WO2016195470A1 - Modulador de células t potencializado capaz de modular la respuesta inmune, método de extracción, comprobación y conteo de extracto dializable de leucocitos de origen bazo de tiburón para su obtención y su uso terapéutico - Google Patents

Modulador de células t potencializado capaz de modular la respuesta inmune, método de extracción, comprobación y conteo de extracto dializable de leucocitos de origen bazo de tiburón para su obtención y su uso terapéutico Download PDF

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    • C12N2502/1164—NK cells

Definitions

  • the present invention is a method of extraction, testing and edging, of dialyzable leukocyte extract from Ieucoeitary cells containing polypeptides equal to or less than 10,000 daltons of spleen origin of selaclmorphs, commonly known as ole sharks, or also called sharks , to obtain a potentiated T-cell modulator (TCM) capable of modulating the immune response through the activation of specific molecules involved in the control of innate immunity called "TolHike Receptor".
  • TCM potentiated T-cell modulator
  • the procedure essentially involves sterilization, shark spleen extraction, counting and quantification, breaking or separation of components, dialysis, filtration and sterilization, formulation, chemical physical evaluation and biological activity evaluation.
  • the means for obtaining a dtaitzabfe leukocyte extract containing polypeptides less than or equal to 10,000 Daltons whose source or origin is from cells, tissues or organs of sharks, more specifically shark spleen, of the present invention, is considered novel.
  • methods were found for said extraction of leukocytes, white cells or T-cell modulator, using Ieucoeitary packages of healthy (human) donors; reptile eggs, amphibians, fish and birds; in addition to colostrum (milk produced by mammals) and crocodile spleen.
  • T cell modulator concentrations of the extraction media described above ranges from 10 4 to 10 s leukocytes x mm 3 (see Figure 1).
  • TRANSFER FACTOR FROM AVE EGGS uses a method to obtain a transfer factor a from the yolk of animals, however, an expert in the slaughter, knows that the method to extract transfer factor from eggs is very complicated, especially in the separation of the Ifpids. Like the transfer factor units obtained per egg, it is thousands of times smaller than the present invention.
  • composition to produce an immune response mediated by T cells in an Individual, which contains the transfer factor of at least two different types of animals.
  • the composition may contain the mammalian transfer factor and a non-mammalian transfer factor.
  • An example of the composition may be a combination of a product derived from colostrum, which includes the mammalian transfer factor, and an egg derived product, which includes the non-mammalian transfer factor.
  • this patent presents two problems, eliminating the multiples contained in the egg yolk and the low amount of leukocytes x mm 3 , which reduces the power of said invention.
  • the patent MK SS0421S IMPROVED PROCEDURE FOR THE PURIFICATION OF OUGOPEPTiDQS WITH MOLECULAR WEIGHTS FROM 1Q0Q TO 10,000 DALTONS, FROM LEUKOCATE STRATECTS AND ITS PHARMACEUTICAL PRESENTATION refers to an improved procedure for performance , from a set of oligopeptides (from 1,000 to 10,000 daitons), recovered from the breakdown of leukocytes and that have biological activity for the regulation of the immune response comprising the following steps from leukocyte packages from healthy donors, ALL UNDER CONDITIONS ASEPTIC, the cells are broken, suspensions are made by adjusting volumes, and by ultracentrifugation, the suspension of the cell debris (cell detritus) is clarified, the oligopeptides are recovered by means of diafiltration and concentrated by tangential ultrafiltration
  • the product is formulated with base in its formula of finished product in presentation No pharmaceutical
  • one skilled in the art knows that the use or
  • the transfer factor units obtained for every 450 ml of blood from healthy donors of the present invention although greater than the transfer factor units obtained from egg yolk and colostrum, it is only 0 8 leukocytes x mm 3 .
  • WO S? / 12 1S PURIFICATION PROCEDURE OF THE TRANSFER FACTOR FROM LEUCOCITOS.
  • compositions that include extracts from sources of immune modulators that include immune molecules of the nanofraction modulator (i.e., molecules that have molecular weights of about 3,000 DA and less). These compositions may also include other immune modulators, such as transfer factor.
  • transfer factor white blood cell extracts
  • TCM is characterized at the molecular level and its main means of inducing therapeutic effects have been elucidated.
  • Clinical data has been generated in a variety of immunologically associated conditions including multiple sclerosis, infections. viral and cancer.
  • In vitro data demonstrates the consistent production of immune modulating cytokines, including infernos and interleukins after treatment of immune cells with the TCM.
  • mice which resulted in a regulation of T-lymphocytes when observing the excitation of interleukins, indicates that it is another function that is not the original Transfer Fact, that is, a T-cell modulator or TCM (T Cells odulator), which has the function of modulating the immune response through the activation of specific molecules involved in the control of innate immunity called "Tol ⁇ - ⁇ ike Receptor” «
  • TCM T Cells odulator
  • JCM T Cell Modulator
  • the production of the immunogenic atocin Th1 of interferon gamma ⁇ IFN «g ⁇ from human peripheral blood mononuccular cells (PBMC) was directly evaluated by the TCM, as well as the Th2 cytokine of interleukin-4 ⁇ IL « 4).
  • the evaluation of the direct stimulation of the TCM of cytokine production was performed, as well as the addition of the TCIvl to know the concanavain cytokine inducer A (ConA), IFNy, is a cylokine which is essential for innate and adaptive immunity against viral and intracellular bacterial infections and for tumor control. IFNy is an important macrophage activator.
  • IFNy expression is associated with a number of autoinflammatory and autoimmune diseases.
  • the importance of IFNv in the immune system It is partly due to its ability to inhibit the viral replicator * directly, and more importantly its ability to stimulate and / or regulate the immune system.
  • IF and is produced predominantly by natural killer (NK) and natural killer T ( ⁇ NKT) cells as part of the innate immune response, and by cytotoxic T lymphocytes (CT1) of effector T cells.
  • IL-4 is considered a Thct prctotypic cytokine, important in the stimulation of antibody-mediated immune responses, as well as the generation of plasma cells.
  • IL-4 is important in the stimulation of anti-inflammatory responses and has been used successfully in the treatment of the Type 1 diabetes mouse model, as well as other anti-inflammatory diseases.
  • the production of these two citoolnas evaluated to gather an idea whether the TC acts on T 1 or Th2 f cells is the broad classification of immune responses, cell activation T s and subsequent polarization in subsets T 1 or Th2 it is controlled by mature dendritic cells that provide co-stimulatory molecules, in addition to the HC-antigen signals to the T cell.
  • T s TolMike receptor
  • TCM is a leukocyte immunomodulator based on low molecular weight iisaoo produced under GMP and currently used in a variety of veterinary and clinical settings as a nutraceutical. Although numerous experiments have been carried out during its cellular properties to commercial immunobiological availability of TCM. We have shown that the TCV! showed no cytotoxic or antiproliferative effects even at supraphysiological concentrations in both cancerous and non-cancerous cell lines.
  • TCM cytokine modulating activity
  • TLR 4 blockade using tPS-RS resulted In the inhibition of CT-induced changes in DC maturation, these data demonstrate that TCM has a potent immunomodulatory activity at the commercial development level of anigene, these have been kept as trade secrets. This has resulted in a lack of mechanistic knowledge regarding TCM in peer-reviewed literature. The purpose of this study is to characterize the presentation, which is a key component of immune surveillance.
  • an object of the present invention to provide an extract source ieucocitate it whose origin is not from mammals, eggs, or colostrum, and that provides a power of 1Q 12 leukocytes x mm 3 (understood as potency to the quantity of leukocytes and quality of smooth, round and innocuous cells), quantity necessary for cell excitation and optimization of chemical signals.
  • a further object of the present invention is to obtain a TCM and its use for the consistent production of immune modulating atokines » including endo interferons and interfeukins.
  • An additional object of the present invention is to obtain a TCM for use as a promoter of the increase and activity of K cells (Natural Killer) which provide protection against viruses as part of the natural immune defense system, yet another object Additional of the present invention is the obtaining of a TCIvl for increased antigen presentation and lysosome activity of macrophages (allowing the destruction of foreign bodies), promoting Sa adhesion and the necessary binding for leukocyte migration (allows immune cells travel more freely) and as an inducer of amphibious effects.
  • the present invention relates to a scientific extract containing polypeptides equal to or less than 10,000 daltons of origin cells, tissues or organs of selacimorphs, in specific more non-limiting shark spleen and its use as a cell exciter and enhancer of chemical signals in the body, that is, opfimizer of the individual's natural immune system.
  • compositions and formulations that may comprise components presented in powder, encapsulated, including, but not limited to, T-cell modulator in various presentations, either encapsulated or powdered for pharmaceutical use in the treatment of cervical cancer in particular the Hela cell cell line.
  • Figure 1 shows a comparison between the transfer factor concentrations of the state of the art extraction media and the CT of the present invention.
  • Figure 2 shows the method of checking the potency of the leucocyte extract from inoculation of the leucocltane extract in Balb-c mice.
  • FIG 3 shows how TCM does not affect the proliferation of HeLa Cancer Cells in Experiment 1 (AXIS X VS AXIS Y).
  • Figure 4 shows how TCM does not affect the proliferation of HeLaen Cancer Cells in Experiment 2 (AXIS X VS AXIS Y).
  • Figure 5 shows how TCM does not affect the proliferation of Hela Cancer Cells in Experiment 3 (AXIS X VS AXIS Y).
  • FIG. 6 shows how TCM increases the production of interferon-induced ConA in Human PBMC in Experiment 1 ⁇ AXIS X VS AXIS Y).
