CN111751551B - 蛋白分子作为诊断肝硬化的生物标志物及其预后方法 - Google Patents

蛋白分子作为诊断肝硬化的生物标志物及其预后方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学生物检测领域，具体涉及一种蛋白分子作为诊断肝硬化的生物标志物及其预后方法，PLPP1蛋白、CMC1蛋白、MROH1蛋白和RHPN2蛋白中至少一种蛋白分子作为生物标志物在制备肝硬化诊断试剂中的应用。本发明采用LC‑MS/MS质谱分析法，筛选出来4个有代表性的蛋白分子；通过将肝硬化组织与正常健康肝组织相应分子含量的差异倍数（大于2或小于0.5）确定4个蛋白分子作为检测肝硬化的分子标志物。以PLPP1蛋白、CMC1蛋白、MROH1蛋白和RHPN2蛋白为生物标志物对被试者进行肝硬化诊断，简单易行、诊断过程安全有效、易为病人所接受、诊断标准统一且受主观因素影响较小。

Description

蛋白分子作为诊断肝硬化的生物标志物及其预后方法
技术领域
本发明涉及医学生物检测领域，具体涉及一种蛋白分子作为诊断肝硬化的生物标志物及其预后方法。
背景技术
“肝炎－肝硬化－肝癌”是肝病进展的“三部曲”。在肝硬化－肝癌的恶变进程中，会经历一个较长的肝癌癌前病变过程。肝硬化目前来说是全球范围内的一个广泛的疾病，其早期表现消化道症状，门静脉高压和肝功能异常，晚期会出现消化道出血，对人们的健康危害极大。
肝硬化（Liver cirrhosis）是一种常见的慢性肝病，可由一种或多种原因引起肝脏损害，肝脏呈进行性、弥漫性、纤维性病变。具体表现为肝细胞弥漫性变性坏死，继而出现纤维组织增生和肝细胞结节状再生，这三种改变反复交错进行，结果肝小叶结构和血液循环途径逐渐被改建，使肝变形、变硬而导致肝硬化。该病早期无明显症状，后期则出现一系列不同程度的门静脉高压和肝功能障碍，直至出现上消化道出血、肝性脑病等并发症死亡。引起肝硬化的病因很多，不同地区的主要病因也不相同。欧美以酒精性肝硬化为主，我国以肝炎病毒性肝硬化多见，其次为血吸虫病肝纤维化，酒精性肝硬化亦逐年增加。研究证实，两种病因先后或同时作用于肝脏，更易产生肝硬化，如血吸虫病或长期大量饮酒者合并乙型病毒性肝炎等。肝炎病毒是慢性肝炎的重要原因，是肝硬化的主要原因，是肝癌和肝移植的最常见的原因。病毒性肝炎患者有不同的转归，其中一部分将发展为肝炎后肝硬化。
肝硬化目前无有效的治疗方法。在肝硬化的早期（代偿期），进行及时的干预，让患者避免重活动量工作，辅以饮食调节，如以高热量、高蛋白质、维生素丰富而易消化的食物为主。严禁饮酒，并限制脂肪，尤其是动物脂肪的过多摄人等，可避免或延缓其病情进展，预防晚期肝硬化及各种并发症的发生。
然而，早期肝硬化诊断比较困难，许多病理组织学证实为肝硬化的患者，常可无任何症状或仅出现非特异性的消化道症状。目前，对于肝硬化的早期诊断主要在于：①对病毒性肝炎患者严密随访观察；②对原因不明的肝大，特别是肝质地坚实、表面不光滑者，有肝病面容者，出现蜘蛛痣、肝掌及毛细血管扩张等体征者，采用包括超声、腹腔镜及肝组织活检等检查手段帮助确定性质。这些手段一则缺少特异性，二则临床操作也有实质性困难。急需更特异性的诊断或随访、追踪指标，尤其是安全有效的相关生物学指标。
肝癌癌前病变是良性病变向恶性病变过渡的移行阶段，是一类具有细胞不典型性和分化异常的增生性病变，持续时间较长。肝硬化－肝癌癌前病变恶性转变促进肝癌的发生、发展，但如果对于肝硬化的早期能够进行有效诊断，则有助于显著提高患者的生存率，因此，开发具有临床早期诊断潜力的新方法对于降低肝癌的发病率和死亡率具有非常重要的现实意义。
发明内容
（一）解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种蛋白分子作为诊断肝硬化的生物标志物及其预后方法，采用质谱分析的方法检测分子标志物的含量来诊断肝硬化；该方法简单，实用，且通过检测小分子的含量可以更好地提高检测方法的灵敏度与特异性。
（二）技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
PLPP1蛋白、CMC1蛋白、MROH1蛋白和RHPN2蛋白中至少一种蛋白分子作为生物标志物在制备肝硬化诊断试剂中的应用。
优选地，诊断方法包括以下步骤：采用LC-MS/MS质谱分析法分别检测待测样本中PLPP1蛋白、CMC1蛋白、MROH1蛋白或RHPN2蛋白的蛋白质表达量强度值。
