CN101252946A - 快速扩增抗原特异性t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括从细胞群扩增抗原特异性T细胞的方法。本发明的方法包括使细胞群与MHC限制性抗原肽、细胞因子和共刺激信号接触。本发明还包括含有抗原特异性T细胞的组合物和试剂盒。

Description

快速扩增抗原特异性T细胞的方法
发明背景
[001]感染性病毒疾病给世界带来了的公共健康难题。存在为数不多的抗病毒药物，而疫苗几乎都是提供预防性援助，但一旦感染开始之后则不提供援助。感染性病毒的例子包括属于下列科的病毒：小核糖核酸病毒、腺病毒、逆转录病毒、副黏病毒、布尼病毒、乳多空病毒、疱疹病毒、呼吸道肠道病毒、痘病毒、披膜病毒、线状病毒、微小病毒、杯状病毒、嗜肝DNA病毒、正黏病毒、沙粒病毒、线状病毒、弹状病毒、冠状病毒和黄病毒。
[002]丙型肝炎是一种疾病，其特征在于由丙型肝炎病毒(hepatitisC virus，HCV)——一种黄病毒——感染而导致的肝脏炎症。已经鉴定出许多HCV感染的危险因子，包括：1992年7月之前接受输血；接受来自患有丙型肝炎的供体的血液、血液制品或实体器官；注射违法药品或与患有HCV的人共用注射针头。长期肾脏透析；工作场所频繁接触血液；与多个伙伴或感染有HCV的多伙伴进行性行为；与受HCV感染的人共用个人用品，如牙刷和剃须刀；或由HCV感染的母亲生育。
[003]据估计，在美国，大约4百万人受HCV感染，或者大约每70人中1人至每100人中1人受HCV感染。HCV经常是无症状的，并且在进行常规体检或另一种医疗步骤的血液检查过程中首先被检测出来。如果感染已经存在很多年，则肝脏可能被永久性瘢痕化，临床上称为硬化。在许多情况下，不存在该疾病的症状，直至发展到硬化。
[004]当存在HCV感染的症状时，它们可以包括黄疸、腹痛、疲劳、食欲减退、恶心和呕吐、低热、灰白或粘土色便、黑尿、全身搔痒、腹水以及食道静脉扩张。
[005]目前尚无法治愈HCV。最常见的治疗包括施用干扰素α或联合施用干扰素α和利巴韦林(ribavirin)。干扰素α通过皮下注射施用，并具有许多副作用，包括流感样症状、头痛、发热、疲劳、食欲减退、恶心、呕吐、压抑和毛发稀少。用干扰素α治疗还可以干扰白细胞和血小板的产生。利巴韦林是每日服用两次的胶囊，主要副作用是严重贫血(低红细胞)。利巴韦林还导致生育缺陷。
[006]现今，在美国，HCV是慢性肝脏疾病最常见的病因之一。患有急性丙型肝炎的患者的至少80％最终发展成慢性肝脏感染，20％至30％的患者发展成肝硬化。1％至5％之间的患者可以发展至肝癌。在美国，丙型肝炎目前是肝脏移植的第一病因。
[007]过继性转移是由Medawar(1954，Proc.Royal Soc.143：58-80)创造出的术语，以研究同种异体移植物排斥。术语过继性免疫治疗表示免疫活性细胞的转移，用于治疗癌症或感染性疾病，包括HCV(June，C.H.，ed.，2001，Cancer Chemotherapy and Biotherapy：Principles andPractice，Lippincott Williams & Wilkins，Baltimore；Vonderheide et al.，2003，Immun.Research 27：1-15)。过继性治疗可以被认为是目标在于通过自体或异源(allogeneic)细胞替代、修复或增强受损组织或系统的生物学功能的一种策略。
[008]过继性免疫治疗在临床上已经被用来治疗各种病毒感染。离体扩增的多克隆CD4 T细胞的首次成功输注是使用由抗-CD3和抗-CD28包被的磁珠(αCD3/28包被珠)从HIV感染个体离体扩增T细胞而进行的，所述多克隆CD4 T细胞在输注后能够产生高度的移入(Levine et al.，2002，Nature Med.8：47-53)。
[009]含有αCD3/28的包被珠输送T细胞活化和生长所需的信号，通过下调CCR5和上调各种配体、β-趋化因子RANTES、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)和MIP-1β的表达，使得T细胞抗感染(Levine et al.，1996，Science 272：1939-1943；Riley et al.，1997，J.Immunol.158：5545-5553 Carroll et al.，1997，Science 276：273-276)。几个I期和II期试验已经证明，将使用αCD3/28包被珠扩增的高达3×1010个自体CD4T细胞输注入感染个体是安全和可行的(Carroll et al.，1997，Science276：273-276；Levine et al.，2002，Nature Med.8：47-53；Walker et al.，2000，Blood 96：467-474；Ranga et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A95：1201-1206)。更重要的是，观察到总淋巴细胞数、CD4 T细胞与CD8T细胞的比例、分泌细胞因子的T细胞的分数以及应答回忆抗原的能力的持续增加，表明过继性T细胞免疫治疗具有使感染个体恢复至少有限的免疫功能的潜力(Levine et al.，2002，Nature Med.8：47-53)。
[010]考虑到总体上病毒感染、特别是HCV感染的严重性，以及过继性免疫治疗作为治疗病毒感染的可行方式的前景，需要多种方法和组合物来建立特异性靶向的淋巴细胞，用于检查对病毒感染的免疫应答和用于治疗病毒性疾病。本发明满足了该需求。
发明概述
[011]本发明包括在细胞群中扩增病毒特异性T细胞的方法，包括从人分离出所述细胞群，使所述细胞群与MHC限制性病毒抗原肽、细胞因子和共刺激信号接触，其中所述共刺激信号是抗-CD3/抗-CD28包被珠，从而从所述细胞群扩增病毒特异性T细胞。
[012]在本发明的一方面，人先前受到所述病毒感染。
[013]在本发明的另一方面，T细胞特异于丙型肝炎病毒。
[014]在本发明的又一方面，细胞因子是白细胞介素-2。
[015]本发明包括富集细胞群以获得病毒特异性T细胞的方法，所述方法包括从人分离出所述细胞群，使所述细胞群与MHC限制性病毒抗原肽、细胞因子和共刺激信号接触，其中所述共刺激信号是抗-CD3/抗-CD28包被珠，从而富集细胞群以获得病毒特异性T细胞。
[016]在本发明的一方面，人先前受到所述病毒感染。
[017]在本发明的另一方面，T细胞特异于丙型肝炎病毒。
[018]在本发明的又一方面，细胞因子是白细胞介素-2。
[019]本发明包括诱导病毒特异性T细胞增殖的方法，所述方法包括使所述细胞与MHC限制性病毒抗原肽、细胞因子和共刺激信号接触，其中所述共刺激信号是抗-CD3/抗-CD28包被珠，从而诱导病毒特异性T细胞增殖。
[020]在本发明的另一方面，T细胞特异于丙型肝炎病毒。
[021]在本发明的又一方面，细胞因子是白细胞介素-2。
[022]本发明包括通过下列步骤产生的病毒特异性T细胞：从人分离出细胞群，使所述细胞群与MHC限制性病毒抗原肽、细胞因子和共刺激信号接触，其中所述共刺激信号是抗-CD3/抗-CD28包被珠。
[023]在本发明的另一方面，T细胞特异于丙型肝炎病毒。
[024]在本发明的又一方面，细胞因子是白细胞介素-2。
[025]本发明包括从细胞群扩增病毒特异性T细胞的试剂盒，所述试剂盒包括白细胞介素-2、抗-CD3/抗-CD28包被珠和病毒抗原肽，其中所述肽选自：在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3中列出的肽，HCV核心蛋白15-聚体(15-mer，15个氨基酸)和HCVNS315-聚体。
附图简述
[026]为了阐述本发明的目的，在附图中描述了本发明的一些实施方式。然而，本发明不限于在附图中所描述的实施方式的精确布置和手段。
[027]图1描绘了通过用所示比例的αCD3/28珠、以及IL-2和HCV肽同时扩增，体外扩增分离的外周血单核细胞(PBMC)。
[028]图2描绘了在用αCD3/28珠、IL-2和HCV肽刺激后取样的每一总淋巴细胞中对HCV四聚体呈阳性的CD8细胞的百分比。星号表示在第10天用15聚体库的额外刺激。
[029]图3是一系列图像，其描绘了在用αCD3/28珠、HCV肽和IL-2刺激之前和之后，通过PBMC的FACS分析测定的对HCV特异性四聚体呈阳性的CD8 T细胞。在每一张FACS图中每一个圆圈中的数字表示在第0、7和17天，针对三种HLA-A2限制性HCV CTL表位的HCV四聚体阳性CD8细胞/淋巴细胞的百分比。
[030]图4是包括核心蛋白和NS3蛋白的HCV多肽的氨基酸序列，从它衍生出用于本发明的15-聚体(SEQ ID NO：63)。
发明详述
[031]本发明涉及从淋巴细胞群快速扩增病毒特异性T细胞的方法的发现。也就是说，如本文公开的数据所证明，本发明包括扩增病毒特异性淋巴细胞——优选CD8细胞，和富集淋巴细胞群以获得病毒特异性淋巴细胞——优选CD8细胞的方法。本发明进一步包括通过本发明的方法扩增的淋巴细胞。
定义
[032]如本文所使用，下列每一术语具有在本部分中与其相关的含义。
[033]冠词“一”(“a”和“an”)在本文中被用来指一或一以上(即，至少一)的该冠词的语法上的对象。例如，“一要素(an element)”是指一种要素或一种以上的要素。
[034]如本文所使用，“氨基酸”由其全名、与其相应的三字母密码或与其相应的单字母密码表示，如在下表中所示：
全名         三字母密码      单字母密码
天冬氨酸     Asp             D
谷氨酸       Glu             E
赖氨酸       Lys             K
精氨酸       Arg             R
组氨酸       His             H
酪氨酸       Tyr             Y
半胱氨酸     Cys             C
天冬酰胺     Asn             N
谷氨酰胺     Gln             Q
丝氨酸       Ser             S
苏氨酸       Thr             T
甘氨酸       Gly             G
丙氨酸       Ala             A
缬氨酸       Val             V
亮氨酸       Leu             L
异亮氨酸     Ile             I
甲硫氨酸     Met             M
脯氨酸       Pro             P
苯丙氨酸      Phe      F
色氨酸        Trp      W
[035]术语“施用器(applicator)”，如在此处所用的术语，是指用于施用本发明的化合物和组合物的任何装置，包括但不限于皮下注射用注射器、移液管等等。
[036]“疾病(disease)”是动物的健康状态，其中所述动物不能维持稳态，并且其中如果所述疾病不被改善，则动物健康持续恶化。相比之下，动物中的“紊乱(disorder)”是这样的健康状态，其中所述动物能够维持稳态，但其中所述动物的健康状态比在不存在紊乱的情况下较为不利。如果保持不治疗的话，紊乱不必然引起动物健康状态的进一步下降。
[037]术语“有效量”，如此处所使用，意指这样的量：当施用于哺乳动物时，相比于在不存在所述化合物时检测到的T细胞应答，引起可检测水平的T细胞应答。T细胞应答可以通过很多领域内公认的方法容易地评估。
[038]技术人员将理解，本文所施用的化合物或组合物的量可变，并可以基于许多因素容易地确定，所述因素如所治疗的疾病或状况、所治疗的哺乳动物的年龄和健康和身体状况、疾病的严重程度、所施用的具体化合物等等。
[039]“说明性材料(Instructional material)”，如在此处使用该术语，包括出版物、录音、图表、或可用于传达试剂盒中本发明的组合物和/或化合物在实现减轻或治疗本文所述的各种疾病或紊乱的有用性的任何其它表达媒介。任选地，或可选地，说明性材料可描述减轻细胞或组织或哺乳动物中的疾病或紊乱的一种或更多种方法，包括本文中别处所公开的那些。
[040]试剂盒的说明性材料可以，例如，附于含有本发明的化合物和/或组合物的容器中，或者与含有所述化合物和/或组合物的容器一起运输。可选地，说明性材料可以与容器分开运输，意图在于，接受者协同使用说明性材料和化合物。
[041]如在本文所使用，术语“药学上可接受的载体”是指这样的化学组分，活性成分可以与其混合，并且，在混合后，其可用于将活性成分输送到对象。
[042]“重组多核苷酸”是指具有非天然连接在一起的序列的多核苷酸。扩增的或装配的重组多核苷酸可以被包括在合适的载体中，并且该载体可用于转化合适的宿主细胞。
[043]重组的多核苷酸也可以起到非编码的功能(例如，启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。
[044]“重组多肽”是重组多核苷酸表达产生的多肽。
