CN105992950A - T 细胞表位表达谱分析、制备 t 细胞组合物以及治疗疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了一种检测从受试者分离的样品中的抗原特异性T细胞和绘制所述抗原的免疫刺激表位的方法。此类方法可用于制备例如用于治疗疾病诸如癌症、感染性疾病和自身免疫疾病的抗原特异性T细胞组合物的方法。
Description
技术领域
本发明提供检测样品中的抗原特异性T细胞,鉴定该抗原特异性T细胞对其应答的抗原的免疫刺激表位,以及使用该表位制备(例如)用于治疗疾病的T细胞组合物的方法。
发明背景
T细胞对抗原的应答涉及T细胞识别抗原的片段,即在抗原呈递细胞上表达的抗原呈递分子的环境中存在的表位。抗原蛋白的给定片段是否为免疫刺激表位,即能够刺激T细胞对其应答,在很大程度上取决于其结合抗原呈递分子的性质,以及表位的特定氨基酸与适当T细胞受体的相互作用。检测抗原特异性T细胞以及理解特别是在疾病的发病期间参与T细胞介导的免疫的抗原的表位,为免疫应答的直接调节和疫苗的开发以及对过敏原、自身免疫疾病和肿瘤的治疗提供了基础。
例如,就自身免疫疾病而言,使用对髓鞘蛋白表位具有反应性的自身T细胞进行免疫治疗已显示出对缺失和/或负调控髓鞘反应性T细胞以及为患有多发性硬化症(MS)的患者提供潜在的临床有益效果有效。然而,每位患者的T细胞免疫治疗必须是个性化的,因为此类自身反应性T细胞的T细胞受体在不同MS患者之间的表位特异性上存在高度变化和差异(Vandevyver等,Eur.J.Immunol.,1995年,第25卷,第958-968页;Wucherpfennig等,J.Immunol.,1994年,第152卷,第5581-5592页;Hong等,J.Immunol.,1999年,第163卷,第3530-3538页)。
除每位患者的个性化之外,针对自身免疫疾病的T细胞免疫治疗的成功制造需要检测自身反应性T细胞和鉴定自身反应性T细胞结合的表位。对抗原的免疫刺激表位进行作图和克隆治疗用途的T细胞的标准方法涉及抗原引发(通常涉及T细胞与抗原一起温育),然后是将单个细胞接种至96孔板。然后扩大培养细胞,并通过耗力、耗时的工艺筛选具有覆盖抗原的单个肽的克隆分析肽特异性。然后使用免疫刺激阳性的肽表位测试获得和扩大用于T细胞免疫治疗的克隆T细胞系。
还开发了增强宿主对肿瘤、病毒和细菌病原体的免疫应答的细胞治疗方法。这些细胞治疗方法通常还涉及肿瘤或病原体相关抗原特异性自身T细胞的体外活化和扩大。这些类型治疗的例子包括肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)(参见授予Rosenberg的美国专利No.5,126,132)、胞毒T细胞(参见授予Cai等的美国专利No.6,255,073和授予Celis等的美国专利No.5,846,827)、扩大肿瘤引流淋巴结细胞(参见授予Tei man的美国专利No.6,251,385)和各种其它淋巴细胞制剂(参见授予Bell等的美国专利No.6,194,207、授予Ochoa等的美国专利No.5,443,983、授予Riddell等的美国专利No.6,040,177、授予Babbitt等的美国专利No.5,766,920)的使用。
然而,易于从患者获得的样品中此类抗原特异性T细胞的频率很低。例如,MS患者外周血中自身反应性T细胞的频率为大约105个外周血单核细胞中存在1个至106个外周血单核细胞中存在1个(Ota等,1990年,Nature,第346卷,第183-187页;Martin等,1990年,J.Immunol.第145卷,第540-548页)。这在T细胞产品的制造期间对患者样品筛选自身反应性T细胞时提出了挑战,因为120ml抽血的典型产率为总共约1亿个T细胞。
为此,需要足够灵敏的分析法来检测稀有反应性T细胞和鉴定该稀有反应性T细胞以强烈方式对其应答的免疫刺激表位。
发明概述
本文提供了检测样品中的抗原特异性T细胞和鉴定抗原的免疫刺激表位的方法。如本文所公开,研究了多种开发此类分析的方法,获得了出乎意料的结果:T细胞的大量培养物仍然是存活的。因此,本文所公开的优选的分析形式利用包含T细胞的样品的“大量培养物”,其中该样品以高浓度和密度与表位库一起培养,其中该库优选地包含自身抗原的重叠肽。
一般来讲,检测抗原特异性T细胞和鉴定该抗原特异性T细胞对其应答的免疫刺激表位的方法包括:(a)使用表位库体外引发至少一种来自受试者的包含T细胞的样品的大量培养物,该表位库包含一个或多个肽,其中该表位库中的每个肽是抗原的独特片段;(b)使用表位库再刺激大量培养物一段时间,以足以允许对表位库中的至少一个肽特异的T细胞释放可检测的至少一个活化细胞因子,以及(c)检测所述大量培养物中是否存在所述至少一个活化细胞因子;其中所述培养物中存在所述至少一个活化细胞因子检测对抗原特异的T细胞,并且将表位库中的一个或多个肽跨越的抗原区域鉴定为包含抗原特异性T细胞对其应答的免疫刺激表位。在一个实施方案中,可利用多种大量培养物进一步限缩结果,并允许进行统计分析。在一个优选的实施方案中,表位库包含至少两个肽,每个肽与表位库中的至少一个其它肽共有重叠氨基酸序列同一性的区域,并且表位库中的肽一起跨越抗原的邻接区域。
在一个实施方案中,该方法包括:(a)使用来自文库的独特表位库体外引发来自受试者的包含T细胞的样品的多种大量培养物中的每种,该文库包括至少两个表位库,其中文库中的每个表位库包含一个或多个肽,每个肽包含抗原的独特片段,(b)使用表位库再刺激每种包含T细胞的大量培养物(该培养物使用该表位库引发)一段时间,以足以允许对表位库中的至少一个肽特异的活化T细胞释放可检测的至少一个活化细胞因子,以及(c)检测所述多种大量培养物中的每种中是否存在活化细胞因子,其中大量培养物中存在活化细胞因子检测对抗原特异的T细胞,并且将用于引发和再刺激大量培养物的表位库中的一个或多个肽跨越的抗原区域鉴定为包含T细胞对其应答的免疫刺激表位。在一个优选的实施方案中,表位库包含至少两个肽,每个肽与表位库中的至少一个其它肽共有重叠氨基酸序列同一性的区域,并且表位库中的肽一起跨越抗原的邻接区域。在一个实施方案中,表位库的文库包括跨越抗原的至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的肽。
在一个实施方案中,大量培养物包含在约2x105个细胞/mL/mm3至约2x106个细胞/mL/mm3之间。在一个实施方案中,大量培养物包含在约4x105个细胞/mL/mm3至约1x106个细胞/mL/mm3之间。在一个优选的实施方案中,大量培养物包含约5x105个细胞/mL/mm3。
样品优选地得自哺乳动物。在一个实施方案中,样品得自啮齿动物。在一个优选的实施方案中,样品是人类样品。在另一个实施方案中,样品还包含抗原呈递分子,该抗原呈递分子是可溶解的或由抗原呈递细胞表达的。在一个优选的实施方案中,样品是外周血单核细胞样品。在另一个优选的实施方案中,样品是人类外周血单核细胞。
在一个优选的实施方案中,样品得自患有疾病的患者,并且抗原与疾病相关。在一个实施方案中,疾病是感染性疾病,并且抗原从与疾病相关的感染性病原体分离。在另一个实施方案中,疾病是癌症,并且抗原是与肿瘤相关的或肿瘤特异性抗原。在一个优选的实施方案中,疾病是自身免疫疾病,并且抗原是与自身免疫疾病相关的自身抗原。最优选地,疾病是多发性硬化症,并且抗原是髓鞘蛋白。在一个实施方案中,髓鞘蛋白选自由以下组成的组:髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞蛋白以及它们的组合。
在某些实施方案中,肽库中的每个肽的长度为约10至约20个氨基酸,优选地长度为约16个氨基酸。在另一个实施方案中,每个肽库包含一个或多个肽。在一个实施方案中,每个肽库包含至少两个肽,并且所述肽之间的重叠氨基酸区域的长度为约4至约16,优选地12个氨基酸。
在一个实施方案中,使用表位库引发大量培养物至少1至10天。在一个优选的实施方案中,使用表位库引发大量培养物至少5天。
在一个实施方案中,在存在另外的抗原呈递细胞或肽装载人工APC的情况下,使用表位库再刺激大量培养物至少12天。在一个优选的实施方案中,使用表位库再刺激大量培养物至少1天。
在一个实施方案中,活化细胞因子选自由以下组成的组:IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-35、TNFα和IFNγ。在一个优选的实施方案中,活化细胞因子是IFNγ。在另一个实施方案中,检测步骤包括检测是否存在两个活化细胞因子,例如IFNγ和TNFα、IFNγ和IL-6或TNFα和IL-6。在一个优选的实施方案中,一个或多个活化细胞因子通过选自流式细胞分析、酶联免疫吸附试验(ELISA)、基于微珠的多重分析和细胞因子捕集分析的方法检测。最优选地,活化细胞因子通过ELISA检测。在另一个实施方案中,一个或多个活化细胞因子通过基于微珠的多重分析检测。
本文还公开了制备用于治疗疾病的组合物的方法,该方法包括:(a)根据本文所公开的方法检测患有疾病的患者中的抗原特异性T细胞和鉴定抗原特异性T细胞对其应答的免疫刺激表位,其中包含T细胞的样品从患者分离,以及(b)使用所鉴定的免疫刺激表位增殖从患者分离的T细胞。在一个实施方案中,疾病是癌症,并且抗原是癌症的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。本文还公开了所制备的T细胞的组合物,以及此类组合物用于疾病诸如癌症的治疗方法的用途。此类用途包括给患有癌症的患者施用治疗有效量的包含T细胞的组合物。
