CN109097471A - 一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法。本发明提供了一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒，所述试剂盒包括核酸分离与纯化试剂，DNA亚硫酸盐转化试剂，KRAS基因突变检测试剂，SDC2和SFRP2基因甲基化检测试剂，粪便隐血检测试剂；其中核酸分离与纯化试剂用于分离及纯化出粪便样本中的人源DNA；DNA亚硫酸盐转化试剂用于将纯化的部分人源DNA进行亚硫酸盐转化，用于后续SDC2和SFRP2基因甲基化水平的检测。本发明检测结直肠癌的灵敏度可达90％以上，特异性85％左右，能够实现结直肠癌的高灵敏度和高特异性检测；本发明能够检测大多数结直肠癌前病变，实现结直肠癌超早期检测，且在用于辅助临床诊断时，可大大降低临床现有方法的漏诊漏检率。

Description

一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物技术及诊断研究领域，更具体的说，它涉及一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法。
背景技术
结直肠癌在世界范围内的发病率和死亡率在所有癌症中分别排名第三位和第四位，每年大概有136万结直肠癌新发病例和69.4万结直肠癌死亡病例。在中国，癌症发病率和死亡率在不断升高，从2010年起，癌症就成了死亡的主要原因。据估计，2015年，中国结直肠癌新发病例达到37.63万，死亡病例达到19.10万，分别排在所有癌症的第五位。结直肠癌主要发生在50岁以上的人群，且年龄越大，患癌风险越高。绝大多数结直肠肿瘤的发展都经历多个阶段，包括一系列组织学、形态学、基因变异的逐渐积累。因此，这就给癌前病变的筛查和检测提供了有利条件，从而实现结直肠癌的超早期检测和早诊早治，降低结直肠癌的发病率和死亡率。
目前有很多结直肠癌筛查方法，它们都具有各自的优势和劣势。比如，肠镜能够实现全结肠的可视化，非常灵敏地检测远端和近端的病变，且在检测的同时去除病变，但它属于侵入性检测，而且需要进行复杂的肠道准备，另外，还伴随肠穿孔以及出血的风险，因此，肠镜检测的依从性比较差。类似的还有乙状结肠镜检查。直肠指检虽然操作简便，但只能了解距肛门8厘米范围内的病变，无法检测肠道远端病变；愈创木脂粪便隐血试验筛查特异性低，存在大量假阳性，且易受含亚铁离子的食物和药物干扰；CEA、CA19-9属于广谱性肿瘤标志物，筛查灵敏度和特异性都不高。
散发性结直肠癌是遗传和表观遗传变异逐渐积累的结果，这些变异累积会导致正常结肠上皮细胞向腺癌转化。研究指出结直肠癌发生过程往往伴随着总体低甲基化以及特定基因启动子区域的超甲基化，这些甲基化水平的变化参与细胞周期调控、DNA修复、细胞凋亡、血管生成、粘附和侵袭。因此，基因甲基化是潜在的结直肠癌标志物，可以用于结直肠癌及癌前病变的筛查。SEPT9甲基化检测是FDA批准的第一个也是唯一的基于血液的结直肠癌筛查方法，进一步证明了基因甲基化用于结直肠癌筛查的有效性。另外，DAVIDA.AHLQUIST开展了一项使用粪便DNA检测结直肠癌和腺瘤的研究。在这项研究中，粪便DNA试验主要检测4个基因(BMP3，NDRG4，TFPI2和波形蛋白)的甲基化水平，KRAS基因突变以及血红蛋白。最终，粪便DNA试验成功检测出85％的结直肠癌患者以及54％的腺瘤(1cm以上)患者，同时特异性高达90％。随后，Thomas F.Imperiale也进行了类似的研究。在研究中，Thomas F.Imperiale主要检测粪便DNA中两个基因(BMP3和NDRG4)的甲基化水平、KRAS突变以及血红蛋白，然后使用这四个肿瘤标志物联合筛查结直肠癌以及癌前病变，同时还比较了这种方法和FIT筛查结直肠癌和癌前病变的效果。该研究总共募集了9989位志愿者，其中包括65名结直肠癌患者以及757名高级癌前病变患者。最终结果显示多靶点粪便DNA试验能够检测92.3％的结直肠癌以及42.4％的高级癌前病变，同时特异性高达86.6％。相比于FIT，多靶点粪便DNA试验检测结直肠癌和癌前病变的效果更好。这项研究表明多靶点粪便DNA试验能够用于在无症状人群中筛查结直肠癌。除了BMP3和NDRG4基因甲基化，粪便DNA中SDC2和SFRP2基因甲基化也能够有效检测结直肠癌。根据文献报道，粪便DNA中SDC2甲基化检测结直肠癌的灵敏度高达90％，检测小息肉的灵敏度为33.3％，特异性高达90.9％；SFRP2基因甲基化检测结直肠癌的灵敏度为71％，特异性为94％。
综上，基于结直肠癌相关基因突变和甲基化标志物的多靶点组合进行结直肠癌和癌前病变的早筛筛查，具有较好的科学研究基础和实际可行性，因此，本发明具有现实可行性和重要的结直肠癌和癌前病变筛查意义。
发明内容