优选地，样本中PLPP1蛋白的蛋白质表达量强度值小于49420107.95，被判为肝硬化患者。
优选地，样本中CMC1蛋白的蛋白质表达量强度值小于140427506.5，被判为肝硬化患者。
优选地，样本中MROH1蛋白的蛋白质表达量强度值小于11267041，被判为肝硬化患者。
优选地，样本中RHPN2蛋白的蛋白质表达量强度值小于17039217.5，被判为肝硬化患者。
一种试剂盒及其在肝硬化的早期诊断、治疗指导及预后判断中的应用，包括特异性检测PLPP1蛋白的试剂、特异性检测CMC1蛋白的试剂、特异性检测MROH1蛋白的试剂和特异性检测RHPN2蛋白的试剂中的一种或几种。
优选地，特异性检测PLPP1蛋白的试剂是特异性识别PLPP1蛋白的抗体；特异性检测CMC1蛋白的试剂是特异性识别CMC1蛋白的抗体；特异性检测MROH1蛋白的试剂是特异性识别MROH1蛋白的抗体；特异性检测RHPN2蛋白的试剂是特异性识别RHPN2蛋白的抗体。
优选地，特异性检测PLPP1蛋白的试剂是特异性识别PLPP1蛋白核酸的引物或探针；特异性检测CMC1蛋白的试剂是特异性识别CMC1蛋白核酸的引物或探针；特异性检测MROH1蛋白的试剂是特异性识别MROH1蛋白核酸的引物或探针；特异性检测RHPN2蛋白的试剂是特异性识别RHPN2蛋白核酸的引物或探针。
优选地，试剂用于检测组织样本。
（三）有益效果
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明采用LC-MS/MS质谱分析方法，将大量临床样本进行质谱分析后，在蛋白质检测中筛选出来4个有代表性的蛋白分子；通过将肝硬化组织与正常健康肝组织相应分子含量的差异倍数（大于2或小于0.5）确定4个蛋白分子具有良好的检验效益。该4个蛋白分子可以作为检测肝硬化的分子标志物。
（2）本发明以PLPP1蛋白、CMC1蛋白、MROH1蛋白和RHPN2蛋白为生物标志物对被试者进行肝硬化诊断，简单易行、诊断过程安全有效、易为病人所接受、诊断标准统一且受主观因素影响较小。
（3）本发明通过质谱分析检测出的分子标志物，该方法可以为日后的抗肝硬化药物的研发提供新的治疗靶点和思路。
附图说明
图1为PLPP1蛋白的蛋白质表达量强度值的ROC曲线图；
图2为肝硬化样本组织和正常健康肝组织中PLPP1蛋白的蛋白质表达量强度值图；
图3为CMC1蛋白的蛋白质表达量强度值的ROC曲线图；
图4为肝硬化样本组织和正常健康肝组织中CMC1蛋白的蛋白质表达量强度值图；
图5为MROH1蛋白的蛋白质表达量强度值的ROC曲线图；
图6为肝硬化样本组织和正常健康肝组织中MROH1蛋白的蛋白质表达量强度值图；
图7为RHPN2蛋白的蛋白质表达量强度值的ROC曲线图；
图8为肝硬化样本组织和正常健康肝组织中RHPN2蛋白的蛋白质表达量强度值图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
与肝硬化诊断相关的分子标志物的筛选
1、实验步骤
（1）蛋白质样品信息
样本：分别取自肝硬化组织的样本40例和取自正常健康肝组织样本40例。
（2）样本预处理
样品采用SDT（4%(w/v) 十二烷基磺酸钠，100mM Tris/HCl pH7.6，0.1M二硫苏糖醇）裂解法提取蛋白质，然后采用BCA法进行蛋白质定量；每个样品取适量蛋白质采用Filter aided proteome preparation（FAS）法进行胰蛋白酶酶解，采用C18 Cartridge对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μL 0.1%甲酸溶液复溶，肽段定量（OD280）。
BCA法进行蛋白质定量，是根据吸光值可以推算出蛋白浓度，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，两分子BCA螯合一个Cu+。将该水溶性复合物在562nm处的吸收值，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
（3）LC-MS/MS数据采集
每份样品采用纳升流速的HPLC液相系统Easy nLC进行分离。
其中：缓冲液A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）。
色谱柱以95%的A液平衡，样品由自动进样器上样到上样柱（Thermo ScientificAcclaim PepMap100, 100μm*2cm, nanoViper C18），经过分析柱（Thermo scientificEASY column, 10cm, ID75μm, 3μm, C18-A2）分离，流速为300 nL/min。
