲线技术、基因芯片技术和飞行时间质谱。

以下通过实施例来进一步描述本发明。

实施例1：DNA提取

DNA提取试剂由裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液组成。裂解缓冲液由蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。结合缓冲液由蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B，清洗缓冲液A由蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、去垢剂、pH缓冲剂和乙醇组成；清洗缓冲液B由核酸酶抑制剂、pH缓冲剂和乙醇组成。洗脱缓冲液由核酸酶抑制剂和pH缓冲剂组成。其中蛋白变性剂为：盐酸胍；去垢剂为：Tween20；pH缓冲剂为：Tris-HCl；核酸酶抑制剂为：EDTA。

本实施例以结直肠癌患者血浆样品为例，提取血浆DNA。提取方法包括如下步骤：

(1)取1mL血浆，加入相同体积的裂解缓冲液，再加入蛋白酶K和Carrier RNA，使其终浓度分别为100mg/L和1μg/mL，震荡混匀，55℃温育30min；

(2)加入100μL磁珠(购自Life technologies公司，货号：37002D)，振荡孵育1小时；

(3)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(4)加入1mL清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；

(5)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；

(6)加入1mL清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；

(7)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(8)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；

(9)将装有磁珠的离心管开盖放置在55℃的金属浴上，晾干10min；

(10)加入100μL洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；

(11)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记；

(12)洗脱后的DNA存放于4℃冰箱待用，或者保存于-20℃冰箱长期保存。

实施例2：亚硫酸氢盐处理DNA

亚硫酸氢盐处理DNA是采用亚硫酸氢盐试剂进行处理，亚硫酸氢盐试剂由亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液组成；亚硫酸氢盐缓冲液为亚硫酸氢钠和水的混合液体；保护缓冲液为氧自由基清除剂对苯二酚和水的混合液体。

本实施例以实施例1提取得到的DNA为处理对象，采用亚硫酸氢盐处理DNA，具体步骤包括：

(1)配制亚硫酸氢盐缓冲液：称取1g亚硫酸氢钠粉末，加水配制成3M缓冲液；

(2)配制保护缓冲液：称取1g对苯二酚试剂，加水配置成0.5M保护缓冲液；

(3)将100μL DNA溶液、200μL亚硫酸氢盐缓冲液和50μL保护液混合，震荡混合均匀；

(4)热循环：95℃5min，80℃60min，4℃10min；

(5)将1mL DNA结合缓冲液加入到亚硫酸氢盐处理后的DNA溶液中，再加入50μL磁珠，震荡孵育1h；

(6)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(7)加入0.5mL清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；

(8)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；

(9)加入0.5mL清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；

(10)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(11)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；

(12)将装有磁珠的离心管放置在55℃的金属浴上，开盖晾干10min；

(13)加入50μL洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；

(14)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记。

实施例3：实时荧光PCR检测基因突变和DNA甲基化及引物组验证

本实施例以实时荧光PCR为例测量生物标志物基因的甲基化水平和基因突变。其中，检测基因突变的基因为KRAS基因第二外显子第12、13号密码子突变(包括G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型)，内参基因为ACTB；其中检测甲基化生物标志物基因为BCAT1、SDC2和Septin9，内参基因为ACTB。本实施例中所述基因突变的检测采用实施例1所提取的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增；本实施例中所述甲基化水平的检测采用实施例2经过亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增。待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照均进行3个复孔检测。

对于KRAS突变(包括G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型)和BCAT1、SDC2和Septin9基因甲基化，可以设计很多套引物和探针的组合，而每一套探针引物组合的性能可能存在差别，所以需要通过实验进行验证。

我们针对KRAS突变(包括G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型)和BCAT1、SDC2和Septin9基因甲基化设计了多种引物和探针，其分别等同于、互补于或杂交于序列表的序列1-4所示的序列的至少15个核苷酸及其互补序列；再用突变型和野生型核酸序列作为模板验证检测基因突变的引物和探针的有效性，用甲基化和非甲基化核酸序列作为模板验证检测甲基化引物和探针的有效性。我们通过实时荧光PCR扩增结果筛选出以下最佳的引物组和内参基因ACTB的引物组(ACTB引物组分别为用于检测基因突变的引物组和用于检测甲基化水平的引物组，另外，下述甲基化引物组中引物1均为正向引物，所述引物2均为反向引物)：

内参基因ACTB引物组(用于检测甲基化)

引物1：SEQ ID NO：5:5’-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’

引物2：SEQ ID NO：6:5’-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTT-3’

探针：SEQ ID NO：7:5’-Cy5-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ3-3’

BCAT1引物组1

引物1：SEQ ID NO：8:5’-ATGTAATTCGTTAGGTCGC-3’

引物2：SEQ ID NO：9:5’-AATACCCGAAACGACGACG-3’