本发明的目的是解决目前结直肠癌筛查方法存在的问题，提供了一种用于检测结直肠癌及癌前病变的试剂盒及其使用方法，通过采集受检者的粪便样本，联合DNA突变和甲基化检测结果和粪便隐血试验结果，检测结直肠癌和癌前病变，具有更高的特异性和灵敏度。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒，所述试剂盒包括核酸分离与纯化试剂，DNA亚硫酸盐转化试剂，KRAS基因突变检测试剂，SDC2和SFRP2基因甲基化检测试剂，粪便隐血检测试剂；其中核酸分离与纯化试剂用于分离及纯化出粪便样本中的人源DNA；DNA亚硫酸盐转化试剂用于将纯化的部分人源DNA进行亚硫酸盐转化，用于后续SDC2和SFRP2基因甲基化水平的检测。
作为优化，所述KRAS基因突变检测试剂包含能够检测KRAS基因7种突变型的试剂；检测试剂含预混试剂、水，以及KRAS基因7种突变形式和内参基因(ACTB)的引物和探针。
作为优化，所述SDC2和SFRP2基因甲基化检测试剂中包含预混试剂、水，以及两种基因和内参基因(GAPDH)的引物和探针，引物和探针的序列如下：
SDC2正向引物：AATAAGTGAGAGGGCGTCGC
SDC2反向引物：AAACTCGAACTCGAAACTCG
SDC2探针：AACGCTCGCTTCCTCCTCCTACGC
SFRP2正向引物：CGCGTTTTAGTCGTCGGTTGTTA
SFRP2反向引物：AACGAAACGACCGAAATTCGAA
SFRP2探针：TATCCCGAACCCGCTCTCTTCGCTA
GAPDH正向引物：GGAGGTAATTAGGATGGTGTGGTT
GAPDH反向引物：CATCRCCCCACTTAATTTTAAAAA
GAPDH探针：TGGGTATATGGTAATTTTGT
作为优化，所述粪便隐血检测试剂包含能够定量检测粪便中血红蛋白水平的试剂。
本发明还提供一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
1)粪便样本采集和处理，采集用于基因突变和甲基化检测以及粪便隐血检测的样本；
2)粪便样本的DNA提取，采用核酸分离与纯化试剂，通过磁珠法分离核酸；
3)分离纯化后的核酸，一部分用于检测KRAS基因突变，另一部分使用重亚硫酸盐进行转化，然后检测样本中的SDC2和SFRP2基因甲基化；
4)粪便隐血检测，使用双抗体夹心CLIA法对样本的血红蛋白进行定量检测。
作为优化，根据各种肿瘤标志物的水平，采用逻辑回归模型，综合判定受检样本的结果，评估受检者是否患结直肠癌或癌前病变；逻辑回归模型中，样本属于低风险(非腺瘤性息肉，慢性结肠炎或正常)的概率为p，属于高风险(结直肠癌或腺瘤性息肉)的概率为1-p，所述逻辑运算公式为：
log(p/(1-p))＝a*△Ct1+b*△Ct2+c*△Ct3+d*FOBT+X
上式中，a，b，c，d，X为常数；△Ct1为KRAS突变和内参基因Ct值差值；△Ct2为SDC2甲基化和内参基因Ct值差值；△Ct3为SFRP2甲基化和内参基因Ct值差值；FOBT为血红蛋白测定值；所述a，b，c，d，X通过大量临床测试数据分布确定；当等式右侧大于0时，等式左侧p大于0.5，样本为低风险，当等式右侧小于0时，等式左侧p小于0.5，样本为高风险。
本发明的有益效果如下：
1、本发明检测结直肠癌的灵敏度可达90％以上，特异性85％左右，能够实现结直肠癌的高灵敏度和高特异性检测；
2、本发明能够检测大多数结直肠癌前病变，实现结直肠癌超早期检测，且在用于辅助临床诊断时，可大大降低临床现有方法的漏诊漏检率；
3、本发明取样方便，无创便捷，不受环境干扰，且能够实现结直肠全覆盖，更适合在大众体检和需要进行结直肠异常疾病筛查的人群中推广。
通过本发明的用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法，可无创便捷的进行结直肠癌及癌前病变的筛查，特异性高，准确度高，可以用于临床作为肿瘤发生的早期预防、筛查的辅助性检测指标。
附图说明
图1：本发明试剂盒的检测流程图。
图2：实施例二中KRAS基因突变检测荧光定量PCR扩增曲线。
图3：实施例三中SDC2、SFRP2甲基化检测的荧光定量PCR扩增曲线。
图4：实施例四中粪便血红蛋白双抗体夹心CLIA检测标准曲线。
图5：基因甲基化检测阴性结果图示。
图6：基因甲基化检测阳性结果图示。
图7：ROC曲线图(高风险vs低风险)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例进行进一步详细说明：如无特殊说明，本发明实施例中所需要的材料、试剂均可市场购得。
实施例一：粪便样本采集及DNA提取
1、粪便样本采集和处理：
人排出粪便后，立即采集5g粪便样品放入采集管中，采集管中装有15ml粪便保存液，充分摇晃采集管，使粪便样品与粪便保存液充分混匀；
试剂名称 15ml体系/份
0.5M EDTA，PH8.0，无菌 3ml
5M NaCl溶液，灭菌 30ul
1M Tris缓冲液，PH7.6 7.5ml
纯化水 4.47ml
2、粪便样本DNA的提取：
(1)细胞沉淀
吸取1ml粪便样本液放入离心管中，吹打混匀，然后在10000rpm条件下离心3分钟，沉淀肠道脱落细胞到管底，保留沉淀，去除上清液；
(2)细胞裂解释放DNA
向步骤(1)的离心管中加入800ul粪便裂解液，在68-75℃条件下温育10分钟，裂解肠道脱落细胞，释放DNA至液体中；