在一个实施方案中,制备用于治疗疾病的组合物的方法还包括最后一个步骤(c)使所增殖的T细胞减弱。在一个实施方案中,疾病是自身免疫疾病,并且抗原是与自身免疫疾病相关的自身抗原。在一个优选的实施方案中,自身免疫疾病是多发性硬化症,并且自身抗原选自由以下组成的组:髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白和髓鞘少突胶质细胞蛋白。本文还公开了所制备的T细胞的组合物,以及此类组合物用于疾病诸如自身免疫疾病的治疗方法的用途。在一个优选的实施方案中,将包含根据本文所公开的方法制备的减弱T细胞的组合物用于治疗自身免疫疾病。此类用途包括给患有自身免疫疾病的患者施用治疗有效量的减弱T细胞。在一个优选的实施方案中,自身免疫疾病是多发性硬化症,并且自身抗原选自由以下组成的组:髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白和髓鞘少突胶质细胞蛋白。
附图简述
图1:第4天CMV pp65诱导IFNγ应答(PBMC以两个密度接种)
图2:第6天CMV pp65诱导IFNγ应答(PBMC以两个密度接种)
图3:抗髓鞘肽IFNγ活性(使用MS供体011034 PBMC作为应答细胞)
图4:抗髓鞘肽IFNγ活性(使用MS供体011054 PBMC作为应答细胞)
图5:对免疫显性破伤风毒素肽表位的应答:直接体外培养对5天微量培养,然后进行IFNγELISpot。数据以四个平行ELISpot孔的平均值+SD表示。
图6.第6天通过IFNγELIspot检测的健康供体03106抗髓鞘肽免疫。数据以四个平行ELIspot孔的平均值+SD表示。CTRLs:阴性对照。
图7:第6天通过IFNγELISpot检测的健康供体03106抗髓鞘肽免疫。数据以四个平行ELISpot孔的平均值+SD表示。CTRLs:阴性对照。
图8:第6天通过IFNγELISpot检测的MS供体03102抗髓鞘肽免疫。数据以四个平行ELISpot孔的平均值+SD表示(左图板分析1,右图板分析2)。CTRLs:仅培养基中的细胞。
图9:第6天通过IFNγELISpot检测的MS供体03103抗髓鞘肽免疫。数据以四个平行ELISpot孔的平均值+SD表示(左图板分析1,右图板分析2)。CTRLs:仅培养基中的细胞。
图10:接种密度和解离步骤对MOGm16肽库的阳性免疫检测的影响。未处理:在微量管和ELISpot分析中不存在肽的情况下培养的PBMC。数据以ELISpot分析中接种的四个平行孔的平均值+SD表示。
图11:ELISpot“斑点”的形状和大小分布-高频、高反应性T细胞的粗略定量。所有3个孔使用相同的设置计数。
图12:MS供体03171-ELISpot与细胞ELISA的髓鞘肽库的阳性应答检测比较。交叉影线条表示大于分析的检测上限的细胞ELISA数据点,因此表示未正式定量的阳性应答。CTRL-对照。
图13:MS供体03172-ELISpot与细胞ELISA的髓鞘肽库的阳性应答检测比较。交叉影线条表示大于分析的检测上限的细胞ELISA数据点,因此表示未正式定量的阳性应答。CTRL-对照。
详述
本发明提供检测样品中的抗原特异性T细胞和鉴定该T细胞对其响应的和/或特异的抗原的一个或多个免疫刺激表位的方法。本文公开了出乎意料的发现,免疫细胞的大量培养物,例如其中细胞以高密度、彼此接近培养的大量培养物,在与免疫刺激表位接触时,提供了有利于培养物中的稀有抗原特异性免疫细胞的可检测活化的环境。本文所公开的方法通常包括使用包含一个或多个肽的表位库体外引发包含T细胞的样品的大量培养物。使用表位库再刺激包含T细胞的大量培养物,以允许对表位库中的一个或多个肽特异的T细胞分泌可检测水平的活化细胞因子。此类活化细胞因子的检测与样品中活化T细胞的检测以及确定表位库中的肽跨越的抗原区域包含活化T细胞的免疫刺激表位有关。
免疫系统的T细胞识别结合到抗原呈递分子例如啮齿动物中的主要组织相容性复合体(MHC)或人类中的人类白细胞抗原(HLA)、在抗原呈递细胞(APC)上表达的肽。T细胞的抗原识别特异性由多个参数定义:1)T细胞受体与结合到抗原呈递分子的肽的亲和力;2)抗原肽的一级序列;和3)抗原肽内某些氨基酸组合的协同增强效应。通常认为,高水平的抗原特异性是T细胞活化的特征。因此,如本文所用,抗原特异性T细胞是指特异性抗原或其免疫刺激表位活化的T细胞。
如本文所用,“表位”包括能够特异性结合到与抗原呈递分子相关的T细胞受体的抗原的任何肽片段。表位决定子通常为分子的化学活性表面基团,诸如氨基酸或糖侧链,并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。如本文所用,“免疫刺激表位”包括不仅能够特异性结合到免疫细胞受体,而且在结合时能够活化免疫细胞例如T细胞的抗原的任何肽片段。
普通技术人员将认识到,T细胞的活化通常引起增殖。因此,使用本文所述的表位库引发和再刺激包含T细胞的样品均会刺激T细胞的增殖。
如本文所用,“引发”是指获得性免疫细胞及其特异性抗原之间的初始接触。因此,体外引发是指使用表位初始体外刺激T细胞。在一个优选的实施方案中,使用肽库引发(例如接触、温育、培养等)T细胞至少24小时,并且优选地至少约2至10天。最优选地,使用肽库引发T细胞5天。
一旦使用抗原(或其表位)引发免疫细胞,则随后免疫细胞和抗原之间的接触在本文中即可称为“再刺激”。在优选的实施方案中,使用肽库再刺激(例如接触、温育、培养等)T细胞至少2小时,并且优选地至少12小时或更长,例如24、48或72小时。最优选地,使用肽库再刺激T细胞约1天。
在本发明的另一个方面,使从所关注的受试者分离的包含T细胞的样品与根据本文所述的方法鉴定的免疫刺激表位接触,以增殖衍生表位的对抗原特异的T细胞。在一个实施方案中,使样品与免疫刺激表位接触约3至14天,并且优选地至少5天。最优选地,使样品与免疫刺激表位接触一段足以提供治疗有效量的T细胞的时间。
大量培养物
在本发明的一个方面,使包含T细胞的样品的大量培养物与肽接触,以允许T细胞的体外引发和/或再刺激。如本文所用,“大量培养物”是指在高浓度和密度下培养细胞。此类高浓度和密度可以例如使用少量培养基和培养管而不是平底或u型底平板或培养瓶实现。例如,与1X106个细胞/1mL接种于24孔板相比,可接种于1.5mL培养管中,以增加细胞的密度。在示例性实施方案中,将至少1X106个细胞,优选地至少2.5X106个细胞,以及最优选地至少3X106个细胞悬浮于至少1mL,优选地至少1.5mL培养基中,并且在小培养管诸如1.5mL培养管,以及最优选地5mL培养管中培养。
在一个优选的实施方案中,样品的大量培养物包含约2x105个细胞/mL/mm3至约2x106个细胞/mL/mm3。在一个实施方案中,大量培养物包含在约4x105个细胞/mL/mm3至约1x106个细胞/mL/mm3之间。在一个优选的实施方案中,大量培养物包含约5x105个细胞/mL/mm3。除使用大量培养物之外,还将标准技术用于如本文所述的细胞培养(例如,使用肽引发、再刺激和增殖T细胞)。
包含T细胞的样品和/或T细胞可从任何哺乳动物例如啮齿动物、人等分离。在一个优选的实施方案中,样品从患有疾病或提供人类疾病的模型的哺乳动物分离。在更优选的实施方案中,样品从人类,最优选地从患有疾病诸如但不限于:感染性疾病、癌症或自身免疫疾病的人类分离。
包含T细胞的样品和/或T细胞可以哺乳动物的新鲜样品,从哺乳动物细胞的体外培养物,从细胞的冰冻样品等分离。合适的样品可包括例如血液、淋巴、淋巴结、脾脏、肝脏、肾、胰腺、扁桃体、胸腺、关节、滑液以及衍生T细胞的其它组织。在一个优选的实施方案中,包含T细胞的样品以外周血单核细胞(PBMC)分离。PBMC可以例如通过离心(例如,从血沉棕黄层),通过密度梯度离心(例如,通过Ficoll-Hypaque),通过淘选,亲和分离,细胞分选(例如,使用一个或多个细胞表面标记物特异性抗体),以及提供PBMC和/或T细胞富集的其它技术部分纯化。
在一个示例性实施方案中,PBMC通过标准Ficoll-Hypaque法从血液样品分离。血液样品使用肝素处理,并经受Ficoll溶液处理。在离心后,可以例如在PBS或T细胞培养基(例如,补充有2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠和15%混合人血清的RPMI 1640;AIM-V;OpTimizer CTS等)中洗涤回收的细胞。可使用熟知的技术将洗涤的细胞重悬于细胞培养基并置于培养管中,形成如本文所述的大量培养物。在一个优选的实施方案中,本文所公开的方法包括引发浓度和密度为约4.0X105个PBMC/mL/mm3至约2X106个PBMC/mL/mm3的外周血单核细胞的大量培养物。在一个优选的实施方案中,本文所公开的方法包括引发浓度和密度为约4.5X105个PBMC/mL/mm3的包含T细胞的外周血单核细胞的大量培养物。
肽、表位库和文库
如上文所述,本文所公开的方法包括在引发和再刺激步骤期间温育包含T细胞的样品以及肽(例如该肽可以是表位库的一部分)的大量培养物。一般来讲,肽的长度可以为约9个氨基酸至约20个氨基酸或更多。在一个优选的实施方案中,肽为约16个氨基酸。表位库或表位文库中的每个肽可以是抗原的独特片段,例如与抗原的邻接片段共有氨基酸序列同一性。在一个实施方案中,每个肽与抗原的邻接片段共有至少75%,例如约80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列同一性,所述片段的长度可以为至少7个氨基酸,并且小于抗原的全长。
肽可以衍生自任何合适的抗原。在某些实施方案中,抗原为至少约4千道尔顿(kD),至少约6kD,或至少约10kD。合适的抗原可包括例如衍生自传染原的抗原、与自身免疫疾病相关的抗原、各种与癌症相关的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原等。