[045]“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然发生的结构变体、和通过肽键连接的其合成的非天然发生的类似物、相关的天然发生的结构变体、和其合成的非天然发生的类似物组成的聚合物。合成的多肽可以例如使用自动多肽合成仪进行合成。
[046]术语“蛋白质”通常是指大的多肽。
[047]术语“肽”通常是指短的多肽。
[048]在本文中使用常规表示方法来描述多肽序列：多肽序列的左手端是氨基端；多肽序列的右手端是羧基端。
[049]如本文所使用，“治疗”意指降低患者所经历的疾病症状(即，病毒感染、肿瘤生长和/或转移、或通过降低的T细胞数和/或降低的T细胞活性介导的其它效应等)的频率。
[050]“治疗性”治疗是为了减少或消除病理体征和/或减少所述体征的频率、持续时间和强度而施用于表现出这些病理体征的患者的治疗。
[051]化合物的“有效量”是细胞(例如，根据本发明刺激和/或扩增的T细胞)的量，其足以向T细胞群、或向施用T细胞和/或与T细胞接触的哺乳动物提供可检测的效应。
[052]术语“特异性结合”，如本文所使用，意指识别并结合存在于样品中的相关结合配偶体(cognate binding partner)(例如，存在于T细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白质的抗体，但该抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其它分子。
描述
[053]本发明涉及令人惊讶的发现：使用抗原肽、细胞因子和共刺激信号，可以从人淋巴细胞和人淋巴细胞群扩增大量的抗原特异性T细胞。具体而言，本发明包括这样的发现：通过使外周血单核细胞(PBMC)群与细胞因子、抗原肽和提供共刺激信号的珠接触，可以从PBMC群扩增和富集病毒特异性T细胞。
I.方法
[054]本发明包括从人淋巴细胞群扩增抗原特异性T细胞的方法。本发明的组合物和方法对于靶向受病毒感染的宿主细胞是特别优选的。CTL应答是大多数哺乳动物对于很多种病毒的一种重要的免疫应答组成，并且本发明提供了有效刺激对病毒感染细胞的CTL应答和在宿主哺乳动物中治疗或预防此类感染的手段。因此，本发明的组合物和方法可适用于任何病毒呈递蛋白和/或肽抗原。这样的病毒包括但不限于下列：致病病毒，例如甲型流感病毒和乙型流感病毒(FLU-A、FLU-B)、人免疫缺陷型病毒I型和II型(HIV-I、HIV-II)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人类嗜T淋巴细胞(或T细胞白血病)病毒I型和II型(HTLV-I、HTLV-II)、人乳头瘤病毒1至18型(HPV-1至HPV-18)、风疹病毒(RV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、腺病毒(AV)和单纯疱疹病毒(HV)。此外，巨细胞病毒(CMV)、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、狂犬病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒和麻疹病毒。
[055]本方法包括从人供体分离淋巴细胞，优选初级外周血单核细胞(PBMC)，使PBMC与抗原肽、细胞因子和共刺激信号接触。在本发明的一个实施方式中，人供体具有在前的病毒感染史。在本发明的一个实施方式中，病毒是HCV、HIV、流感病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、腺病毒、黄病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、乳头瘤病毒、微小病毒B19、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、麻疹病毒、风疹病毒、人T细胞病毒I和人T细胞病毒II。优选地，病毒是HCV。
[056]本发明的方法进一步包括使PBMC和抗原肽接触。用于本发明的抗原肽优选是病毒的已知抗原的肽。换言之，本发明的抗原肽优选是当细胞感染病毒时在MHC分子的背景中由所述细胞表达的抗原。在一个实施方式中，所述抗原是HCV NS3 1073肽、HCV NS3 1406肽、HCV NS5 2594肽、来自HCV核心蛋白的15-聚体和来自HCV NS3蛋白的15-聚体。本发明进一步包括来自其它病毒的额外MHC限制性CTL表位，如在本文中所公开的那些。甚至更优选的，用于本发明的方法中的抗原肽/CTL表位被限制为HLA-A2。
[057]用于鉴定抗原肽尤其是MHC限制性病毒抗原肽的方法在本领域中是熟知的，并在例如美国专利5,780,036、5,783,567和美国专利6,419,931中公开，所有这些专利通过引用被全部并入本文。MHC I类限制性CTL识别加工过的病毒肽，该病毒肽被呈递在I类分子的抗原结合位点上，所述抗原结合位点形成于两个α螺旋之间，由β-片层形成的沟的底(floor)。许多方法已经用来确定所呈递的肽的身份。最精确的定义来自于从I类分子洗脱这类肽，揭示出与同一I类分子呈递的肽共享的一致基序(consistent motifs)。结合基序的特征是锚定残基，所述锚定残基作为肽和I类结合沟中的特定口袋之间的接触位点。表位肽的氨基和羧基端分别适合该沟的口袋A和F，其原因在于氢键。所述肽的氨基端锚在位置和数量上是可变的，而羧基锚一直在C-端，其中侧链直接伸入口袋F的底部。尽管在氨基端锚定残基中存在可观的异质性，但是口袋F似乎对其将容纳的氨基酸有更多的限制，使得亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸处于95％以上的已知表位的C端。对于大量的HLA I类分子，现在已经产生了抗原肽的基序预测，并且在本领域中是已知的。这样的MHC I类病毒肽包括，但不限于，下表中所列的肽。
  病毒   肽  SEQ ID NO：
  HIV nef84-94   AVDLSHFLK   4
  HBc18-27   FLPSDFFPSV   5
  HIV nef73-82   QVPLRPMTYK   6
  HIV-1 NL43 env gp41 768-778   RLRDLLLIVTR   7
  HCV 141-151   STLPETTTVRR   8
  HIV gag p24 265-274   KRWIILGLNK   9
  HIV-2   TPYDINQML   10
  HIV RT   ILKEPVHGV   11
  HTLV-1，Tox 12-19   LFGYPVYV   12
  甲型流感病毒，M158-66   GILGFVFTL   13
  HIV gp41 586-593   YLKDQQLL   14
  EBV EBNA-3   FLRGRAYGI   15
  HIV gag261-269   GEIYKRWII   16
  HCMV，gB 619-628   IAGNSAYEYV   17
  HIV gag331-339   DCKTILKAL   18
  HIV gp41586-593   YLKDQQLYL   19
  HIV   GGKKKYKLK   20
  HBV POL 1117   LLAQFTSAI   21
  HBV ENV 338   LLVPFVQWFV   22
  HBV ENV 335   WLSLLVPFV   23
  HCV   YLLPRRGPRL   24
  HCV   DLMGYIPLV   25
  HCV   GVAGALVAFK   26
  HBV ENV 1116   FLLAQFTSA   27
  HBV POL 1147   FLLSLGIHL   28
  HBV POL 1245   ALMPLYACI   29
  HCV   LLFNILGGWV   30
  HCV   FLLLADARV   31
  HCV   LLALLSCLTV   32
  HPV16 E7   LLMGTLGIV   33
  HPV16 E7   YMLDLQPET   34
  HPV16 E6   FAFRDLCIV   35
  HBV ENV   ILLLCLIFLL   36
  HBV POL   KLHLYSHPI   37
  HBV ENV   VLLDYQGML   38
  HBV ENV   LLPIFFCLWV   39
  HBV ENV   VLQAGFFLL   40
  HPV16 E7   TLGIVCPIC   41
  HPV16 E7   TLHEYMLDL   42
 HPV16 E7   GTLGIVCPI   43
 HIV   VLAEAMSQV   44
 HIV   LLWKGEGAVV   45
 HIV   LLWKGEGAV   46
 HIV   ILKEPVHGV   47
 HIV   IVGAETFYV   48
 HPV16 E7   MLDLQPETT   49
 HPV16 E6   TIHDIILECV   50
 HCV   STNPKPQK   51
 HCV   GPRLGVRAT   52
 HCV   YPWPLyGNEGLGWAGWLLSP   53
 HBV POL   YLHTLWKAGV   54
 HBV ENV   PLLPIFFCL   55
 HBV NUC(CORE)   ILSTLPETTV   56
 HIV   IIGAETFYV   57
 HIV   LWVTVYYGV   58
 HIV   LMVTVYYGV   59
 HBV POL   YLHTLWKAGI   60
 HIV pol185-193   DPKVKQWPL   61
 HBVadr-ENV(S Ag335-343)   WLSLLVPFV   62
[058]本发明还包括使PBMC与细胞因子接触。优选地，细胞因子是T细胞生长因子细胞因子，例如，IL-2、IL-15、IFNγ等等。甚至更优选地，细胞因子是IL-2。重组IL-2(rIL2)可以从例如Sigma(St.Louis，MO)商购获得。
[059]本文所公开的发明进一步包括使PBMC与共刺激信号接触。优选地，共刺激信号是含有特异性结合T细胞并提供共刺激信号的抗体的珠子。共刺激信号的例子包括但不限于，抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。制备抗-CD3抗体/抗-CD28抗体包被珠(αCD3/28)的方法在本领域中是已知的，并且在例如Levine et al.(2002，Nature Med.8：47-53；Levine et al.，1996，Science 272：1939-1943)中有所描述。
[060]如本文所公开的数据所示，PBMC以不同比例的珠子细胞比与αCD3/28珠接触。优选地，PBMC以约1∶1(αCD3/28∶细胞)的比例接触，甚至更优选地，以约1∶2的比例，仍更优选地，以约1∶3的比例，甚至更优选地，以约1∶4的比例，仍更优选地，以1∶5的比例接触。技术人员，当具有本公开内容和本文所公开的数据后，可以确定其它的αCD3/28∶细胞的比例，包括例如1∶10、1∶20、1∶50和1∶100的比例。
[061]如本文别处所公开，PBMC与抗原肽、细胞因子和共刺激信号基本上同时发生接触。也就是说，抗原肽、细胞因子和共刺激信号在大约相同的时刻或彼此接近的时间临近度提供给细胞。本发明进一步包括使PBMC与抗原肽、细胞因子和共刺激信号在不同的时刻下接触。也就是说，本发明包括以间隔较长时间期间的明显单独事件来进行本文所公开的方法。
[062]本发明的方法扩增T细胞，优选CD8 T细胞，特别地，原因在于只有所扩增的T细胞对于衍生出抗原肽的病毒是特异性的。因此，当待扩增的T细胞存在于细胞混合物中时，目标T细胞将被诱导增殖和细胞数扩增。进一步地，如在本文所公开的数据所说明，大量的对病毒抗原具有特异性的T细胞被扩增，并且细胞混合物被富集以获得病毒特异性T细胞。此外，可以使用很多种细胞分离和纯化技术，例如本领域中已知的和/或本文别处所描述的那些技术，进一步纯化T细胞。
[063]如普通技术人员将理解，基于本文所提供的公开内容，在使用本发明的方法进行扩增之前，不需要鉴定或分离目标T细胞。这是因为本发明的方法对于来自任何给定的病毒的抗原肽类型是选择性的，并将扩增对所述抗原肽应答的T细胞(一种或多种)。
[064]本发明还包括特异性扩增T细胞群体亚群的方法。更具体地，所述方法包括使含有至少一种目标亚群T细胞的T细胞群与抗原肽、细胞因子和能够扩增该T细胞的共刺激信号接触。这是因为，如本文的数据所示，本发明的方法诱导T细胞的增殖，从而特异性扩增T细胞群亚群。本领域普通技术人员将理解，基于本文所提供的公开内容，该T细胞亚群包括辅助T细胞(TH1和TH2)CD4表达细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(Tc1或Tc2)调节T细胞(TREG)、TC/S、稚细胞、记忆细胞、中枢记忆性细胞、效应记忆性细胞和γδT细胞。因此，使用本发明的方法可以容易地产生对于具体T细胞亚群富集的细胞群。
