CN105699473A - 胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，包括以下步骤：样品收集；纳米磁珠预处理；样品预处理；唾液样品洗脱上样；质谱分析；数据采集；数据分析；建立诊断模型。本发明将WCX结合MALDI-TOF-MS蛋白质学技术在方法学上具有高通量、高敏感性、高特异性优势；分析胃癌与慢性胃炎患者唾液在蛋白质组水平上的差异，发现了23个具有显著性意义的差异蛋白质峰，建立了由4267.09、6564.85、2138.14m/z三个显著差异蛋白峰组成的鉴别诊断模型，经临床回代检验该模型的灵敏度和特异度分别达96％和86％；显示该模型对胃癌和慢性胃炎的鉴别具有较高的诊断效率。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质谱应用技术领域，具体地说，涉及一种胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法。
背景技术
众所周知，胃炎和胃癌的初期临床表现难以鉴别，因此胃癌早期与慢性胃炎的鉴别诊断尤为重要。胃癌诊断的金标准是内镜加活检，但该检查属于侵入性检查，检查时患者普遍痛苦体验强烈，况且大量胃癌患者早期无明显症状，主动就医性差，难以作为胃癌普遍筛查手段；血清胃泌素(PG)水平的检查在胃癌诊断中具有重要作用，但其在人体内的水平受种族和地域的影响较大；B超多用于观察胃的邻近脏器，CT在组织特异性性方面存在不足，对胃粘膜的充血、水肿、浅表隆起或凹陷性病变不敏感。因此，目前仍缺乏能够用于大众人群的胃癌早期筛查方法。
胃癌早期诊断是提高胃癌患者5年生存率的关键。胃癌的发生发展常通过原癌通路，包括HP感染型胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠化生、原位癌等。慢性萎缩性胃炎和胃癌组织基因的表达既有相似性,又有异质性，肿瘤基因表达与癌前状态和癌前病变相关，基因表达的相似性提示慢性萎缩性胃炎与胃癌这两者病理发展的相关性和延续性。HP感染是慢性胃炎和胃癌的共同致病因素,而EBV病毒与HP联合感染，是肠型胃癌的重要危险因素。在慢性萎缩性胃炎患者体内检测到jhp0945，是发展为胃癌的重要分子标志物。胃癌PGⅠ和PGⅠ/Ⅱ水平明显低于萎缩性胃炎组以及慢性胃炎组。JiW等通过检测p53β和Δ133p53两个亚型mRNA分别在慢性浅表性胃炎组织细胞、慢性萎缩性胃炎组织细胞、胃癌组织细胞的表达水平，结果发现慢性浅表性胃炎组织细胞中仅有p53βmRNA表达，慢性萎缩性胃炎组织细胞中同时有p53β和Δ133p53mRNA的表达，胃癌细胞系中没有p53β和Δ133p53mRNA的表达。分别采集25名慢性萎缩性胃炎患者、胃癌患者，以及正常健康人的血清标本，进行蛋白质组学分析，构建并验证胃癌前病变及胃癌的诊断模型，结果其敏感性和特异性均大于65％，高于现有的肿瘤标志物筛查水平。
寻找胃癌的生物标志物是目前研究胃癌早期诊断、分期、治疗靶点、以及预后评估的热点。蛋白质组学技术的发展为唾液生物标志物的发现提供了强大武器。也已发现唾液中含有2300多种蛋白质[2]，利用唾液进行疾病诊断具有无创、微量、易于收集和储存、操作简便快捷、易于被患者接受等明显优势。已有研究证明，唾液中含有HP及HP抗体IgG、KYNA(具有抗结胃癌作用)等180余种生物标志物。唾液蛋白的研究目前多采用的方法，质谱技术是蛋白质组学研究中的前沿技术。
因此，提供一种诊断模型简便、快速、标本用量少，灵敏度高，特异性好的胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型的建立方法，就成为该技术领域急需解决的技术难题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决现有技术对胃癌的检测复杂，检测周期长，灵敏度低，特异性差的问题，提供了一种胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，包括以下步骤：
(1)样品收集；
(2)纳米磁珠预处理；
(3)样品预处理：取出冷冻保存的唾液样品，冰上解冻，所有唾液样品均1次冻融，取5μl所述唾液样品加入10μl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μl的WashBuffer稀释(唾液最终上样量为2.5μl)；
(4)唾液样品洗脱上样：③向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μl预处理后的唾液样品，混匀，置于室温孵育30min，将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；④每管加入100μl的WashBuffer洗脱5min，然后将PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液，再重复步骤④操作一次，以获得较纯的目的蛋白；⑤在PCR管中加入10μl的ElutionBuffer洗脱5min，将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，取5μl上清液移至另一个PCR管中；⑥将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀，至样品颜色发灰，而没有明显的沉淀时，取2μl混合溶液，加样到Au/Steel芯片上，晾干后放入仪器读取；