粪便裂解液成分：1％(m/v)CTAB，1M NaCl，0.1％(m/v)Tris，15mM EDTA，0.2M异巯基乙醇；
(3)沉淀杂质
将步骤(2)的离心管在10000rpm条件下离心1分钟，此时肠道脱落细胞已经裂解，DNA已释放到上清液中，沉淀多为杂质，将上清液转移至新的离心管中，除去沉淀杂质，若上清中有残留杂质，则转移时弃去颗粒状杂质；
(4)去杂质纯化DNA
在步骤(3)得到的上清液中加入杂质分离液500ul，彻底混匀5-10分钟，然后在13000rpm条件下离心5-10分钟，液体分为三层，上层即是含有DNA的溶液，杂质已沉淀至中下层，将上层清液转移至新的离心管中，除去中下层沉淀杂质，此步骤中转移上层清液需在生物安全柜中进行，吸取时保留一部分上层清液防止吸到中层白膜；
杂质分离液成分：氯仿；
(5)磁珠结合DNA
向步骤(4)得到的上清液中加入磁珠结合液600ul，磁珠30ul，室温条件下孵育15分钟，得到磁珠混合液；
磁珠结合液成分：异丙醇；
(6)磁珠洗涤及DNA洗脱
将步骤(5)得到的磁珠混合液放置于磁力架上3分钟，待磁珠彻底吸附后使用磁珠洗涤液清洗2次，然后加入200ul磁珠洗脱液，室温洗脱10分钟后置于磁力架上，待磁珠吸附后，吸取洗脱液到新的离心管中，该洗脱液即为含DNA的溶液。
磁珠洗涤液成分为75％-80％乙醇。
磁珠洗脱液成分为无核酸酶水。
实施例二：粪便样本DNA中的KRAS突变检测
1、试剂准备
(1)从冰箱中取出内参基因(ACTB)反应液和KRAS反应液，平衡至室温，充分溶解，快速离心10秒；从4℃冰箱取出PCR反应预混试剂(master mix)，瞬离10秒。PCR预混试剂为商品化的定量PCR反应混合试剂；反应液由探针(专业的探针合成公司合成)、引物(专业的引物合成公司合成)、水组成，KRAS和内参基因(ACTB)各有反应液。探针和引物序列来自文献“Optimized Multiplex Detection of 7KRAS Mutations by Taqman Allele-SpecificqPCR”，具体的探针和引物序列如下：
KRAS：
备注：引物包括针对7个突变的正向引物和一个反向引物，探针5‘端为FAM，3’端为MGB，小写字母表示人为错配；
ACTB：
正向引物：GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT
反向引物：CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
探针：ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA
(2)按照每孔每个样本7.5ul预混试剂(master mix)和6ul反应液分别分装至PCR反应管中。
(3)PCR管转移至样本准备区，剩余反应液放回-20℃±5℃冰箱冷冻避光保存。预混试剂(master mix)放回4℃冰箱，切勿冷冻。
2、样本制备
(1)加样：取2ul待测样本DNA分别加入PCR预混试剂(master mix)和反应液(内参/KRAS)的混合液中，混匀后快速离心10秒。待测样本的基因组DNA推荐浓度为20ng/ul。弱阳性对照和空白对照采取相同的操作。
(2)若PCR反应管内加入DNA后遇临时情况不能立即检测，建议将加好模板的PCR反应管放于2-8℃暂时保存，并在24小时内尽快检测。
3、荧光定量PCR扩增
(1)开机荧光定量QPCR仪，型号为ABI7500，并进行仪器性能自检。
(2)取样本制备区准备好的PCR反应管，放在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序。
(3)设置仪器扩增相关参数，并开始进行PCR扩增。参数如下：50℃，2分钟；95℃，10分钟；10个循环(95℃，20秒；62℃，30秒；70℃，30秒)；40个循环(95℃，15秒；60℃，1分钟，此处采集荧光信号)；40℃，5秒。反应总体系为15ul。KRAS基因—FAM通道采集荧光信号，内参基因—FAM通道采集荧光信号。反应结束后，根据扩增曲线划定合适荧光阈值，得到Ct值。
实施例三：粪便样本人源DNA的甲基化检测
1、亚硫酸盐转化
(1)在2.0ml离心管中加入1ug待处理粪便样本DNA，即实施例一得到的含DNA的溶液，10ng/ul的浓度推荐用量为100ul；
(2)在步骤(1)离心管中加入300ul亚硫酸盐转化溶液、50ul保护溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀，短暂离心；
亚硫酸盐转化溶液为含50％(m/v)亚硫酸氢钠和15％(m/v)亚硫酸钠的水溶液，pH值为5.5；
保护溶液为按200mg：1.5ml比例配置的奎诺二甲基丙烯酸酯与二乙二醇二甲醚的混合液；
(3)将步骤(2)离心管密闭置于恒温振荡孵育器中，95℃静置孵育20分钟；
(4)立即将步骤(3)离心管取出，放置冰上5分钟；
(5)将步骤(4)离心管从冰上取出，颠倒混匀，短暂离心，将离心管置于恒温振荡孵育器中，75℃静置孵育60分钟；