  • the figure ? shows how the TCM increases the production of Interferon-induced ConA in Human PBMC in Experiment 2 (AXIS X VS AXIS Y),
  • Figure 8 shows how the TCM increases the production of ConA induced by e! Interferon in Human PBIMtC in Experiment 3 (AXIS X VS AXIS Y).
  • Dialysis Dialysis is the process of separating the molecules in a solution by the difference in their diffusion indices through a semipermeable membrane »So, the leucocitano extract, After the separation and breaking of components has been carried out, it is placed in a semipermeable dialysis bag, such as a cellulose membrane with pores, and the bag is sealed. The sealed dialysis bag is placed in a container with a different solution, or pure water. Extracts from the brain, being small enough to pass through the pores, tend to move in or out of the dialysis bag in the direction of the lowest concentration, the larger molecules (often proteins, ⁇ , or polysaccharides) that have significantly larger dimensions than the pore diameter are retained inside the dialysis bag. In this way, leucocstane extracts less than or equal to 10,000 Daitons are separated. Filtration and sterilization.- After dialysis, the isoucocftarium extract is filtered through a membrane of the pore size between 2 and
  • the leukocyte extract is analyzed by inoculating the extract in Balb ⁇ ca mice at a concentration equivalent to that used in humans in leukocyte weight-to-extract ratio, inoculation kinetics are performed by having mice exposed to the extract for a certain time, for example, 0.2 , 6 S 24, 48 and 120 hours; blood is drawn from the mouse, which the serum It will be used to determine the active cytosines by placing the serum on microarray membranes to determine the type of atocin found in the leukocyte extract and the time of activity of the chemical series in the induction of cytosines, also making serum dilutions until finding the point where cytosine is no longer found, which means that the last dilution is the title of the cytosine pr senla.
  • T cell modulator in powder presentation, which gives it the virtue of being easily transported and stored, does not require refrigeration and a T cell modulator power of 1G 2 leukocytes x mm is obtained 3 which is highly superior to any known T-cell modulator, meaning leukocyte concentration per mm 3 and the quality of the cells (smooth, round and inocula).
  • the present figure 2 illustrates the method of checking the potency of the leukocyte extract from the inoculation of the leukocyte extract in Balb-c mice.
  • Groups of 8 mice are used, the fours will be used at each time of the kinetics, they will be inoculated with the amount equivalent to the weight ratio of the T cell modulator ⁇ 0.005 T cell modulator unit), using in addition cell modulator T of human leukocyte origin and crocodile spleen origin for comparative purposes, the mice are maintained at certain times, the time being 0 the base level! of induced cytosines of the mice, which will be eliminated with the intention of knowing the type, title and permanence of the induced cytosines.
  • Whey is extracted from each mouse in its time according to the kinetics and 50 serum micropyroids are used, they are exposed against the microarray membranes that contain the cytosine receptor antibodies and the wells that develop color will be the induced cltosins.
  • Serum is diluted with a regulatory solution in multiples of 2 initially to then make dilutions in multiples of 100.
  • Basis dilution is eliminated from time 0 and the dilution that preserves the development of color in the microarrays prior to dilution where the color development is the title of the teucocyte extract.
  • the group of mice that retain the maximum titer with the longest induction time will be the residence time of the induction of cytosirs.
  • the enhanced TCM of the present invention has the function of:
  • HK Natural Killer ⁇ cells which provide protection against viruses as part of the natural immune defense system.
  • the TCM is designed for pharmaceutical use in the treatment of cervical cancer, in particular the HeLa cell line, which are commonly used not only for the evaluation of potentially useful anti-cancer agents, but also to evaluate the non-specific inhibitory / cytoioxic activity of the test compounds.
  • Interferon gamma ⁇ IFN Interferon gamma ⁇ IFN
  • cytokine broad and loose category of small proteins that are important in cell signaling. It was first recognized when human or mouse lymphocytes obtained from TB positive individuals were exposed to a PPD skin test. This Interferon was later called the macrophage activating factor, a term that is now used to describe a large family of proteins to which IFN belongs.
  • the IFN protein is encoded by the IFMG gene, 5 IFN, is a cytokine that is essential for innate and adaptive immunity against intra-eiular bacterial and viral infections and for tumor control.
  • the IFN is an important activator of macrophages. Abnormal IFN expression is associated with a number of auto-inflammatory and auto-immune diseases.
  • IFN cytotoxyl T effector T cells
  • ⁇ has antiviral properties, immunoregulatory, and oral antMu properties, lt alters transcription in up to 30 genes that produce a variety of physiological and cellular responses.
  • the effects and functions are:
  • the product passes less than 10,000 Da.
  • Bal c mice were selected in groups of 8, of which one group was left as a control and 8 groups of 8 mice each group were administered 0.005 U of Transfer Factor of human origin and blood was drawn via ocular at 0.2, 6, 24, 48, 72, 98 and 120 hours to be examined by microarrays, the ability to induce cytosines.
  • each group was given a TCM of shark spleen origin following the same procedure as the Human Transfer Factor. Finding that the Human Transfer Factor induces the production of cytosines it ⁇ 2, IFMY and INF ⁇ as indicated by the literature, but the shark TÜM induces the same cyosines, also annexing the cytosines indicated in Figure 2,
  • dilutions of the mouse serum ⁇ multiples of 1: 100) are made until the disappearance of the induction effected atokines, being the last dilution to where the induction of cltodnas appears as the title of the power of the CT ,
  • peripheral blood mononucerial cells ⁇ P8MC peripheral blood mononucerial cells
  • ⁇ P8MC peripheral blood mononucerial cells
  • the cells of the leukocyte layer were dispensed in five 50 ml Falcon tubes, phosphate buffered saline (PBS) / 2% fetal calf serum (FCS) was added to reach a volume of 20 ml and 10 ml of Ficoll-Paque was added gently by virtue of the diluted familiacocyte layer cells. Centrifugation was performed at 400 g for 20 min at room temperature (RT) and the washing of the PB C was done three times with PBS / 2% FCS.
  • PBS phosphate buffered saline
  • FCS fetal calf serum
  • the culture of freshly isolated PBMC was carried out in a complete MEM medium.
  • the TCM was diluted in a complete MEM medium prepared as described above. Dilutions of 1:10, 1: 100, 1: 1000 and 1: 10,000 were made.
  • the negative controls were complete MEM media.
  • the positive controls were concanavalin A, at a concentration of 2.5 ug / ml.
  • PBWCs were grown in 1 * 5 x 108 cells / ml in 98 piano bottom culture plates at a volume of 200 ⁇ per well and incubated at 37 ° in a humidified atmosphere of 5% C02. The conditioned medium was then evaluated for IFN ⁇ gamma production using R & D Systems ELISA (QuanSk ⁇ ne ELISA). The concentration was calculated by plotting against a standard curve generated with control cytokine.
  • Hela cells were plated at a concentration of 10,000 cells per well in flat-bottom plates and incubated with CT dilutions at 1:10, 1: 100, 1; 1000 and 1: 10,000,
  • the 3 ⁇ ⁇ 4, S-dimethyltiaml-2 ⁇ yl) -2,5-dipheosi tetrazolium bromide (MTT) assay was performed for proliferation evaluation.
  • MTT S-dimethyltiaml-2 ⁇ yl) -2,5-dipheosi tetrazolium bromide
  • the TCM does not appear to have any antiscotic effect on the HeLa cancer cell line. This is consistent with the notion that TCM is an immune stimulator, in contrast to the potential to be a direct toxic cancer drug. 2.
  • the TCM Stimulates the Production of Transmitter of Activated T Cells.
  • TCM directly activates the production of cstokine T cells, or if it requires a costimulatory signal, such as CooA, it was analyzed. With reference to Figures 6 to 8, it seems that TCM is added to existing immunity, but does not initiate immunity, by hands ID based on IFM-gamma assays. This would be consistent with an immunological regulatory role of IFH-gamma.
  • TCM is an immunomodulator, which provides support for immune responses that have already been initiated. This is an important feature since the direct stimulation of interferon gamma, in the absence of other stimuli would imply the possibility that the TCM induces toxicity that has been associated with other immunomoductors such as administration of I-2,
  • the TCM is extracted from leukocytes used from Shark Spleen that use dlalizable processes.
  • the CT obtained a provider.
  • Beta human cervical cancer cells were obtained from the American Type Tissue Culture (ATCC: Manassas, VA) and grown in a completely humidified environment of 5% C02 with MEM suppressed with 10% FBS, of pyruvate 2% sodium a, non-essential amino acids (2 mM), penicillin (100 mi units), streptomycin (100 g / mi) and glutamine (4 mM) (Gibco-BRL), The cells were passed through trypsinization twice a week or as necessary based on 75% confluence.
  • ATCC Manassas, VA
  • PB C Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • Freshly isolated PBMC culture was performed in complete MEM medium, Treatments and Cell Analysis
  • the TOMs were diluted in a complete MM medium prepared as described above. Dilutions of 10:10, 1: 100, 1: 1000 and 1: 10,000 were made.
  • the negative controls were complete MBM media.
  • the positive vQs controls were eoncanavalin A at a concentration of 2.5 ug me.
  • the PBMC were grown in 1 * S x 106 cells / mi in 96 flat bottom cyclic plates in a volume of 200 pl per well and incubated at 37 'in an atmosphere of 5% humidified C02. The conditioned medium was then evaluated for the production of iF-gamma using ELISA from & D Systems ⁇ Quant ⁇ k ⁇ ne ELISA).
  • the concentration was calculated by plotting against a standard curve generated with a control cyto.