[065]本发明进一步包括诱导对抗原的T细胞应答的方法，优选哺乳动物中的病毒抗原。所述方法包括从动物分离PBMC，使PBMC与抗原肽--优选MHC限制性抗原肽、细胞因子和共刺激信号接触。优选地，细胞因子是IL-2，共刺激信号是αCD3/38珠。一旦使用本发明扩增T细胞的方法获得了足够数目的抗原特异性T细胞，则如此获得的抗原特异性T细胞被施用给所述哺乳动物，从而诱导所述哺乳动物中对所述抗原的T细胞应答。这是因为本文所公开的数据充分证明，使用本发明的方法，通过刺激静息T细胞，可以容易地产生抗原特异性T细胞。
II.组合物
[066]本发明包括通过本发明的方法产生的分离的T细胞。优选地，T细胞是CD8细胞。甚至更优选地，CD8细胞特异于病毒抗原。普通技术人员将理解，基于本文所提供的公开内容，众多的病毒抗原可用于产生几乎无穷多种的病毒特异性T细胞。换言之，在本领域中存在关于抗原肽的大量知识，该抗原肽在感染的细胞上在MHC分子的背景中表达。因此，本领域技术人员，应用本文所公开的方法，可以产生对任何病毒具有特异性的T细胞。
[067]通过本发明的方法产生的T细胞可用于药物组合物的制备和应用中，所述药物组合物含有作为活性成分的本发明的病毒特异性T细胞。这样的药物组合物可以单独由活性成分组成，该活性成分作为至少一种活性成分(例如，有效剂量的病毒特异性T细胞)的组合，其形式适于施用给对象；或者所述药物组合物可以包括活性成分和一种或多种药学上可接受载体、一种或更多种另外的(活性和/或非活性的)成分、或它们的一些组合。
[068]如本文所使用，术语“药学上可接受的载体”意指这样的化学组分：活性成分可以与其混合，并且在混合后，其可以用于将所述活性成分施用给对象。
[069]本文描述的药物组合物的制剂可以通过药学领域中任何已知的或以后开发的方法加以制备。通常，这类制备方法包括将活性成分与载体或一种或多种其它辅助成分关联起来，然后，如果需要或期望的话，将产品成型或包装为期望的单剂量或多剂量单位。
[070]尽管本文提供的对药物组合物的描述主要涉及适于凭处方施用给人类的药物组合物，但是技术人员将理解，这类组合物通常适于施用给所有种类的动物。为了使适于施用给人类的药物组合物适于施用给各种动物而进行的对所述药物组合物的修改是被充分理解的，并且普通兽医药学家仅仅应用普通的试验--如果有的话--就可以设计并进行这类修改。考虑向其施用本发明的药物组合物的对象包括，但不限于，人和其它灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，如非人灵长类动物、牛、猪、马、绵羊、猫和狗；鸟类，包括商业相关的鸟类，如鸡、鸭、鹅和火鸡；鱼类，包括农场养殖的鱼类和观赏鱼；以及甲壳动物，例如农场养殖的甲壳水生动物。
[071]在本发明的方法中有用的药物组合物可以以适于口服、直肠给药、阴道给药、肠胃外给药、局部给药、肺部给药、鼻内给药、颊部给药、眼部给药或另一种给药途径的制剂制备、包装或销售。其它考虑的制剂包括投射纳米颗粒(projected nanoparticles)、脂质体制剂、含有活性成分的重新包封的红细胞、以及基于免疫学的制剂。
[072]除了活性成分之外，本发明的药物组合物可以进一步包括一种或更多种另外的药物活性剂。特别考虑的另外的药剂包括抗病毒剂，例如蛋白酶抑制剂、核苷类似物、反转录酶抑制剂、干扰素α、利巴韦林等等。
[073]本发明的药物组合物可以以单一单位剂量或多个单一单位剂量大批制备、包装或销售。如在本文所使用，“单位剂量(unit dose)”是含有预定量的活性成分的药物组合物的个别量。活性成分的量通常等于将被施用给对象的活性成分的剂量或者这类剂量的适宜部分，例如，如这类剂量的二分之一或三分之一。
[074]本发明的药物组合物中活性成分、药学上可接受载体和任何另外的成分的相对量将可变，取决于所治疗对象的身份、身材和状况，并进一步取决于施用组合物的途径。例如，组合物可以包括0.1％至100％(w/w)之间的活性成分。
[075]如本文所使用，药物组合物的“肠胃外给药”包括特征为物理破裂对象的组织和通过该组织中的裂口施用药物组合物的任何给药途径。因此，肠胃外给药包括但不限于，通过注射组合物、通过手术切开应用组合物、通过渗透组织的非外科创伤应用组合物等等而进行的药物组合物给药。具体而言，所考虑的肠胃外给药包括，但不限于，皮下注射、腹膜内注射、肌内注射、胸骨内注射、和肾透析输注技术。
[076]适于肠胃外给药的药物组合物制剂包含与药学上可接受载体例如无菌水或无菌等渗盐水混合的活性成分。这类制剂可以以适于丸剂给药或持续给药的形式制备、包装或销售。可注射的制剂可以以单位剂型制备、包装或销售，例如在安瓿或含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外给药的制剂包括，但不限于，悬浮液、溶液、油性或水性载体中的乳剂、糊剂、和可植入的缓释或可生物降解的制剂。这类制剂可进一步包括一种或更多种另外的成分，包括但不限于，悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外给药的制剂的一个实施方式中，活性成分以干燥(即，粉末或颗粒状)形式提供，用于与合适的载体(例如，无菌的无热原水)重构，所述重构是在重构组合物的肠胃外给药之前进行。
[077]药物组合物可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。该悬浮液或溶液可以根据已知技术进行配制，并且除了活性成分之外，可以包括其它成分，例如本文所描述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。此类无菌可注射制剂可以使用非毒性胃肠外可接受稀释剂或溶液--例如水或1，3-丁二醇--加以制备。其它可接受稀释剂和溶剂包括，但不限于，林格液、等渗氯化钠溶液和不挥发油，如合成的甘油一酯或甘油二酯。其它有用的可胃肠外给药的制剂包括那些包含微晶形式、脂质体制剂形式或作为可生物降解聚合物体系的组分的活性成分的制剂。用于缓释或植入的组合物可以包括药学上可接受的高分子或疏水材料例如乳液、离子交换树脂、微溶的聚合物或微溶的盐。
[078]本发明的病毒特异性T细胞和/或使用本发明的方法扩增的T细胞可以被施用于动物，优选人类。当使用本发明的方法扩增的T细胞被施用时，所施用细胞的量可以在约1,000,000个细胞到300,000,000,000个细胞之间的范围。所施用的精确剂量将根据任何数量的因素变化，包括但不限于，动物类型和所治疗的疾病状态的类型、动物的年龄和给药途径。
[079]病毒特异性T细胞可以频繁至每日几次施用给动物，或者它可以被较不频繁地施用，例如一天一次、一周一次、每两周一次、一月一次或甚至更不频繁，例如每几个月一次或甚至一年一次或更少。剂量频率对于技术人员将是明显的，并且将取决于任何数量的因素，例如但不限于，所治疗的疾病的类型和严重程度、动物的类型和年龄等等。
[080]病毒特异性T细胞可以与各种其它化合物(细胞因子、化学治疗和/或抗病毒药物等等)共同施用。可选地，可以在施用病毒特异性T细胞之前一小时、一天、一周、一个月或甚至更长时间施用所述化合物，或者它们的任何改变。进一步地，可以在施用病毒特异性T细胞之后一小时、一天、一周或甚至更长时间施用所述化合物，或者它们的任何改变。频率和给药方案对于技术人员将是明显的，并将取决于任何数量的因素，例如但不限于，所治疗的疾病的类型和严重程度、动物的年龄和健康状态、所施用的化合物或多个化合物的性质、各种化合物和病毒特异性T细胞的给药途径，等等。
III.试剂盒
[081]本发明包括各种试剂盒，其包含用于产生本发明的病毒特异性T细胞的各种试剂。这类试剂包括，但不限于，抗原肽、细胞因子和共刺激信号。在本发明的试剂盒的一个实施方式中，抗原肽来自病毒，包括HCV、HIV、流感病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、腺病毒、黄病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、乳头瘤病毒、微小病毒B19、多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、麻疹病毒、风疹病毒、人T细胞病毒I和人T细胞病毒II。在本发明的一个实施方式中，细胞因子是IL-2，共刺激信号是αCD3/28。本发明的试剂盒进一步包括施用器和说明性材料，该说明性材料描述了应用试剂盒进行本发明的方法。尽管示例性的试剂盒在下面进行了描述，但是根据本公开内容，其它有用试剂盒的内容物对于技术人员将是明显的。这些试剂盒的每一个被包括在本发明之内。
[082]本发明包括治疗人类病毒感染的试剂盒。即，本发明包括MHC限制性抗原肽、细胞因子和共刺激信号，用于诱导T细胞增殖，所述T细胞然后被施用于人或其它哺乳动物，以治疗病毒感染。这是因为本发明的方法诱导特异于病毒抗原的T细胞的增殖，并且该T细胞可用于治疗病毒感染。按照本发明所公开的方法使用试剂盒。简言之，试剂盒可用于将本发明的病毒特异性T细胞施用给哺乳动物。这是因为，如在本文别处更加充分公开的，本文所公开的数据证明：T细胞与MHC限制性抗原肽、细胞因子和共刺激信号的接触介导来自细胞群的T细胞的增殖、特异性和富集。应用该试剂盒产生的T细胞可以被施用给动物，实现治疗结果。
[083]试剂盒进一步包括可用于施用本发明的方法所扩增的T细胞的施用器。包括在试剂盒内的具体施用器将取决于，例如，用于施用T细胞的方法。这类施用器在本领域中是熟知的，并且可以包括移液管、注射器、滴管等等。而且，试剂盒包括使用试剂盒的说明性材料。这些说明只是体现了本文所提供的公开内容。
[084]试剂盒可以进一步包括药学上可接受的载体。组合物以合适量予以提供，如本文别处所描述。此外，给药途径和给药频率如本文别处先前所描述。
[085]通过参考下面的实验性实施例，对本发明进行进一步详细描述。这些实施例仅为了阐述的目的加以提供，并且不意图是限制性的，除非另外说明。因此，本发明无论如何不能被解释成受限于下面的实施例，而是应该被解释成，包括由于本文所提供的教导而变得明显的任何变化和所有变化。
实施例
实施例1：从淋巴细胞快速扩增抗原特异性T细胞
[086]从个体分离外周血单核细胞(PBMC)，该个体从丙型肝炎病毒感染自然恢复。根据表1中的方案，在第0天开始刺激分离的PBMC。
表1
  方案   HCV CTL表位   rIL-2   aCD3/28珠与细胞的比例
  1∶1+A2+IL2   HLA-A2限制性NS31073、NS3 1406和NS52594，各10μg/ml   100U/ml   1∶1
  1∶5+A2+IL2   HLA-A2限制性NS31073、NS3 1406和NS52594，各10μg/ml   100U/ml   1∶5
  1∶1+15-聚体库+IL2   重叠HCV-核心和NS3 15-聚体的库，每种肽1μM   100U/ml   1∶1
  1∶1+15-聚体库+IL2   重叠HCV-核心和NS3 15-聚体的库，每种肽1μM   100U/ml   1∶5
[087]丙型肝炎病毒细胞毒性T淋巴细胞(HCV CTL)表位的序列或引用如下：NS3 1073：CVNGVCWTV(SEQ ID NO：1)、NS3 1406：KLVALGINAV(SEQ ID NO：2)、NS5 2594：ALYDVVTKL(SEQ IDNO：3)。HCV基因组的氨基酸序列，包括核心蛋白和NS3蛋白质，描述于图4中(SEQ ID NO：63)。来自HCV核心和NS3蛋白的重叠的HCV-衍生15-聚体的库的构建在例如Anthony et al.(2004，J.Immunology，172：4907-4916)中有所描述。抗-CD3/抗-CD28单克隆抗体包被珠(αCD3/28珠)如在例如Levine et al.(2002，Nature Med.8：47-53；Levine et al.，1996，Science 272：1939-1943)中所描述而产生。
[088]在初始刺激之后，用完全培养基中的rIL2(100U/ml)每3-4天维持培养物，并在第7天和第17天进行检查。在一些情况下，培养物在第10天分成两个单独的孔，其中一个孔仅接受rIL2，而另一个孔用第二剂量的、与第0天相同的抗原肽刺激。这使得总细胞数增加了10-15倍(图1)。
[089]当比较于在第0天(刺激前)可检测的HCV-特异T细胞的低频率，本文所描述的扩增方案使HCV-特异性T细胞显著富集。使用特异于HLA-A2限制性CD8CTL表位的MHC/肽四聚体并通过胞内细胞因子染色，检测HCV-特异性T细胞的富集(图2和图3)。
[090]如本文所公开的数据所证明，用抗原和αCD3/28珠与rIL2同时刺激是体外快速扩增抗原特异性T细胞的有效方法。
[091]本文引用的每一个和各个专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用全部并入本文中。
[092]尽管本发明已经参考具体实施方式进行了描述，但是显然的是，本领域技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变化，而不背离本发明的真正精神和范围。所附权利要求意图被解释成包括所有这类实施方式和等同变化。
序列表
<110>K-M·昌
<120>快速扩增抗原特异性T细胞的方法
<130>053893-5092PC
<150>60/679,795
<151>2005-05-11
