CN113481157A - 特异性抗病毒过继免疫细胞的优化制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种优化的特异性抗病毒过继免疫细胞的制备方法，所述制备方法包括步骤:(1)取适量经过二周培养扩增的抗病毒特异性T细胞；(2)用同种病毒抗原肽再次激活抗病毒特异性T细胞；(3)采用G‑REX 10瓶培养扩增步骤(2)激活的T细胞至需要的数量。本制备方法，采用G‑REX 10瓶进行细胞的培养扩增，避免了操作中的污染和传代，采血量小、制备时间短，可以继续培养抗病毒特异性T细胞，在第四周再次输注一次VST，而且所获得的免疫细胞病毒抗原的特异性T细胞纯度高、活力强，治疗效果更好。

Description

特异性抗病毒过继免疫细胞的优化制备方法
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗领域，具体涉及抗病毒过继免疫细胞的制备方法。
背景技术
同种异体造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)已成为针对造血系统相关恶性疾病或遗传性疾病最佳治疗方式之一。然而除了需要对造血干细胞供者进行HLA配型之外，为避免出现移植物抗宿主病(graft versus hostdisease，GVHD)，受者需要经历一段免疫空窗期，在此期间其自身免疫力受到巨大破坏，因此患者容易被病毒感染并引发一系列病症，严重者可能危及生命。根据报道，巨细胞病毒(CMV)，EB病毒(EBV)、BK多瘤病毒(BKV)和腺病毒(ADV)感染尤为常见，并且通常被描述为影响HSCT术后预后的关键危险因素。(Francesco Saglio etal.The time is now:moving towardvirus-specific T cells after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation asthe standard ofcare.Cytotherapy.2014Feb；16(2):149–159.)
抗病毒药物是临床控制CMV感染的首要选项，自1980年代以来已有5个药物获准用于治疗CMV，这些药物的总体疗效都不错，但仍有相当比例的患者因不能耐受药物毒性或因基因变异造成病毒耐药而导致治疗失败。(Hantz et al.Drug-resistantcytomegalovirusin transplant recipients:a French cohort study.J AntimicrobChemother.2010；65:2628–2640.)迄今为止国内外均没有抗病毒药物获准用于控制ADV和BKV感染，临床治疗则以病毒DNA聚合酶抑制剂如西多福韦(cidofovir)最为常见，但疗效在很大程度上取决于患者的特异性免疫功能。此外，该药具有毒副作用如骨髓抑制和肾脏毒性，一些患者不易耐受。(Katherine A.Baugh et al.Infusion of cytotoxic Tlymphocytesfor the treatment of viral infections in hematopoetic stem celltransplant patients.CurrOpin InfectDis.2018Aug；31(4):292–300.)
过继细胞疗法(Adoptive cell therapy)是一种新兴的治疗平台，用于在器官移植或造血干细胞移植后诱导肿瘤消退或某些病毒感染的清除。其中病毒特异性T细胞(virus-specific T cells，VST)指经过扩增培养后对病毒编码抗原具有特异性免疫应答能力的记忆T细胞(memory T cells，TM)，VST是临床控制病毒感染的另一个有效选项，尤其在抗病毒药物不能耐受或者治疗失效的感染患者，输注VST后临床获益率(clinicalbenefit)通常达到70％或以上。(Theresa Kaeuferle et al.Strategies ofadoptive T-cell transfer to treat refractory viral infections post allogeneicstem cell transplantation.Journal of Hematology&Oncology.2019Feb；12:13.)