  • HeLa cells were plated at a concentration of 10,000 cells per well on flat bottom plates and incubated with 1CM dilutions at 1:10, 1: 100, 1; 1000 and 1: 10,000,
  • the S ⁇ S-dimethylthiazol-a-ii) - 2,5-diphen H tetrazolium bromide (MTT) assay was performed for proliferation evaluation.
  • MTT 2,5-diphen H tetrazolium bromide
  • Dendrite cells DC were generated from resuspended PBMC in RPM1-10% FCS, and allowed to adhere to 8-well plates (Costar Corp., Cambridge, MA). After 2 h of incubation at 3? degrees Celsius, non-adherent cells were removed and adherent cells were washed in phosphate buffered saline (PBS), followed by detachment by incubation with MQ 2+ and PBS-free Ca 2+ containing 0.5 mW of EDTA at 37 degrees Celsius.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the adherent fraction was subsequently cultured at 3 x 10 (8) / ml in p-10% of FCS supfetned with 50 ng / ml of GfVI-CSF and 1,000 U / ml of IL-4.
  • the medium was changed every 2 days for a total of 8 days of culture, the DC were isolated by the positive selection for CD83 and subsequently treated with the TCM on day 8 of culture, the maturation evaluation was performed by flow cytometry for the expression of CD80 and CD86.
  • TLR-blockade was performed using the culture in the presence of TLR4 S-LPS antagonists (Invivogen (San Diego, CA), (Spg / mL), with treatment anticipated 4 hours before exposure to TCM.
  • TCM has been reported to have anticancer activity. Accordingly, we conducted a series of experiments that evaluated the ability of various concentrations of TCM to inhibit the proliferation of HeLa cells. We have used the chemotherapeutic drug doxorubicin as a control. As seen in Figure 9a, several doses of TCM did not affect Hela cell proliferation as assessed in the MTT assay after 48 hours of culture. Importantly, supraphysiological doses of TCM, as high as 1:10 volume diluted by volume in the tissue culture medium did not result in proliferation inhibition. These data suggest that TCM does not act through cytotoxic or costostic mechanisms. These data were confirmed with other cell lines such as PC-3, DU-145, and malignant 3B3 flbrobiasios ( Figures 9b ⁇ 9d).
  • TCM directly activates the production of atokine T cells, or if it requires a costimulatory signal, such as concanavalin A fConA
  • a costimulatory signal such as concanavalin A fConA
  • the TCM does not affect the viability of the PBMC (data not shown). It seems that the TCM complements the existing production of Immune stimulatory molecules after primary stimuli, ⁇ ero does not initiate immunity, at least on the basis of IFN-gamma and IL-4 ( Figures 10a and 10b), since the different TCM doses have different costimulatory profiles for the different atokines, we wonder if the effect was specific for concanavalin A stimulation, or if other factors may be at play.
  • TCM INDUCES THE MATURATION OF DRF TICAS CELLS IN A DEPENDENT TLR FORM
  • a series of experiments were carried out to evaluate if the TCM acts on the cell that has the most potent antigen, the dendritic cell, on Day 6 the immature DC generated from monodias by treatment IL-4 and G -CSF were used to evaluate the potential for induction of maturation of the TCW, the cells were treated with saline, the positive control LPS, and 3 concentrations of TCM.
  • TCM is a low molecular weight leukocyte extract that induces a TLR-4-dependent modulation of dendritic cell activity, which we have shown to be associated with the production of T-cell cytokines in a co-formulating manner.
  • the ability of TCM to modulate the immune system at the level of antigen presentation supports its current use as an immunogenic adjuvant for vaccination, as well as its immunomodulatory activity, which is observed in conditions ranging from vitiligo to viral states and oncological

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Abstract

La presente invención se refiere a un modulador de células T (TCM) potencializado, con una potencia de 1012 leucocitos/mm3, obtenido de un extracto dializado de leucocitos procedentes de bazo de selacimorfos o escualos, que contiene péptidos iguales o menores de 10.000 Da., presentado en forma de polvo. Se refiere también a su uso para fabricar un medicamento para tratamiento de enfermedades relacionadas con la regulación de la respuesta inmune como cáncer o infecciones virales.

Description

La presente invención es un método de extracción, comprobación y canteo, de extracto dializable de leucocitos a partir de células Ieucoeitarias que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones de origen bazo de selaclmorfos, conocidos comúnmente con el nombre ole tiburones, o también llamados escualos, para la obtención de un modulador de células T (TCM por sus siglas en inglés) potenciaitzado capaz de modular ia respuesta inmune a través de la activación de moléculas especificas implicadas en eí control de la inmunidad innata denominados " TolHike Receptor ".
El procedimiento Involucra esencialmente esterilización, extracción de bazo de tiburón, conteo y cuantificación, rompimiento o separación de componentes, diálisis, filtración y esterilización, formulación, evaluación físico química y evaluación de actividad biológica.
El medio para la obtención de un extracto dtaitzabfe de leucocitos que contiene polipéptidos menores o iguales a 10,000 Daltones cuya fuente u origen es a partir de células, tejidos u órganos de escualos, más específicamente bazo de tiburón, de la presente invención, se considera novedoso, ya que ai analizar el estado del arte actual se encontraron métodos para dicha extracción de leucocitos, células blancas o modulador de células T, mediante paquetes Ieucoeitarias de donadores sanos (humanos); huevos de reptiles, anfibios, peces y aves; además de calostro (leche producida por mamífero) y bazo de cocodrilo. Mas no se encontró documento alguno que mencione la posibilidad de extraer células Ieucoeitarias a partir de seiaci morios para la extracción de TCM, los cuales son un superorden de condrictíos (peces cartilaginosos) conocidos comúnmente con el nombre de tiburones, o también llamados escualos, ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En el estado de la técnica no existe fuente alguna que provea una concentración de modulador de células T de alrededor de los 10t2 leucocitos x mm3. Ya que en dicho estado de la técnica, las concentraciones de modulador de células T de ios medios de extracción antes descritos, oscila entre los 104 a 10s leucocitos x mm3 (ver figura 1 ).
Por ejemplo, la patente WO/200&02 746. FACTOR DE TRANSFERENCIA A PARTIR DE HUEVOS DE AVE. Utiliza un método para obtener un factor a de transferencia a partir de la yema de huevos de animales, sin embargo, un experto en la matada, sabe que el método para extraer factor de transferencia a partir da huevos es muy complicado, sobre todo en la separación de los Ifpidos. Al igual que las unidades de factor de transferencia obtenidas por huevo es miles de veces menor que la presente Invención.
Así mismo, la patente US 81SS63, PROCESS FQR ΟΒΤΑΙΜΝβ TRANSFER FÁCTOR FRQM COLOSTRUM, TRANSFER FACTOR SO QBTÁINED AND USE THERE GF, uts&a como fuente de extracción del factor de transferencia al calostro de animales, en específico de mamíferos. Sin embargo, al igual que la patente anterior, la cantidad de unidades de factor de transferencia obtenidas a partir de calostro es mínima a comparación con la presente invención, ya qm el TC encontrado en a partir de ios escualos es de 1012 leucocitos x mm3, contra 108 leucocitos x mm3del calostro. De la misma manera, la patente WO COMPOSICIONES QUE
CONTIENEN DIFERENTES TIPOS DE FACTOR DE TRANSFERENCIA, METODOS PARA PREPARAR LAS COMPOSICIONES Y METODOS DE TRATAMIENTO UTILIZANDO LAS COMPOSICIONES. Combina una composición para producir una respuesta inmunitaria mediada por células T en un Individuo, que contiene ei factor de transferencia de por lo menos dos diferentes tipos de animales. Por ejemplo, la composición puede contener el factor de transferencia de mamífero y un factor de transferencia no mamífero. Un ejemplo de la composición puede ser una combinación de un producto derivado de calostro, que inclusa ei factor de transferencia mamífero, y un producto derivado de huevo, que incluye el factor de transferencia no mamífero. Al igual que las anteriores, esta patente presenta dos problemas, eliminar los iipldos que contiene la yema de huevo y la baja cantidad de leucocitos x mm3, io que resta potencia a dicha invención.
De la misma manera, se encontró que la patente MK SS0421S PROCEDIMIENTO MEJORADO PARA LA PURIFICACION DE OUGOPEPTiDQS CON PESOS MOLECULARES DE 1Q0Q A 10,000 DALTONES, A PARTIR DE ESTRÁCTOS LEUCOCITOS Y SU PRESENTACION FARMACEUTICA, Se refiere a un procedimiento mejorado para ei fraccionamiento con alto rendimiento, de un conjunto de oligopéptidos (de 1000 a 10000 daítones), recuperados a partir del rompimiento de leucocitos y que poseen actividad biológica para la regulación de la respuesta inmune que comprende los siguientes pasos a partir de paquetes leucocitarios de donadores sanos, TODO BAJO CONDICIONES ASEPTICAS, se rompen las células, se hacen suspensiones ajusfando volúmenes, y mediante ultracentrifugación, se clarifica la suspensión de ios restos celulares (detritus celulares), se recuperan los oligopéptidos por medio de díafiltración y se concentran por ultrafiltraclón tangencial Se formula el producto con base en su fórmula de producto terminado en presentación farmacéutica. Sin embargo, un experto en la materia sabe que el uso o utilización de sangre humana y sus derivados destilados o componentes separados a partir de procedimientos químicos, no pueden ser comercializados, ya que diferentes legislaciones en el mundo lo prohiben y se cataloga como delito la comercialización de sangre humana y sus derivados. Asi mismo, las unidades de factor de transferencia obtenidas por cada 450 mi de sangre de donadores sanos de la presente in ención, aunque superior a ias unidades de factor de transferencia obtenidas a partir de yema de huevo y de calostro, es tan solo de 08 leucocitos x mm3. Así mismo, la patente WO S?/12 1S, PROCEDIMIENTO DE PURIFICACIO DEL FACTOR DE TRANSFERENCIA A PARTIR DE LEUCOCITOS. Denota un procedimiento de purificación del Factor de Transferencia (otigopéptidos de 1000 a 10.000 daltones, que poseen actividad biológica), a partir de leucocitos, que comprende los siguientes pasos: se lisan las células en condiciones estériles, se clarífica ta suspensión mediante ultrafiltración, se recupera el Factor de Transferencia por dsafiltracsón y se concentra por ultrafiltración tangencial. El Factor de Transferencia se utiliza farrrsacéuticalmente como reguiador de la respuesta Inmune. Sin embargo, esta patente se encuentra relacionada con la f$X 9110421 § y consta del mismo problema de utilizar sangre humana como medio de extracción de leucocitos.