(6)短暂离心步骤(5)反应后的离心管，向其中加入1000ul磁珠结合溶液、100ul混匀的磁珠溶液，涡旋混匀；
磁珠结合液为：含0.1％PEG6000(v/v)、0.1％PEG8000(v/v)、5％氯化钠(m/v)、5mMEDTA(pH8.0)、5mM Tris-HCl(pH7.6)和体积浓度为50％无水乙醇的水溶液，pH7.5；
磁珠溶液为含浓度为50mg/ml纳米磁性颗粒的水溶液，所述纳米磁性颗粒为超顺四氧化三铁，且外表由表面修饰有羟基的二氧化硅包被；
(7)将步骤(6)离心管置于23℃的恒温振荡孵育器中，转速1000rpm，孵育60分钟；
(8)短暂离心离心管，将其置于磁力架5分钟，待磁珠分离后，弃除上清液；
(9)将步骤(8)离心管从磁力架上取下，加入800ul磁珠结合溶液；涡旋混匀重悬磁珠；重复步骤(8)；
磁珠结合液为：含0.2％PEG6000(v/v)、0.2％PEG8000(v/v)、5％氯化钠(m/v)、5mMEDTA(pH8.0)、5mM Tris-HCl(pH7.6)和体积浓度为50％无水乙醇的水溶液，pH7.5；
(10)将步骤(9)离心管从磁力架上取下，加入800ul洗涤液；涡旋混匀后重复步骤(8)；
(11)将步骤(10)离心管从磁力架上取下，加入600ul洗涤液；涡旋混匀后重复(8)步骤；
洗涤液为体积浓度为80％的乙醇水溶液。
(12)短暂离心步骤(11)离心管，将其置于磁力架5分钟，用枪头去除残留液体；
(13)打开步骤(12)离心管管盖，将离心管放置于恒温振荡孵育器中；23℃静置15分钟，待磁珠干燥，不要震荡；
(14)将步骤(13)离心管移至无磁力架上；加入35ul洗脱液；盖好离心管；涡旋混匀重悬磁珠；将离心管放入恒温振荡孵育器中，23℃，1000rpm，孵育10分钟；
洗脱液为无核酸酶水；
(15)短暂离心步骤(14)离心管后，将其置于磁力架2-5分钟，将洗脱液转移至新的无DNase无RNase酶的1.5mL离心管中；-80℃保存备用。
2、使用荧光定量PCR方法检测SDC2、SFRP2基因甲基化水平，以ABI7500设备进行检测，反应总体系为35ul，包括17.5ul PCR预混试剂、2.5ul反应液和15ul重亚硫酸盐转化后DNA。PCR预混试剂为商品化的定量PCR反应混合试剂，反应液由探针(100uM，0.105ul)(专业的探针合成公司合成)、引物(正反引物，100uM，0.315ul*2)(专业的引物合成公司合成)、水(1.765ul)组成，SDC2、SFRP2和内参基因(GAPDH)各有反应液。
SDC2正向引物：AATAAGTGAGAGGGCGTCGC
SDC2反向引物：AAACTCGAACTCGAAACTCG
SDC2探针：AACGCTCGCTTCCTCCTCCTACGC
SFRP2正向引物：CGCGTTTTAGTCGTCGGTTGTTA
SFRP2反向引物：AACGAAACGACCGAAATTCGAA
SFRP2探针：TATCCCGAACCCGCTCTCTTCGCTA
GAPDH正向引物：GGAGGTAATTAGGATGGTGTGGTT
GAPDH反向引物：CATCRCCCCACTTAATTTTAAAAA
GAPDH探针：TGGGTATATGGTAATTTTGT。
反应参数如表1所示：
表1：PCR反应参数
反应结束后，根据扩增曲线设置合适荧光阈值，得到不同通道Ct值。
3、检测结果分析
(1)试剂有效性判定
弱阳性对照：内参基因的VIC通道Ct值≤35；靶基因(SDC2和SFRP2)的FAM通道Ct值≤42；扩增曲线有明显指数增长期；
空白对照：内参基因VIC通道和靶基因(SDC2和SFRP2)的FAM通道无扩增曲线或者扩增曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期。
(2)样本有效性判定
样本检测结果中内参基因Ct值≤35，扩增曲线有明显指数增长期。
(3)单基因甲基化检测结果的判定
表2：结果判定
a.Ct值>42或无Ct值，则该基因甲基化检测结果为阴性，如图5。
b.Ct值≤42，则该基因甲基化检测结果为阳性，如图6。
实施例四：粪便血红蛋白定量检测
试剂盒预处理：
1.从4℃冰箱中取出已配制好的包被液，空白检测板中每孔加入100ul，将检测板放入密封袋内，放置于4℃冰箱中过夜；
注：包被液成分为0.05M碳酸盐缓冲液(ph9.6)100ml+1mg鼠抗人血红蛋白抗体；
2.从4℃冰箱中取出已包被的检测板和封闭液，弃净包被液，加入400ul洗涤液，室温静置1min。2000rpm离心1min弃净洗涤液，每孔加入250ul封闭液，将检测板放入密封袋内，放置于4℃冰箱中过夜；
注：封闭液成分为0.05M碳酸盐缓冲液(ph9.6)100ml+2.0gBSA；
3.从4℃冰箱中取出已包被的检测板，弃净封闭液，加入400ul洗涤液，室温静置1min。2000rpm离心1min弃净洗涤液。将检测板放入密封袋内，-20℃保存待用。
操作步骤：
1.取提取组已分装好的液体保存粪便样品1支，室温化冻，期间可颠倒数次，涡旋混匀。在生物安全柜中操作，用移液器吸取20ul粪便液体，加入180ul ddH2O中，涡旋混匀；