在示例性实施方案中,抗原是具体癌症相关的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原,包括但不限于:细胞角蛋白,特别是细胞角蛋白8、18和19;上皮细胞膜抗原(EMA);人类胚胎抗原(HEA-125);人乳脂肪球诸如MBr1、MBr8、Ber-EP4、17-1A、C26和T16;肌间线蛋白;肌特异性肌动蛋白;胎盘碱性磷酸酶;β-人绒毛膜促性腺激素;α-胎儿球蛋白;前列腺特异性抗原(PSA);结肠腺癌的癌胚抗原;HMB-45;嗜铬粒蛋白-A;突触小泡蛋白、酪氨酸酶等。
在另外的示例性实施方案中,抗原衍生自病原体。非限制性例子包括单纯疱疹-2病毒VP16、破伤风毒素、流感血凝素、HIV gag蛋白、细胞巨化病毒pp65、HBV表面抗原以及其它的病毒包膜和外壳蛋白等。
在优选的实施方案中,抗原是与自身免疫疾病相关的自身抗原。自身抗原的非限制性例子包括髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞蛋白、水通道蛋白4、血小板膜糖蛋白IIb-IIIa和Ib-IX、胰岛素、前胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD)、GAD65、GAD67、热激蛋白65(hsp65)、胰岛细胞抗原69(ICA69)、胰岛细胞抗原相关蛋白-酪氨酸磷酸酶(PTP)、GM2-1神经节苷脂、Tep69、胰岛细胞蛋白酪氨酸磷酸酶及其衍生的37-kDa自身抗原(包括IA-2)、福格林(Phogrin)、人软骨细胞糖蛋白-39、胶原、II型胶原、软骨链蛋白、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白、分枝杆菌热激蛋白6、桥粒芯糖蛋白、β-2-GPI、Ku(p70/p80)自身抗原或其80-kd亚基蛋白、核自身抗原La(SS-B)和Ro(SS-A)、蛋白酶体β-型亚基C9、中心体自身抗原PCM-1、多发性肌炎-硬皮病自身抗原(PM-Scl)、自身抗原CENP-A、U5、核仁U3-和Th(7-2)核糖核蛋白、核糖体蛋白L7、hPop1、来自核基质抗原的36-kd蛋白、甲状腺过氧化物酶和甲状腺刺激激素受体、人TSH受体、乙酰胆碱受体、肌肉受体激酶或任何其它合适的自身抗原。
对于长抗原而言,可将重叠肽分选到肽库,形成至少两个肽库的文库。肽库通常包括一个或多个肽。在一个实施方案中,表位库的文库包括一起跨越抗原的至少1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的肽。在一个优选的实施方案中,表位库的文库包括跨越抗原的至少90%,更优选地至少95%,以及最优选地至少98%的肽。
肽库中的肽通常(但不一定)具有约两个和约十五个或更多个氨基酸残基之间的重叠(即,共有氨基酸序列同一性的区域)。在一个优选的实施方案中,肽库的肽重叠至少四个氨基酸。在另一个实施方案中,肽库的肽重叠约10个氨基酸。在一个优选的实施方案中,重叠肽重叠约12个氨基酸。例如,肽“n”可以是抗原的残基1至16,肽“n+1”可以是抗原的残基4至20等。然而,技术人员将会知道,肽的长度和肽之间重叠的残基的数量可根据抗原的长度和/或所关注的区域、所需的分辨度等而变化。
将肽分选到库的依据可以是变化的,如技术人员所理解。例如,在一个实施方案中,提供至少约2或约3至约8个重叠肽的库(例如,跨越抗原的邻接区域)。在一个实施方案中,提供2个重叠肽的库。在优选的实施方案中,提供至少6个重叠肽的库。
在其它实施方案中,根据任何其它合适的依据将肽分选到库,使得每个库中的肽是已知的或可确定的。在一个实施方案中,将肽分选到库,使得库中的肽一起跨越抗原的独特和邻接区域。在另一个实施方案中,将肽进行另外分选,不仅使得库中的肽一起跨越抗原的独特和邻接区域,而且使得第一库中的至少一个肽与第二库中的至少一个肽共有重叠氨基酸序列同一性区域,并且第一和第二库中的肽一起跨越抗原的邻接区域,该邻接区域包含第一库中的肽跨越的抗原的邻接区域和第二库中的肽跨越的抗原的邻接区域二者。
在任一个实施方案中,肽可以多种方式制备。例如,肽可使用自动化肽合成仪合成。肽也可人工合成。或者,肽可通过蛋白水解裂解(例如,通过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶等)或特异性化学裂解(例如,通过溴化氰)生成。肽也可通过重叠核酸序列的体内或体外表达合成,每条核酸序列编码特定的肽。
肽任选地可在接触包含T细胞的样品的大量培养物之前分离和纯化。合适的方法包括例如色谱法(例如,离子交换色谱法、亲和色谱法、大小排阻柱色谱法、高压液相色谱法等)、离心法、差示溶解度法或任何其它合适的肽或蛋白质纯化技术。在某些实施方案中,肽可以是标记的(例如,放射性标记、发光标记、化学发光标记、亲和标记等),以便有利于肽的纯化。
在另一个方面,提供鉴定候选免疫刺激表位的方法。在某些实施方案中,候选免疫刺激表位可使用计算机执行算法进行候选表位鉴定。此类计算机程序包括例如TEPITOPE程序(参见例如,Hammer等,Adv.Immunol,第66卷,第67-100页,1997年;Sturniolo等,Nat.Biotechnol.,第17卷,第555-561页,1999年;Manici等,J Exp.Med.,第189卷,第871-876页,1999年;de Lalla等,J.Immunol.,第163卷,第1725-1729页,1999年;Cochlovius等,J.Immunol.,第165卷,第4731-4741页,2000年;这些文献的公开内容以引用方式并入本文),以及其它计算机执行算法。
用于候选表位鉴定的计算机执行算法可鉴定例如单个蛋白质、大型蛋白质、相关蛋白质的组(例如,同源物、直系同源物或多态性变体)、不相关的蛋白质的混合物、组织或器官的蛋白质或生物体的蛋白质组中的候选表位。除分析已知候选分子靶标之外,使用此方法还可根据表达蛋白质的序列信息查询复合组织或生物体(例如,从推导开放阅读框或cDNA文库查询),是鉴定潜在T细胞表位的有效、灵敏、特异性方法。
在鉴定候选表位后,可形成一个或多个候选表位对应的肽或肽库。例如,一定鉴定出候选表位,即可制备跨越候选表位或其部分的重叠肽,以确认刺激T细胞,以及(如有需要)限缩该表位的鉴定结果。或者,可制备包括多个候选表位的肽库,该候选表位使用计算机执行算法进行候选表位鉴定。
使用肽刺激包含T细胞的大量培养物
在另一个方面,使包含T细胞的样品的大量培养物与肽库接触,以确定库中的至少一个肽是否以表位特异性方式结合和刺激T细胞。此类接触可在引发、再刺激和增殖步骤之间进行。在一些实施方案中,使用多种大量培养物。
一般来讲,使用肽培养从所关注的受试者分离的包含T细胞的样品的大量培养物,该肽可处于肽库中,该肽库是肽库的文库的一部分。在一个优选的实施方案中,大量培养物还包含抗原呈递分子,该抗原呈递分子是可溶解的或由细胞表达的,该细胞能够在从受试者分离的T细胞的准确环境中呈递肽。
在一些实施方案中,T细胞在存在表位或免疫刺激表位库的情况下在T细胞培养基中引发、再刺激、增殖、培养、接触、温育等约1至10天之间或更长,以刺激衍生表位的抗原特异性T细胞的增殖。培养基任选地可补充用于T细胞的培养和/或生存的其它组分(例如,血清、抗生素、细胞因子、共刺激受体激动剂等)。
使包含T细胞的样品在合适的结合条件下与肽库/免疫刺激表位接触。在一个实施方案中,结合条件为37℃、在任何合适的T细胞培养基(例如,RPMI 1640、AIM-V、OpTmizerCTS培养基)、磷酸盐缓冲盐水、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水、Dulbecco改良Eagle培养基、Iscove培养基等中。培养基可补充有用于T细胞的培养和/或生存的其它组分(例如,血清、抗生素、细胞因子等)。肽的适当浓度可通过滴定确定。在一个实施方案中,肽库中的每个肽或免疫刺激表位以约2ng/mL至约100μg/mL的最终浓度添加。在一个实施方案中,特别是对于在呈递之前不需要进一步加工的肽,每个肽以20和200ng/mL之间的浓度添加。对于大型肽而言,每个肽以约10μg/mL至约50μg/mL,最优选地20μg/mL的浓度添加。
抗原特异性T细胞的检测及其免疫刺激表位的鉴定
抗原特异性T细胞及其结合的免疫刺激表位可通过T细胞活化检测鉴定。通过比较包含来自受试者的T细胞的样品的不同大量培养物与不同的肽库接触时的活化状态,可鉴定包含抗原的免疫刺激表位的一个或多个肽库。在一个实施方案中,大量培养物中活化T细胞的检测将使用大量培养物温育的表位库中的肽跨越的抗原区域鉴定为包含活化T细胞的免疫刺激表位。
在某些实施方案中,进行一个或多个另外的筛选轮次(或循环),其中使用所鉴定的一个或多个肽库中的单个肽筛选包含T细胞的样品的大量培养物。通过单个肽的分析,可将一个或多个免疫刺激表位鉴定为一个或多个肽,或一个或多个肽的一部分。在相关的实施方案中,可任选地合成另外的肽,以进一步定义一个或多个表位。例如,可制备截短的肽,以限缩表位的鉴定。
T细胞活化可使用熟知的方法确定,以检测和/或测定任何多个标准活化依据(例如,T细胞增殖的测定,活化细胞因子的释放,细胞表面活化标记物的表达等)(参见例如,Novak等,J.Immunol.,第166卷,第6665-6670页,2001年;Kwok等,J.Immunol.,第164卷,第4244-4249页,2000年;Fraser等,Immunology Today,第14卷,第357页,1993年;Novak等,International Immunology,第13卷,第799页,2001年;这些文献的公开内容以引用方式并入本文。)。