La patente MX20089296A, OPTIMISED PROCESS FOR THE OBTENTiON OF
DIALYZÁBLE LEU&OCYTE EXTRACT, CONTAINING PEPTIDES WITH MOLECULAR WEIGHT EQÜAL TO OR LO ER THAN 10, 000 DALTONS, FROM C OCODILE LY PHOID TISSUE AND THE PREPARATION THEREOF IN AN ORAL AMD/OR I JECTABLE PHARMACEUTIC, se relere a un procedimiento optimizado para la obtención del extracto ieucocitario que contiene pépíidos con peso molecular igual o inferior a 10,000 Daltones, a partir de células de tejido linfoide provenientes de cocodrilo y que posee la propiedad de regular la respuesta inmune en humanos y animales. Sin embargo, la potencia del factor de transferencia obtenido es de 108 leucocitos x mm3
Asi mismo, en el estado de la técnica se encuentra la patente: US 2G09W053197 TRANSFER FACTOR GOMPOSITIONS AND METHODS, la cuai menciona la posibilidad de utilizar factor de transferencia como adyuvante, cuya característica principal radica en que la composición que comprende factor de transferencia y un anticuerpo, cada una es derivada independlentemente de una tiente seleccionada del grupo que consiste en huevos, calostro, sangre, y combinaciones de los mismos. Este quiere decir que el extracto feucocitario tiene como mente huevos, calostro, sangre o sus combinaciones. Sin embargo, para un experto en el estado de la técnica, es bien sabido que esta patente presenta tos siguientes problemas, si se utiliza yema de huevo, resulta muy difícil eliminar los lípidos que contiene, así mismo, tanto la yema de huevo, como fas demás fuentes constan de una baja cantidad de leucocitos x mm9, lo que resta potencia a dicha invención. Asi mismo, la síntesis de las anteriores fuentes de extracto feucocitario resulta muy complicada para separar las células leucooltarias de las proteínas, lípidos, carbohidratos y toxinas.
Por último, se mencionan las patentes: O/ 008¾ 2i0 . IMMUNE MODULATORS, PREPARA TIQNS AND COMPOSíTIONS IMCLUDÍNG IMMUNE MODULATORS, TESTS FOR EVALUATING THE ACTMTY QF IMMUNE MODULATORS AND PREPARATIQNS AND COMPOSÍTIONS INCLUDíNQ THE SAME, AND METHQDS. Que divulga las composiciones que incluyen los extractos de fuentes de moduladores inmunes que incluyan las moléculas inmunes del modulador del nanofraction (es decir, moléculas que tienen pesos moleculares de cerca de 3.000 DA y menos). Estas composiciones pueden también incluir otros moduladores inmunes, tales como factor de transferencia. US 44683?Sf LEUKOCYTE EXTRACTS FOR AFFECTINO THE IMMUNE SYSTEM. Que describe a un grupo de sustancias derivadas de los leucocitos humanos (glóbulos blancos) que amplifican, suprime, o modula de otra manera la respuesta del sistema inmune a la reintroduccidn de antígenos.. Y US Sg 0?0O, METHODS OF PRODUCING TRANSPER FACTOR, Oue ilustra que la invención se relaciona con el factor de transferencia substancialmente puro con una actividad específica por lo menos de 5000 unidades por unidad de la absorción en 214 nanómetros, La actual invención también se relaciona con un proceso para preparar el factor de transferencia de Usados de la célula. La actual invención incluye el uso del facto de transferencia substancialmente puro con una actividad específica po lo menos de 5000 unidades por unidad de l absorción en 214 nandmetr© para tratar enfermedades infecciosas.
En la actualidad no se dispone de una fuente leucocitaria para ¡a producción de TCM potencíalizado y sin efectos adversos. Se ha intentado utilizar factor de transferencia a partir de yema de huevo, leche y sangre, que aunque el producto funge como snmunomodulador, existe una baja concentración de leucocitos en dichas fuentes, lo que se traduce en una baja excitación celular y acopiamiento a señases químicas deficiente, Asimismo, éstas fuentes para extracción de extracto leucocitarío, al administrarlas, pueden provocar a los pacientes reacciones alérgicas, tai es el caso del huevo. Todas las anteriores, aunque con métodos diversos de sintetizar los extractos feucocitarios, utilizan como fuente leucocitaria ya sea huevos de mamíferos, peces o aves, calostro, sangre o sus combinaciones. Sin embargo, para un experto en el estado de la técnica, es bien sabido que las patentes anteriores presentan en general los siguientes problemas, si se utiliza yema de huevo, resulta muy difícil eliminar los lipidos que contiene, asi mismo, tanto la yema de huevo, como las demás feotes constan de una baja cantidad de leucocitos x mm3, lo que resta potencia a dicha invención. Así mismo, la síntesis de las anteriores fuentes de extracto leucocitarío resulta muy complicada para separar las células leucocítarias de las proteínas, lipidos, carbohidratos y toxinas, De la misma manera, cabe mencionar que diversas legislaciones en al mundo prohiben la comercialización de sangre humana y sus derivados. En el estado de la técnica no se encontró invención alguna que refiera a un método para el conteo de leucocitos y comprobación de ias señales químicas activadas del extracto leucocitarío.
Por lo tanto, numerosos ensayos clínicos se han llevado a cabo en ios últimos 3 décadas utilizando extractos de células blancas de la sangre conocidas como "factor de transferencia". Desafortunadamente, ios diferentes grupos científicos que trabajan en este campo no fueron capaces de generar consistentemente preparaciones purificadas y reproducibies de los factores de transferencia. A pesar de ello, la eficacia de los factores de transferencia han sido publicados en publicaciones revisadas para el tratamiento de condiciones que van desde la esclerosis múltiple, cáncer, e infecciones del herpes. Por lo tanto, mientras que los ínmunólogos siempre han creído en e! potencial de los factores de transferencia, la traducción comercial ha sido imposibl debido a las inconsistencias de la producción.
En este sentido los inventores de la presente invención lograron desarrollar un protocolo económico y escalante para la generación de un factor de transferencia optimizado a partir de leucocitos de tiburón. A diferencia de las versiones anteriores de factores de transferencia, el TCM se caracteriza a nivel molecular y sos principales medios de inducir efectos terapéuticos se han dilucidado, Los datos clínicos han sido generados en una variedad de condiciones asociadas inmunológicamente incluyendo ia esclerosis m ltiple, infecciones virales y cáncer. Los datos in vitro demuestra la producción consistente de citocinas moduiadoras inmunitarias, incluyendo inferiéronos y las interleuquinas después del tratamiento de las células inmunes con el TCM.
De igual forma, los experimentos de Kirkpatrik demostraron que todos los Factores de Transferencia descritos hasta ia fecha son aproximadamente 200 moléculas de peso molecular menor a 10,000 da y son un péptido de 44 aminoácidos, que tienen una región común de 10 aminoácidos, por lo que se puede utilizar un Factor de Transferencia de una especie a otra.
Otro experimento importante fue el que utilizando ratones Bai -c sin ningún estimulo previo, se inocularon vía oral y en diferentes tiempos se obtuvo sangre de los ratones, para que con el suero en una técnica de microarregios se buscara la interleucina excitada, encontrando que diferentes moléculas tienen una especificidad hacia excitar diferente interieuoinas. Con la información hasta este momento se abría la posibilidad de tener un factor de Transferencia especifico hacia determinadas snterieucinas y conociendo que interleucina está asociada a determinada patología, entonces se puede tener un Factor de Transferencia hacia una patología en especial.
Avanzando los conocimientos acerca de la red de interfeucinas y la cooperación entre ellas, fue obligando a tener un Factor de Transferencia que logre cubrir la más amplia gama de interleucínas, asi apareció -PlUS cuya fórmula incluye la posibilidad de tener el Factor de Transferencia más completo desalío hasta ahora, -PLUS se utilizo en pacientes candidatos a recibir Terapia Celular con Células Madre, logrando acortar los tiempos de respuesta, logrando ta diferenciación celular en menos tiempo.
Oto logro importante es el Incremento de Células HK en pacientes con Cáncer, hasta lograr un aumento de 30-40% y como consecuencia los tumores se reducen de tamaño, se encapsulan y se vuelven operables. Regresando a la definición original de Factor de Transferencia que es: Extracto Diaiizable de Leucocitos de una persona que tiene una enfermedad (ejemplo utilizado fue Tuberculosis) con PPD positivo, al inocularse en una persona PPD negativo se convierte en PPQ positivo, concluyendo que la Inmunidad Celular se puede transferir de una persona a otra» pero existe la premisa de que se trata de una inducción previa.