(5)质谱分析：采用质谱仪读取所述Au/Steel芯片信息，设置激光强度为190，灵敏度为5；
(6)数据采集；
(7)数据分析；
(8)建立诊断模型：用BiomarkerPatternSoftware5.0.2采用决策树算法计算出多个变量变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。
进一步的，所述步骤(1)样品收集的方法为：胃癌组和慢性胃炎组在取材前一天晚上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴中的15ml唾液离心管内，4℃下静置1h后，3000r/min、4℃下离心10min，冰浴上分装在1ml的EP管中，每管200μl，于-80℃冰箱冷冻保存备用。
进一步的，所述步骤(2)纳米磁珠预处理的方法为：①取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管中，置于磁铁上孵育1min，去除上清液；②再加入100μl的WashBuffer洗脱5min，在磁铁上孵育1min，去除上清液，再重复步骤②操作一次，以洗脱干净，去除杂质，这样质谱检测受到干扰的可能性会更少。
进一步的，所述步骤(6)数据采集的方法为：用CiphergenProteinchipSoftware3.2.1软件采集数据，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，收集数据的质荷比范围为2000～25000m/z，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100次，已知多肽标准芯片标准，激光离子流0.5。
进一步的，所述步骤(7)数据分析的方法为：对位于2000～25000m/z峰值，用BiomarkerWizard软件过滤噪音；设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10％为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较所述胃癌组和所述慢性胃炎组唾液蛋白质质谱数据，找出所述胃癌组和所述慢性胃炎组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰。
进一步的，步骤(7)中，所述胃癌与所述慢性胃炎组对比，设置P＜0.05，并选取其中两组蛋白质质谱数据比值比率＞2的差异蛋白，所述胃癌组和慢性胃炎组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰有23个，其中有5个差异蛋白质峰表达下调，18个差异蛋白质峰表达上调，所述23个差异表达蛋白质峰具体如下：
进一步的，步骤(6)所述荷质比范围为2000～15000m/z。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明将WCX结合MALDI-TOF-MS蛋白质学技术在方法学上具有高通量、高敏感性、高特异性优势，其检测的标本可以是血液、尿液、唾液等人体各种体液。
2)本发明应用WCX结合MALDI-TOF-MS技术分析胃癌与慢性胃炎患者唾液在蛋白质组水平上的差异，发现了23个具有显著性意义的差异蛋白质峰，经BiomarkerPatternSoftware5.0.2系统软件筛选、采用决策树算法建立了由4267.09、6564.85、2138.14m/z三个显著差异蛋白峰组成的鉴别诊断模型，经临床回代检验该模型的灵敏度和特异度分别达96％和86％；对所建立的胃癌与慢性胃炎的鉴别诊断模型采用十字交叉法进行验证，结果该模型的灵敏度和特异度分别为89％和75％，显示该模型对胃癌和慢性胃炎的鉴别具有较高的诊断效率。
3)本发明的技术方案说明唾液蛋白质组学无创伤分子诊断方法对于早期鉴别诊断胃癌和慢性胃炎具有重要临床价值，值得进一步深入研究并在临床推广应用。
当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例中胃癌与慢性胃炎组MALDI质谱峰图(m/z＝4267)；
图2为本发明实施例中胃癌与慢性胃炎组MALDI质谱峰图(m/z＝2912)；
图3为本发明实施例中胃癌组与慢性胃炎组无创分子诊断模型树状图；
图4为本发明实施例中诊断模型十字交叉验证的ROC曲线。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例