在一个优选的实施方案中,活化通过检测熟知的活化细胞因子的存在确定。非限制性例子包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-35、TNFα和IFNγ,例如IL-2、IFNγ、TNFα等。在一个优选的实施方案中,活化通过检测单个活化细胞因子优选地IFNγ的存在确定。
在另一个实施方案中,活化通过检测至少第二熟知的活化细胞因子的存在确定。优选地,通过第一活化细胞因子的活化水平是否低于被视为存在的阈值来检测是否存在第二活化细胞因子。在此类实施方案中,活化可通过检测是否存在第一和第二活化细胞因子来确定。
活化细胞因子的活化水平可通过与阴性对照培养物,例如使用阴性对照肽或不使用肽温育的样品的大量培养物的比较确定。一般来讲,活化细胞因子的活化水平可通过根据本文所公开的方法引发和再刺激的大量培养物的上清液中活化细胞因子的浓度与作为阴性对照温育的样品的大量培养物的上清液中活化细胞因子的浓度的比较来确定。活化水平可通过与阴性对照相比的倍数增加来确定,例如浓度增加1.5倍可视为活化水平为1.5,与阴性对照相比增加10倍可视为活化水平为10等。在一个实施方案中,如果活化细胞因子的活化水平为至少约1.2,例如约1.5、约1.8、约2、约2.5、约5、约7.5,优选地至少约10,则确定该活化细胞因子存在。在另一个实施方案中,如果第一活化细胞因子和第二活化细胞因子的累积活化水平达到至少约1.2,例如约1.5、约1.8、约2、约2.5、约5、约7.5,优选地至少约10,则确定第一和第二活化细胞因子存在。
在示例性实施方案中,使用酶联抗体,例如酶联免疫吸附斑点分析(ELISPOT)和酶联免疫吸附分析(ELISA)检测是否存在活化细胞因子。在一个优选的实施方案中,活化使用ELISA确定。在另一个优选的实施方案中,使用基于微珠的分析检测是否存在活化细胞因子。
包含活化T细胞的组合物以及使用该组合物治疗疾病的方法
在检测受试者中的抗原特异性T细胞和鉴定该细胞应答的免疫刺激表位时,免疫刺激表位可用于制备包含抗原特异性T细胞的组合物的方法,例如用于治疗疾病。
因此,本文提供了制备包含抗原特异性T细胞的组合物的方法,该方法包括:(a)根据本文所公开的方法检测患有疾病的患者中的抗原特异性T细胞和鉴定抗原特异性T细胞对其应答的免疫刺激表位,其中包含T细胞的样品从患者分离,以及(b)使用所鉴定的免疫刺激表位增殖从患者分离的T细胞。在一个实施方案中,增殖T细胞从而得到治疗有效量的施用给需要其的患者的T细胞。
“治疗有效量”或“有效量”意指,当施用给受试者用于治疗疾病、病症或病状时,组合物、化合物、疗法或疗程的量足以实现此类疾病、病症或病状的治疗。“治疗有效量”将根据组合物、化合物、疗法、疗程、疾病、病症或病状及其严重性以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。在另一个实施方案中,方法还包括最后一个步骤:使T细胞减弱的步骤。
本文还提供了根据上述方法制备的包含抗原特异性T细胞的组合物。在一个实施方案中,组合物包含减弱的抗原特异性T细胞。在一个优选的实施方案中,组合物包含治疗有效量的抗原特异性T细胞(可以是减弱的),以治疗选自癌症、感染性疾病和自身免疫疾病的疾病。
技术人员将认识到,此类组合物可具有治疗癌症和感染性疾病以及(当T细胞减弱时)自身免疫疾病的特定用途。此类方法包括将治疗有效量的本文提供的包含抗原特异性T细胞的组合物施用于需要其的患者。对于这些组合物而言,根据本文所述的方法检测抗原特异性T细胞和鉴定免疫刺激表位,其中该抗原与疾病相关。在优选的实施方案中,用于引发、再刺激和增殖步骤的包含T细胞的样品从待治疗的患者分离,使得所施用的组合物包含自身T细胞。
在一个实施方案中,患者患有癌症,根据本文所公开的方法鉴定的免疫刺激表位衍生自癌症相关的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。特别关注的癌症是呈递肿瘤相关或肿瘤特异性抗原的那些癌症。此类抗原可呈递于异常环境中,通常具有高水平,或可以是突变形式。肿瘤抗原特异性自身T细胞可作为响应于肿瘤细胞的宿主T细胞对其应答的一部分施用。
肿瘤抗原的例子是细胞角蛋白,特别是作为癌抗原的细胞角蛋白8、18和19。上皮细胞膜抗原(EMA)、人类胚胎抗原(HEA-125)、人乳脂肪球、MBr1、MBr8、Ber-EP4、17-1A、C26和T16也是已知的癌抗原。肌间线蛋白和肌特异性肌动蛋白是肌原肉瘤的抗原。胎盘碱性磷酸酶、β-人绒毛膜促性腺激素和α-胎儿球蛋白是滋养层和生殖细胞肿瘤的抗原。前列腺特异性抗原是前列腺癌的抗原、结肠腺癌的癌胚抗原。HMB-45和酪氨酸酶是黑素瘤相关的抗原。嗜铬粒蛋白-A和突触小泡蛋白是神经内分泌和神经外胚层肿瘤的抗原。特别要关注的是形成具有坏死区域的实质性肿块的侵润性肿瘤。
多种常规的癌症疗法诸如化学疗法和放射疗法显著减少了淋巴细胞群体。虽然受试者治疗可在一定程度上缓解此免疫抑制,但在受试者治疗之前或之后优选的组合疗程将使用此类淋巴毒性治疗。
上述组合物也可作为响应于病原体的宿主应答的一部分施用。当宿主抗病毒机制失效时,某些病毒的感染成为慢性的。此类感染可持续多年或甚至受感染宿主的生命期,并且通常导致严重的疾病。显著发病和早期死亡相关的慢性感染包括两种人类肝炎病毒:乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HVC)的感染,该感染导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌。其它人类慢性病毒感染包括人类逆转录病毒:人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)的感染(该感染导致AIDS)和人类嗜T淋巴球病毒(HTLV-1和HTLV-2)的感染(该感染导致T细胞白血病和骨髓病)。人类疱疹病毒包括单纯疱疹病毒(HSV)1型和2型、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(EBV)、细胞巨化病毒(CMV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)和人类疱疹病毒6(HHV-6)的感染通常不会被宿主机制根除。当宿主防御机制不能消除时,在细胞内复制的其它感染原,诸如病原性原生动物,例如锥体虫、疟疾和弓形虫(Toxoplasma gondii);细菌,例如分枝杆菌(Mycobacteria)、沙门氏菌(Salmonella)和李斯特氏菌(Listeria);和真菌,例如假丝酵母(Candida)的感染也可成为慢性的。
本文所公开的组合物可施用给患有此类慢性病原体感染的患者,其中T细胞是衍生自病原体的抗原的所鉴定免疫刺激表位特异性的。多种此类抗原是本领域已知的,并且可通过病原体的分离或通过重组方法表达获得。例子包括HIV gp120、HBV表面抗原、病毒的包膜和外壳蛋白等。
当上述组合物包含减弱T细胞时,此类组合物也可作为T细胞免疫治疗施用给需要其的患者。在一个实施方案中,患者患有自身免疫疾病,并且根据本文所公开的方法鉴定的免疫刺激表位衍生自与自身免疫疾病相关的自身抗原。
自身免疫疾病的非限制性例子包括多发性硬化症、类风湿性关节炎、自身免疫葡萄膜视网膜炎、糖尿病、神经炎、多发性肌炎、牛皮癣、白癜风、斯耶格伦综合征、自身免疫胰腺炎、炎性肠疾病(例如,克罗恩氏病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎)、乳糜泻、肾小球肾炎、硬皮病、肉样瘤病、自身免疫甲状腺疾病(例如,桥本氏甲状腺炎和格雷夫斯病)、重症肌无力、阿狄森氏病(Addison's disease)、寻常型天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、恶性贫血和系统性红斑狼疮。在一个优选的实施方案中,自身免疫疾病是多发性硬化症。
用于扩大T-细胞(用于自身免疫疾病的免疫治疗)的自身抗原的例子包括但不限于:髓鞘蛋白诸如髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白(PLP)以及多发性硬化症的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白。
对于硬皮病、全身性硬化和系统性红斑狼疮而言,自身抗原包括例如β-2-GPI、Ku(p70/p80)或其80-kd亚基蛋白、核自身抗原La(SS-B)和Ro(SS-A)、蛋白酶体β-型亚基C9、中心体自身抗原PCM-1、多发性肌炎-硬皮病自身抗原(PM-Scl)、自身抗原CENP-A、U5、核仁U3-和Th(7-2)核糖核蛋白、核糖体蛋白L7、hPop1和来自核基质抗原的36-kd蛋白。
对于皮肤的自身免疫疾病而言,可用的抗原包括但不限于:450kD人类表皮自身抗原、230kD和180kD大疱性类天疱疮抗原、落叶型天疱疮抗原(桥粒芯糖蛋白1)、寻常型天疱疮抗原(桥粒芯糖蛋白3)、BPAg2、BPAg1、VII型胶原、瘢痕性类天疱疮患者子集中的168-kDa粘膜抗原和218-kd核蛋白(218-kdMi-2)。
胰岛素依赖性糖尿病相关的自身抗原包括但不限于:胰岛素、前胰岛素、GAD65和GAD67、热激蛋白65(hsp65)、胰岛细胞抗原69(ICA69)、胰岛细胞抗原相关蛋白-酪氨酸磷酸酶(PTP)、GM2-1神经节苷脂、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞抗原(ICA69)、Tep69、胰岛细胞蛋白酪氨酸磷酸酶及其衍生的37-kDa自身抗原(包括IA-2)和福格林。
类风湿性关节炎相关的自身抗原包括但不限于:人软骨细胞糖蛋白-39、胶原、II型胶原、软骨链蛋白、埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白和分枝杆菌热激蛋白6。