2.离心机6000g离心2min；
3.移液器吸取20ul上清，加入180ul稀释液，涡旋混匀；
注：稀释液成分为0.02M磷酸盐缓冲液(ph7.4PBS)100ml+0.2gBSA；
4.移液器吸取100ul混匀后的稀释溶液，加入样品检测板，用封板覆膜封好，37℃孵育90min；
5.取出样品板，弃去板孔中的液体，每孔加入100ul现配的生物素化鼠抗人HB抗体稀释液(生物素化鼠抗人HB抗体使用稀释液按1:100稀释)，用封板覆膜封好，37℃孵育60min；
6.取出样品板，弃去板孔中的液体，每孔加入400ul现配的洗涤液(浓缩洗涤液使用稀释液按1:20稀释)，静置1min后弃去板孔中液体。重复3次。每孔加入100ul现配的HRP标记亲和素稀释液(HRP标记亲和素使用稀释液按1:100稀释)，用封板覆膜封好，37℃孵育30min；
注：浓缩洗涤液的成分为0.02M磷酸盐缓冲液(ph7.4PBS)100ml+50ul tween-20；
7.打开化学发光免疫分析仪，提前0.5h预热；
8.取出样品板，弃去板孔中的液体，每孔加入400ul现配的洗涤液(浓缩洗涤液使用稀释液按1:20稀释)，静置1min后弃去板孔中液体。重复5次。每孔加入100ul现配的显影液(显色液A和显色液B均稀释50倍后取1：1混匀)，37℃孵育5min；
9.孵育5min后使用化学发光免疫分析仪检测，excel表格中记录RLU读数，根据标准曲线，计算血红蛋白浓度值。
注意事项：
1.洗涤时，先把板孔内液体倾倒干净，再倒转放入板式离心机内，离心30s。
2.每步骤操作都要换枪头，确保试剂加入板孔底部，加液时枪头尖不能触碰到板孔底部。
3.最后测定RLU读数时不能超过10min，测量时间要和所使用的标曲保持一致。
实施例五：最终结果判定
根据各种肿瘤标志物的水平，采用逻辑回归模型，综合判定受检样本的结果，评估受检者是否患结直肠癌或癌前病变；逻辑回归模型中，样本属于低风险(非腺瘤性息肉，慢性结肠炎或正常)的概率为p，属于高风险(结直肠癌或腺瘤性息肉)的概率为1-p，
逻辑运算公式为：
log(p/(1-p))＝a*△Ct1+b*△Ct2+c*△Ct3+d*FOBT+X
上式中，a，b，c，d，X为常数；△Ct1为KRAS和内参基因Ct值差值；△Ct2为SDC2和内参基因Ct值差值；△Ct3为SFRP2和内参基因Ct值差值；FOBT为血红蛋白测定值；a，b，c，d，X通过临床测试数据分布确定；当等式右侧大于0时，等式左侧p大于0.5，样本为低风险，当等式右侧小于0时，等式左侧p小于0.5，样本为高风险。
检测方法的局限性：
a.样本检测结果与样本的收集、处理和保存质量有关，其中任何失误都将导致检测结果的不准确。如果样本处理时未控制好DNA的质量，可能出现假阴性的结果。
b.此结果本仅供参考，不能直接作为确诊结直肠疾病/结直肠癌症的证据，检测结果呈阳性的患者需要进行肠镜检查以确诊。
实施例六：临床样本测试结果
总共收集了38个高风险样本(26个结直肠癌和12个腺瘤)以及13个低风险样本(5个息肉和8个正常/慢性结肠炎)。然后分别检测粪便样本中血红蛋白含量、KRAS突变和两个基因(SDC2和SFRP2)甲基化水平，然后通过实施例五中的逻辑回归模型，对所有临床样本进行分类，最终模型区分高风险样本的灵敏度高达84.2％(32/38)，其中检测结直肠癌的灵敏度高达92.3％，检测腺瘤的灵敏度为66.6％，特异性高达84.6％(11/13)，AUC＝0.879，如图7所示。
表3：实施例六中样本病理信息及模型判定结果
实施例七：KRAS突变检测和SDC2、SFRP2基因甲基化检测重复性测试
在检测重复性测试中，总共做了三个批次，每个批次3例样本，结果显示在基因甲基化检测重复性测试结果中，如表4所示，无论是阳性质控品内参、SDC2和SFRP2还是阴性质控品的内参，其Ct值变异系数都小于5％，符合标准；同时阴性质控品中几个肿瘤标志物均为阴性，符合标准。在KRAS突变检测结果中，如表5所示，无论是阳性质控品还是临床样本，KRAS突变检测的Ct值变异系数都小于5％；同时临床样本内参的Ct值变异系数小于5％，阴性质控品KRAS突变检测结果均为阴性，符合要求。
结论：基因甲基化检测以及KRAS突变检测重复性测试的结果证明现有的实验流程稳定、成熟，结果真实可靠。
表4：基因甲基化检测重复性测试结果
表5：KRAS突变检测重复性测试结果
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域中的普通技术人员来说，在不脱离本发明核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州和壹基因科技有限公司
<120> 一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法
<130> 21-2018-2202