1病例选择
1.1诊断标准
胃癌与慢性胃炎(包括慢性浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎)的诊断均根据《内科学》的诊断标准。
1.2纳入标准
(1)符合诊断标准，年龄在20-75岁之间；
(2)未经手术和放化疗；
(3)自愿且能够配合参加的受试对象。
以上3项必须全部符合才能纳入。
1.3排除标准
(1)不符合上述诊断标准者；
(2)年龄＜20或＞75岁者；
(3)患有口腔局部及唾液腺的炎症、消化道溃疡、肿瘤及先天性疾病；患有舍格伦综合征、囊性纤维病；患有其他系统严重并发疾病。
1.4质量控制
(1)采用统一诊断标准、统一调查表格、统一调查方法；
(2)调查者在调查时严格按照“标准化”执行，减少调查者偏倚，确保资料的一致性和真实性；
(3)电子胃镜及病理结果均由1月内三级甲等医院诊断。
1.5纳入病例基本资料
本研究自2014年12月-2015年04月共收集符合诊断和纳入标准的胃癌患者57例，全部病例来源于湖南省肿瘤医院胃十二指肠胰腺外科，均经病理检查确诊。患者年龄24-73岁，中位年龄56岁，男39例，女18例，肿瘤类型(低分化腺癌35例，中-低分化腺癌5例，高分化腺癌1例，中分化腺癌2例，其他类型14例)。慢性胃炎28例，为湖南省中医附一院脾胃病科2014年12月-2015年2月住院病人，所有病例均经胃镜检查确诊，患者年龄27-68岁，中位年龄55岁，男19例，女9例，慢性浅表性胃炎26例，慢性萎缩性胃炎2例。该研究方案符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会的批准，受试者在受试前已知情，且获得书面同意。
2实验方法
2.1主要仪器和试剂
蛋白指纹图谱(液体芯片)试剂盒(WCX磁珠、WashBuffer、ElutionBuffer、U9裂解液)及MALDI-TIF-MS(蛋白指纹图谱仪I型)，均为湖州赛尔迪生物医药科技有限公司产品，试剂盒批号为K20150501；dH2O(HPLC级)、CHCA为Sigma公司产品。
2.2样品收集
按照本课题专用临床观察表进行临床观察记录。取材前一天晚上临睡前清水漱口三次(不再进任何食物和药物)，采用非刺激性唾液采集方式，第二天晨起后漱口前空腹取材。由经过培训的课题组专人取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，患者将已经过消毒的无菌小圆柱形棉花含入口中，口腔唾液积聚至一定量后，将该棉花吐入置于冰浴中的15ml唾液离心管内，4℃下静置1h后，3000r/min、4℃下离心10min，冰浴上分装在1ml的EP管中，每管200μl，于-80℃冰箱冷冻保存。实验时取出样本，冰上解冻，所有检测唾液样本均1次冻融。取5μl唾液加入10μl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μl的WashBuffer稀释(唾液最终上样量为2.5μl)。
2.3纳米磁珠预处理
①取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管，置于磁铁上孵育1min(注意避免由于孵育时间过长导致磁珠结块)，去除上清液；②再依次加入100μl的WashBuffer洗脱5min，在磁铁上孵育1min，去除上清液；再重复步骤②操作一次。
2.4唾液样品洗脱上样
①向每个装有纳米磁珠的PCR管中加入100μl处理好的唾液样品，混匀后，置于室温孵育30min，将PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；②每管加入100μl的WashBuffer洗脱5min，然后将PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；再重复步骤②操作一次。③在PCR管中加入10μl的ElutionBuffer洗脱5min(不能少于5min)，将PCR管置于磁铁上孵育1min，取5μl上清液移至另一个PCR管中；④装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA(基质)饱和溶液，充分混匀(混合到样品颜色发灰，而没有明显的沉淀并及时上样)，取2μl混合溶液(1μl唾液样品+1μl基质)加样到Au/Steel芯片上，待干后放入仪器读取。
2.5芯片检测、数据采集和参数设置
采用蛋白指纹图谱仪I型(湖州赛尔迪生物医药科技有限公司)质谱仪读取芯片信息。设置激光强度为190，灵敏度为5，收集数据的质荷比(m/z)范围为2000～25000m/z，优化范围为2000～15000m/z，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100次。已知多肽标准芯片标准(all-in-one)，激光离子流0.5。用CiphergenProteinchipSoftware3.2.1软件自动采集数据，纵坐标为峰强度(蛋白相对含量)，横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。