样品经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。检测方式为正离子，母离子扫描范围300–1800m/z，一级质谱分辨率为70,000 at 200m/z，AGC（Automatic gaincontrol）target为1e6，Maximum IT为50ms，动态排除时间（Dynamic exclusion）为60.0s。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后采集20个碎片图谱（MS2 scan），MS2 Activation Type为HCD，Isolation window为2m/z，二级质谱分辨率17, 500 at 200m/z，Normalized Collision Energy为30eV，Underfill为0.1%。
（4）蛋白质鉴定和定量分析
质谱分析原始数据为RAW文件，用软件MaxQuant软件（版本号1.5.3.17）进行查库鉴定及定量分析。
iBAQ Intensity是基于iBAQ算法得到的样品X中的蛋白质表达量，近似等于该样品中的蛋白质绝对浓度。LFQ Intensity是基于LFQ算法得到的样品X的蛋白相对表达量，常应用于组间比较。一般Labelfree选择其中之一作为定量结果。
iBAQ（Intensity-based absolute quantification）和LFQ属于Maxquant软件提供的两种不同的蛋白质定量算法。
iBAQ一般用于样本的蛋白质绝对定量，主要算法是基于该蛋白质鉴定到的肽段的强度之和与理论肽段个数的比值。
LFQ一般用于多组间的两两定量比较，主要算法是经过肽段和蛋白质多层的pair-wise矫正。本专利采用LFQ进行蛋白质定量。
（5）统计学分析
对符合同组三次重复数据中至少有两个非空值的数据进行比值计算和统计学分析，包含各比较组的LFQ或者iBAQ强度值比值和P-value；初步筛选出各组间的差异物。
进一步根据P-value验证差异蛋白物是否具有显著性。选择同时具有多维统计分析Fold change>2或<0.5认为肝硬化组织和正常健康肝组织之间该蛋白物的含量存在明显的倍数差异，并且筛选出单变量统计分析P value <0.05的蛋白物，作为具有显著性差异的蛋白质；从而得到差异蛋白分子。然后利用SPSS软件作出差异蛋白物ROC曲线，并计算其曲线下面积（AUC），进而判断其诊断价值。具体判断方法为AUC线下面积大于0.7，且P<0.05，利用约登指数最大时候的阈值标准（cut off值）作为判断肝硬化组织与否的阈值标准（倍数大于2者认为大于阈值为肝硬化组织检测阳性，倍数小于0.5者认定小于阈值者为肝硬化组织检测阳性），从而得到较高的敏感度和特异度。
（6）生物信息学分析
① GO功能注释
利用Blast2GO对目标蛋白质集合进行GO注释，过程大致可以归纳为序列比对（Blast）、GO条目提取（Mapping）、GO注释（Annotation）和InterProScan补充注释（Annotation Augmentation）等四个步骤。
② KEGG通路注释
利用KAAS（KEGG Automatic Annotation Server）软件，对目标蛋白质集合进行KEGG通路注释。
③ GO注释和KEGG注释的富集分析
采用Fisher精确检验（Fisher’s Exact Test），比较各个GO分类或KEGG通路在目标蛋白质集合和总体蛋白质集合中的分布情况，对目标蛋白质集合进行GO注释或KEGG通路注释的富集分析。
④ 蛋白质聚类分析
首先对目标蛋白质集合的定量信息进行归一化处理（归一化到（-1,1）区间）。然后，使用Complexheatmap R包（R Version 3.4）同时对样品和蛋白质的表达量两个维度进行分类（距离算法：欧几里得，连接方式：Average linkage），并生成层次聚类热图。
⑤ 蛋白质相互作用网络分析
基于STRING（http://string-db.org/）数据库中的信息查找目标蛋白质之间的相互作用关系，并使用CytoScape软件（版本号：3.2.1）生成相互作用网络并对网络进行分析。
（7）差异表达蛋白质筛选