El experimento realizado con ratones no Inmunizados, que resultó en una regulación de los tinfocitos T al observar la excitación de interleucinas, nos indica que se trata de otra función que no es ia del Facto de Transferencia original, es decir, un modulador de células T o TCM (T Cells odulator), el cual tiene la función de modular la respuesta inmune a través de la activación de moléculas especificas Implicadas en el control de la Inmunidad innata denominados " Tolí-íike Receptor "«
EN base a lo anterior, ef Modulador de Células T (JCM) es un extracto de leucocitos fabricado por una metodología propia, que se describe en parte en la Solicitud PCT Ho. PCT X2G12 000084, Los efectos terapéuticos del TCM han sido previamente informados en condiciones mediadas inmunológicamente, así como en la oncología. Dada la amplitud de las actividades inmunomoduladoras clínicas reivindicadas, así como la metodología utilizada en su producción, llevamos a cabo una se ie de experimentos para evaluar inmunológlcamente el JCM in vstro.
Los experimentos iniciales evaluaron los posibles efectos directos del TCM sobre la proliferación celular, dada la actividad anitum raí reportada, los efectos del TCM se evaluaron en células Hela, una línea celular de cáncer cervical que se na utilizado en la Investigación del cáncer durante décadas como un modelo ín viiro de la neoplasi . Derivado originalmente en 1955, estas células son comúnmente utilizadas no para la evaluación de agentes contra el cáncer potencíaímente útiles» sino también para evaluar le actividad inhifoídora ctotóxíea no específica de los compuestos de ensayo.
La producción de la atocina inmunoiógica Th1 de interferón gamma {IFN«g} a partir de células mononuc eares de sangre periférica humana (PBMC) se evaluó directamente por el TCM, así como la citocina Th2 de interleuclna-4 {IL« 4). Con el fin de recapitula los efectos in vivo se realizó la evaluación de la estimulación directa del TCM de la producción de citocinas, así como la adición del TCIvl para conocer el inductor de citoquínas de concanavaíina A (ConA), El IFNy, es una ciloquina que es fundamental para la inmunidad innata y adapfatíva contra las Infecciones bacterianas virales e intraceiularas y para el control de tumores. El IFNy es un importante activador de macrófagos. La expresión de IFNy anormal está asociada con un numero de enfermedades autoínflamatorias y autoinmunes. La importancia del IFNv en el sistema inmune se debe en parte a su capacidad para inhibir la replicador* viral directamente, y más importantemente de su capacidad para estimular y/o regular el sistema inmunológico. El IF y es producido predominantemente por células asesinas naturales (NK) y asesinas naturales T (¡NKT) como parte de la respuesta inmune innata, y por línfocitos T citotóxicos (CTl) de células T efectoras. El IL-4 se considera una citocina Th2 prctotipica, importante en la estimulación de respuestas inmunes mediadas por anticuerpos, así como la generación de células plasmáticas. El IL-4 es importante en la estimulación de respuestas antí-iniamatorias y se ha utilizado con éxito en el tratamiento del modelo de ratón de diabetes de Tipo 1 , así como otras enfermedades ant-inflamatorias. De acuerdo con ello, se evaluó la producción de estas dos citoolnas para reunir una Idea de sí el TC actúa sobre las células T 1 o Th2f que es la amplia clasificación de las respuestas inmunes, La activación de células Ts y la posterior polarización en subconjuntos T 1 o Th2 es controlada por las células dendrlticas maduras que proporcionan moléculas coesimuladoras, además para las señales de antlgeno- HC a la célula T. Buscamos determinar si la maduración inducida del TC de células dendrlticas, y evaluamos una de las principales moléculas implicadas en la maduración de las células dendrlticas» el TolMike receptor (TL ) «4.
Dado el doble papel del TCM reportado tanto en la estimulación inmune (por ejemplo, anti cáncer y antsvirai), asi como la regulación inmune {eficaz en vitíligo y ojo seco), y que podría ser importante para ios pacientes con VIH y diferente tratamiento del cáncer por células dendrlticas, buscamos determinar sí el TC afectó la generación de células T reguladoras
Por lo tanto el TCM es un inmunomodulador de leucocitos basado en iisaoo de bajo peso molecular producido bajo GMP y actualmente utilizado en una variedad de escenarios veterinarios y clínicos como un nutracéutico. Aunqu numerosos experimentos se han realizado durante sus propiedades celulares a inmunoíógicas de disponibilidad comercial de TCM. Hemos demostrado que el TCV! no mostró efectos citotóxicos o antiproliferativos incluso a concentraciones suprafisiológicas tanto en lineas celulares cancerosos como no cancerosas. La evaluación de la actividad modufadora de citoquinas de TCM reveló una actividad coestlmulaclora potente sobre el interferón gamma (IFN-g) y la producción de interleucina~4 (11-4) a partir de células (P&1BC) mononucleares de sangre periférica estimuladas con concanavalina A (Con A) o fitoliemaglutinina (PHA }. Dado que las PBMC poseen antígenos que presentan células de que pueden ser activadas como coestimuladores, se evaluaron tos efectos de TCM an la estimulación de la maduración de células dendríticas (DC), La expresión de TCM estimulado de marcadores de maduración DC CD80 y CP8SS asi como la producción sobre regulada tanto de IL-10 como de !t~12: cltocinas clav que controlan la actividad de células T. El bloqueo de TLR 4 que utiliza tPS-RS resultó en la Inhibición de los cambios TC -inducidos por en la maduración DC. Estos datos demuestran que el TCM posee una potente actividad inmunomoduladora en el nivel de desarrollo comercial de aníigeno, éstos han sido mantenidos como secretos comerciales. Esto ha resultado en una falta de conocimiento mecanioísta respecto al TCM en la literatura revisada por pares. El propósito de este estudio es caracterizar la presentación, que es un componente clave de la vigilancia inmunológica.
OBJETOS Di LA INVE CIÓ
Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar una fuent de extracto ieucocitarlo cuyo o igen no sea a partir de mamíferos, huevos, ni calostro, y que brinde una potencia de 1Q12 leucocitos x mm3 (entendiéndose por potencia a la cantidad de leucocitos y calidad de las células lisas, redondas e inocuas), cantidad necesaria para la excitación celular y optimización de las señales químicas. Un objeto más de la presente invención es la obtención de un TCM y su uso ara la producción consistente de atocinas moduiadoras inmunitarias» inclu endo interferones y las interfeuquinas. Oto objeto adicional de la presente invención es ía obtención de un TCM para su uso como promotor del incremento y la actividad de las células K (Natural Killer) las cuales proporcionan la protección contra virus como parte del sistema de defensa inmune natural, Todavía otro objeto adicional de la presente invención es la obtención de un TCIvl para aumento de la presentación del antígeno y la actividad de lisosomas de ios macrófagos (permitiendo la destrucción de cuerpos extraños), promover Sa adhesión y la unión necesaria para la migración de leucocitos (permite a las células inmunes a viajar con más libertad) y como inductor de efectos anfivirales.
Es otro objeto de la presente invención la obtención de un TCM y su uso farmacéutico para el tratamiento de cáncer cervical en particular la linea celular de células HeLa. Es también objeto de ía presente invención proporcionar un incremento de Células en pacientes con Cáncer, hasta lograr un aumento de 30-40% y como consecuencia reducir ios tumores de tamaño, de modo que se encapsulen y se vuelvan operables.
Por lo tanto la presente invención, se refiere a un extracto ieuc citario que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones de origen células, tejidos u órganos de selacimorfos, en especifico mas no limitativo bazo de tiburón y su utilización como excitador celular y mejorador de señales químicas en el cuerpo, es decir, opfimizador del sistema inmunotógico natural del Individuo. Así mismo, es también objeto de la presente invención proporcionar un método para el conteo de leycocitos y comprobación de tas señales químicas activadas del extracto leucocltano, Los aspectos adicionales de ta Invención se relacionan con las composiciones y tas formulaciones que pueden comprender componentes en presentación en polvo, encapsulados, incluyendo, pero no limitado a, modulador de células T en diversas presentaciones, ya sea encapsulado o en polvo para su uso farmacéutico en el tratamiento de cáncer cervical en particular la linea celular de células Hela.
BIREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FtCSU ÁS
La Figura 1 muestra un comparativo entre las concentraciones de factor de transferencia de ios medios de extracción del estado de la técnica y el TC de la presente invención.
La Figura 2 muestra el método de comprobación de la potencia del extracto leucocitario a partir de la inoculación del extracto leucocltano en ratones Balb-c.
La Figura 3 muestra como el TCM no Afecta la Proliferación de Células Cancerosas HeLa en el Experimento 1 (EJE X VS EJE Y). La Figura 4 muestra como el TCM no Afecta ía Proliferación de Células Cancerosas HeLaen el Experimento 2 (EJE X VS EJE Y).
La Figura 5 muestra como el TCM no Afecta la Proliferación de Células Cancerosas Hela en el Experimento 3 (EJE X VS EJE Y).
La Figura 6 muestra como el TCM aumenta la producción de ConA inducidos por el ínterferón en PBMC Humano en el Experimento 1 {EJE X VS EJE Y).
La Figura ? muestra como el TCM aumenta la producción de ConA inducidos por el Interferón en PBMC Humano en el Experimento 2 (EJE X VS EJE Y), La Figura 8 muestra como el TCM aumenta la producción de ConA inducidos por e! interferón en PBIMtC Humano en el Experimento 3 (EJE X VS EJE Y).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El procedimiento de la presente invención para l extracción de un extracto dialízable de leucocitos es el siguiente:
1 Esterilización,- Involucra que todo instrumento utilizado para la extracción del extracto leuoocitarío se encuentre estéril.