封闭引物：SEQ ID NO：10:5’-ATTTGTTAGGTTGTGAGTTTTTGTTGTGAGAG-C3-3’

探针：SEQ ID NO：11:5’-Texas Red-CGACCCTCTCGCGACGAA-BHQ2-3’

BCAT1引物组2

引物1：SEQ ID NO：12:5’-TATTGTTTCGTCGGTTACG-3’

引物2：SEQ ID NO：13:5’-CCAAATCTTACTACAACCG-3’

封闭引物：SEQ ID NO：14:5’-TGTTGGTTATGAGGGAAGTTTGAGTTGAGTG-C3-3’

探针：SEQ ID NO：15:5’-Texas Red-GCGCTCTACAACCGCAAACCC-BHQ2-3’

SDC2引物组1

引物1：SEQ ID NO：16：5’-CGGCGTAGTTATAGCGCG-3’

引物2：SEQ ID NO：17：5’-GAACTCCCCTAAACGACTAA-3’

封闭引物：SEQ ID NO；18：5’-AGTTATAGTGTGGAGTTGTGGTGTTTATTGGTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO：19：5’-HEX-AATTACACGCCGATTAACAACTCCG-BHQ1-3’

SDC2引物组2

引物1：SEQ ID NO：20：5’-CGTAGGAGGAGGAAGCG-3’

引物2：SEQ ID NO：21：5’-GCACACGAATCCGAAAC-3’

封闭引物：SEQ ID NO：22：5’-GGAGGAAGTGAGTGTTTTTGAGTTTTGAG-C3-3’

探针：SEQ ID NO：23：5’-HEX-AATACCGCAACGATTACGACTCAAACTCG-BHQ1-3’

Septin9引物组1

引物1：SEQ ID NO：24:5'-CGATTCGTTGTTTATTAG-3’

引物2：SEQ ID NO：25:5'-ACCTTCGAAATCCGAAA-3

封闭引物：SEQ ID NO：26:5'-AAAATCCAAAATAATCCCATCCAACTACACATTAAC-C3-3’探针：SEQ ID NO：27:5'-FAM-GCGTTAACCGCGAAATCCGACA-BHQ1-3’

Septin9引物物2

引物1：SEQ ID NO：28:5'-AGCGTATTTTCGTTTCGC-3’

引物2：SEQ ID NO：29:5'-CGAACTTCGAAAATAAATACT-3

封闭引物：SEQ ID NO：30:5'-TTTGTTTTGTGTTAGGTTTATTTGTAGGGTTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO：31:5'-FAM-AACTACTACGACCGCGAACGTA-BHQ1-3’

内参基因ACTB引物组(用于检测基因突变)

引物1：SEQ ID NO：32:5'-CCAGGTCATCACCATCG-3’

引物2：SEQ ID NO：33:5'-CAGGATTCCATGCCTGA-3’

探针：SEQ ID NO：34:5'-Cy5-CCGACTGAGCTTCCGCTGTG-BHQ3-3’

KRAS-G12D突变型正向引物1SEQ ID NO：35:5'-GTGGTAGTTGGAGCTGA-3'

KRAS-G12D突变型正向引物2SEQ ID NO：36:5'-GTGGTAGTTGGAGCCGA-3'

KRAS-G12A突变型正向引物1SEQ ID NO：37:5'-GTGGTAGTTGGAGCTGC-3'

KRAS-G12A突变型正向引物2SEQ ID NO：38:5'-GTGGTAGTTGGAGCAGC-3'

KRAS-G12V突变型正向引物1SEQ ID NO：39:5'-GTGGTAGTTGGAGCTGT-3'

KRAS-G12V突变型正向引物2SEQ ID NO：40:5'-GTGGTAGTTGGAGCGGT-3'

KRAS-G12S突变型正向引物1SEQ ID NO：41:5'-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3'

KRAS-G12S突变型正向引物2SEQ ID NO：42:5'-CTTGTGGTAGTTGGAGGTA-3'

KRAS-G12R突变型正向引物1SEQ ID NO：43:5'-CTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3'

KRAS-G12R突变型正向引物2SEQ ID NO：44:5'-CTTGTGGTAGTTGGAGGTC-3'

KRAS-G12C突变型正向引物1SEQ ID NO：45:5'-CTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3'

KRAS-G12C突变型正向引物2SEQ ID NO：46:5'-CTTGTGGTAGTTGGAGGTT-3'

KRAS-G13D突变型正向引物1SEQ ID NO：47:5'-GTAGTTGGAGCTGGTGA-3'

KRAS-G13D突变型正向引物2SEQ ID NO：48:5'-GTAGTTGGAGCTGGCGA-3'

KRAS通用反向引物SEQ ID NO：49:5'-CCTCTTGACCTGCTGTG-3'

KRAS通用探针SEQ ID NO：50：5'-FAM-AGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-BHQ1-3'