以倍数变化大于2.0倍（上调大于2倍或者下调小于0.5）且P value小于0.05的标准筛选差异表达蛋白质，各比较组的差异表达蛋白质数目。
（8）实验基本原理
非标记定量蛋白质组学（Label-free）技术近年来已成为重要的质谱定量方法。Label-free技术的定量原理主要有两种：首先，spectrum counts类的非标记定量方法发展较早，也形成了多种定量算法，但核心原理都是根据MS2的鉴定结果作为定量的基础，各种方法的差别在于后期算法对高通量数据的修正；第二种非标记定量方法的原理是以MS1为基础，计算每个肽段信号在LCMS色谱上的积分。本发明采用的Maxquant算法即基于第二种原理。
2、实验结果
经质谱数据分析，将肝硬化样本组织与正常健康肝组织的蛋白小分子进行比较，最终得到4个蛋白分子（即PLPP1蛋白、CMC1蛋白、MROH1蛋白和RHPN2蛋白），可作为与肝硬化相关的分子标志物。
为了评估蛋白分子的蛋白质表达量强度值对肝硬化的诊断效能，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，也是重要的试验准确度指标。若AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
具体结果与分析如下：
① 采用LC-MS/MS质谱分析，检测到PLPP1蛋白在肝硬化样本组织与正常健康肝组织中存在差异。
经研究发现，PLPP1蛋白在肝硬化样本中显著性下调了0.50倍，p值<0.05。
由图1可知，PLPP1蛋白的AUC为0.708>0.7，说明PLPP1蛋白可以作为诊断肝硬化的分子标志物。
当PLPP1蛋白的蛋白质表达量强度值为49420107.95时，灵敏度为73.1%，特异度为64%；当进行个体检测时，该蛋白的蛋白质表达量强度值小于49420107.95时，被判为肝硬化患者，否则判断为未发生肝硬化人群（假阳性率为36%）。
由图2可知，肝硬化组织样本主要分布在检测阈值（图中实线）以下，正常健康肝组织主要分布在检测阈值以上，说明肝硬化组织和正常健康肝组织的蛋白质表达量强度值相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
综上所示，PLPP1蛋白可以作为诊断肝硬化的分子标志物。
② 采用LC-MS/MS质谱分析，检测到CMC1蛋白在肝硬化样本组织与正常健康肝样本组织中存在差异。
经研究发现，CMC1蛋白在肝硬化样本中显著性下调了0.37倍，p值<0.05。
由图3可知，CMC1蛋白的AUC为0.762>0.7，说明CMC1蛋白可以作为诊断肝硬化的分子标志物。
当CMC1蛋白的蛋白质表达量强度值为140427506.5时，灵敏度为75%，特异度为72.7%；当进行个体检测时，该蛋白的蛋白质表达量强度值小于140427506.5时，被判为肝硬化患者，否则判断为未发生肝硬化人群（假阳性率为27.3%）。
由图4可知，肝硬化组织样本主要分布在检测阈值（图中实线）以下，正常健康肝样本组织主要分布在检测阈值以上，说明肝硬化组织和正常健康肝组织的蛋白质表达量强度值相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
综上所示，CMC1蛋白可以作为诊断肝硬化的分子标志物。
③ 采用LC-MS/MS质谱分析，检测到MROH1蛋白在肝硬化组织与正常健康肝组织中存在差异。
经研究发现，MROH1蛋白中在肝硬化样本显著性下调了0.32倍，p值＜0.05。
由图5可知，MROH1蛋白的AUC为0.761>0.7，说明MROH1蛋白可以作为诊断肝硬化的分子标志物。
当MROH1蛋白的蛋白质表达量强度值为11267041时，灵敏度为78.6%，特异度为73.3%；当进行个体检测时，该蛋白的蛋白质表达量强度值小于11267041时，被判为肝硬化患者，否则判断为未发生肝硬化人群（假阳性率为26.7%）。
由图6可知，肝硬化组织样本主要分布在检测阈值（图中实线）以下，正常健康肝组织主要分布在检测阈值以上，说明肝硬化组织和正常健康肝组织的蛋白质表达量强度值相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
综上所述，MROH1蛋白可以作为诊断肝硬化的分子标志物。
④ 采用LC-MS/MS质谱分析，检测到RHPN2蛋白在肝硬化组织与正常健康肝组织中存在差异。
经研究发现，RHPN2蛋白在肝硬化样本显著性下调了0.30倍，p值<0.05。
由图7可知，RHPN2蛋白的AUC为0.739>0.7，说明RHPN2蛋白可以作为诊断肝硬化的分子标志物。