针对VST的制备方法基本可分为经典制备法和快速制备法。研究型实验室多采用经典制备法将PBMC(外周血单个核细胞)与EBV转化的淋巴母细胞共培养，最终培养出针对EBV、ADV和CMV的特异性T细胞，但是此方法所需的抗原呈递细胞(EBV-LCL)需要4至6周的制备时间，而CTL扩展也需要4–8周的时间，培养过程繁琐和制备时间过长都使得细胞制剂不易在GMP环境下进行标准化生产；
较为快速的方法是采集供者外周血，通过特定抗体或磁珠直接富集得到血液中的VST细胞，但正常人体中VST含量非常低，需要大量血液才能实现目的细胞的富集，从标准化生产制备的角度来看可行性不大。
另一种快速制备法则无需制备抗原递呈细胞，国际上常规方法是采集定量外周血并分离出PBMC后，利用抗原病毒的重叠肽段直接激活PBMC中的VST，配合细胞因子进行细胞扩增，此方法培养两周后即收集细胞进行回输治疗，具有采血量少、制备时间短的鲜明特点。(X Wang et al.Manufacture of tumor-and virus-specific T lymphocytes foradoptive cell therapies.Cancer Gene Therapy.2015Mar；22(2):85-94.)但是TSCM/CM亚群相对含量不够高。且目前经常因为病人病情，需要连续输入二次VST，而通常的制备方法由于会发生T细胞分化，无法继续培养出所需的抗病毒特异性T细胞。
因此，本领域迫切需要开发抗病毒特异性T细胞的优化制备方法。
发明内容
本发明优化方法在吸收国际上先进的VST制备经验后，通过创新发展形成了独具特色的VST规模化制备新工艺。该制备过程在符合GMP标准的洁净环境中实施，形成细胞治疗产品LymaVir-XX，其中LymaVir即lymphocytes against virus，而LymaVir-XX可以指LymaVir-AB，文中也称为特异性抗病毒过继免疫细胞AB，即特异性抗腺病毒(ADV)及BK病毒(BKV)T细胞；也可以指LymaVir-CE，文中也称为特异性抗病毒过继免疫细胞CE，即特异性抗巨细胞病毒(CMV)及EB病毒(EBV)T细胞或其他病毒组合。
本发明提供一种特异性抗病毒过继免疫细胞的优化制备方法，所述制备方法包括步骤：
(1)取适量经过二周培养扩增的抗病毒特异性T细胞；
(2)用同种病毒抗原肽再次激活T细胞；
(3)采用G-REX 10瓶培养扩增步骤(2)激活的T细胞至需要的数量。
上述步骤(1)中抗病毒特异性T细胞可以抗二种以上的病毒。
上述步骤(1)和步骤(2)中的病毒为BK病毒和腺病毒。
上述步骤(1)和步骤(2)中的病毒为巨细胞病毒和EB病毒。
上述每种病毒抗原肽均采取二个不同的病毒抗原肽，激活同时还加入载荷CD3和CD28抗体的可降解微球。
上述可降解微球为TransACT；所述病毒抗原肽浓度为1-3微克/107细胞。
上述步骤(2)在病毒抗原再次激活的六天内，加入IL21。
上述步骤(2)在病毒抗原再次激活的六天内，加入IL2110-30 ng/ml。
上述步骤(3)扩增培养T细胞中，多次添加IL7,IL15，保持其浓度分别在10-30ng/ml和10-50ng/ml。
上述步骤(3)扩增培养T细胞的培养基为AIM-V培养基；所述每个病毒抗原肽长度为15肽。
本发明优化方法的具有下列主要创新优化特征：
(1)细胞制备模式上的创新优化：采血量小、制备时间短，可以对抗病毒特异性T细胞进行再次激活和培养，从而在第4周再次输注一次VST。通常和第2周的输注形成“一次采血二次输注”的治疗新模式，有利于提高或巩固临床疗效。
(2)细胞激活环节上的创新优化：在利用抗原病毒的重叠肽段激活PBMC中VST的同时，加入少量TransACT(载荷CD3和CD28抗体的可降解微球，德国梅天妮公司)，使VST维持在TSCM亚群(CD45RA+CD62L+)阶段，具有更高的记忆干细胞特性，以及VST细胞产品展现出更强的抗病毒能力；
(3)细胞扩增环节上的创新优化：引入G-REX封闭培养体系，提升细胞增殖效能的同时降低操作导致的污染风险；为了扩增形成TSCM/CM亚群占优势的VST，在实验过程中先后添加IL4/IL7/IL15/IL21等4种细胞因子，并对上述细胞因子不同浓度进行了优化排列组合，配伍形成最佳组合后用于实验，抑制T细胞分化。
本发明优化方法适用于制备特异性抗ADV/BKV免疫细胞的LymaVir-AB，也适用于制备特异性抗CMV/EBV免疫细胞的LymaVir-CE细胞，最后皆可得到满足回输剂量要求且TSCM/CM亚群高度富集的VST细胞。
附图说明
图1过继免疫细胞的制备工艺流程图；
图2酶联免疫斑点法检测细胞分泌γ-干扰素能力实验示意结果图；
图3流式细胞术分析血样中免疫T细胞(CD3+)所占百分比示意图；
图4流式细胞术分析免疫细胞群中VST纯度及激活状态(CD137+/CD28+)示意图；
图5流式细胞术分析免疫细胞构成(CD3+/CD4+/CD8+)示意图；
图6流式细胞术分析免疫细胞亚型(TSCM/TCM/TEM/TEMRA)占比示意图。
图7流式细胞术分析比较两种激活方式(添加或不添加TransACT微球)下VST纯度及激活状态(CD137+/CD28+)示意图