KRAS通用封闭引物SEQ ID NO：51：5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTA-C3-3’

多组引物和探针均能区分突变型和野生型模板或甲基化和非甲基化模板，分别可以作为检测KRAS突变(包括G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型)和检测BCAT1、SDC2和Septin9基因甲基化的引物和探针。虽然不同的引物和探针组合效果略有不同，但是以上引物和探针分别适用于KRAS突变(包括G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型)检测和BCAT1、SDC2和Septin9基因的甲基化检测。下表1和表2显示了采用各个引物和探针组合对上述基因的甲基化和非甲基化模板(经亚硫酸氢盐处理)或突变型和野生型模板的检测结果。显然，所设计的各个引物和探针组合是对于甲基化模板是高度特异性的。

表1所设计的引物组对甲基化和非甲基化DNA模板的检测结果(Ct，均值)

表2所设计的引物组对突变和野生型DNA模板的检测结果(Ct，均值)

实施例4：试剂盒检测结直肠癌患者、非结直肠癌人群(含良性病症患者、其他类型癌症干扰人群和健康人群)血浆的灵敏度和特异性

使用来自病理学上确定结直肠癌的患者的740个样本(“病例组”)和确定为非结直肠癌的患者的752个样品(“对照组”)，对照组包含271例肠炎患者、203个病理确定为非癌结直肠息肉患者、208个病理确定为非癌结直肠腺瘤患者、其他类型样本70例(具体地，含32例结直肠健康无异常样本和38例其他癌症：20例胃癌、10例食管癌、8例肝癌)(见表3)，所有样本都收集自中国人民解放军海军总医院。病例组的结直肠癌样品包括疾病的所有分期和常见分型。结直肠癌患者都是通过内镜、影像学及病理学诊断确诊的，样本分期基于国际TNM分期标准，样本分型依据组织活检及免疫组化方法确定。对照组样本包括在整个研究群体中看到的良性病症的常见类型和一些其他类型癌症干扰样本和一些结直肠健康无异常样本。在外科手术后得到完整临床病理学报告，包括患者年龄、吸烟史、人种、分期、分型并且对每个样品编码收集地点。

表3所采集样本对象的结直肠癌分期以及其它特征

对于KRAS(包括G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型)基因突变的检测，用实施例1的DNA提取方法提取DNA，再利用实施例3中提供的引物和探针组合混合物(对于每个突变位点均采用正向引物2、通用反向引物、通用探针和通用封闭引物)进行实时荧光PCR实验，因此只检测KRAS的7个常见突变位点是否突变，而不区分具体突变位点，同时检测内参基因ACTB，最后得出对照组和病例组样本中KRAS基因突变的三个复孔的平均Ct值。如上文实施例3所描述的，可以通过该Ct值反映基因是否发生基因突变。检测KRAS基因突变的引物混合物包含以下成分：

内参基因ACTB引物组(用于检测基因突变)

引物1：SEQ ID NO：32:5'-CCAGGTCATCACCATCG-3’

引物2：SEQ ID NO：33:5'-CAGGATTCCATGCCTGA-3’

探针：SEQ ID NO：34:5'-Cy5-CCGACTGAGCTTCCGCTGTG-BHQ3-3’

KRAS-G12D突变型正向引物2SEQ ID NO：36:5'-GTGGTAGTTGGAGCCGA-3'

KRAS-G12A突变型正向引物2SEQ ID NO：38:5'-GTGGTAGTTGGAGCAGC-3'

KRAS-G12V突变型正向引物2SEQ ID NO：40:5'-GTGGTAGTTGGAGCGGT-3'

KRAS-G12S突变型正向引物2SEQ ID NO：42:5'-CTTGTGGTAGTTGGAGGTA-3'

KRAS-G12R突变型正向引物2SEQ ID NO：44:5'-CTTGTGGTAGTTGGAGGTC-3'

KRAS-G12C突变型正向引物2SEQ ID NO：46:5'-CTTGTGGTAGTTGGAGGTT-3'

KRAS-G13D突变型正向引物2SEQ ID NO：48:5'-GTAGTTGGAGCTGGCGA-3'

KRAS通用反向引物SEQ ID NO：49:5'-CCTCTTGACCTGCTGTG-3'

KRAS通用探针SEQ ID NO：50：5'-FAM-AGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-BHQ1-3'

KRAS通用封闭引物SEQ ID NO：51：5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTA-C3-3’

对于BCAT1、SDC2和Septin9基因甲基化的检测，用实施例1的DNA提取方法提取DNA然后采用实施例2的方法用亚硫酸氢盐处理DNA模板，再利用实施例3中提供的引物和探针组合混合物(针对每个生物标志物基因都采用引物组1)进行实时荧光PCR实验，检测BCAT1、SDC2和Septin9基因的甲基化，同时检测内参基因ACTB，最后得出对照组和病例组样本中各个基因的三个复孔的平均Ct值。如上文实施例3所描述的，可以通过该Ct值反映各基因的甲基化水平。所述检测BCAT1、SDC2和Septin9基因甲基化的引物混合物包含以下成分：