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<170>PatentIn Version 3.3
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<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>1
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<213>丙型肝炎病毒
<400>2
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<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>3
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<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>4
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<213>乙型肝炎病毒
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<213>人免疫缺陷病毒
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<213>人免疫缺陷病毒
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<213>丙型肝炎病毒
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<213>人免疫缺陷病毒
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<213>人免疫缺陷病毒
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<213>人免疫缺陷病毒
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<213>人类嗜T淋巴细胞病毒
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<213>甲型流感病毒
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<213>丙型肝炎病毒
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<213>乙型肝炎病毒
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<211>9
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>37
Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile
1               5
<210>38
<211>9
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>38
Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu
1               5
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>39
Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
1               5                   10
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>40
Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu
1               5
<210>41
<211>9
<212>PRT
<213>人乳头瘤病毒
<400>41
Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys
1               5
<210>42
<211>9
<212>PRT
<213>人乳头瘤病毒
<400>42
Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu
1               5
<210>43
<211>9
<212>PRT
<213>人乳头瘤病毒
<400>43
Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile
1               5
<210>44
<211>9
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>44
Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val
1               5
<210>45
<211>10
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>45
Leu Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala Val Val
1               5                   10
<210>46
<211>9
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>46
Leu Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala Val
1               5
<210>47
<211>9
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>47
Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val
1               5
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>48
Ile Val Gly Ala Glu Thr Phe Tyr Val
1               5
<210>49
<211>9
<212>PRT
<213>人乳头瘤病毒
<400>49
Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr
1               5
<210>50
<211>10
<212>PRT
<213>人乳头瘤病毒
<400>50
Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val
1               5                   10
<210>51
<211>8
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>51
Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Lys
1               5
<210>52
<211>9
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>52
Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr
1               5
<210>53
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>53
Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp
1               5                   10                  15
Leu Leu Ser Pro
            20
<210>54
<211>10
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>54
Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Val
1               5                   10
<210>55
<211>9
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>55
Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu
1               5
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>56
Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val
1               5                   10
<210>57
<211>9
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>57
Ile Ile Gly Ala Glu Thr Phe Tyr Val
1               5
<210>58
<211>9
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>58
Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val
1               5
<210>59
<211>9
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>59
Leu Met Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val
1               5
<210>60
<211>10
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>60
Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile
1               5                   10
<210>61
<211>9
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>61
Asp Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu
1               5
<210>62
<211>9
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>62
Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
1               5
<210>63
<211>3011
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>63
Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn
1               5                   10                  15
Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly
            20                  25                  30
Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala
        35                  40                  45
Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro
    50                  55                  60
Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly
65                  70                  75                  80
Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp
                85                  90                  95
Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro
            100                 105                 110
Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys
        115                 120                 125
Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu
    130                 135                 140
Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile
                165                 170                 175
Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr
            180                 185                 190
Gln Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro
        195                 200                 205
Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro
    210                 215                 220
Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val
225                 230                 235                 240
Ala Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr
                245                 250                 255
Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys
            260                 265                 270
Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly
        275                 280                 285
Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys
    290                 295                 300
Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp
305                 310                 315                 320
Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln
                325                 330                 335
Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His
            340                 345                 350
Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp
        355                 360                 365
Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu
    370                 375                 380
Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val
385                 390                 395                 400
Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr
                405                 410                 415
Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser
            420                 425                 430
Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn
        435                 440                 445
Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp
    450                 455                 460
Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu
465                 470                 475                 480
Asp Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile
                485                 490                 495
Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser
            500                 505                 510
Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser
        515                 520                 525
Trp Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro
    530                 535                 540
Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe
545                 550                 555                 560
Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn
                565                 570                 575
Asn Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala
            580                 585                 590
Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met
        595                 600                 605
Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr
    610                 615                 620
Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu
625                 630                 635                 640
Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp
                645                 650                 655
Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln Trp
            660                 665                 670
Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly
        675                 680                 685
Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly
    690                 695                 700
Val Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val
705                 710                 715                 720
Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu Trp
                725                 730                 735
Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val
            740                 745                 750
Ile Leu Asn Ala Ala Ser Leu Ala Gly Thr His Gly Leu Val Ser Phe
        755                 760                 765
Leu Val Phe Phe Cys Phe Ala Trp Tyr Leu Lys Gly Arg Trp Val Pro
    770                 775                 780
Gly Ala Val Tyr Ala Phe Tyr Gly Met Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu
785                 790                 795                 800
Leu Ala Leu Pro Gln Arg Ala Tyr Ala Leu Asp Thr Glu Val Ala Ala
                805                 810                 815
Ser Cys Gly Gly Val Val Leu Val Gly Leu Met Ala Leu Thr Leu Ser
            820                 825                 830
Pro Tyr Tyr Lys Arg Tyr Ile Ser Trp Cys Met Trp Trp Leu Gln Tyr
        835                 840                 845
Phe Leu Thr Arg Val Glu Ala Gln Leu His Val Trp Val Pro Pro Leu
    850                 855                 860
Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Val Ile Leu Leu Met Cys Val Val
865                 870                 875                 880
His Pro Thr Leu Val Phe Asp Ile Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Phe
                885                 890                 895
Gly Pro Leu Trp Ile Leu Gln Ala Ser Leu Leu Lys Val Pro Tyr Phe