图8常规方法与优化方法第一轮激活后培养2周所得细胞之亚群占比比较图；
图9常规方法与优化方法第一轮激活后培养2周所得细胞之酶联免疫斑点数柱状比较图；
图10常规方法与优化方法培养2周及4周所得细胞之亚群构成对比图；
图11常规方法与优化方法培养2周及4周所得细胞之酶联免疫斑点数比较图。
具体实施方式
以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明。
实施例1常规方法制备病毒过继免疫细胞
常规制备方法为：采血分离出免疫细胞(PBMC)后，取1.5×107细胞置于15ml离心管中，加入病毒抗原编码的重叠肽段(CMV/EBV/ADV/BKV)(100ng/1.5×107细胞)37℃培养30min，转至G-REX10后加IL4(400U/ml)和IL7(10ng/ml)培养2周，最后收集细胞进行制剂灌装并回输。
常规方法所得细胞检测结果如表1及表2：
Figure BDA0003172793510000041
表1.常规制备方法所得细胞之亚群构成数据表
ELISPOT(SFCs/2×10<sup>5</sup>cell) CMVST EBVST ADVST BKVST
1404 260 836 331
表2.常规制备方法所得细胞之酶联免疫斑点法检测细胞分泌γ-干扰素数据表通常按照常规方法在2周后继续培养T细胞，会发现T细胞容易分化。
实施例2LymaVir-CE过继免疫细胞的制备
由本发明所述培养方式可制备得到LymaVir-CE过继免疫细胞，其中LymaVir即lymphocytes against virus，而CE分别指CMV和EBV。LymaVir-CE制备过程见图1。
1.血样甄别
健康成人外周血中T细胞占体内T细胞总数的2-2.5％，采用Ficoll梯度离心分离出PBMC后，粗略估算细胞得率为1x106/ml血样，其中CD3+T细胞占比50-80％。(Jae-Ouk Kimet al.NF-kB and AP-1regulate activation-dependent CD137(4-1BB)expression in Tcells.FEBS Letters.2003Apr.24163-170)
在PBMC中添加病毒抗原的重叠短肽(长度为15肽)足以激活VST，这种激活方式称为MLPC(mixed lymphocyte peptide culture)。(Jae-Ung Lee et al.Revisiting theConcept of Targeting NFAT to Control T Cell Immunity and AutoimmuneDiseases.Front Immunol.2018Nov；27(9):2747.)
在MLPC激活细胞后进行IFN-γELISPOT(IFN-γ酶联斑点法)检测(图2)，并与相同病毒抗原激活后CD137+细胞占比进行了同步比对，统计分析后显示上述ELISPOT数值大致相当于1％CD137+细胞(数据未列)。德国研究组C Sukdolak等曾采用IFN-γ酶联斑点法(ELISPOT)对健康成年人外周血VST进行过检测，通过204例血样分析作者认为高应答者(high responder，斑点形成细胞SFC＞50/2.5×105待检细胞)更适合作为供者用于扩增培养VST。据此设定了合格血样的甄别标准，即CD3+T细胞占比＞50％和CD137+细胞占比＞2％(每种VST均采用2个病毒抗原肽段进行刺激)。(Cinja Sukdolak et al.CMV-,EBV-andADV-Specific T Cell Immunity:Screening and Monitoring of Potential Third-PartyDonors to Improve Post-Transplantation Outcome.Biol Blood MarrowTransplant.2013Oct；)
本发明方法在制备过程中均采用流式细胞术对细胞表型及亚群占比进行分析鉴定，CD3+细胞占比分析方法如下：取PBMC(5×105细胞/100微克)，检测组加入PerCP-CD3抗体(5微升，美国Biolegend公司)，对照组不加抗体，4℃避光温育30min后加入PBS离心去除游离抗体后上机分析，即以前向散射(FSC)对侧向散射(SSC)作图，设置淋巴细胞组份P1门，实验示意结果见图3A；
选择淋巴细胞组份P1后检测CD3+细胞，根据未加CD3抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD3+细胞百分比，实验示意结果见3B。
CD3+细胞占比分析方法如下：取PBMC(5×105/50微升)，添加CMV抗原(pp65及IE1各100ng，德国梅天妮公司)或EBV抗原(LMP2a及EBNA1各100纳克，德国梅天妮公司)，培养24小时后检测组加入APC-CD137抗体(5微升，美国Biolegend公司)及PE-CD28抗体(20微升，美国BD公司)，对照组不加抗体，4℃避光温育30min后加入PBS离心去除游离抗体后上机分析，以FSC对SSC作图，设置淋巴细胞组份P1门，实验示意结果如图4C所示。