内参基因ACTB引物组(用于检测甲基化)

引物1：SEQ ID NO 5:5’-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3’

引物2：SEQ ID NO 6:5’-CCAATAAAACCTACTCCTCCCTT-3’

探针：SEQ ID NO 7:5’-Cy5-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ3-3’

BCAT1引物组1

引物1：SEQ ID NO 8:5’-ATGTAATTCGTTAGGTCGC-3’

引物2：SEQ ID NO 9:5’-AATACCCGAAACGACGACG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 10:5’-ATTTGTTAGGTTGTGAGTTTTTGTTGTGAGAG-C3-3’

探针：SEQ ID NO 11:5’-Texas Red-CGACCCTCTCGCGACGAA-BHQ2-3’

SDC2引物组1

引物1：SEQ ID NO 16：5’-CGGCGTAGTTATAGCGCG-3’

引物2：SEQ ID NO 17：5’-GAACTCCCCTAAACGACTAA-3’

封闭引物：SEQ ID NO 18：5’-AGTTATAGTGTGGAGTTGTGGTGTTTATTGGTT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 19：5’-HEX-AATTACACGCCGATTAACAACTCCG-BHQ1-3’

Septin9引物组1

引物1：SEQ ID NO 24:5'-CGATTCGTTGTTTATTAG-3’

引物2：SEQ ID NO 25:5'-ACCTTCGAAATCCGAAA-3

封闭引物：SEQ ID NO 26:5'-AAAATCCAAAATAATCCCATCCAACTACACATTAAC-C3-3’

探针：SEQ ID NO 27:5'-FAM-GCGTTAACCGCGAAATCCGACA-BHQ1-3’

使用可商购软件包(IBM SPSS Statistics 24和MedCalc11.4.2.0，分别购自IBM和MedCalc)进行血浆生物标志物水平的描述性统计、受试者工作特征(ROC)曲线和图形展示。使用非参数Kruskal-Wallis检验(ANOVA)，然后使用Dunn's多重比较后检验确定了统计学差异。对于所有的统计学比较，P值<0.05视为统计学显著。

所研究样本如表3所示共1492例样本，病例组包括病理学上确定为结直肠癌的患者740例，包含常见结直肠癌分型和各分期的患者。对照组为确定为非结直肠癌的患者的752个样品，对照组包含271例肠炎患者、203个病理确定为非癌结直肠息肉患者、208个病理确定为非癌结直肠腺瘤患者、其他类型样本70例(具体地，含32例结直肠健康无异常样本和38例其他癌症：20例胃癌、10例食管癌、8例肝癌)。所研究样本类型为血浆，使用实时荧光PCR测定，检测上述1492例样本中KRAS突变(包括但不区分G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型)和BCAT1、SDC2和Septin9基因的甲基化水平。为了有助于确定这些生物标志物基因区分症状相似的癌症与良性结直肠疾病的能力，所有样品从相同的临床群体(基于存在结直肠息肉进行外科手术的患者)中得到。在任何介入之前和已知疾病状态之前就收集所有的样品。随后通过离体组织的病理学检查来确定疾病状态。使用单一的样品收集方案来收集血浆，监测顺从性。这确保了样品质量并且消除了样品集合中的任何收集、加工和生物偏倚的可能性。这些样本显示，患结直肠癌的个体中的平均患者年龄(59.73岁)比患良性病症或健康无异常(55.12岁)的那些个体高，并且有随疾病表现的分期进展而增加的趋势(表3)。总体上，结直肠癌分型的分布与人群中所有结直肠癌病例所见分布相类似，其中腺癌的比例(72.70％)比其它分型的结直肠癌高。研究中的非结直肠癌对照代表常见良性结直肠疾病，包括肠炎、肠息肉、腺瘤等，还包括一些其他类型癌症的干扰样本和一些健康无异常样本。

多标志物诊断模型需要使用统计分析方法进行，以下以逻辑回归模型为例构建基因突变和/或甲基化基因标志物诊断模型来检测结直肠癌。逻辑回归模型的训练通过如下方式进行：将样本分成病例组和对照组，然后使用IBM SPSS Statistics 24软件来优化回归系数。对于每种标志物都有一个回归系数，加上一个偏差参数，使得逻辑回归模型用于训练数据的似然性最大化。训练后，回归系数集合就限定了逻辑回归模型。通过将生物标志物的基因突变和/或甲基化水平放入逻辑回归方程中，本领域技术人员可容易地使用这种类型的诊断模型来预测任何新样品鉴定为病例或对照的可能性。