2.6数据分析
对位于2000～25000m/z峰值，用BiomarkerWizard软件过滤噪音。设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10％为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较2组唾液蛋白质质谱数据(由BiomarkerWizard软件完成)，找出2组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰。用BiomarkerPatternSoftware5.0.2采用决策树算法计算出多个变量(m/z蛋白质质谱峰)变化对两样本的判别价值，确定最佳的筛选模型(即诊断模型)。
3结果
3.1数据分析及建立诊断模型
3.1.1筛选差异蛋白质峰
胃癌组与慢性胃炎组两组共85份唾液标本，经过标准化后，在相对分子质量为2000～25000m/z范围内共检测到371个蛋白质峰，两组比值大于2(胃癌组/慢性胃炎组＞2，或者慢性胃炎组/胃癌组＞2)的共有23个差异蛋白质峰有统计学意义(P＜0.05)(表1)，其中有3个蛋白峰胃癌组表达下调(典型下调图，图1，m/z＝4267)，14个蛋白峰胃癌组表达上调(典型上调图，图2，m/z＝2912)，共有17个差异蛋白质峰有显著差异(P＜0.01)。
表1胃癌与慢性胃炎组之间差异有统计学意义的蛋白质峰
图1和2为不同m/z的胃癌与慢性胃炎组MALDI质谱峰图，图中纵坐标为峰强度(蛋白相对含量)，横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。图1中m/z为4267的峰，上第1、2幅图为胃癌组，下第3、4幅图为慢性胃炎组。与慢性胃炎组相比，胃癌组表达下调。图2中m/z为2912的峰，上第1、2幅图为胃癌组，下第3、4幅图为慢性胃炎组。与慢性胃炎组相比，胃癌组表达上调。
3.1.2建立诊断模型
用BiomarkerPatternSoftware5.0.2采用决策树算法计算出多个变量(m/z蛋白质质谱峰)变化对两样本的判别价值，确定最佳的筛选模型(图3)，最终选定m/z为4267.09、6564.85、2138.14建立胃癌与慢性胃炎组的判别模型，该模型的灵敏度和特异度分别为96％(55/57)和86％(24/28)(见表2)。
表2所建诊断模型对胃癌的诊断效率(临床回代检验结果)
| 组别 | 例数 | 正确诊断(例) | 错误诊断(例) | 正确率(％) |
| 胃癌组 | 57 | 55 | 2 | 96 |
| 慢性胃炎组 | 28 | 24 | 4 | 86 |
如图3所示，当满足条件以下条件之一者：①4268.09m/z≤5.08；②5438.67m/z＞5.08、6564.85＞0.88且2138.14m/z≤7.10则提示为胃癌患者；当满足条件①4268.08m/z＞5.08且6564.85≤0.88；②4267.09m/z＞5.08、6564.85＞0.88且2138.14m/z＞7.10则提示为慢性胃炎患者。M：质谱峰相对强度。
3.2鉴别诊断模型十字交叉验证
对所建立的胃癌与慢性胃炎的诊断模型采用十字交叉法进行验证，结果该模型的灵敏度和特异度分别89％(51/57)和75％(21/28)(见表3)。
表3所建诊断模型对胃癌的诊断效率(十字交叉验证结果)
| 组别 | 例数 | 正确诊断(例) | 错误诊断(例) | 正确率(％) |
| 胃癌组 | 57 | 51 | 6 | 89 |
| 慢性胃炎组 | 28 | 21 | 7 | 75 |
图4为胃癌与慢性胃炎组的诊断模型十字交叉验证的ROC曲线，其中横轴坐标为假阳性率(1-特异度)，纵坐标为真阳性率(灵敏度)。ROC曲线下面积越大，其诊断价值越高。图4中十字交叉验证的ROC曲线值为0.924，进一步的分析验证了所建立模型的准确性。
发明人采用的WCX结合MALDI-TOF-MS蛋白质学技术在方法学上具有高通量、高敏感性、高特异性优势，其检测的标本可以是血液、尿液、唾液等人体各种体液。本研究应用WCX结合MALDI-TOF-MS技术分析胃癌与慢性胃炎患者唾液在蛋白质组水平上的差异，发现了23个具有显著性意义的差异蛋白质峰，经BiomarkerPatternSoftware5.0.2系统软件筛选、采用决策树算法建立了由4267.09、6564.85、2138.14m/z三个显著差异蛋白峰组成的鉴别诊断模型，经临床回代检验该模型的灵敏度和特异度分别达96％和86％；对所建立的胃癌与慢性胃炎的鉴别诊断模型采用十字交叉法进行验证，结果该模型的灵敏度和特异度分别为89％和75％，显示该模型对胃癌和慢性胃炎的鉴别具有较高的诊断效率。本研究结果提示，唾液蛋白质组学无创伤分子诊断方法对于早期鉴别诊断胃癌和慢性胃炎具有重要临床价值，值得进一步深入研究并在临床推广应用。