选择淋巴细胞组份P1门后检测CD137+和CD28+细胞，根据未加CD137或CD28抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD137+和CD28+的细胞百分比，实验示意结果如图4D所示。
对健康志愿者血样进行了检测，显示所有受检血样中CD3+T细胞占比均＞50％且CD137+细胞占比均＞2％(表3)。
Figure BDA0003172793510000051
表3.志愿者外周血免疫细胞占比筛选及针对单种病毒抗原的特异性T细胞百分比检测。注：CMVST为巨细胞病毒特异性T细胞；EBVST为EB病毒特异性T细胞。
2.VST的初次激活与表型转换
血样甄别合格后采用MLPC激活PBMC中的VST，将PBMC(1.5×107)调整至1×107/ml，添加CMV抗原和EBV抗原(CMV pp65、CMV IE1、EBV LMP2a及EBV EBNA1，德国梅天妮公司，浓度均为2微克/107细胞)，12孔板培养24小时。但上述VST激活并扩增培养2周后TCM亚群占据优势(数据未列)，为了促使TSCM亚群形成，额外在MLPC时再添加TransACT(载荷CD3和CD28抗体的可降解微球，德国梅天妮公司)，滴定实验显示，将TransACT用量控制在10-30微升/107细胞时，培养24小时后CD137+细胞占比与不加TransACT的病毒抗原激活组相比无显著差异，最佳用量为10微升/107细胞。在此条件下扩增培养2周，TSCM/CM亚群占比与不加TransACT组别比较数值更高，具体见下述。
VST激活后收集细胞置于G-REX 10透气性培养瓶(美国Wilson wolfmanufacturing公司，底面积为10cm2)中，补充40ml培养基(AIM-V，美国GICO公司，其中添加3％UltraGRO Cell Culture Supplement，美国CliniScineces公司)及白介素(interleukins，IL)，包括IL2(50-500IU/ml，双鹭药业公司)、IL4(10-30ng/ml)、IL7(10-30ng/ml)和IL15(10-50ng/ml)，IL4/7/15均为同源海立公司。鉴于T细胞激活后的增殖分化与细胞代谢方式密切相关，如IL2优先激活葡萄糖酵解代谢、驱使T细胞增殖形成TEM/EMRA亚群，而IL7和IL15有利于氨基酸氧化代谢、促进T细胞增殖形成TSCM/CM亚群。为了扩增形成TSCM/CM亚群占优势的VST，通过大量实验最终确定添加以上4种细胞因子，然后对上述细胞因子不同浓度进行了优化排列组合，配伍形成最佳组合后用于实验。
本方法引入G-REX培养瓶，其优势在于：
(1)接种细胞(细胞密度控制在1×106/cm2或以下)后培养2周内无需传代，可显著降低人员操作造成病原体污染的风险；
(2)G-REX瓶由底部的微孔膜供氧，添加过量的培养基不仅不会造成细胞缺氧反而可以促进细胞代谢产物弥散稀释，因而明显提升细胞增殖效能。
VST激活后首先在G-REX瓶中培养6天，然后间隔3-4天添加IL4/7/15满足细胞生长需求。为了保障VST始终处于活跃增殖状态，可以在培养6天时取样计数，如发现细胞增殖＜4倍时则添加适量TransACT(用量控制在20-60微升/107细胞之间)。
3.质控检验
VST在G-REX瓶中扩增培养15天即可灌装用于临床治疗，因此在灌装前2天(即培养13天)收集部分细胞进行质控检验，检验项目包括：
1)细胞数量
细胞数量以台盼蓝拒染的活细胞为准，取20微升细胞与等量的台盼蓝溶液混合，细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)检测活细胞占比及数量。2例VST的检测结果显示，2周扩增培养后活细胞占比均＞97％，其中CD3 T细胞纯度平均为99.3％。T细胞数量平均扩增约13.9倍，其中将PBMC的培养密度控制在1.5×106/cm2时，T细胞的扩增效率更高。(表4)
Figure BDA0003172793510000071
表4：激活前及激活后扩增2周的免疫细胞总数及T细胞总数之比较；
*单位：106
2)T细胞构成及亚群
T细胞构成包括CD3+T细胞占比以及其中CD4+T细胞和CD8+T细胞占比，分析方法如下，取PBMC(5×105细胞/100微克)，其中检测组加入FITC-CD3抗体、PerCP-CD8抗体和PE-CD4抗体(5微升，美国Biolegend公司)，对照组不加抗体，4℃避光温育30min后加入PBS离心去除游离抗体后上机分析，即以前向散射(FSC)对侧向散射(SSC)作图，设置淋巴细胞组份P1门，实验示意结果见图5E；
选择淋巴细胞组份P1后检测CD3+细胞，根据未加CD3抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD3+细胞百分比，实验示意结果见图5F；