发明人对比了两种不同的多标志物组合，分别构建逻辑回归模型，通过对比得到更优组合。其中一种为3个标志物组合“BCAT1+SDC2+Septin9”，即检测所述甲基化生物标志物基因BCAT1、SDC2和Septin9的甲基化水平，将检测得到的BCAT1、SDC2、Septin9三个标志物甲基化的Ct值通过SPSS Statistics 24软件拟合逻辑回归方程，再用MedCalc11.4.2.0绘制受试者工作特征(ROC)曲线确定最佳分界值，以确定所述受试者是否患有结直肠癌。另一种为4个标志物组合“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”，即同时检测所述KRAS基因第二外显子第12、13号密码子突变(包括但不区分G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型)和所述甲基化生物标志物基因BCAT1、SDC2和Septin9的甲基化水平，将检测得到的KRAS突变的Ct值和检测得到的BCAT1、SDC2、Septin9三个标志物甲基化的Ct值通过SPSSStatistics24软件拟合逻辑回归方程，再用MedCalc11.4.2.0绘制受试者工作特征(ROC)曲线确定最佳分界值，以确定所述受试者是否患有结直肠癌。

对于这两种组合方法，分别使用MedCalc11.4.2.0软件，选择95％置信区间，产生ROC曲线并且计算其曲线下面积(AUC)值。相对于对照组人群，病例组样本中两种组合方法AUC均大于0.9(P值＜0.05)，“BCAT1+SDC2+Septin9”和“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合AUC分别为0.953和0.980，可见“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”优于“BCAT1+SDC2+Septin9”。(见图1、图2和表4)。

表4两种标志物组合受试者工作特征(ROC)曲线分析的曲线下面积(AUC)

为了评价两种标志物组合对结直肠癌的不同分期(特别是早期)的鉴定的灵敏度，比较了两种组合在各分期特别是早期(标志物检测最重要时期)样品中的灵敏度。结果显示在表5和表6中。从结果可知，“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合优于“BCAT1+SDC2+Septin9”组合，且随着结直肠癌分期增加，两组合灵敏度都呈增加趋势，“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合诊断I期、II期灵敏度达到95％以上，对早期结直肠癌诊断效果好。

表5“BCAT1+SDC2+Septin9”组合在不同结直肠癌分期中的灵敏度

项目	I期	II期	III期	IV期	总数
						入组病例	181	179	208	172	740
假阴性分布	31	29	16	13	89
						灵敏度	82.87％	83.80％	92.31％	92.44％	87.97％

表6“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合在不同结直肠癌分期中的灵敏度

项目	I期	II期	III期	IV期	总数
						入组病例	181	179	208	172	740
假阴性分布	8	7	6	4	25
						灵敏度	95.58％	96.09％	97.12％	97.67％	96.62％

为了评价两种标志物组合对结直肠癌的不同分型(特别是占比较高的腺癌)的鉴定的灵敏度，比较了两种组合在各常见分型尤其是腺癌样本中的灵敏度。结果显示在表7和表8中。可见“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合优于“BCAT1+SDC2+Septin9”组合。

表7“BCAT1+SDC2+Septin9”组合在不同结直肠癌分型中的灵敏度

项目	腺癌	黏液腺癌	印戒细胞癌	其他类型肠癌	总数
						入组病例	538	126	52	24	740
假阴性	62	17	6	4	89
						灵敏度	88.48％	86.51％	88.46％	83.33％	87.97％

表8“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合在不同结直肠癌分型中的灵敏度

项目	腺癌	黏液腺癌	印戒细胞癌	其他类型肠癌	总数
						入组病例	538	126	52	24	740
假阴性	13	6	4	2	25
						灵敏度	97.58％	95.24％	92.31％	91.67％	96.62％

为了评价两种标志物组合对对照组非结直肠癌人群鉴定的特异性，研究样本包括结直肠常见疾病如肠炎、息肉、腺瘤等，还包括一些其他对照样本(其它类型癌症干扰样本和一些健康无异常的样本)，比较了两种组合在非结直肠癌尤其是容易与结直肠癌相混淆的疾病或其他癌症样本中的特异性。结果显示在表9和表10中。从结果可知，“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合优于“BCAT1+SDC2+Septin9”组合，且对结直肠息肉、腺瘤诊断特异性都在95％以上，可以很好的区分良性的息肉腺癌和早期结直肠癌。

表9“BCAT1+SDC2+Septin9”组合在对照样本中的特异性

良性	肠炎	息肉	腺瘤	其他	总数
						样本量	271	203	208	70	752
符合	12	8	9	3	32
						符合率	95.57％	96.06％	95.67％	95.71％	95.74％

表10“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合在对照样本中的特异性

良性	肠炎	息肉	腺瘤	其他	总数
						样本量	271	203	208	70	752
符合	9	5	5	2	21
						符合率	96.68％	97.54％	97.60％	97.14％	97.21％