2, Extracción de bazo.- Este paso consiste en extraer el bazo del tiburón quirúrgicamente para asi poder extraer el extracto leucocitano. 3. Conteo y cuantíficacióa- Mediante la Cámara de Neu auer y microscopio se cuenta el número de leucocitos por campo en la cuadricula de Neubauer, para saber la potencia del modulador de células T que se obtendrá, es decir, el número de leucocitos por milímetro cubico» ajustando el conteo a 1012 leucocitos x mm3, mediante la adición de bazo de tiburón hasta lograr la cuenta de 1Q12 leucocitos x mm3. Asi mismo se requiere valora la calidad de dichas células, que no exista arsisocitosis, es decir, medíante el microscopio se observa que las células sean redondas y lisas. 4. Rompimiento o separación de componentes.- Se deben separar las células ieucocitarías de las proteínas, lipidos, carbohidratos y toxinas,
5. Diálisis.- La diálisis es el proceso de separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus Indices de difusión a través de una membrana semipermeable» Entonces, el extracto leucocitano, después de haber sido realizada la separación y rompimiento de componentes, es puesto en un bolso semipermeable de diálisis, como por ejemplo, en una membrana de la celulosa con poros, y ei bolso es sellado. El bolso de diálisis sellado se coloca en un envase con una solución diferente, o agua pura. Los extractos ieucodtaríos, al ser io suficientemente pequeños como para pasar a través de los poros tienden a moverse hacia adentro o hacia afuera del bolso de diálisis en la dirección de la concentración más baja, tas moléculas más grandes (a menudo proteínas, ΆΡΝ, o polisacáridos) que tiene dimensiones significativamente mayores ue el diámetro del poro son retenidas dentro del bolso de diálisis. De ésta manera, se separan los extractos leucocstanos menores o iguales a 10,000 Daitones. Filtración y esterilización.- Después de la diálisis se filtra el extracto íeucocftarío por medio de una membrana de tamaño ele poro entre 2 y
4 micrómetros. Así mismo, se esteriliza la solución nuevamente. Formulación.- Se realiza un proceso de isofliaclán para quitar el agua del extracto leucocítarío por medio de la generación de urs vacio, así mismo en este paso se realiza la agregación de un vehículo, como puede ser leche, agua, gel o saborizaníe artificial, para darle una presentación y sabor agradable al producto. Evaluación Fisicoquímica. En este punto se evalúan ios procesos físico-químicos como son densidad, PH, color, olor y sabor. Cabe mencionar que si ai producto no se le agregó ningún vehículo, el modulador de células T obtenido será inoloro, Incoloro e ínsa oro, Evaluación de actividad biológica. Se analiza el extracto leucocitario inoculando el extracto en ratones Balb~c a una concentración equivalente a la utilizada en humanos en relación peso-extracto leucocitario, se realiza una cinética de inoculación al tener ratones expuestos al extracto durante un tiempo determinado, por ejemplo 0, 2, 6S 24, 48 y 120 horas; se extrae sangre del ratón, la cual el suero servirá para ia determinación de ias citosinas actívadascoiocando el suero sobre membranas de microarre jos para determinar el tipo d atocina que se encuentra en el extracto leucocitano y el tiempo de actividad de la serial química en la inducción de citosinas, Realizando además diluciones del suero hasta encontrar el punto donde ya no se encuentra la citosina, lo que quiere decir que la última dilución es el titulo de la citosina pr senla. Esto quiere decir a mayor sea el titulo o factor de dilución mayor será la potencia del extracto leucocitario. tediante el estudio en tiempos, es decir la cinética, será indicativo del tiempo de inicio de la inducción de citosinas, el lempo óptimo de inducción de citosinas y el tiempo de permanencia total de la inducción de citosinas.
El resultado del proceso anterior es un modulador de células T potencia Jizado en presentación en polvo, lo que le da la virtud de ser fácilmente transportado y almacenado, no requiere refrigeración y se obtiene una potencia de modulador de células T de 1G 2 leucocitos x mm3 lo cual es altamente superior a cualquier modulador de células T conocido, entendiéndose por potencia a la concentración de leucocitos por mm3 y la calidad de las células (lisas, redondas e ínoquas).
La presente figura 2 Ilustra el método de comprobación de la potencia del extracto leucocitario a partir de ia inoculación dei extracto leucocitario en ratones Balb-c. Se utilizan grupos de 8 ratones, los cuates se utilizarán en cada tiempo de la cinética, se inocularán con la cantidad equivalente a la relación peso-unidad de modulador de células T {0.005 unidad de modulador de células T), utilizando además modulador de células T de origen leucocitos humano y de origen bazo de cocodrilo con fines comparativos, se mantienen los ratones en ios tiempos determinados, siendo el tiempo 0 el nivel basa! de citosinas inducidas de los ratonas, la cual se eliminará con la intención de conocer el tipo, titulo y permanencia de las citosinas inducidas. Se extrae suero de cada ratón en su tiempo de acuerdo a la cinética y se utilizan 50 microíiros de suero, se exponen frente a las membranas de mícroarreglos que contienen ios anticuerpos receptores de las cítosinas y los pozos que desarrollen color serán las cltosinas inducidas- El suero se diluye con solución reguladora en múltiplos de 2 inicíaimente para después realizar diluciones en múltiplos de 100, Se elimina la dilución basai del tiempo 0 y la dilución que conserve el desarrollo de color en los mícroarreglos previo a la dilución donde ya no se presente el desarrollo de color, es el titulo del extracto teucocitario. El grupo de ratones que conserve el título máximo con mayor tiempo de inducción será el tiempo de permanencia de la inducción de citosirsas.
Así, con el experimento utilizando ratones Balb-c sin ningún estimulo previo, buscamos la interleueina exitada, encontrando que diferentes moléculas tienen una especificidad hacia excitar diferentes ínterieucínas.
En base a lo anterior, de determinó que el TCM potenciaüzado de la presente invención tiene la función de:
Promover la actividad de las células HK (Natural Killer} las cuales proporcionan la protección contra virus como parte del sistema de defensa inmune natural.
Producir de manera consistente ciíocinas moduladores inmunitarias, incluyendo interferones y las interíeuquinas, Aumentar la presentación del antígeno y la actividad de lisos-omas de ios macrófagos (permitiendo la destrucción de cuerpos extraños).
Promover ia adhesión y la unión necesaria para la migración de leucocitos (permite a las células inmunes a viajar con más libertad) y como inductor de efectos antivirales. Asimismo, en otro aspecto de la presente Invención el TCM está diseñado para su uso farmacéutico en el tratamiento de cáncer cervical en particular la linea celular de células HeLa, las cuales son comúnmente utilizadas no solo para la evaluación da agentes contra el cáncer potenciaímente útiles, sino también 5 para evaluar la actividad inhibidora/citoióxica no especifica de los compuestos de ensayo.
En nuestro estudio, la alteración de la proliferación de células Hela se evaluó en pantalla para la posible actividad directa antí cáncer/Inhibitoria de célula del 10 TCM. En este sentido, si efectos inhibidores están presentes, ei siguiente paso de la experimentación seria evaluar si la inhibición es directamente hacia las células tumoraies, o si también es en contra da tejido de control no tumorai,
PBMC INTERFERÓN GÁMÜA
Í5
El interferón gamma {IFN ] es una citoquína (amplia y suelta categoría de pequeñas proteínas que son importantes en la señalización celular). Se reconoció por primera vez cuando los linfocitos humanos o de ratón obtenidas de Individuos positivos de tuberculosis fueron expuestos a una prueba cutánea 20 de PPD. Este Interferón más tarde fue llamado el factor activador de macrófagos, un férmino que ahora se utiliza para describir una gran familia de proteinas a la que pertenece IFN. En los seres humanos, la proteina de IFN se codifica por el gen IFMG, 5 IFN, es una citoquina que es fundamental para la inmunidad innata y adaptativa contra las Infecciones bacterianas y vírales intra eiulares y para el control del tumor. El IFN es un importante activador de los macrófagos. la expresión de IFN anormal está asociada con un número de enfermedades autoinHamatorias y autolnmunes. ta importancia de IFN en el sistema inmune se debe en parte a 0 su capacidad para inhibir la repíícación viral directamente, y lo más importante de su capacidad para estimular y o regular el sistema ínmunoiógico. El IFN se produce predominantement por linfocitos citolíticos naturales (HK) y células T asesinas naturales ( T) como parte de la respuesta Inmune innata, y por linfocifos T citotáxlcos células T efectoras (CTL).
ΙΨΗ tiene propiedades antivirales, inmunorregulador, y antMu oral properties, lt altera la transcripción en hasta 30 genes que producen una variedad de respuestas fisiológicas y celulares. Como se mencionó anteriormente, los efectos y funciones son:
• Promover la actividad de las células N {natural killer).
* Aumentar la presentación del antígeno y la actividad de lisosomas de los macrófagos,
» Promueve la adhesión y la unión necesaria para la migración de leucocitos » Induce efectos antivírales.
Para un mejor entendimiento de la invención, a continuación se muestran ejemplos ilustrativos del uso y aplicación de la misma.
Ejemplo 1
Producto 2 veces concentrado (0.520 g) carriles: 1.» Marcador peso Molecular 2,- control negativo 3,4,5,- producto 2 veces concentrado.
El producto pasa menos de 10,000 Da.