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aataagtgag agggcgtcgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaactcgaac tcgaaactcg 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacgctcgct tcctcctcct acgc 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcgttttag tcgtcggttg tta 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacgaaacga ccgaaattcg aa 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tatcccgaac ccgctctctt cgcta 25
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaggtaatt aggatggtgt ggtt 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catcrcccca cttaatttta aaaa 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgggtatatg gtaattttgt 20

Claims (7)

1.一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸分离与纯化试剂，DNA亚硫酸盐转化试剂，KRAS基因突变检测试剂，SDC2和SFRP2基因甲基化检测试剂，粪便隐血检测试剂；其中核酸分离与纯化试剂用于分离及纯化出粪便样本中的人源DNA；DNA亚硫酸盐转化试剂用于将纯化的人源DNA进行亚硫酸盐转化，用于后续SDC2和SFRP2基因甲基化的检测。
2.根据权利要求1所述的用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒，其特征在于，所述KRAS基因突变检测试剂中包含能够检测KRAS基因7种突变型的试剂；检测试剂含预混试剂、水，以及KRAS基因7种突变形式和内参基因(ACTB)的引物和探针。
3.根据权利要求1所述的用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒，其特征在于，所述SDC2和SFRP2基因甲基化检测试剂中包含预混试剂、水，以及两个基因和内参基因(GAPDH)的引物和探针，其序列分别为：
SDC2正向引物：AATAAGTGAGAGGGCGTCGC
SDC2反向引物：AAACTCGAACTCGAAACTCG
SDC2探针：AACGCTCGCTTCCTCCTCCTACGC
SFRP2正向引物：CGCGTTTTAGTCGTCGGTTGTTA
SFRP2反向引物：AACGAAACGACCGAAATTCGAA
SFRP2探针：TATCCCGAACCCGCTCTCTTCGCTA
GAPDH正向引物：GGAGGTAATTAGGATGGTGTGGTT
GAPDH反向引物：CATCRCCCCACTTAATTTTAAAAA
GAPDH探针：TGGGTATATGGTAATTTTGT。
4.根据权利要求1所述的用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒，其特征在于，所述粪便隐血检测试剂包含能够定量检测粪便中血红蛋白水平的试剂。
5.权利要求1-4任意一项所述的用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
1)粪便样本采集和处理，采集用于基因检测和粪便隐血检测的样本；
2)粪便样本的DNA提取，采用核酸分离与纯化试剂，通过磁珠法分离及纯化出粪便样本中的人源DNA；
3)分离纯化后的人源DNA，一部分使用KRAS基因突变检测试剂检测KRAS基因突变，另一部分使用DNA亚硫酸盐转化试剂进行重亚硫酸盐转化，然后使用SDC2和SFRP2基因甲基化检测试剂检测SDC2和SFRP2基因甲基化水平；
4)粪便隐血检测，使用双抗体夹心CLIA法通过粪便隐血检测试剂对粪便样本的血红蛋白进行定量检测。
6.根据权利要求5所述的用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒的使用方法，其特征在于，根据各种肿瘤标志物的水平，采用逻辑回归模型，综合判定受检样本的结果，评估受检者是否患结直肠癌或癌前病变；逻辑回归模型中，受检样本属于低风险的概率为p，属于高风险的概率为1-p，所述逻辑运算公式为：
log(p/(1-p))＝a*△Ct1+b*△Ct2+c*△Ct3+d*FOBT+X
上式中，a，b，c，d，X为常数；△Ct1为KRAS突变和内参基因Ct值差值；△Ct2为SDC2甲基化和内参基因Ct值差值；△Ct3为SFRP2甲基化和内参基因Ct值差值；FOBT为血红蛋白测定值；所述a，b，c，d，X通过大量临床测试数据分布确定；当等式右侧大于0时，等式左侧p大于0.5，受检样本为低风险，当等式右侧小于0时，等式左侧p小于0.5，受检样本为高风险。