与自身免疫甲状腺疾病相关的自身抗原包括:甲状腺过氧化物酶和甲状腺刺激激素受体和人TSH受体的非限制性例子。
重症肌无力相关的自身抗原包括但不限于:乙酰胆碱受体和肌肉受体激酶。
实施例
实施例1:培养环境和培养持续时间对诱导抗原特异性T细胞应答的影响评估;在微量培养后IFNγELISpot作为检测稀有抗原特异性T细胞的高灵敏度方法评估;以及在培养第6天检测抗原特异性免疫和表位表达谱分析建立的常规的ELISA评估。
实施例1.1:材料和方法
组织培养基
将完全OpTmizer CTS培养基(Life Technologies)用于整个方法开发,在使用前补充2体积%热减弱混合人AB血清(Valley Biomedical)和L-谷氨酰胺(LifeTechnologies)至终浓度2mM。根据制造商的说明,重构培养基的有效期设定为1个月。
外周血单核细胞(PBMC)
外周血单核细胞(PBMC)从来自Key Biologics,Memphis,TN的健康供体血液成分分离产物获得。MS供体的PBMC在临床地点根据IRB批准的Opexa方案OP-BD-007以120ml抽血收集。受试者募集、筛选和抽血在以下两个临床地点收集:Dr Gazda,Integra ClinicalResearch,LLC,San Antonio,TX和Dr Fox,Central Texas Neurology Consultants,RoundRock,TX。根据Opexa方案2005.00(称为‘TERMS’的第2b阶段临床试验)获得的存档PBMC也用于早期方法开发。
从血液成分分离和全血富集的PBMC通过将原材料以1:2稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)来存档,并且将多个30ml稀释产物的等分试样加入50ml锥形管,每个锥形管包含15mlFicoll Hypaque Premium(GE Healthcare)。以800g进行Ficoll梯度离心20分钟。从每个管的界面收集单核细胞、混合、1:5稀释于PBS中,通过300g离心10分钟洗涤PBMC。将细胞重悬于50ml PBS中、进行计数并用于方法开发或使用制造商的说明以5x107或2x108个PBMC/ml冷冻保存于CS10冷冻保护剂(BioLife)中。将细胞置于Coolbox(Biocision)中,保持在2-8℃下,然后转移到Coolcell(Biocision),在-80℃下程控冷冻过夜。将PBMC转移到蒸气相液氮长期储存。
通过在37℃水浴中迅速解冻最多四瓶细胞,从液氮储存恢复全血或血液成分分离产物的冷冻储存PBMC,并稀释到50ml OpTmizer CTS完全培养基。以250g离心细胞10分钟,然后重悬于10ml完全OpTmizer CTS培养基中,然后进行计数,并用于下游方法开发。
利用细胞巨化病毒(CMV)回忆应答进行微量培养物分析研究
通过血液成分分离从预筛选的HLA-A2阳性、抗CMV免疫球蛋白反应性健康供体收集PBMC。将来自CMV pp65的优化的HLA-A2结合的9-mer肽(NLVPMVATV)以200ng/ml的浓度溶于补充有20IU/ml IL-2的完全OpTmizer CTS培养基(R&D systems)中,用于刺激1ml微量管中的PBMC(1x106/350ul或1x106/ml)3或5天。通过在培养的第3天或第5天加入200ng/ml肽再刺激微量培养物。在肽脉冲24小时后,收集上清液,并通过夹心ELISA分析IFNγ含量。
在微量培养物中使用存档MS供体PBMC研究抗髓鞘免疫
在早期开发中,使用来自TERMS临床试验的存档PBMC研究对一组包含MBP、MOG和PLP的序列的109个肽的免疫。肽文库构建为一系列16-mer肽,其中有12-mer重叠。肽根据其在每个髓鞘抗原的相应蛋白质序列中的线性位置按质量成对混合。序列表、配对混合物和最终库在附录中提供。
在350ul补充有20IU/ml IL-2的完全OpTmizer CTS培养基中建立1x106个PBMC/1.2ml圆底微量培养管,并且每个肽“对”以1ug/ml脉冲,总共55种微量管培养物。在5天后,通过加入1x106个PBMC和1ug/ml适当的肽对再刺激培养物。在第0和5天不存在肽刺激的情况下,使阴性对照培养物接受PBMC。在第6天,从所有培养物收集培养物上清液,并经受通过夹心ELISA进行的IFNγ含量分析。
通过夹心ELISA测定培养物上清液中的IFNγ
使用得自BD Bioscience的具有链亲和素-HRP的捕集和检测抗体以及OptEIA分析稀释剂通过夹心ELISA进行IFNγ含量测定。使用制造商的说明进行ELISA。简而言之,用100ul 1:250稀释于涂覆缓冲液(pH9.6)的储备捕集抗体涂覆96孔ELISA板,并在2-8C下温育过夜。使用Biotek ELx405 96孔板洗涤器通过PBS洗涤平板5次。向每个孔加入100ul蛋白质阻断溶液,并在室温下温育2小时。通过倾析平板并吸去吸附的组织来移除阻断溶液,然后向指定的孔加入100ul体积的上清液。在一些实验中,将“未稀释”至1:8倍比稀释的上清液加入ELISA平板。在每种情况下,平板布置允许每个平板接收涵盖300至25pg/ml范围的重组IFNγ曲线。分析的LLOQ设定为11.25pg/ml。在温育2小时后,用0.05%溶于PBS的Tween20洗涤平板7次,然后加入1:250稀释的结合到链亲和素-HRP的生物素酰化检测抗体。使平板在室温下再温育一小时,然后用0.05%溶于PBS的Tween 20洗涤14次。通过在每20ml蒸馏水中加入一粒尿素片剂和一粒OPD片剂重构邻苯二胺(OPD)酶底物。将100ul底物溶液施加到所有的孔,并在室温下黑暗处温育30分钟。光密度(OD)使用BioTek ELx800 ELISA读板器测定,滤光器设定为450nm。使用Genie 5软件(BioTek)生成IFNγ标准曲线,将OD读数转换为IFNγ的浓度(pg/ml)。
通过ELISpot测定IFNγ分泌细胞的频率。
所有ELISpot均使用由eBioscience供应的试剂盒形式的试剂在96孔板中进行。在使用前24小时,在2-8C下使用100ul 1:250稀释的抗IFNγ捕集抗体涂覆ELISpot平板。倾析捕集抗体,并更换为200ul阻断溶液,该阻断溶液由RPMI培养基加上10%FBS构成,并且平板在室温下进一步温育2小时。倾析阻断溶液,将各种实验的PBMC制剂(参见实验设计和步骤)以100ul的总体积加入指定的孔。如有必要,向每个孔的50ul体积再加入1x105个PBMC,作为抗原呈递来源(APC)。肽以80ug/ml的浓度加入50ul体积中,在分析孔中得到20ug/ml的最终肽浓度。当排除APC或肽时(阴性对照),将单独培养基更换为适当体积的细胞悬浮液或肽溶液。对于分析中的阳性对照而言,使用50ul浓度为20ug/ml的PHA-L代替肽对接受应答细胞和APC的对照孔进行脉冲。负载的ELISpot平板在37C下温育大约18小时,以允许在各种微孔中分泌和捕集IFNγ。在完成细胞培养时,将平板从温育移除,并用蒸馏水洗涤两次,以裂解和移除细胞,然后用0.05%溶于PBS的Tween 20再洗涤五次。所有洗涤使用BioTek ELx405平板洗涤器进行。向洗涤的平板加入100ul/孔1:250稀释的溶于分析稀释剂的生物素酰化抗IFNγ检测抗体,并且平板在室温下进一步温育2小时。然后使用七次变化的0.05%溶于PBS的Tween 20再次洗涤平板,然后加入100ul/孔1:100稀释的溶于分析稀释剂的储备链亲和素-HRP。然后在室温下温育平板1小时。在完成时,使用0.05%溶于PBS的Tween 20洗涤平板七次,然后单独用PBS再洗涤五次。AEC底物通过以下步骤制备:将10滴浓缩物加入10ml分析稀释剂,并将100ul底物溶液加入每个ELISpot孔。在大约20分钟的时期后,显影斑点变为可见的,通过蒸馏水洗涤五次淬灭反应。使显影平板空气干燥过夜,然后在CTL Immunospot读取器上使用ImmunoSpot软件5.1.8版对斑点计数。
通过ELISpot对抗破伤风毒素(TT)应答进行定量
直接体外ELISpot
将来自健康供体的PBMC一式四份以2x105个细胞/孔直接接种于200ul完全Optmizer CTS培养基中,该培养基补充有20ug/ml一组七个(TT1-TT7)包含已知免疫显性决定子的破伤风毒素肽中的一个。肽使用FMOC化学法合成,通过HPLC纯化至大于95%的肽纯度。单个肽溶解于二甲基亚砜(DMSO)、乙酸和/或水中,达到5mg/ml的终浓度。包含200ng/mlHLA-A2 CMVpp65 9-mer的四个平行孔作为对照回忆抗原包括在内,此前使用来自该供体的PBMC检测该肽对该抗原的免疫。阴性对照孔在不存在肽的情况下接受PBMC。使ELISpot平板温育过夜,随后如上文所述通过斑点计数进行IFNγ分泌细胞的计数。
在微量培养5天后进行ELISpot
PBMC以1x106个细胞/微量管接种于500ul体积完全OpTmizer CTS培养基中。每个管补充有20ug/ml一组七个(TT1-TT7)破伤风毒素肽中的一个加上5IU/ml终浓度的IL-2。阴性对照微量培养物由培养基中的细胞加上IL-2构成,但不存在任何肽。在培养5天后,轻轻重悬每个微型管的内容物,培养物以100ul等分试样分配到四个平行ELISpot孔中,以建立用于分析的四个平行的相同孔。向孔的50ul体积再接种1x105个PBMC,作为抗原呈递来源,并且肽以80ug/ml的浓度重叠于50ul中,在ELISpot培养物中得到20ug/ml的终浓度。阴性对照孔还包含另外的PBMC,但不存在肽。在37C下过夜温育后,对ELISpot平板显影,并且如上文所述对IFNγ斑点进行计数。
使用微量和大量培养以及ELISpot对细胞-ELISA对抗髓鞘免疫进行定量