Para estudiar el efecto de Viikare en modelos animales y ai mismo tiempo demostrar el efecto de inducción de citosinas, se realiiá el siguiente experimento:
Se seleccionaron ratones Bal c en grupos de 8, ios cuates se dejo un grupo como control y a 8 grupos de 8 ratones cada grupo se les administró 0.005 U de Factor de Transferencia de origen humano y se extrajo sangre via ocular a las 0, 2, 6, 24, 48, 72, 98 y 120 horas para ser examinada mediante microarreglos, la capacidad de inducir citosinas. En otros 8 grupos de 8 ratones cada grupo se suministró un TCM de origen bazo de tiburón siguiendo el mismo procedimiento que el Factor de Transferencia Humano. Encontrándose que el Factor de Transferencia humano induce la producción de citosinas it~2, IFMY y INF α como lo indica la literatura, pero el TÜM de tiburón induce las mismas ciiosinas, anexando además las citosinas indicadas en ía Figura 2,
Para la determinación de potencia del TCM, se realizan diluciones dei suero del ratón {múltiplos de 1:100) hasta la desaparición de la inducción efe atocinas, siendo la última dilución hasta donde aparece la inducción de cltodnas como el titulo de ia potencia del TC ,
Lista de Citocinas inducidas en este experimento se pueden apreciar en ia siguiente Tabla.
Figure imgf000021_0001
PROTOCOLO Una vez obtenida una muestra de TCM se procede a obtener una muestr de células humanas de cáncer cervical Hela de la American Type Tissue Culture (ATCC; Manassas, VA) y se cultivan en medio ambiente completamente humidificado de C02 al 5 con MEM suplementado con FBS al 10%, 2% de plruvato de sodio, aminoácidos no esenciales {2 mM) , penicilina (100 unidades / mi), estreptomicina (100 mg / mi) y glutamin (4 mhft) (Gibco-BÍ L). Las células se pasaron mediante tripsinización dos veces por semana o según sea necesario sobre la base de 76% de confluencia
Asimismo, se obtiene una muestra de células mononucieares de sangre periférica {P8MC), las cuales se aislaron a partir de capas feucociiarias por centrifugación en gradiente de densidad. Específicamente, las células de la capa leucocltaria se dispensaron en cinco tubos Falcon de 50 mi, se añadió solución salina iamponada con fosfato (PBS) / 2% de suero de ternera fetal (FCS) para alcanzar un volumen de 20 mi y 10 mi de Ficoll-Paque se añadió suavemente en virtud de las células de la capa feucocitaria diluidas. La centrifugación se realizó a 400 g durante 20 m n a temperatura ambiente (RT) y el lavado de las PB C se hizo tres veces con PBS / 2% de FCS, El cultivo de PBMC recién aisladas se realizó en un medio MEM completo. El TCM se diluyó en un medio MEM completos preparados como se describió anteriormente. Se realizaron diluciones de 1:10, 1 : 100, 1 :1000 y 1 : 10,000. Los controles negativos fueron medios MEM completos. Los controles positivos fueron concanavalina A, a un concentración de 2,5 ug / mi Los PBWC se cultivaron en 1 * 5 x 108 céluias/ml en 98 placas de cultivo de fondo piano en un volumen de 200 μΐ por pocilio y se incuóa a 37° en una atmósfera humidificada de 5% de C02. El medio condicionado fue entonces evaluado para la producción de IFN~gamma utilizando ELISA de R & D Systems (QuanSkíne ELISA). La concentración se calculó medíante el trazado en contra de una curva estándar generada con citoquina de control.
Las células Hela fueron cultivadas en placas a una concentración de 10.000 células por pocilio en placas de rondo plano y se Incubaron con diluciones de TC a 1:10, 1:100, 1 ; 1000 y 1 :10,000, El ensayo de 3~{4,S-dimetíltiaml-2~il) - 2,5-dífeosi bromuro de tetrazolio (MTT) se realizó para la evaluación de la proliferación. En este ensayo MU soluble es metaboiizado por la actividad de la enzima mltocondrlal de las células tumorales viables, en un producto de formazano coloreado insoluole. Posteriormente el formazano se disolvién en DWSO y se midió espectrofotométricamente a 540 nm. Brevemente, 200 μΙ de suspensión de células se cultivaron en micropiacas de 96 pocilios y se incubaron durante 48 h (37° C, 5% de C02 de aire humidiflcado). Para evaluar la supervivencia celular, se añadieron 20 μΙ de solución de MTT (6 mg / mi en PBS) a cada pocilio y se incubaron durante 3 h. Luego suavemente 150 μΙ del medio anterior que contiene MTT fue sustituido por DMSO y pipeteado para disolver cualquier formación de cristales. La absorbencia se determina entonces a S40 nm mediante un ensayo inmuno absorbente enzimático (ELISA) lector de placas. Cada concentración del extracto se ensayó en 4 pocilios y se repítsé 3 veces.
De lo anterior se obtuvo como resultado que; 1. El TC no afecta a ia viabilidad de la proliferación de células cancerosas Hela.
Con referencia a las Figuras 3 a 5, no parece que el TCM tiene algún efecto antimscotico sobre ia linea celular de cáncer de HeLa. Esto es consistente con la noción de que el TCM es un inmuno estimulador, en contraste con el potencial para ser un fármaco tóxico directo de cáncer. 2. El TCM Estimula la Producción de !nterferdn de las Células T Activadas.
Para evaluar si el TCM activa directamente la producción de células T de cstocinas, o si requiere una señal coestimuladora, tal como la CooA, fue analizado. Con referencia a las Figuras 6 a 8, parece que el TCM se añade a la inmunidad existente, pero no inicia la inmunidad, por ID manos sobre la base de ensayos de IFM-gamma. Esto serla consistente con un papel regulador ínmunológico de IFH-gamma. Conclusiones.
Por lo tanto, la demostración de una naturaleza no citotoxica de TCM, incluso a altas concentraciones (dilución 1:10) sugiere la naturaleza inocua relativa de la composición. Además, se sugiere que las actividades biológicas están mediadas por la modulación inmune, mientras se oponen a ios efectos directos sobre la mitcgénesis de células.
El aumento de la síntesis de lFH~gamma en respuesta a ConA, apoya la idea de que el TCM es un inmunomodulador, que proporciona apoyo a las respuestas inmunes que ya han sido Iniciadas. Esta es una característica importante ya que la estimulación directa de gamma interferón, en ausencia de otros estímulos implicaría la posibilidad de que el TCM inducirla toxicidad que ha sido asociada con otros inmunomoduíadores tales como administración de íl-2,
Los datos actuales proporcionan un mecanismo científico para actividades inmunomoduladoras del TCM, y apoyan su uso como un "mecanismo de apoyo" a la respuesta inmune, dic os datos so pueden apreciar en las Figuras 2 a l. 2 !-4
10 3
Ei TCI El TCM es extraído de leucocitos Usados de Bazo de tiburón que utilizan procesos dlalizables. El TC se obtuvo un proveedor.
Líneas Celulares las células de cáncer cervical humano Beta se obtuvieron de la American Type Tissue Culture (ATCC: Manassas, VA) y se cultivan en un medio ambiente completamente humidiflcado de C02 al 5% con MEM supíemenfado con FBS al 10%, de piruvaío de sodio ai 2%, aminoácidos no esenciales (2 mM), penicilina (100 unídades mi), estreptomicina (100 g/mi) y glutamina (4 mM) (Gibco-BRL), Las células se pasaron mediante tripsinszación dos veces por semana o según sea necesario sobre la base de 75% de confluencia.
Células Mononucleares de Sangre Periférica (PB C) Las PBMC se aislaron a partir de capas ieucocitadas por centrifugación en gradiente de densidad. Específicamente» las células de la capa teuoodtarla fueron dispensadas sobre cinco tobos Falcan de 50 mi, se añadió solución salina tamponada con fosfato (PBS}/2% de suero da ternera fetal (FCS) para alcanzar un volumen de 20 mi y 10 mi de Ficoll-Paque® se añadió suavemente bajo las células de capa ieucocítaria diluida. La centrifugación se reaiizó a 400 g durante 20 min a temperatura ambiente (RT) y el lavado de las PBMC se hizo tras veces con PBS / 2% de FCS. El cultivo de PBMC recién aisladas se realizó en medio MEM completo, Tratamientos y Análisis de Células Los TOM se diluyeron en un medio M M completo preparados como se describió anteriormente. Se realizaron diluciones de 10:10, 1:100, 1:1000 y 1:10,000. Los controles negativos fueron medios MBM completos. Los controles posit vQs fueron eoncanavalina A a una concentración de 2,5 ug mí Los PBMC fueron cultivados en 1 * S x 106 células/mi en 96 placas ele cyltivo de fondo plano en un volumen de 200 pl por pocilio y se incubaron a 37' en una atmósfera de 5% de C02 humidíficado. El medio condicionado fue entonces evaluado la producción de iF -gamma utilizando ELISA de & D Systems {Quantíkíne ELISA). La concentración fue calculada mediante el trazado en contra de una curva estándar generada con cito uina de control. Las células HeLa se cultivaron en placas a una concentración de 10,000 células por pocilio en placas de fondo plano y se incubaron con diluciones de 1CM a las 1:10, 1 :100, 1; 1000 y 1:10,000, El ensayo S^S-dimetiltiazol-a-ii)- 2,5-dífenH bromuro de tetrazolio {MTT) se realizó para la evaluación de proliferación. En este ensayo ΜΤΤ soluble se metabolizó por la actividad dé la enzima mitocondria! de las células femorales viables, en un producto de formazano coloreado Insoluole. Posteriormente el formazano se disolvió en ΏΜΒΟ y se midió espectrofotomé icamente a 540 nm. Brevemente, 200 μΙ de suspensión de células se sembraron en microplacas de 98 pocilios y se incubaron durante 48 h (3? 8 C, 5% de C02 de aire humidíficado).