为了评价两种标志物组合对结直肠癌的不同分化级别(特别是低级别和未分化)的鉴定的灵敏度，比较了两种组合在各分化级别尤其是低级别和未分化样本中的灵敏度。结果显示在表11和12中，可见“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合优于“BCAT1+SDC2+Septin9”组合，且随结直肠癌分化程度升高，灵敏度呈升高趋势。

表11“BCAT1+SDC2+Septin9”组合在不同结直肠癌分化级别中的灵敏度

表12“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合在不同结直肠癌分期中的灵敏度

上述2种标志物组合AUC均大于0.90。通过在固定特异性值下确定模型的灵敏度和在固定灵敏度值下确定模型的特异性来进一步比较两种组合模型。结果显示在表13和14中，可见“BCAT1+SDC2+Septin9+KRAS”组合优于“BCAT1+SDC2+Septin9”组合。

表13 3种标志物组合和4种标志物组合的逻辑回归模型在重要特异性阈值时的灵敏度

表14 3种标志物组合和4种标志物组合的逻辑回归模型在重要灵敏度阈值时的特异性

需要指出的是，本实施例提供的基因突变检测结果是采用针对各个突变位点的正向引物2、通用反向引物、通用探针和通用封闭引物混合物一起得到的，但采用本文提供的另外正向引物1、通用反向引物、通用探针和通用封闭引物混合物检测，得到类似的检测结果(数据未示出)。本实施例提供的甲基化水平检测结果是采用针对各个生物标志物基因的引物组1得到的，但采用本文提供的另外引物组2，得到类似的检测结果(数据未示出)。

本发明提供的技术方案，通过联合检测KRAS突变(包括但不区分G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型)和BCAT1、SDC2和Septin9基因甲基化，使得结直肠癌检测的灵敏度和特异性得到了提高，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。并且，通过检测样本中的KRAS突变(包括但不区分G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C、G13D等7种常见突变类型)和BCAT1、SDC2和Septin9基因甲基化水平，利用逻辑回归方程分析，快速、便捷地判断样本是否呈阳性及风险值，提供了一种快速的检测结直肠癌的试剂盒。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，因此其均应涵盖在本发明说明书的范围中。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京艾克伦医疗科技有限公司