当RHPN2蛋白的蛋白质表达量强度值为17039217.5时，灵敏度为75.9%，特异度为70%；当进行个体检测时，该蛋白的蛋白质表达量强度值小于17039217.5时，被判为肝硬化患者，否则判断为未发生肝硬化人群（假阳性率为30%）。
由图8可知，肝硬化组织样本主要分布在检测阈值（图中实线）以下，正常健康肝组织主要分布在检测阈值以上，说明肝硬化组织和正常健康肝组织的蛋白质表达量强度值相差甚大，该检测阈值检测效果良好。
综上所述，RHPN2蛋白可以作为诊断肝硬化的分子标志物。
实施例1
PLPP1蛋白作为生物标志物在制备肝硬化诊断试剂中的应用。
诊断方法包括以下步骤：采用LC-MS/MS质谱分析法分别检测待测样本中PLPP1蛋白的蛋白质表达量强度值；当待测样本中PLPP1蛋白的蛋白质表达量强度值小于49420107.95，被判为肝硬化患者。
一种试剂盒及其在肝硬化的早期诊断、治疗指导及预后判断中的用途，包括特异性检测PLPP1蛋白的试剂；特异性检测PLPP1蛋白的试剂是特异性识别PLPP1蛋白的抗体；试剂用于检测组织样本。
实施例2
CMC1蛋白作为生物标志物在制备肝硬化诊断试剂中的应用。
诊断方法包括以下步骤：采用LC-MS/MS质谱分析法分别检测待测样本中CMC1蛋白的蛋白质表达量强度值；当待测样本中CMC1蛋白的蛋白质表达量强度值小于140427506.5，被判为肝硬化患者。
一种试剂盒及其在肝硬化的早期诊断、治疗指导及预后判断中的用途，包括特异性检测CMC1蛋白的试剂；特异性检测CMC1蛋白的试剂是特异性识别CMC1蛋白的抗体；试剂用于检测组织样本。
实施例3
MROH1蛋白作为生物标志物在制备肝硬化诊断试剂中的应用。
诊断方法包括以下步骤：采用LC-MS/MS质谱分析法分别检测待测样本中MROH1蛋白的蛋白质表达量强度值；当待测样本中MROH1蛋白的蛋白质表达量强度值小于11267041，被判为肝硬化患者。
一种试剂盒及其在肝硬化的早期诊断、治疗指导及预后判断中的用途，包括特异性检测MROH1蛋白的试剂；特异性检测MROH1蛋白的试剂是特异性识别MROH1蛋白的抗体；试剂用于检测组织样本。
实施例4
RHPN2蛋白作为生物标志物在制备肝硬化诊断试剂中的应用。
诊断方法包括以下步骤：采用LC-MS/MS质谱分析法分别检测待测样本中RHPN2蛋白的蛋白质表达量强度值；当待测样本中RHPN2蛋白的蛋白质表达量强度值小于17039217.5，被判为肝硬化患者。
一种试剂盒及其在肝硬化的早期诊断、治疗指导及预后判断中的用途，包括特异性检测RHPN2蛋白的试剂；特异性检测RHPN2蛋白的试剂是特异性识别RHPN2蛋白核酸的引物或探针试剂用于检测组织样本。
本发明以PLPP1蛋白、CMC1蛋白、MROH1蛋白和RHPN2蛋白或其组合蛋白为生物标志物对被试者进行肝硬化诊断，简单易行、诊断过程安全有效、易为病人所接受、诊断标准统一受个人主观因素影响较小。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.PLPP1蛋白、CMC1蛋白、MROH1蛋白和RHPN2蛋白中至少一种蛋白分子作为生物标志物在制备肝硬化诊断试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用LC-MS/MS质谱分析法分别检测待测样本中PLPP1蛋白、CMC1蛋白、MROH1蛋白或RHPN2蛋白的蛋白质表达量强度值。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，样本中PLPP1蛋白的蛋白质表达量强度值小于49420107.95，被判为肝硬化患者。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，样本中CMC1蛋白的蛋白质表达量强度值小于140427506.5，被判为肝硬化患者。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，样本中MROH1蛋白的蛋白质表达量强度值小于11267041，被判为肝硬化患者。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，样本中RHPN2蛋白的蛋白质表达量强度值小于17039217.5，被判为肝硬化患者。
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