在微量培养后,使用55个肽“对”编码MBP、MOG和PLP(对照组使用检测抗破伤风应答所用的七个肽文库)扩大培养与破伤风毒素肽应答定量所用类似的分析形式,以研究抗髓鞘免疫。在此形式中,建立500ul培养体积的完全OpTmizer CTS培养基中的1x106个PBMC,该培养基补充有5IU/ml IL-2加上20ug/ml终浓度的一个肽对,总共55个微量管,涵盖全部髓鞘肽文库。再次平行运行阴性对照培养物,该培养物由PBMC和IL-2构成,但不存在肽。
为增加暴露至任何一个抗原来源的PBMC的总数,根据由六个组成的组(对照组成“对”进行测试)的质量等量混合肽,并在第0天将20ug/ml这些肽库加入无菌5ml圆底试管中1.5ml完全OpTmizer CTS中的3x106个PBMC。
在培养的第5天,轻轻重悬每个微量培养管中的细胞,并将100ul等分试样一式四份接种于ELISpot平板中。对于5ml试管中的大量培养物而言,移除1ml培养基并将细胞重悬于其余的500ul中,然后接种以进行分析。在每种情况下,在第0天存在20ug/ml所用的匹配髓鞘肽对或库的情况下使用1x105个PBMC作为抗原呈递来源再刺激孔。在过夜培养后,对ELISpot平板显影,并对IFNγ斑点定量。在一些实验中,将培养物的二分之一和八分之一各两份接种于孔中(对照组将全部培养物均匀接种于四个孔中),以减少每个孔的潜在斑点数,从而提高斑点定量的准确性。
作为ELISpot的替代形式,将细胞-ELISA作为检测原位累积IFNγ分泌的方法进行研究,对照组对IFNγ分泌细胞的数量进行定量。第5天的培养物的接种方式与ELISpot孔相同。然而在细胞-ELISA中,ELISA平板预先涂覆抗IFNγ捕集抗体,代替ELISpot平板。在过夜温育后,使用0.05%溶于PBS的Tween 20洗涤5次,将细胞从平板移除,使用由eBioscience供应的试剂对分析进行显影,并用于上述常规夹心ELISA。再次参考细胞ELISA(但不存在细胞)中滴定的IFN□的标准曲线,将光密度转换为IFNγ的浓度。
在一些实验中,对培养物进行细胞“解离步骤”,然后接种到ELISpot或细胞-ELISA分析。这通过以下步骤实现:在第5天离心(10分钟250g)培养管,移除用过的培养基,随后使用0.5ml PBS洗涤,重复离心,然后在37℃下悬浮于0.5ml 1mM EDTA,10U/ml溶于PBS的DNA酶10分钟。通过离心移除解离溶液,并用0.5ml完全OpTmizer CTS补充细胞,然后进行下游分析。
优化的表位表达谱分析
将3x106个PBMC接种于18个5ml FACS管中的每个,该FACS管含有1.5ml补充有5IU/ml IL-2的完全OpTmizer培养基。将每个培养物加入18个肽库中的一个,达到20ug/ml的终浓度。两个阴性对照管接受溶于培养基的PBMC,但不存在肽。在第0天给另外的管接种PBMC,随后在第5天用另外的PBMC和PHA脉冲时作为阳性对照。掩盖所有试管,并在37C 5%CO2下温育5天。在第5天,从每个试管移除1ml用过的培养基,将1x106个PBMC加入补充有匹配肽库的0.5ml总体积,在1ml的最终培养物体积中获得20ug/ml的终浓度。阴性对照管接受0.5ml培养基中的1x106个PBMC,但不含肽。阳性对照(从第0天不接受肽的管建立)接受另外的1x106个PBMC,用PHA-L代替肽,在1ml最终培养物体积中获得2ug/ml的终浓度。试管在37C5%CO2下温育18-24小时的时期。然后收集上清液,并从“未稀释”双倍稀释至1:8,并施用到常规夹心ELISA。参考包括每个测试板的IFNγ标准曲线记录IFNγ浓度。
“反应性”肽库阳性的临时定义如下:1:2稀释的上清液中的IFNγ含量大于阴性对照2.5倍,即PBMC培养物在不存在肽的情况下始终得以保持。
实施例1.2:结果
实施例1.2.1:培养环境和培养持续时间对诱导抗原特异性T细胞应答的影响
图1和2示出了使用HLA-A2呈递的优化的9-mer肽时,时间和培养条件对CMVpp65T-细胞回忆应答的影响。以高密度(1x106个PBMC/350ul)培养细胞使得在培养的第4和6天检测到抗原特异性IFNγ的浓度增加4-5倍。向培养物加入20IU/ml IL-2由于支持T-细胞增殖会大大增加IFNγ应答,从而增加培养物中抗CMV pp65反应性T-细胞的克隆呈递。总共培养6天,在第5天再刺激抗原,与仅培养4天后,在第3天使用抗原再刺激所培养和分析的细胞相比,使得抗CMV pp65 T-细胞应答大大增加。
图3和4示出了使用优化的CMV pp65抗原回忆应答产生的接种密度和培养条件(图2),两种MS供体PBMC制剂对109个髓鞘肽文库的成对混合物的刺激的IFNγ应答。两种供体均未显示出大于背景2倍所定义的IFNγ抗髓鞘肽相对于阴性对照(仅培养基的微量培养物)的任何显著活性。使用供体011054的分析显示出阴性对照培养物中的一个的高背景应答所定义的存在“假阳性”活性。
实施例1.2.2:IFNγELISpot的评估是在微量培养后检测稀有抗原特异性T细胞的高灵敏度方法
不能观察到清晰的抗髓鞘肽IFNγ活性暗示,所开发的培养条件不足以支持低频率髓鞘反应性T-细胞组库,或分析读数未显示出描述相对于背景的阳性应答的足够严重性。为了对后者进行评估,实施IFNγELISpot分析,以代替常规夹心ELISA,用于定量相对于上清液中测定的累积IFNγ应答的培养物中IFNγ分泌细胞的频率。ELISpot分析通常用于检测低频率T-细胞应答。此外,为了控制培养物中的背景应答,IL-2的浓度从20IU/ml减少至5IU/ml。
为建立ELISpot后细胞培养物对定量稀有T-细胞应答的影响,设定分析从而使健康供体(03094)的PBMC经受针对破伤风毒素的一组七个已知免疫显性决定子肽的直接体外ELISpot,如上述文献所述。或者,在存在每个肽的情况下细胞培养后第5天进行重复分析,并在ELISpot环境中再刺激。
图5示出,供体的PBMC的直接体外ELISpot不能检测IFNγ分泌性抗破伤风毒素T-细胞的存在,但来自CMV pp65的HLA-A2免疫显性肽的免疫易于检测为“回忆”应答。然而,当在存在每个破伤风毒素肽的情况下,PBMC经受5天细胞培养以扩大培养稀有T-细胞克隆,然后进行ELISpot时,获得特异性应答。为确认至少TT4的应答不是“假阳性”,每周使用达21天培养期的肽加上另外的供体细胞样品的PBMC重复再刺激成功产生TT4-反应性T-细胞系。
在建立微量管和候选抗原即破伤风毒素的ELISpot终点,并且微量培养物可将破伤风应答扩增至可检测范围后,进行分析以研究抗髓鞘T-细胞免疫。首先将分析应用到健康供体PBMC。对相同来源的存档组织库进行两种分析,以反映分析间差异。图6和7示出了鉴定两种ELISpot分析之间阳性应答肽库的不一致性。
为确认共培养微量IFNγELISpot平台的较小分析间差异,将分析应用到从两个MS供体收集的PBMC。每个供体的分析进行两次,第二分析利用相同的PBMC,但来自冷冻保存来源。另外,数据产生了不一致的结果(图8和9)。
缺乏可重复性,以及任何一种肽混合物的四个平行孔之间存在标准偏差暗示,潜在反应性T-细胞在四个平行ELISpot系列的每个成员孔之间的分布不均匀。这可以是细胞培养5天转移到ELISpot之前不充分解离而在微量管中形成聚集体的结果。由于洗涤时细胞碎片从ELISpot孔的移除不充分,聚集体也可在ELISpot中导致“假阳性”数据,然后检测抗体的非特异性捕集在分析中导致“假斑点”。为了试图改善每个肽混合物的四个平行ELISpot组中的任一组之间的细胞分布,并减少聚集体产生“假阳性”数据点的风险,微量培养物样品首先经受“解离步骤”,以增加接种单个细胞悬浮液的可能性,并减少带入ELISpot分析的细胞和碎片聚集体的数量。解离步骤通过如下步骤实现:洗涤微量培养物,重悬于37℃下含10U/ml溶于PBS的DNA酶的1mM EDTA中10分钟,然后重悬于细胞接种培养基中并进行最后分析。
另一个问题涉及抗髓鞘T-细胞免疫的绝对频率,以每个肽对取样的应答细胞/PBMC的数量计。成“对”混合的109个肽文库的使用根据来自120ml抽血的PBMC可能产率,规定了1x106个细胞/微量培养物的PBMC样品量,以支持分析设计。此样品量太小,以至于预期文献暗示外周血中抗髓鞘T-细胞的频率在1/105至1/106个细胞的范围内时,不能检测可靠的抗髓鞘T-细胞免疫。为解决此问题,以及除聚集体对最后ELISpot分析的影响之外,设定微量培养物中的PBMC,在微量管中包含的PBMC样品量为1x106或3x106个细胞/350ul体积,并研究对MOG肽文库的应答,如上文所述成“对”混合MOG肽。
图10示出,微量管培养物的接种ELISpot(初始以1x106个PBMC接种)揭示了对肽混合物MOGm16的“弱”应答。在此实验中,解离步骤的应用对“未处理的”培养基对照所定义的“假阳性”可能性的影响最小。然而,利用3x106个PBMC作为第0天接种材料产生的对肽库MOGm16的应答更强,并且解离步骤移除了未处理的对照中存在斑点所定义的“假阳性”的风险。
上述数据支持了每个肽库的样品量增加。然而,由于等待从120ml抽血移除的PBMC的量有限,不可能筛选成对混合的109个肽文库,从而产生55个肽“靶标”,样品量为3x106个PBMC/靶标。为了能够将PBMC样品量增加至3x106个细胞/肽“靶标”,需要混合重叠肽文库产生6个肽的“库”(对照组仅“成对”)。实际上,MBP文库由6个肽的6个“库”构成。对于MOG,6个肽的5个“库”,其中c-末端库(MOGp6)由八个肽构成。最后,PLP由6个肽的5个“库”构成,并且一个库(PLPp6)由5个肽构成。在此情形下,肽家族涵盖MBP、MOG和PLP,每个由涵盖全部109个肽文库的6个“靶标”构成。为了便于提高样品细胞数量/肽库,即3x106个PBMC,第0天在5ml FACS管中建立1.5ml体积的细胞培养物,对照组在微量管中建立350ul体积。此模式即为所谓的“大量”培养物。