            900                 905                 910
Val Arg Val Gln Gly Leu Leu Arg Ile Cys Ala Leu Ala Arg Lys Ile
        915                 920                 925
Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Ile Ile Lys Leu Gly Ala Leu
    930                 935                 940
Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asn His Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp Ala
945                 950                 955                 960
His Asn Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Val Phe
                965                 970                 975
Ser Arg Met Glu Thr Lys Leu Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala
            980                 985                 990
Cys Gly Asp Ile Ile Asn Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Gln
        995                 1000                1005
Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Met Val Ser Lys Gly Trp
    1010                1015                1020
Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly
    1025                1030                1035
Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn
    1040                1045                1050
Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Thr Gln Thr
    1055                1060                1065
Phe Leu Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His
    1070                1075                1080
Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile
    1085                1090                1095
Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala
    1100                1105                1110
Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser
    1115                1120                1125
Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg
    1130                1135                1140
Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile
    1145                1150                1155
Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala
    1160                1165                1170
Gly His Ala Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly
    1175                1180                1185
Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr
    1190                1195                1200
Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Ala
    1205                1210                1215
Val Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly
    1220                1225                1230
Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly
    1235                1240                1245
Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly
    1250                1255                1260
Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Val Asp Pro Asn Ile
    1265                1270                1275
Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr
    1280                1285                1290
Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly
    1295                1300                1305
Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala
    1310                1315                1320
Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr
    1325                1330                1335
Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly
    1340                1345                1350
Ser Val Thr Val Ser His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser
    1355                1360                1365
Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu
    1370                1375                1380
Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys
    1385                1390                1395
Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn
    1400                1405                1410
Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr
    1415                1420                1425
Ser Gly Asp Val Val Val Val Ser Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly
    1430                1435                1440
Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val
    1445                1450                1455
Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu
    1460                1465                1470
Thr Thr Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg
    1475                1480                1485
Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala
    1490                1495                1500
Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys
    1505                1510                1515
Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala
    1520                1525                1530
Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu
    1535                1540                1545
Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr
    1550                1555                1560
Gly Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln
    1565                1570                1575
Ser Gly Glu Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val
    1580                1585                1590
Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp
    1595                1600                1605
Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro
    1610                1615                1620
Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn Glu Val Thr Leu Thr
    1625                1630                1635
His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met Ser Ala Asp Leu
    1640                1645                1650
Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Gly Gly Val Leu Ala
    1655                1660                1665
Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Ser Thr Gly Cys Val Val Ile Val
    1670                1675                1680
Gly Arg Ile Val Leu Ser Gly Lys Pro Ala Ile Ile Pro Asp Arg
    1685                1690                1695
Glu Val Leu Tyr Gln Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys Ser Gln
    1700                1705                1710
His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Met Leu Ala Glu Gln Phe
    1715                1720                1725
Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Ser Arg Gln Ala
    1730                1735                1740
Glu Val Ile Thr Pro Ala Val Gln Thr Asn Trp Gln Lys Leu Glu
    1745                1750                1755
Val Phe Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln
    1760                1765                1770
Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala
    1775                1780                1785
Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ala Val Thr Ser Pro Leu Thr Thr
    1790                1795                1800
Gly Gln Thr Leu Leu Phe Asn Ile Leu Gly Gly Trp Val Ala Ala
    1805                1810                1815
Gln Leu Ala Ala Pro Gly Ala Ala Thr Ala Phe Val Gly Ala Gly
    1820                1825                1830
Leu Ala Gly Ala Ala Ile Gly Ser Val Gly Leu Gly Lys Val Leu
    1835                1840                1845
Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu
    1850                1855                1860
Val Ala Phe Lys Ile Met Ser Gly Glu Val Pro Ser Thr Glu Asp
    1865                1870                1875
Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val
    1880                1885                1890
Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Gly Pro
    1895                1900                1905
Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu Ile Ala Phe Ala
    1910                1915                1920
Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser
    1925                1930                1935
Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Ala Ile Leu Ser Ser Leu Thr Val
    1940                1945                1950
Thr Gln Leu Leu Arg Arg Leu His Gln Trp Ile Ser Ser Glu Cys
    1955                1960                1965
Thr Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp
    1970                1975                1980
Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys
    1985                1990                1995
Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg
    2000                2005                2010
Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met His Thr Arg
    2015                2020                2025
Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His Val Lys Asn Gly Thr
    2030                2035                2040
Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Arg Asn Met Trp Ser Gly
    2045                2050                2055
Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Leu
    2060                2065                2070
Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser Ala Glu
    2075                2080                2085
Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val Ser
    2090                2095                2100
Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro Ser
    2105                2110                2115
Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe
    2120                2125                2130
Ala Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg
    2135                2140                2145
Val Gly Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu
    2150                2155                2160
Pro Glu Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro
    2165                2170                2175
Ser His Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly
    2180                2185                2190
Ser Pro Pro Ser Met Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala
    2195                2200                2205
Pro Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp
    2210                2215                2220
Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly
    2225                2230                2235
Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu
    2240                2245                2250
Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val
    2255                2260                2265
Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Arg Arg Phe Ala Arg
    2270                2275                2280
Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Val
    2285                2290                2295
Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val Val His Gly
    2300                2305                2310
Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro Pro Arg
    2315                2320                2325
Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Ser Thr Ala
    2330                2335                2340
Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser
    2345                2350                2355
Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro
    2360                2365                2370
Ser Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met
    2375                2380                2385
Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly
    2390                2395                2400
Ser Trp Ser Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val
    2405                2410                2415
Cys Cys Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Val Thr Pro
    2420                2425                2430