7.根据权利要求6所述的用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述低风险为非腺瘤性息肉，慢性结肠炎或正常；所述高风险为结直肠癌或腺瘤性息肉。
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Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109811056A (zh) * 2019-02-28 2019-05-28 苏州唯善生物科技有限公司 用于结直肠癌及其癌前病变早期诊断、检测或筛查的引物探针组和试剂盒
CN110373470A (zh) * 2019-08-06 2019-10-25 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒
CN110551818A (zh) * 2019-08-14 2019-12-10 苏州唯善生物科技有限公司 一种用于消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的多基因检测引物探针组、试剂盒及其应用
WO2020029567A1 (zh) * 2018-08-06 2020-02-13 上海锐翌生物科技有限公司 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂
CN110923300A (zh) * 2019-11-18 2020-03-27 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种基因甲基化的检测方法和应用
CN111370061A (zh) * 2019-06-20 2020-07-03 深圳思勤医疗科技有限公司 基于蛋白标记物与人工智能的癌症筛查方法
CN111440872A (zh) * 2020-05-07 2020-07-24 杭州和壹基因科技有限公司 一种用于胃癌相关基因甲基化检测的试剂盒及其应用
CN111500730A (zh) * 2020-05-18 2020-08-07 苏州唯善生物科技有限公司 结直肠癌及其癌前病变早期诊断标记物及其应用
WO2021004372A1 (zh) * 2019-07-10 2021-01-14 中山大学 二甲双胍在治疗kras突变型结直肠癌中的应用
WO2021013140A1 (zh) * 2019-07-22 2021-01-28 中南大学 一种双基因监控反应体系、试剂盒及其应用
CN112301124A (zh) * 2019-07-29 2021-02-02 人和未来生物科技（长沙）有限公司 用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒及其使用方法
WO2021159074A1 (en) * 2020-02-06 2021-08-12 Graphene-Dx, Inc. Graphene-based sensor for detecting hemoglobin in a biological sample
CN113249477A (zh) * 2021-05-19 2021-08-13 北京艾克伦医疗科技有限公司 结直肠癌早期诊断的方法和试剂盒
CN115472226A (zh) * 2022-07-04 2022-12-13 上海锐翌生物科技有限公司 建立诊断大肠癌模型的方法、用于分析粪便样本基因的设备和计算机程序
CN116064815A (zh) * 2019-02-14 2023-05-05 博尔诚（北京）科技有限公司 一种食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和/或胰腺癌患癌、癌前筛查组合物及其用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104498615A (zh) * 2015-01-06 2015-04-08 浙江诺辉生物技术有限公司 用于检测kras突变的引物和探针
CN106399570A (zh) * 2016-11-30 2017-02-15 杭州诺辉健康科技有限公司 用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法和检测系统
CN108103195A (zh) * 2018-01-22 2018-06-01 上海酷乐生物科技有限公司 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用
CN108410980A (zh) * 2018-01-22 2018-08-17 深圳华大基因股份有限公司 筛选甲基化pcr检测的目标区域的方法、试剂盒及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104498615A (zh) * 2015-01-06 2015-04-08 浙江诺辉生物技术有限公司 用于检测kras突变的引物和探针