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.一种胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品收集；
(2)纳米磁珠预处理；
(3)样品预处理：取出冷冻保存的唾液样品，冰上解冻，所有唾液样品均1次冻融，取5μl所述唾液样品加入10μl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μl的WashBuffer稀释；
(4)唾液样品洗脱上样：③向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μl预处理后的所述唾液样品，混匀，置于室温孵育30min，将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；④每管加入100μl的WashBuffer洗脱5min，然后将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液，再重复步骤④操作一次；⑤在所述PCR管中加入10μl的ElutionBuffer洗脱5min，将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，取5μl上清液移至另一个PCR管中；⑥将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀，至样品颜色发灰，而没有明显的沉淀时，取2μl混合溶液，加样到Au/Steel芯片上，晾干后放入仪器读取；
(5)质谱分析：采用质谱仪读取所述Au/Steel芯片信息，设置激光强度为190，灵敏度为5；
(6)数据采集；
(7)数据分析；
(8)建立诊断模型：用BiomarkerPatternSoftware5.0.2采用决策树算法计算出多个变量变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。
2.如权利要求1所述的胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，所述步骤(1)样品收集的方法为：胃癌组和慢性胃炎组在取材前一天晚上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴中的15ml唾液离心管内，4℃下静置1h后，3000r/min、4℃下离心10min，冰浴上分装在1ml的EP管中，每管200μl，于-80℃冰箱冷冻保存备用。
3.如权利要求2所述的胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，所述步骤(2)纳米磁珠预处理的方法为：①取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管中，置于磁铁上孵育1min，去除上清液；②再加入100μl的WashBuffer洗脱5min，在磁铁上孵育1min，去除上清液，再重复步骤②操作一次。
4.如权利要求3所述的胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，所述步骤(6)数据采集的方法为：用CiphergenProteinchipSoftware3.2.1软件采集数据，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，收集数据的质荷比范围为2000～25000m/z，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100次，已知多肽标准芯片标准，激光离子流0.5。
5.如权利要求4所述的胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，所述步骤(7)数据分析的方法为：对位于2000～25000m/z峰值，用BiomarkerWizard软件过滤噪音；设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10％为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较所述胃癌组和所述慢性胃炎组唾液蛋白质质谱数据，找出所述胃癌组和所述慢性胃炎组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰。
6.如权利要求5所述的胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，步骤(7)中，所述胃癌组与所述慢性胃炎组对比，选取两组蛋白质质谱数据比值比率＞2的差异蛋白，设置P＜0.05，所述胃癌组和所述慢性胃炎组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰有23个，其中有5个差异蛋白质峰表达下调，18个差异蛋白质峰表达上调，所述23个差异表达蛋白质峰具体如下：