选择CD3阳性细胞群，根据未加CD4抗体和CD8抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD4+和CD8+细胞百分比，实验示意结果见图5G。VST经扩增培养后富集了CD3+T细胞，平均占比达到99.4％，其中CD+4和CD8+T细胞(包括CD4+CD8+细胞)占比分别为14.5％和84.3％(表5)。通常扩增后的T细胞可以分为二种类型，一是CD8+T细胞占优势；二是CD4+T细胞占比略超CD8+T细胞，类似情况国外也有报道。(Marta Grau-Vorster et al.Characterizationof a Cytomegalovirus-Specific T Lymphocyte Product Obtained Through a Rapidand Scalable Production Process for Use in Adoptive Immunotherapy.Frontiersin Immunology.2020Feb；11(271))
Figure BDA0003172793510000072
表5：本发明新方法制备2周后的免疫细胞构成比例；
T细胞亚群采用四种荧光抗体(PerCP-CD3抗体、APC-CD95抗体、PE-CD62L和FITC-CD45RA抗体，均为美国Biolegend公司)染色，FCM分析首先以FSC对SSC作图，选择淋巴细胞组份后检测CD3+CD95+细胞；然后选择该群细胞检测CD62L+细胞及CD45RA+细胞。其中各亚群表型分别为TN(CD3+CD95-)、TSCM(CD3+CD95+CD45RA+CD62L+)、TCM(CD3+CD95+CD45RA-CD62L+)、TEM(CD3+CD95+CD45RA-CD62L-)和TEMRA(CD3+CD95+CD45RA+CD62L-)。以FSC对SSC作图，设置淋巴细胞组份P1门，实验示意结果见图6H；
选择淋巴细胞组份P1门，根据未加CD3或CD95抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD3+CD95+细胞,实验示意结果见图6I；
选择CD3+CD95+细胞组份，根据未加CD45RA或CD62L抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD3+CD95+细胞中CD45RA+和CD62L+细胞百分比,实验示意结果见图6J；
健康成年人外周血中的T细胞主要包括四个亚群(即TN、TCM、TEM和TEMRA)，其占比大体为40％、30％、20％和10％，而TSCM亚群较少，通常占比为2-6％。VST经扩增培养后形成的主要亚群为TSCM和TCM(平均占比分别为17.4％和63.7％)，TN基本检测不到并且TEM和TEMRA亚群平均占比分别降至13.9％和5.07％(表6)，这种T细胞表型转换的可能原因是激活抗原特异性TCR信号导致CD28+T细胞优先增殖。
Figure BDA0003172793510000081
表6.本发明新方法制备2周后所获免疫细胞的亚群分布百分比；
3)VST占比及活力
利用酶联免疫斑点法检测细胞分泌γ-干扰素的能力(IFNγ-ELISPOT检测)，并将其视为VST活力。
将VST(1×106/管)调整至1×107/ml，分别添加ADV抗原、BKV抗原(10微克/107细胞)或不加抗原(阴性对照)，培养3-4小时后取2-5微升/管(即2-5×104细胞)用于IFNγ-ELISPOT检测(Mabtech)，剩余细胞继续培养20小时用于FCM检测CD137/CD28表达百分比。ELISPOT检测显示阴性对照组仅有少量斑点形成细胞(spot-forming cells，SFC)而抗原激活组中SFC显著增多，后者减去对照组的SFC数值并换算成SFCs/2×105待检细胞。实验示意结果见图2。
5例VST的检测结果显示，经过2周扩增培养后CD137+VST(包括CMVST和EBVST)占比通常超过60％，说明扩增后VST得到明显富集。此类CD137+VST中，CD28阳性率平均达到86.8％，明显高于培养前，提示此类CD137+CD28+VST属于TSCM/CM亚群，与表型检测结果吻合。IFNγ-ELISPOT检测显示SFC平均值分别为2265(CMVST)和1795(EBVST)(表7)，上述数值均高于国外的同类报道。(Ifigeneia Tzannou et al.Off-the-Shelf Virus-Specific TCells to Treat BK Virus,Human Herpesvirus 6,Cytomegalovirus,Epstein-BarrVirus,and Adenovirus Infections After Allogeneic Hematopoietic Stem-CellTransplantation.Journal of Clinical Oncology.2017Nov；35(31):3547-3557.)CD137+CD28+VST流式检测方法如下：选择利用病毒抗原肽激活24小时的细胞，APC-CD137抗体(5微升，美国Biolegend公司)及PE-CD28抗体(20微升，美国BD公司)，对照组不加抗体，4℃避光温育30min后加入PBS离心去除游离抗体后上机分析，以FSC对SSC作图，设置淋巴细胞组份P1门(图7-K)；选择淋巴细胞组份P1门后检测CD137+和CD28+细胞，根据未加CD137或CD28抗体的对照组设置阳性基准线，并检测CD137+和CD28+的细胞百分比(图7-L)；