使用ELISpot的另一个问题是计数斑点的“半定量”性质。虽然可校准CTLImmunospot软件来识别均匀性质的斑点,但ELISpot分析中形成的斑点在形状、大小和分布方面差别很大。图11中最好地示出了这一点。由于ELISpot分析在5天的共培养期后进行,抗原特异性T-细胞产生的大斑点的大小不一致,反映出它们对IFNγ分泌的高反应性,以及在18小时的再刺激分析期间它们在ELISpot孔之间的运动性。计数斑点的准确性随着ELISpot孔中活性的增加而下降(图11)。
为了提高ELISpot计数的准确性,特别是第0天接种PBMC样品量从1x106增加至3x106个PBMC,以增加检测到阳性信号的可能性,ELISpot设定为包括细胞稀释步骤,以便对斑点进行准确计数。简而言之,使1.5ml第5天培养物离心,移除用过的培养基,应用“细胞解离”步骤,最后将细胞沉淀物重悬于400ul新鲜培养基中。代表一半大量培养物的ELISpot平板的两个孔各取100ul接种。其余的细胞(200ul)使用600ul新鲜培养基进一步稀释,然后再将100ul细胞悬浮液分配到两个ELISpot孔中的每个,以创建初始接种大量培养物的1:8稀释。
作为ELISpot中“细胞因子分泌细胞的数量”计数的替代形式,还建立了检测IFNγ的“累积分泌”的平行细胞ELISA。分析的形式与ELISpot基本上相同,不同的是该细胞接种于抗IFNγ抗体涂覆的ELISA平板上,而不是硝化纤维ELISpot平板上。在通过加入肽库再刺激和支持作为APC来源的PBMC,以及培养18小时后,洗掉细胞,以常规ELISA对平板显影,包括比色底物。此方法的优点是,当OD解释为IFNγ的浓度依赖性标准曲线时,读数是完全定量的。从相同的冷冻保存PBMC原材料建立ELISpot和细胞ELISA分析,但每个分析从第0天开始进行不同的天数。
图12和13示出,对于第一次开发优选的表位表达谱分析,当根据相同的细胞原材料设定在不同的天数进行独立分析时,甚至当替代分析平台用于最终读数时,个体中的应答肽库检测具有一致性。数据的质量改善几乎毫无疑问涉及初始培养物的量增加,即第0天3x106对1x106个PBMC。这增加了捕集相对稀有髓鞘反应性T-细胞的可能性,该稀有髓鞘反应性T-细胞可在存在来自包括109个肽文库的重叠序列的任一个肽库的情况下,在共培养的前5天期间扩大培养。
ELISpot和细胞ELISA均具有可检测范围的问题。当斑点计数超过200时,包含大量大型反应性斑点的ELISpot孔难以准确定量。细胞ELISA具有大约300pg/ml的定量上限,可导致一些数据点“超出范围”。为解决这些问题,设定包括接种材料的稀释步骤的两种分析(图12和13)。实现准确数据需要准确稀释均匀的细胞悬浮液,这需要引入细胞“解离步骤”,然后将“稀有事件”即髓鞘反应性T-细胞均匀分配于样品孔中。尽管能够实现,但稀释系列导致大量培养物的大量操作,以及在总共三个96孔板上接种,每个抗原靶标MBP、MOG和PLP接种一个96孔板。当旨在设计“高通量”平台时,进行细胞稀释的复杂性以及分析“量”将成为挑战。
实施例1.2.3:在培养第6天检测抗原特异性免疫的常规ELISA评估以及表位表达谱分析(EPA)的建立
细胞ELISA的读数为细胞分泌的IFNγ的浓度,从而从分析自身内部的周围上清液原位捕集。因此除稀释应答细胞数量以进行分析范围内的IFNγ含量分析之外,更简单的方法是不稀释应答细胞,而稀释上清液,进行常规ELISA二次分析。由于其后均匀细胞悬浮液不再具有决定性,可避免细胞“解离步骤”。第5天,在收集上清液进行IFNγ含量定量之前,可在培养管中直接进行大量培养物的再刺激,显著减少培养物的操作。
作为上述限缩分析的初始测试,定性通过四位独立的操作员检测健康供体(3183)对破伤风毒素的公布免疫显性肽序列的免疫应答设定,涵盖总共七个肽(TT1-TT7)。简而言之,每位操作员在第0天设定5ml FACS管中的3x106个PBMC/1.5ml培养基体积的七种培养物,每种使用20ug/ml一组七个肽中的一个脉冲。第5天,移除1ml培养基上清液,加入1x106个PBMC作为抗原呈递来源,再次使用20ug/ml肽脉冲培养物,最终培养物体积为1ml。在过夜温育后,收集上清液并使用常规ELISA分析IFNγ含量,参考重组IFNγ的标准曲线将光密度转换为pg/ml。对“未稀释”和1:2、1:4和1:8稀释的上清液进行分析。
表1示出了如上所述测定的IFNγ的浓度(pg/ml),阈值设定为阴性对照的2.5倍(PBMC在不存在肽的情况下培养)。一致率记录了准确鉴定对单个肽靶标的阳性或阴性应答的操作员(总共四名)的百分比。不出意料,当检测到阳性应答时,一致率随着上清液的滴定而下降,反映了不同操作员之间检测的IFNγ的绝对浓度差异。重要的是,当对未稀释的上清液进行分析时,4名操作员记录到TT肽TT3、TT5、TT6和TT7的阳性活性100%一致。记录到TT肽TT1和TT2的非反应性100%一致。TT4的数据的差异更大,仅一名操作员(HK)检测到强烈应答。TT4缺乏可重复性可反映稀有初级免疫应答的检测,其在第0天开始培养。
表1:利用破伤风毒素肽进行表位表达谱分析的操作员间定性
数据表示大于阳性阈值的IFNγ(pg/ml)设定为大于阴性对照(无肽)培养物2.5倍。ALOQ:大于定量的水平(313pg/ml)
EPA的进一步定性由另外两位操作员使用不同供体(03190)的PBMC以及破伤风毒素肽组进行。表2的数据反映了在测试上清液的1:2稀释点处大于阴性对照(无肽)2.5倍的IFNγ浓度(pg/ml)。1:2稀释点被选为分析的最适当滴定点,因为与“未稀释”上清液中所检测的信号相比,它要求信号为可滴定的。此外,它还排除分析中包括的弱的从而可能假阳性数据。数据示出,两位操作员的供体03190对破伤风毒素肽TT3、TT6和TT7的阳性反应之间100%一致。
表2:利用破伤风毒素肽进行表位表达谱分析的二次定性
数据表示大于阳性阈值的IFNγ(pg/ml)设定为上清液的1:2稀释点处大于阴性对照(无肽)培养物2.5倍。
为了定性髓鞘肽库的优选分析形式,在第0天启动3x106个PBMC/肽库,在第5天进行再刺激,在第6天对上清液进行IFNγ含量定量。使用来源于健康供体的PBMC的单个来源建立不同操作员的三个重复EPA。表3示出,当从滴定上清液的1:2稀释点绘制数据时,供体(03190)具有可检测的对MOGp6、PLPp1和PLPp4的应答。IFNγELISA分析的定量下限水平(LLOQ)为11.25pg/ml。阳性阈值再次设定为大于无肽对照中的应答2.5倍,在这些分析中分析等于LLOQ。
表3:检测髓鞘反应性T-细胞的表位表达谱分析(EPA)的操作员间和分析间定性。数据表示在每个培养物中检测的大于阳性阈值的IFNγ浓度(pg/ml)。
对于该供体具有重复阳性评分的三个免疫反应性肽库为MOGp6、PLPp1和PLPp4。两个最具反应性的肽库(PLPp1和PLPp4)的一致率为100%。对MOGp6的反应性较弱,并且在所进行的6个分析中的5个进行检测。因此,存在假阴性数据的可能性,然而在低频率下,仅反应性较弱的肽库存在该可能性。根据数据,有十五个肽库被视为“非反应性”。在总共90个培养物中(15个肽库进行六次分析),仅两个显示出假阳性数据,显示出大约2%的比率。成功产生用于T-细胞免疫治疗方案的髓鞘反应性T-细胞系的能力仅取决于被选择用于T-细胞增殖的完全反应性肽库。EPA中非常低的假阳性率大大缓解了产生缺乏抗原特异性的T-细胞系的风险。
实施例1.3
为了进一步示例反映阳性T-细胞对髓鞘肽的免疫反应性的细胞因子检测的用途,使表位表达谱分析的上清液经受更详细的分析。为此,使用基于微珠的多重分析进行13个细胞因子的同时检测,以对多功能T-细胞对髓鞘肽的免疫进行表达谱分析。
对来自5个单独MS供体的PBMC进行EPA。如前所述,在第6天收集上清液,24小时后使用另外的PBMC和肽再刺激培养物。
在多重分析之前,离心样品以移除细胞碎片并储存在-20℃下直到分析。在分析制剂中,试剂以MILLIPLEX Magnetic Human Th17试剂盒形式提供,其包括抗体固定微珠、质量控制样品和细胞因子标准品,并且在适当的缓冲液中重构。标准曲线样品使用所提供的分析缓冲液从储备标准品进行1:4系列稀释来制备。使用200μL分析缓冲液温育所提供的平板的所有孔10分钟,以防止非特异性结合。然后弃去分析缓冲液,将25μL每种标准品或对照以及25μL适当的基质溶液加入适当的孔。向每个样品孔加入25μL分析缓冲液以及25μL样品上清液。然后使用25μL抗体固定微珠在避免光照、搅拌、4℃的条件下培养所有孔18小时。然后使用BioTek EL-405平板洗涤器洗涤平板,并施加检测抗体溶液1.5小时。向未洗涤的平板施加链亲和素PE溶液30分钟,立即洗涤以移除所有过量试剂。向所有孔加入150μLMagPix运行缓冲液,然后用MagPix光度计采集数据。使用Millipore Milliplex Analyst软件对样品中的细胞因子水平定量。
如表4所示,全部五个供体显示出对一个或多个肽库的阳性反应。在所有情况下,肽(NP)对照培养物均不能用于设定每个细胞因子的基线自发分泌水平。在所检测的分析物中,IFNγ、TNFα和IL-6最易于检测并且检出的频率最高。
表4:对髓鞘肽应答的五个MS供体样品的细胞因子水平
在建立IFNγ、TNFα和IL-6作为检测多功能MRTC的主要候选活化细胞因子的用途后,使8个另外的MS供体经受三个分析物的多重分析。数据示于表5中。
表5:对髓鞘肽应答的八个MS供体样品的细胞因子水平
实施例1.4:讨论
方法开发的焦点是生成检测PBMC中的髓鞘反应性T-细胞(MRTC)的可靠平台,最后功能读数为IFNγ的分泌。
解决了两个主要问题:
1)PBMC中MRTC的频率较低,及其对阳性免疫检测的样品量的影响。
2)优选的检测系统能够对单个肽库的阳性免疫进行高通量读取。
最初目的是使用成对的109个肽文库创建55个“靶标”,其中测定该靶标的T-细胞免疫。然而,利用120ml抽血作为原材料通常会限制用于1.2-1.5亿个细胞分析的PBMC总数,包含大约1-1.2亿个T-细胞。如果在分析前不经过扩大抗原特异性T-细胞的预培养期,简单体外分析诸如ELISpot的灵敏度不会很高。为利用55个肽靶标,以及允许足够的细胞能够在分析中再刺激培养物,要求任何一种“成对”肽混合物的免疫分析具有100万个PBMC的样品量。尽管处于测试中,但基于100万个PBMC的初始样品量的分析不能称为很大。MRTC可视为“稀有事件”,在PBMC中具有1/105至1/106个T-细胞之间,预期仅100万个PBMC/肽混合物或库的样品量易于成为“假阴性”数据。为解除此限制,将六个肽混为一组,而不是成为一对,创建一组18个肽靶标,在“大量”培养物环境中评估每个肽靶标的300万个细胞的PBMC样品量。
在存在涵盖MBP、MOG和PLP的18个肽库的情况下大量培养PBMC五天后,评估总共三个分析平台的阳性抗髓鞘免疫检测。ELISpot由于能够检测低频率免疫应答,被视为精选的分析。然而,利用检测5天培养物预敏化的免疫的分析仅得到半定量数据。此外,分析需要在接种前进行细胞解离,并且它们的滴定能够可靠地定量“斑点”。作为另外一种选择,开发原位细胞ELISA用于测定“累积”IFNγ分泌。然而,由于缺乏动态范围,细胞仍需要解离和滴定,以允许IFNγ的有效定量。虽然两个分析均产生了鼓舞人心的数据,但平台的复杂性不适用于“高通量”形式。
最终分析模式第0天每个肽库使用300万个PBMC的样品量,第5天再刺激培养物。第6天收集上清液,并滴定为常规IFNγ夹心ELISA。由于此方法避免了任何滴定应答细胞需要,分析平台的复杂性大大降低。
评估优选分析平台的操作员间和分析间差异,该分析平台研究七个来自破伤风毒素的免疫显性肽的免疫,以及18个髓鞘肽库的免疫。
设计分析时的重要考虑因素是限制检测到“假阳性”数据的可能性。为此,阳性阈值初始设定为大于阴性对照培养物2.5倍。此外,ELISA中培养物上清液的1:2稀释必须超出该阈值。选择该阈值将确保,只有当来自“未稀释”上清液的数据分析不能作为潜在的“假阳性”肽选择进行时,弱应答才记为阳性。根据该阈值,仍存在分析可记录偶然的“假阴性”的可能性(参见表3)。然而,最重要的是所选的肽库表示强烈应答,以成功产生T-细胞系,并且显示出抗原特异性免疫。
阳性应答的确定,以及用于T-细胞疫苗制造的肽的分配。
在开发期间,对任何一个肽库的阳性应答通过上清液1:2稀释点处IFNγ浓度(pg/ml)的检测确定,该检测结果比对应的阴性对照培养物的记录高至少2.5倍。如果IFNγ的浓度超出分析的检测上限水平(313pg/ml),则1:4和1:8稀释点必须落在范围内,并显示出滴定度证据。利用表示IFNγ的存在的肽库,例如活性水平高于预定水平的肽库,可产生用于T-细胞免疫治疗的多个T-细胞系。
随着开发的进行,与单个分析物例如IFNγ的检测相比,利用多个细胞因子的上清液EPA分析允许检测多功能T-细胞对髓鞘肽库的应答。因此,可检测更宽泛的反应性组,得到更多的记录为髓鞘的阳性反应的供体。据设想,不同细胞因子组合的检测可用于涉及不同疾病的表位表达谱分析。
表5示出了用于鉴定每个供体对基于多个髓鞘肽与无肽对照的阳性反应的“活性水平”。为支持对髓鞘肽库的阳性反应选择,通过以下活化水平测定一个或多个细胞因子的存在:
单独IFNγ应答大于无肽对照10x。以IFNγ排序。
IFNγ应答大于无肽对照5x且TNFα应答大于无肽对照5x。以IFNγ排序。
IFNγ应答大于无肽对照5x且IL-6应答大于无肽对照5x。以IFNγ排序。
TNFα应答大于无肽对照5x且IL-6应答大于无肽对照5x。以TNFα排序。
对于每个供体,表5示出了每个阳性肽库的细胞因子,或第一和第二细胞因子的存在测定。浓度(pg/ml)列列出了排序最高的细胞因子的浓度及其相关活性水平。在多种情况下,髓鞘肽库的免疫通过多于一个细胞因子的存在测定。对于八个供体中的七个,MRTC反应性通过存在IFNγ达到。对于一个供体(14010030-03856),阳性通过存在TNF-a和IL-6二者的信号但不存在IFNγ达到。
本文所提及的所有专利和专利公布据此以引用的方式并入。
本领域的技术人员在阅读上述具体实施方式时可作出某些修改和改进。应当理解,为了简明和清晰目的,所有此类修改和改进可从本文删除,但仍在以下权利要求书的范围内
髓鞘肽序列、混合物和库
Claims (24)
1.一种检测抗原特异性T细胞和鉴定所述抗原特异性T细胞对其应答的免疫刺激表位的方法,所述方法包括:
(a)使用表位库体外引发至少一种包含来自受试者的T细胞的样品的大量培养物,所述表位库包含一个或多个肽,其中所述表位库中的每个肽是抗原的独特片段;
(b)使用所述表位库再刺激所述大量培养物一段时间,以足以允许对所述表位库中的至少一个肽特异的T细胞释放可检测的至少一个活化细胞因子;以及
(c)检测所述大量培养物中是否存在所述至少一个活化细胞因子;
其中所述培养物中存在所述至少一个活化细胞因子检测对所述抗原特异的T细胞,并且将所述抗原的所述片段鉴定为包含所述抗原特异性T细胞对其应答的免疫刺激表位。
2.根据权利要求1所述的方法,其中每个表位库包含至少两个肽,其中每个肽与所述表位库中的至少一个其它肽共有重叠氨基酸序列同一性的区域,所述表位库中的所述肽一起跨越所述抗原的邻接区域,并且其中所述培养物中存在所述至少一个活化细胞因子将所述表位库中的所述肽跨越的所述区域鉴定为包含所述抗原特异性T细胞对其应答的免疫刺激表位。
3.根据权利要求1所述的方法,其中每种大量培养物包含密度为4.5x105个细胞/mL/mm3的T细胞。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品包含从患者分离的外周血单核细胞。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述患者患有疾病,并且所述抗原与所述疾病相关。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述疾病是自身免疫疾病,并且所述抗原是与所述自身免疫疾病相关的自身抗原。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述自身免疫疾病是多发性硬化症,并且所述自身抗原是髓鞘蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述髓鞘蛋白选自由以下组成的组:髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞蛋白以及它们的组合。
9.根据权利要求5所述的方法,其中所述疾病是肿瘤,并且所述抗原是肿瘤相关抗原。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述肽的长度为约16个氨基酸。
11.根据权利要求1所述的方法,其中每个肽库具有至少2个不同的肽。
12.根据权利要求11所述的方法,其中两个不同肽之间的重叠氨基酸区域的长度为12个氨基酸。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述活化细胞因子是IFNγ。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述活化细胞因子通过ELISA检测。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述表位库来自包括至少两个表位库的文库,并且其中对所述文库中的每个表位库重复步骤(a)-(c)。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述表位库的文库包含跨越所述抗原的至少50%的肽。
17.根据权利要求1所述的方法,其中所述检测步骤包括检测所述大量培养物中是否存在两个活化细胞因子;其中所述培养物中存在两个活化细胞因子检测对所述抗原特异的T细胞,并且将所述抗原的所述片段鉴定为包含所述抗原特异性T细胞对其应答的免疫刺激表位。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述两个活化细胞因子选自:(a)IFNγ和TNFα、(b)IFNγ和IL-6以及(c)TNFα和IL-6。
19.一种制备用于治疗患有疾病的患者的组合物的方法,所述方法包括:
(a)根据权利要求1所述的方法检测来自所述患者的样品中的抗原特异性T细胞,并且鉴定与所述疾病相关的抗原的免疫刺激表位和所述抗原特异性T细胞对其应答的免疫刺激表位;以及
(b)使用所述鉴定的免疫刺激表位增殖从所述患者分离的T细胞。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述疾病是癌症,并且所述抗原是与所述癌症相关的肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
21.根据权利要求20所述的方法,还包括最后一个步骤使所述增殖的T细胞减弱的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述疾病是自身免疫疾病,并且所述抗原是与所述自身免疫疾病相关的自身抗原。
23.一种组合物,其包含根据权利要求19所述的方法制备的T细胞。
24.一种治疗疾病的方法,所述方法包括施用根据权利要求19所述的方法制备的组合物。
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