Cys Ala Ala Glu Glu Gln Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn
    2435                2440                2445
Ser Leu Leu Arg His His Asn Leu Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg
    2450                2455                2460
Ser Ala Cys Gln Arg Gln Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln
    2465                2470                2475
Val Leu Asp Ser His Tyr Gln Asp Val Leu Lys Glu Val Lys Ala
    2480                2485                2490
Ala Ala Ser Lys Val Lys Ala Asn Leu Leu Ser Val Glu Glu Ala
    2495                2500                2505
Cys Ser Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr
    2510                2515                2520
Gly Ala Lys Asp Val Arg Cys His Ala Arg Lys Ala Val Ala His
    2525                2530                2535
Ile Asn Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu Asp Ser Val Thr Pro
    2540                2545                2550
Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gln
    2555                2560                2565
Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro
    2570                2575                2580
Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val
    2585                2590                2595
Val Ser Lys Leu Pro Leu Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe
    2600                2605                2610
Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Gln Ala Trp
    2615                2620                2625
Lys Ser Lys Lys Thr Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys
    2630                2635                2640
Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu Ser Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ala
    2645                2650                2655
Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Asp Pro Gln Ala Arg Val Ala Ile
    2660                2665                2670
Lys Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Leu Thr Asn
    2675                2680                2685
Ser Arg Gly Glu Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly
    2690                2695                2700
Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Ile Lys
    2705                2710                2715
Ala Arg Ala Ala Cys Arg Ala Ala Gly Leu Gln Asp Cys Thr Met
    2720                2725                2730
Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly
    2735                2740                2745
Val Gln Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met
    2750                2755                2760
Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gln Pro Glu Tyr
    2765                2770                2775
Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala
    2780                2785                2790
His Asp Gly Ala Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro
    2795                2800                2805
Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala Arg His Thr
    2810                2815                2820
Pro Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Phe Ala Pro Thr
    2825                2830                2835
Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Val Leu
    2840                2845                2850
Ile Ala Arg Asp Gln Leu Glu Gln Ala Leu Asn Cys Glu Ile Tyr
    2855                2860                2865
Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Pro Ile Ile
    2870                2875                2880
Gln Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser
    2885                2890                2895
Pro Gly Glu Ile Asn Arg Val Ala Ala Cys Leu Arg Lys Leu Gly
    2900                2905                2910
Val Pro Pro Leu Arg Ala Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg
    2915                2920                2925
Ala Arg Leu Leu Ser Arg Glu Gly Arg Ala Ala Ile Cys Gly Lys
    2930                2935                2940
Tyr Leu Phe Asn Trp Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro
    2945                2950                2955
Ile Ala Ala Ala Gly Arg Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Thr Ala
    2960                2965                2970
Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile Tyr His Ser Val Ser His Ala Arg
    2975                2980                2985
Pro Arg Trp Phe Trp Phe Cys Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val
    2990                2995                3000
Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg
    3005                3010

Claims (15)

1. 扩增细胞群中的病毒特异性T细胞的方法，所述方法包括：从人分离出所述细胞群，使所述细胞群与MHC限制性病毒抗原肽、细胞因子和共刺激信号接触，其中所述共刺激信号是抗-CD3/抗-CD28包被珠，从而从所述细胞群扩增病毒特异性T细胞。
2. 权利要求1所述的方法，其中所述人先前受到所述病毒感染。
3. 权利要求1所述的方法，其中所述T细胞特异于丙型肝炎病毒。
4. 权利要求1所述的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素-2。
5. 富集细胞群获得病毒特异性T细胞的方法，所述方法包括：从人分离出所述细胞群，使所述细胞群与MHC限制性病毒抗原肽、细胞因子和共刺激信号接触，其中所述共刺激信号是抗-CD3/抗-CD28包被珠，从而富集细胞群获得病毒特异性T细胞。
6. 权利要求5所述的方法，其中所述人先前受到所述病毒感染。
7. 权利要求5所述的方法，其中所述T细胞特异于丙型肝炎病毒。
8. 权利要求5所述的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素-2。
9. 诱导病毒特异性T细胞增殖的方法，所述方法包括：使所述细胞与MHC限制性病毒抗原肽、细胞因子和共刺激信号接触，其中所述共刺激信号是抗-CD3/抗-CD28包被珠，从而诱导病毒特异性T细胞增殖。
10. 权利要求10所述的方法，其中所述T细胞特异于丙型肝炎病毒。
11. 权利要求10所述的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素-2。
12. 通过下列步骤产生的病毒特异性T细胞：从人分离出细胞群，使所述细胞群与MHC限制性病毒抗原肽、细胞因子和共刺激信号接触，其中所述共刺激信号是抗-CD3/抗-CD28包被珠。
13. 权利要求13所述的方法，其中所述T细胞特异于丙型肝炎病毒。
14. 权利要求13所述的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素-2。
15. 试剂盒，其用于从细胞群扩增病毒特异性T细胞，所述试剂盒包括白细胞介素-2、抗-CD3/抗-CD28包被珠和病毒抗原肽，其中所述肽选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3中列出的肽，HCV核心蛋白15-聚体和HCV NS3 15-聚体。
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