<120> 结直肠癌早期诊断的方法和试剂盒

<130> 21110CI

<160> 51

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 786

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

cgttcccaaa agcgaatgtg aaaaagtccg agaaggcacg tcctgcgagt ggaggttaaa 60

ccgaaatctg aacagaatgc acggtccccg caaactacga ttgataaaga agatactgag 120

acgtttgcgg gggatataag ccatggttgt ctcgccttcc tcccctccct gccaactatg 180

tttcttggag aaatcgccgg ttcgattcac gcacacattt ttgtaaaaca cggacaaaac 240

cataagtagt taccttcatt gttccgtcgg ccacgaggga agctcgagct gagcggaggg 300

cagatcccaa gggtcgtagc ccctggccgt gtggaccggg tctgcggctg cagagcgcgg 360

tcccggctgc agcaagacct ggggcagtgc ccgaggcggc ggcgagtaca cgtggcgggc 420

tggattgcag accggccctc tcgcggcgga gactcgcgac ctagcggatt gcatcagcag 480

gaagacacta aggctgctcc cccaggccgc ccccagatgg tggagtctct cccagcccga 540

agattcggag ccagcgccca gacccgagcc tcactcactg ctcactcccg gggtgcaggg 600

cagaggtgcc agtgttgcaa gcaaatgaca cggttacccc cgaatcagcc actgtgggtg 660

cgtatccgag tgtggggatg cccgtgtaac atttatatgg agacgtcaag gaggaggaaa 720

taaacagatc agaggtcaaa tgtgattgcc attccgtcat cactggctcc tgcccacctc 780

cctact 786

<210> 2

<211> 828

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

cggtgagcag agccggcgca gccacagcgc ggagccgcgg cgcccactgg tcctcggagc 60

tgccaatcgg cgtgtaatcc tgtaggaatt tctcccgggt ttatctggga gtcacactgc 120

cgcctcctct ccccagtcgc ccaggggagc ccggagaagc aggctcagga gggagggagc 180

cagaggaaaa gaagaggagg agaaggagga ggacccgggg agggaggcgc ggcgcgggag 240

gaggaggggc gcagccgcgg agccagtggc cccgcttgga cgcgctgctc tccagatacc 300

cccggagctc cagccgcgcg gatcgcgcgc tcccgccgct ctgcccctaa acttctgccg 360

tagctccctt tcaagccagc gaatttattc cttaaaacca gaaactgaac ctcggcacgg 420

gaaaggagtc cgcggaggag caaaaccaca gcagagcaag aagagcttca gagagcagcc 480

ttcccggagc accaactccg tgtcgggagt gcagaaacca acaagtgaga gggcgccgcg 540

ttcccggggc gcagctgcgg gcggcgggag caggcgcagg aggaggaagc gagcgccccc 600

gagccccgag cccgagtccc cgagcctgag ccgcaatcgc tgcggtactc tgctccggat 660

tcgtgtgcgc gggctgcgcc gagcgctggg caggaggctt cgttttgccc tggttgcaag 720

cagcggctgg gagcagccgg tccctgggga atatgcggcg cgcgtggatc ctgctcacct 780

tgggcttggt ggcctgcgtg tcggcggagt cggtgagtgg gccaggcg 828

<210> 3

<211> 572

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

cggtgcgggt gcgggaacct gatccgcccg ggaggcgggg gcggggcggg ggcgcagcgc 60

gcggggaggg gccggcgccc gccttcctcc cccattcatt cagctgagcc agggggccta 120

ggggctcctc cggcggctag ctctgcactg caggagcgcg ggcgcggcgc cccagccagc 180

gcgcagggcc cgggccccgc cgggggcgct tcctcgccgc tgccctccgc gcgacccgct 240

gcccaccagc catcatgtcg gaccccgcgg tcaacgcgca gctggatggg atcatttcgg 300

acttcgaagg tgggtgctgg gctggctgct gcggccgcgg acgtgctgga gaggaccctg 360

cgggtgggcc tggcgcggga cgggggtgcg ctgaggggag acgggagtgc gctgagggga 420

gacgggaccc ctaatccagg cgccctcccg ctgagagcgc cgcgcgcccc cggccccgtg 480

cccgcgccgc ctacgtgggg gaccctgtta ggggcacccg cgtagaccct gcgcgccctc 540

acaggaccct gtgctcgttc tgcgcactgc cg 572

<210> 4

<211> 570

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag agagtggagg atgcttttta tacattggtg 480