Figure BDA0003172793510000091
表7.本发明新方法制备2周后所获免疫细胞的CD137+/CD28+VST占比及酶联免疫斑点数据表；
*扩增细胞中CD137+VST占比(％)；**CD137+VST中CD28+细胞占比(％)；***SFCS/2×105待检细胞
4)内毒素、支原体及细菌培养
细菌内毒素检查方法：取本品，按《中华人民共和国药典》2020年版第四部<1143细菌内毒素检查法>进行检测，应＜0.5EU/ml。细菌检测采用BacTALERT3D微生物检测系统，将样本加入BACT/ALERT培养瓶中培养5天，检测厌氧菌和需氧菌，样品测试结果应为阴性。支原体检测采用荧光染色方法，使用sigma公司hochest 33258染液进行染色，在荧光显微镜下观察，仅见细胞的细胞核呈现蓝色荧光为阴性。
4.VST的再次激活与优化扩增
国外的近期研究报道显示，约20-40％的患者需要输注2次或以上VST才能临床获益。(Ifigeneia Tzannou et al.“Mini”bank of only 8donors supplies CMV-directedT cells to diverse recipients.Blood advances.2019Sep；3(17):2571-2580.)由此设想，在扩增培养2周获得VST后取其中一部分细胞继续扩增培养2周，然后再次输注，这种“一次制备二次输注”的治疗新模式将有可能提高或巩固临床疗效。
按此思路在2周扩增培养后取VST(3×107，调整至1×107/ml)，采用MLPC(添加TransACT)方式再次激活(与初次激活相同，抗原浓度减至1微克/107)。但是结果发现，这些VST经过2周扩增培养形成了TSCM/CM占优势的TM，相同抗原再次激活后仍添加IL4/7/15则导致明显的细胞分化，表现为上述亚群的占比下降。为了避免这种分化，实验以TM自稳增殖(homeostatic proliferation)因子IL7和IL15为基础进行优化组合，发现病毒抗原激活后6天内采用IL21(10-30ng/ml)替代IL4具有明显的分化遏制效应。培养第2周仍采用IL4/7/15扩增培养VST，上述2周扩增培养也采用G-REX 10培养瓶。
在抗原再次激活VST后继续培养13天时取样进行四项质控检验，结果如下：
1)细胞数量
2例VST的检测结果(表8)显示，2周扩增培养后活细胞占比均＞97％，其中CD3T细胞纯度平均为99.3％。T细胞数量平均扩增约13.9倍，其中将PBMC的培养密度控制在1.5×106/cm2时，T细胞的扩增效率更高。
Figure BDA0003172793510000101
表8：本发明方法二次细胞激活前及再激活后扩增2周的免疫细胞总数及T细胞总数之比较；
2)T细胞构成及亚群
VST经扩增培养后富集了CD3T细胞，平均占比达到99.9％，其中CD4+和CD8+T细胞(包括CD4+CD8+细胞)占比分别为7.55％和90.6％(表9)。由于CD8+T细胞是主要的抗病毒效应细胞，此类T细胞高度富集有利于提升临床疗效。
Figure BDA0003172793510000102
表9：本发明方法二次激活并扩增2周后获得细胞之构成；
VST经扩增培养后形成的主要亚群为TSCM和TCM，平均占比分别为17.4％和63.7％，基本检测不到TN，且TEM和TEMRA亚群平均占比分别降至13.9％和5.07％(表10)。
Figure BDA0003172793510000111
表10：本发明方法二次激活并扩增2周后获得细胞之亚群占比；
3)VST占比及活力
除了TSCM亚群高度富集外，VST再次激活并采用优化的扩增体系培养2周后，VST占比也有所提升，其纯度(包括CD137+CMVST和CD137+EBVST)和SFC数值均超过前2周培养(表11)。
Figure BDA0003172793510000112
表11:本发明方法二次激活并扩增2周后获得细胞之VST纯度和SFC数据表；
*扩增细胞中CD137+VST占比(％)；**CD137+VST中CD28+细胞占比(％)；***SFCs/2×105待检细胞
5.VST灌装及低温贮藏
通过质控检验达到放行标准(release criteria)即可进行VST灌装。参照国际上临床研究的相关报道，放行标准需同时达到下列要求：
Figure BDA0003172793510000113
表12：VST过继免疫细胞放行标准表；
*单位：EU/ml；**VST扩增培养2周时，因存在个体差异CD8 T细胞占比不作为放行标准。
VST灌装数量因人而异，常用标准为：
①按照体表面积，通常为2×107细胞/m2；②依据患者体重，要求1×106细胞/kg。
VST灌装需先离心洗涤清除培养基中的蛋白成份包括细胞因子，然后将细胞重悬在氯化钠注射液(生理盐水)或复方氯化钠注射液(林格氏液)中，在聚丙烯输液袋(体积为50ml)中封装，冷链运输。如果患者对人血清白蛋白(HSA)没有过敏反应，则适量添加(如1-2％)可以改善细胞活力。VST灌装时采用的容器、液体及蛋白均需符合中国药典标准并有药监部门核准的批号。