7.如权利要求6所述的胃癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，步骤(6)所述荷质比范围为2000～15000m/z。
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|---|---|
| CN (1) | CN105699473B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106950380A (zh) * | 2017-03-02 | 2017-07-14 | 先思达（南京）生物科技有限公司 | 一种胃癌监测试剂盒及其使用方法 |
| CN110220965A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-09-10 | 山东省分析测试中心 | 一种快速鉴别反复冻融肉类的方法 |
| CN110880356A (zh) * | 2018-09-05 | 2020-03-13 | 南京格致基因生物科技有限公司 | 对卵巢癌进行筛查、诊断或风险分级的方法和装置 |
| CN113466465A (zh) * | 2021-01-20 | 2021-10-01 | 浙江大学滨海产业技术研究院 | 一种基于蛋白质组学的唾液检测方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104007169A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-08-27 | 深圳市第二人民医院 | 一种胃癌的唾液蛋白诊断模型及其建立方法 |
| CN104007166A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-08-27 | 深圳市第二人民医院 | 一种慢性胃炎诊断的唾液蛋白诊断模型及其构建方法 |
| CN104515797A (zh) * | 2014-05-29 | 2015-04-15 | 深圳市第二人民医院 | 乳腺癌早期诊断的唾液蛋白指纹图谱模型及其构建方法 |
-
2016
- 2016-03-23 CN CN201610169314.3A patent/CN105699473B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104007169A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-08-27 | 深圳市第二人民医院 | 一种胃癌的唾液蛋白诊断模型及其建立方法 |
| CN104007166A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-08-27 | 深圳市第二人民医院 | 一种慢性胃炎诊断的唾液蛋白诊断模型及其构建方法 |
| CN104515797A (zh) * | 2014-05-29 | 2015-04-15 | 深圳市第二人民医院 | 乳腺癌早期诊断的唾液蛋白指纹图谱模型及其构建方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杨长青: "基于唾液蛋白质组学的2型糖尿病病证结合分子诊断模型研究", 《万方数据》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106950380A (zh) * | 2017-03-02 | 2017-07-14 | 先思达（南京）生物科技有限公司 | 一种胃癌监测试剂盒及其使用方法 |
| CN106950380B (zh) * | 2017-03-02 | 2019-01-11 | 江苏先思达生物科技有限公司 | 一种胃癌监测试剂盒及其使用方法 |
| CN110880356A (zh) * | 2018-09-05 | 2020-03-13 | 南京格致基因生物科技有限公司 | 对卵巢癌进行筛查、诊断或风险分级的方法和装置 |
| CN110220965A (zh) * | 2019-07-17 | 2019-09-10 | 山东省分析测试中心 | 一种快速鉴别反复冻融肉类的方法 |
| CN110220965B (zh) * | 2019-07-17 | 2020-05-22 | 山东省分析测试中心 | 一种快速鉴别反复冻融肉类的方法 |
| CN113466465A (zh) * | 2021-01-20 | 2021-10-01 | 浙江大学滨海产业技术研究院 | 一种基于蛋白质组学的唾液检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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