agagagatcc gacaatacag attgaaaaaa atcagcaaag aagaaaagac tcctggctgt 540

gtgaaaatta aaaaatgcat tataatgtaa 570

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

gtgatggagg aggtttagta agt 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

ccaataaaac ctactcctcc ctt 23

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 7

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 8

atgtaattcg ttaggtcgc 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 9

aatacccgaa acgacgacg 19

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 10

atttgttagg ttgtgagttt ttgttgtgag ag 32

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 11

cgaccctctc gcgacgaa 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 12

tattgtttcg tcggttacg 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 13

ccaaatctta ctacaaccg 19

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 14

tgttggttat gagggaagtt tgagttgagt g 31

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 15

gcgctctaca accgcaaacc c 21

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 16

cggcgtagtt atagcgcg 18

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 17

gaactcccct aaacgactaa 20

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 18

agttatagtg tggagttgtg gtgtttattg gtt 33

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 19

aattacacgc cgattaacaa ctccg 25

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 20

cgtaggagga ggaagcg 17

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 21

gcacacgaat ccgaaac 17

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 22

ggaggaagtg agtgtttttg agttttgag 29

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 23

aataccgcaa cgattacgac tcaaactcg 29

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 24

cgattcgttg tttattag 18

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 25

accttcgaaa tccgaaa 17

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 26

aaaatccaaa ataatcccat ccaactacac attaac 36

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 27

gcgttaaccg cgaaatccga ca 22

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 28

agcgtatttt cgtttcgc 18

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 29

cgaacttcga aaataaatac t 21

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 30

tttgttttgt gttaggttta tttgtagggt tt 32

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 31

aactactacg accgcgaacg ta 22

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 32

ccaggtcatc accatcg 17

<210> 33

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 33

caggattcca tgcctga 17

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 34

ccgactgagc ttccgctgtg 20

<210> 35

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 35

gtggtagttg gagctga 17

<210> 36

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 36

gtggtagttg gagccga 17

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 37

gtggtagttg gagctgc 17

<210> 38

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 38

gtggtagttg gagcagc 17

<210> 39

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 39

gtggtagttg gagctgt 17

<210> 40

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 40

gtggtagttg gagcggt 17

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 41

cttgtggtag ttggagcta 19

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 42

cttgtggtag ttggaggta 19

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 43

cttgtggtag ttggagctc 19

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 44

cttgtggtag ttggaggtc 19

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 45

cttgtggtag ttggagctt 19

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 46

cttgtggtag ttggaggtt 19

<210> 47

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 47

gtagttggag ctggtga 17

<210> 48

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 48

gtagttggag ctggcga 17

<210> 49

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 49

cctcttgacc tgctgtg 17

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 50

agctgtatcg tcaaggcact cttgc 25

<210> 51

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 51

acttgtggta gttggagctg gtggcgta 28

Claims

1.在受试者中早期诊断结直肠癌状态的方法，包括：

1)在来自所述受试者的生物样品中检测生物标志物基因BCAT1、SDC2和Septin9的甲基化水平；以及

2)将1)中检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，以确定所述受试者的结直肠癌状态。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤1)中还包括检测来自所述受试者的生物样品中的KRAS基因的第二外显子第12或第13号密码子突变，并且步骤2)中包括将所述甲基化水平与所述突变联合来确定所述受试者的结直肠癌状态。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述第二外显子第12或第13号密码子突变为G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C或G13D突变。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述结直肠癌状态包括结直肠癌的存在、分型、分期和/或分级。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤1)中包括从所述生物样品提取DNA并以亚硫酸氢盐处理，使得所述DNA中的未甲基化胞嘧啶残基脱氨基，而甲基化的胞嘧啶残基保持不变，接着使用甲基化特异性引物对以所述生物标志物基因或其片段为模板进行扩增反应来确定所述甲基化水平。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤1)中用于BCAT1基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQ ID NO：8和9或引物SEQ ID NO：12和13；用于SDC2基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQ ID NO：16和17或引物SEQ ID NO：20和21；用于Septin9基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQ ID NO：24和25或引物SEQ ID NO：28和29。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤1)中检测KRAS基因的第二外显子第12或第13号密码子突变包括使用引物组合进行扩增反应，所述引物组合包括：

用于检测G12D突变的正向引物SEQ ID NO：35或36；

用于检测G12A突变的正向引物SEQ ID NO：37或38；

用于检测G12V突变的正向引物SEQ ID NO：39或40；

用于检测G12S突变的正向引物SEQ ID NO：41或42；

用于检测G12R突变的正向引物SEQ ID NO：33或44；

用于检测G12C突变的正向引物SEQ ID NO：45或56；

用于检测G13D突变的正向引物SEQ ID NO：47或48；以及

通用反向引物SEQ ID NO：49。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤1)中还包括利用引物对SEQ ID NO：1和2和/或SEQ ID NO：32和33对内参基因ACTB进行检测。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤2)中确定所述受试者的结直肠癌状态是根据所述生物标志物基因的甲基化水平通过逻辑回归进行的，或步骤2)中确定所述受试者的结直肠癌状态是根据所述生物标志物基因的甲基化水平联合所述第二外显子第12或第13号密码子突变通过逻辑回归进行的。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自所述受试者的血液、血清、血浆、粪便、淋巴、脑脊液、腹水、尿和活检组织。

11.在受试者中早期诊断结直肠癌状态的试剂盒，包括用于检测来自所述受试者的生物样品中生物标志物基因BCAT1、SDC2和Septin9的甲基化水平的试剂。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于检测来自所述受试者的生物样品中的KRAS基因的第二外显子第12或第13号密码子突变的试剂。

13.如权利要求11或12所述的试剂盒，其中所述第二外显子第12或第13号密码子突变为G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C或G13D突变。

14.如权利要求11-13任一项所述的试剂盒，其中用于检测甲基化水平的所述试剂包括用于通过扩增反应来确定所述甲基化水平的甲基化特异性引物对以及任选的亚硫酸氢盐。

15.如权利要求11-14任一项所述的试剂盒，其中用于BCAT1基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQ ID NO：8和9或引物SEQ ID NO：12和13；用于SDC2基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQ ID NO：16和17或引物SEQ ID NO：20和21；用于Septin9基因甲基化水平检测的引物对包括引物SEQ ID NO：24和25或引物SEQ ID NO：28和29。

16.如权利要求11-15任一项所述的试剂盒，其中用于检测来自所述受试者的生物样品中的KRAS基因的第二外显子第12或第13号密码子突变的试剂包括用于通过扩增反应来检测所述突变的引物组合。

17.如权利要求11-16任一项所述的试剂盒，其中所述引物组合包括：

用于检测G12D突变的正向引物SEQ ID NO：35或36；

用于检测G12A突变的正向引物SEQ ID NO：37或38；

用于检测G12V突变的正向引物SEQ ID NO：39或40；

用于检测G12S突变的正向引物SEQ ID NO：41或42；

用于检测G12R突变的正向引物SEQ ID NO：33或44；

用于检测G12C突变的正向引物SEQ ID NO：45或56；

用于检测G13D突变的正向引物SEQ ID NO：47或48；以及

通用反向引物SEQ ID NO：49。

18.如权利要求11-17任一项所述的试剂盒，其中所述生物样品选自所述受试者的血液、血清、血浆、粪便、淋巴、脑脊液、腹水、尿和活检组织。

19.如权利要求11-18任一项所述的试剂盒，还包括阐述以逻辑回归对所述甲基化水平的检测结果进行处理以确定所述结直肠癌状态的说明书，或者阐述以逻辑回归对所述甲基化水平和所述突变的检测结果进行处理以确定所述结直肠癌状态的说明书。

20.如权利要求11-19任一项所述的试剂盒，其中所述结直肠癌状态包括结直肠癌的存在、分型、分期和/或分级。