CN106399570A (zh) * 2016-11-30 2017-02-15 杭州诺辉健康科技有限公司 用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法和检测系统
CN108103195A (zh) * 2018-01-22 2018-06-01 上海酷乐生物科技有限公司 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用
CN108410980A (zh) * 2018-01-22 2018-08-17 深圳华大基因股份有限公司 筛选甲基化pcr检测的目标区域的方法、试剂盒及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MINGHAO SUN, ET AL.: ""A novel panel of stool-based DNA biomarkers for early screening of colorectal neoplasms in a Chinese population"", 《J CANCER RES CLIN ONCOL》 *
TAE JEONG OH, ET AL.: ""Feasibility of quantifying SDC2 methylation in stool DNA for early detection of colorectal cancer"", 《CLINICAL EPIGENETICS》 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020029567A1 (zh) * 2018-08-06 2020-02-13 上海锐翌生物科技有限公司 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂
CN116064815A (zh) * 2019-02-14 2023-05-05 博尔诚（北京）科技有限公司 一种食管癌、胃癌、肠癌、肝癌和/或胰腺癌患癌、癌前筛查组合物及其用途
CN109811056A (zh) * 2019-02-28 2019-05-28 苏州唯善生物科技有限公司 用于结直肠癌及其癌前病变早期诊断、检测或筛查的引物探针组和试剂盒
CN111370061A (zh) * 2019-06-20 2020-07-03 深圳思勤医疗科技有限公司 基于蛋白标记物与人工智能的癌症筛查方法
WO2021004372A1 (zh) * 2019-07-10 2021-01-14 中山大学 二甲双胍在治疗kras突变型结直肠癌中的应用
WO2021013140A1 (zh) * 2019-07-22 2021-01-28 中南大学 一种双基因监控反应体系、试剂盒及其应用
CN112301124A (zh) * 2019-07-29 2021-02-02 人和未来生物科技（长沙）有限公司 用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒及其使用方法
CN110373470A (zh) * 2019-08-06 2019-10-25 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒
CN110551818A (zh) * 2019-08-14 2019-12-10 苏州唯善生物科技有限公司 一种用于消化道肿瘤早期诊断、筛查或检测的多基因检测引物探针组、试剂盒及其应用
CN110923300A (zh) * 2019-11-18 2020-03-27 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种基因甲基化的检测方法和应用
WO2021159074A1 (en) * 2020-02-06 2021-08-12 Graphene-Dx, Inc. Graphene-based sensor for detecting hemoglobin in a biological sample
CN111440872A (zh) * 2020-05-07 2020-07-24 杭州和壹基因科技有限公司 一种用于胃癌相关基因甲基化检测的试剂盒及其应用
CN111500730A (zh) * 2020-05-18 2020-08-07 苏州唯善生物科技有限公司 结直肠癌及其癌前病变早期诊断标记物及其应用
CN113249477A (zh) * 2021-05-19 2021-08-13 北京艾克伦医疗科技有限公司 结直肠癌早期诊断的方法和试剂盒
CN115472226A (zh) * 2022-07-04 2022-12-13 上海锐翌生物科技有限公司 建立诊断大肠癌模型的方法、用于分析粪便样本基因的设备和计算机程序

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