VST灌装后尚余下大量细胞，这种情况在低体重患者(如儿科病人)尤为明显，因此需采用适当的方法将细胞低温贮藏下来，可以为可能需要的后续治疗节省制备时间和费用。低温贮藏(cryopreservation)是指在深低温(如液氮)条件下保存活体组织或细胞的一项技术，其中涉及2个基本要素，即低温保护剂和降温速率。
当人体细胞的环境温度从37℃降至冰点以下时，细胞内的水分就会凝聚成冰，这种细胞内冰晶(intracellular ice crystals，ICIC)对细胞存活及功能具有显著伤害。低温保护剂(cryoprotective agents，CPA)的主要作用就是遏制ICIC形成，不同类型的T细胞对CPA的要求存在差异，为此我们对VST的CPA组方进行了优化，从中筛选出的最佳配方如下：林格氏液与20％HAS按1:1比例混合形成10％HSA溶液，后者再与CryoStor CS10按1:1比例混合(简称HSA-CS10)。采用上述CPA将VST的细胞密度调整为5-20×106/ml，以1.25ml/管(冻存管)或20ml/袋(冻存袋)分装，采用程序降温仪(赛默飞世尔科技公司)缓慢降温(降温速率控制在-1℃/min)至-80℃后液氮保存。
低温贮藏的VST经37℃水浴融化复苏后具有较高的活细胞占比(通常＞75％)，此时添加生理盐水及1-2％HSA可以直接灌装；也可以将细胞离心去除蛋白成份后培养2-3天再灌装。与复苏后直接灌装比较，培养后VST的活细胞占比更高(通常＞85％)，因而更适合灌装后需要冷链运输较长时间的患者。根据我们对LymaVir-CE的系列测试结果，选择的最佳培养条件为IL7(20ng/ml)和IL15(10ng/ml)。在此条件下培养1-3天，活细胞占比均＞85％而活细胞数量保持相对恒定。
实施例3本发明制备方法制备获得的病毒过继免疫细胞与常规方法细胞之优化比较
一、本专利通过优化VST激活工艺可得到更具优势的细胞亚群；
优化后VST激活工艺：取1.5×107胞置于12孔板中，加入病毒抗原的重组肽段(CMV/EBV/ADV/BKV)及TransACT，37℃隔夜培养，第二天至G-REX10后加IL4(10-50ng/ml)、IL7(10-50ng/ml)和IL15(10-50ng/ml)培养15天。
为了促使TSCM亚群形成，新方法在进行病毒抗原肽激活时额外添加TransACT(载荷CD3和CD28抗体的可降解微球，德国梅天妮公司)，滴定实验显示，将TransACT用量控制在10-30微升/107细胞时，培养24小时后CD137+细胞占比与不加TransACT的病毒抗原激活组相比无显著差异，而在此条件下扩增培养2周，TSCM/CM亚群占比较常规方法超过1/3。
以LymaVirCE和LymaVirAB为例，第一轮激活后扩增15天，所得细胞检测结果如表13所示：
Figure BDA0003172793510000131
表13.优化制备新方法第一轮激活后培养2周所得细胞之亚群构成数据表
根据表型特征和生物学功能的差异可将TM分为四个亚群，即记忆干细胞(memorystemcells，TSCM)、中央记忆细胞(central memory cells，TCM)、效应记忆细胞(effectormemory cells，TEM)和组织定居记忆细胞(resident memory cells，TRM)。TSCM和TCM的表型特征是：
(1)表达TM核心标志如CD95等；
(2)表达淋巴结“归巢受体”(homing receptors)如CCR7和CD62L等；
(3)表达共刺激受体(co-stimulatory receptors)如CD28等；
(4)表达白细胞共同抗原CD45的剪辑变异体如CD45RA(TSCM)和CD45RO(TCM)。
上述两种TM亚群具有成体干细胞(somatic stem cells)的特性，如能够通过自我更新(self-renewal)在次级淋巴器官如淋巴结内长寿命(longevity)生存而不明显分化；当再次遭遇相应抗原时则高效增殖并分化成为TEM和效应细胞(effector cells，TEFF)，后者又称重新表达CD45RA的终末分化TEM(terminally differentiated effector memory Tcells re-expressing CD45RA，TEMRA)。目前认为TSCM和TCM承担了整体免疫监管功能，在免疫记忆中起着关键作用。与TSCM/CM不同，TEM不能表达CD28、CD45RA和上述归巢受体，因而主要分布在外周非淋巴样器官中并且生存时间也比较短暂，但部分TEM在外周器官的特殊微环境(niches)中可以分化成为TRM，后者具备长寿命生存的特性并承担区域免疫监管功能。(Charlotte M.Mouss et al.Comprehensive Phenotyping of T Cells Using FlowCytometry.Cytometry.2019Jun；95A(6):647-654.)
有资料揭示，采用经典制备方案获得的VST以TEM占优势(占比＞80％)，而采用快速制备方案获得的VST则以TCM为主(占比约40-60％)，但规模化制备VST后富集到TSCM还没有研究报道。本专利制备优化新方法为首次获得高度富集的TSCM细胞。二者对比结果如图8所示。
二、本专利优化了激活培养方式并得到具有更高VST活力的细胞群；
利用酶联免疫斑点法检测细胞分泌γ-干扰素的能力(IFNγ-ELISPOT检测)，并将其视为VST活力。将VST(1×106/管)调整至1×107/ml，分别添加ADV抗原、BKV抗原(10微克/107细胞)或CMV抗原、EBV抗原或不加抗原(阴性对照)，培养3-4小时后取2-5微升/管(即2-5×104细胞)用于IFNγ-ELISPOT检测(Mabtech)，ELISPOT检测显示阴性对照组仅有少量斑点形成细胞(spot-forming cells，SFC)而抗原激活组中SFC显著增多，后者减去对照组的SFC数值并换算成SFC/2×105待检细胞。
对比表2与表14，IFNγ-ELISPOT检测显示优化新方法所得细胞之SFC平均值分别为2265(CMVST)、1795(EBVST)、2607(ADVST)和1761(BKVST)上述数值均高于常规方法所得细胞之数值，比较数据图见图9。
Figure BDA0003172793510000141
表14.优化制备新方法第一轮激活后培养2周所得细胞之酶联免疫斑点法检测细胞分泌γ-干扰素数据表
三、本专利优化了制备模式，2周后进行细胞二次激活并配合细胞因子组合的运用得到更具优势的VST细胞，同时形成一种“一次采血二次输注”的治疗新模式；
优化方案中，细胞扩增2周后再进行二次激活，同样是进行病毒抗原肽激活时额外添加TransACT，又培养2周后收获细胞。
再次激活并扩增培养2周后，细胞数量平均增加约5倍(数据未列)。虽然T细胞扩增效率低于前2周培养，但纯度得到了提升(平均值＞99％)并且最终细胞数量足以满足治疗所需。(具体数据见表15)
Figure BDA0003172793510000142
Figure BDA0003172793510000151
表15.优化制备新方法第二轮激活后培养2周所得细胞之亚群构成数据表
Figure BDA0003172793510000152
表16.优化制备新方法第二轮激活后培养2周所得细胞之酶联免疫斑点法检测细胞分泌γ-干扰素数据表
VST再次激活并优化扩增培养后T细胞构成发生了显著变化，表现为CD8+T细胞占据优势(平均占比达到87.9％)，而CD4+T细胞占比均降至10％上下。由于CD8+T细胞是主要的抗病毒效应细胞，此类T细胞高度富集有利于提升临床疗效。VST再次激活并优化扩增培养后另一个显著变化是TSCM占比发生增长。TSCM处于T细胞分化层级的顶端，是T细胞群体中干细胞特性最显著的一个亚群，因而TSCM富集的T细胞具有更明显的疗效。常规方法所得细胞中Tcm与TSCM亚群的总和远低于用本专利优化方法培养2周或4周的细胞，数据对比见图10。在VST研究领域中，迄今没有见到TSCM亚群增长占优势的文献报道。除了TSCM亚群高度富集外，VST再次激活并采用优化的扩增体系培养2周后，细胞抗病毒活力即SFC数值均超过前2周培养，数据对比见图11。
综上，通过优化建立快速制备方案的相关工艺，可以在2周培养后实施治疗。过继输入VST后的抗病毒作用机理是此类T细胞能够重建特异性免疫监管机制，如通过自我更新(self-renewal)方式在患者体内持久生存(即长寿命，longevity)，遭遇相应的病毒抗原后高效增殖和发挥显著免疫效应功能(即免疫记忆，immunological memory)。创新设计“一次采血二次回输”的制备新模式，通过对细胞进行二次激活与扩增，可进一步促进特异性抗病毒作用，巩固临床治疗效果。(具体特点比较见表17)
Figure BDA0003172793510000161
表17.优化方法与VST制备常规方法原理及特点之比较
此外，应理解，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围和实质的情况下，可以对本发明的技术方案进行各种修改或者等同替换。

Claims (10)

1.特异性抗病毒过继免疫细胞的优化制备方法，其特征在于，所述制备方法包括步骤：
(1)取适量经过二周培养扩增的抗病毒特异性T细胞；
(2)用同种病毒抗原肽再次激活T细胞；
(3)采用G-REX 10瓶培养扩增步骤(2)激活的T细胞至需要的数量。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中抗病毒特异性T细胞可以抗二种以上的病毒。
3.如权利要求2所述的优化制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中的病毒为BK病毒和腺病毒。
4.如权利要求2所述的优化制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中的病毒为巨细胞病毒和EB病毒。
5.如权利要求3或4所述的优化制备方法，其特征在于，所述每种病毒抗原肽均采取二个不同的病毒抗原肽，激活同时还加入载荷CD3和CD28抗体的可降解微球。
6.如权利要求5所述的优化制备方法，其特征在于，所述可降解微球为TransACT；所述病毒抗原肽浓度为1-3微克/107细胞。
7.如权利要求5所述的优化制备方法，其特征在于，所述步骤(2)在病毒抗原再次激活的六天内，加入IL21。
8.如权利要求6所述的优化制备方法，其特征在于，所述步骤(2)在病毒抗原再次激活的六天内，加入IL21 10-30ng/ml。
9.如权利要求6-8任一权利要求所述的优化制备方法，其特征在于，所述步骤(3)扩增培养T细胞中，多次添加IL7,IL15，保持其浓度分别在10-30ng/ml和10-50ng/ml。
10.如权利要求9所述的优化制备方法，其特征在于，所述步骤(3)扩增培养T细胞的培养基为AIM-V培养基；所述每个病毒抗原肽长度为15肽。
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