Para evaluar la supervivencia celular, se añadieron 20 pl de solución de MTT {5 m§ ml en PBS) a cada pocilio y se incubaron durante 3 h. Luego suavemente 150 pl del medio viejo que contiene MTT fue sustituido por D SO y se pipeteó para disolver todos los cristales de formazano formados. La absorbancla fue entonces determinada a 540 nm mediante un ensayo inmunoabsorbente de enemas ligadas (ELISA) de lector de placas. Cada concentración del extracto se ensayó en 4 pozos y se repitió 3 veces. ELISA Los IFN-gamma, IL~4, 1L-10 e !L-12 m evaluaron por ELISA { y D Systems) utilizando sobrenadante de cultivos activadas por mitógenos y DC tratadas. Las células dendritas Se generaron DC a parir de PBMC resusjpendidas en RPM1-10% de FCS, y se permitió adherirse a placas de 8 pocilios (Costar Corp,, Cambridge, MA). Después de 2 h de incubación a 3? grados Celsius, se eliminaron las células no adhereotes y las células adherentes se lavaron en solución salina tamponada de fosfato (PBS), seguido de desprendimiento por incubación con MQ 2 + y Ca 2 + libre de PBS que contiene 0.5 mW de EDTA a 37 grados Celsius. La fracción adherente fue posteriormente cultivada a 3 x 10 (8)/ml en p i-10% de FCS supfetnentado con 50 ng/ml de GfVI-CSF y 1,000 U/mi de IL-4. El medio se cambió cada 2 días para un total de 8 días de cultivo, tas DC fueron aisladas por la selección positiva para CD83 y posteriormente tratadas con el TCM en el día 8 de cultivo, ta Evaluación de la maduración se realizó por citometrla de flujo para la expresión de CD80 y CD86.
El bloqueo de TLR- se realizó utilizando el cultivo en la presencia de antagonistas TLR4 S-LPS (Invivogen (San Diego, CA), (Spg/mL), con tratamiento previ© 4 horas antes de la exposición ai TCM.
Resultados De lo anterior se obtuvo como resultado que:
1. EL TCM NO MODULA LA PROLIFERACIÓN CELULAR
El TCM ha sido reportado de que posee actividad anticancerosa. De acuerdo con ello, llevamos a cabo una serie de experimentos que evaluaban la capacidad de varias concentraciones de TCM para Inhibir la proliferación de células HeLa. Hemos utilizado el fármaco quimioterapéutíco doxorubicína como un control. Como se ve en la Figura 9a, varias dosis de TCM no afectaron la proliferación de células Hela como se evaluó en el ensayo MTT después de 48 horas de cultivo. Es importante destacar que, las dosis suprafisiológicas de TCM, tan alto como 1:10 de volumen diluido por volumen en el medio de cultivo de tejido no dieron como resultado la Inhibición de la proliferación. Estos datos sugieren que el TCM no actúa a través de mecanismos citotóxicos o cstostéticos. Estos dalos se confirmaron con otras líneas celulares tales como PC-3, DU- 145, y flbrobiasíos 3T3 rio malignos (Figuras 9b~9d).
2. EL TCM ACTUA COMO UN COFACTOR PARA SECRECIÓN DE QTQQUINAS A PARTIR DE CÉLULAS INMUNES ENCONTRADAS EN LA SANGRE PERIFÉRICA,
Para evaluar si el TCM activa directamente la producción de células T de atocinas, o si requiere una señal coestimu ladera, tal como la concanavalina A fConA), se examinó. El TCM no afecta a la viabilidad de las PBMC (datos no mostrados). Parece que el TCM complementa ia producción existente de moléculas estimuladoras Inmunes después de estímulos primarios, ©ero no inicia la inmunidad, por lo menos sobre la base de IFN-gamma y de IL-4 (Figuras 10a y 10b), Dado que las diferentes dosis de TCM poseen diferentes perfiles coestimuladoras para las diferentes atocinas, nos preguntamos si el efecto era específico para ia estimulación de concanavalina A, o si oíros factores pueden estar en juego. De acuerdo con ello, sustituimos la estimulación por concanavalina A a la estimulación por fitohemaglutinina, un rniiógeno utilizado a menudo en los estudios de estimulación de las células T humanas. Como se ve en las Figuras 10c y 10d, un patrón similar de coesimuiacián IFN-gamma e iL~4 se observó con PHA que actúa como el estimulador primario.
3. EL TCM INDUCE LA MADURACIÓN DE CÉLULAS DE DRf TICAS EN UNA FORMA DEPENDIENTE TLR Teniendo en cuenta la contaminación de las células que presentan antígeno en PBMC, y el hecho de que las células que presentan antígeno pueden estar enviando señales coestimuladoras a las células T en respuesta al tratamiento de TCM, se llevaron a cabo una serle de experimentos para evaluar si el TCM actúa sobre ia célula que presenta antfgeno más potente, la célula dendrítiea, El Día 6 la DC inmadura generada a partir de monodias por tratamiento IL-4 y G -CSF fueron utilizados para evaluar el potencial de Inducción de maduración del TCW, Las células fueron tratadas con solución salina, el LPS de control positivo, y 3 concentraciones de TCM. Además, el bloqueo de la señalización de TLR4 se realizó por el ©©tratamiento con LPS-RS, un antagonista del receptor TL -4, Como se ve en las Figuras 11a y 11b, el TCM fue capas de sobreregular la expresión de !t-12 e 11-10, respectivamente, lo que sugiere desde una perspectiva funcional que la activación de DC estaba ocurriendo. De hecho, el hecho de que el 11-12 impulsara la producción de citoquinas Thl y el IL-10 impulsara el Th2, estos datos están de acuerdo con los datos previos que sugieren que el TCM es capaz de modular la Inmunidad. Se observó evidencia definitiva de maduración de DC utilizando cltometrfa de flujo, lo que demuestra que ia sobre regulación de CD80 y CD86 estaba ocurriendo como resultado de tratamiento con TCM (Figuras 11c y 11d), En todos los experimentos, el bloqueo de TL -4 por tratamiento con LPS-RS, un antagonista de TL 4, resultó en una reducción marcada de ambos cambios inducidos por LPS (control positivo), asi como en la actividad del TCM,
CONCLUSIÓN
El TCM es un extracto de leucocitos de bajo peso molecular que induce una modulación dependiente de TLR-4 de la actividad de células dendrítícas, que hemos demostrado esté asociada con la producción de citoquinas de células T de una manera coes lmuladora. La abiiidad del TCM para modular ef sistema inmune en el nivel de la presentación de antígenos apoya su uso actual como un adyuvante nmunoiógico para la vacunación, así como su actividad inmunomoduladora, que se observa en condiciones que van desde el vitíligo a los estados virales y oncológicos

Claims

1. Modulador de células T potencíalizado (TC ) capaz de modular la respuesta inmune a través de la activación de moléculas específicas implicadas en el control de la inmunidad innata obtenido mediante un extracto dializable ele leucocitos a parir de células leucociíarías que contienen poiípéptídos iguales o menores a 10,000 daltones, en donde la urúáaú de factor de transferencia de dicho TCM se define como el equivalente a 1012 leucocitos x mm3 cuya fuente especifica es el bazo de selacimortos o escualos el cual es el centro de actividad del sistema Inmune de los mismos.
2, Método de extracción, comprobación y conteo de extracto dializable de leucocitos a partir de células feucocitarías que contiene poiípéptídos iguales o menores a 10,000 daltones para la obtención de un Modulador de células T potendai izado (TCM) capaz de modular la respuesta inmune a través de la activación de moléculas especificas implicadas en el control de la inmunidad innata, en donde la fuente específica es el es el bazo de selacimortos o escualos el cual es el centro de actividad del sistema Inmune cíe dichos selacimorfos o escualos, que comprende ios siguientes pasos: a) esterilización. - Involucra que todo instrumento utilizado para la extracción del extracto leucocitario se encuentre estéril;
b) extracción de bazo.» Este paso consiste en extraer el bazo del tiburón quirúrgicamente para asi poder extraer el extracto leucocitario; i, descongelar el órgano a trabajar; i . disgregar en un mortero estéril con ayuda del liquido que puede o no acompañar al órgano, en cas© de no presentarlo se puede utilizar agua destilada estéril. Contar el número de células de ba^o, ajustando el número de células a 5 x 108 células por mi debiendo ser el volumen máximo a obtener 250 mi;
íii. el liquido se reparte en tubos Falcon nuevos de SO mi, los cuales se centrifugan a 1500 rpm; o) oonteo y cuantíficacion,- mediante la Cámara de Neubauer y microscopio se cuenta el número de leucocitos por campo en la cuadricula de Neubauer, para saber la potencia del modulador de células T que se obtendrá, es decir, el número de leucocitos por milímetro cúbico, ajustando el conteo a 1012 leucocitos x rrtrrt3, medíante la adición de bazo de tiburón hasta lograr la cuenta de 1012 leucocitos x mm3, asimismo, se requiere valorar l calidad de dichas células, que no exista anisocítosis, es decir, mediante el microscopio se observa que las células sean redondas y lisas;
d) rompimiento o separación de componentes,- separar las células leucoclíarías de las proteínas, llpídos, carbohidratos y toxinas;
e) diálisis-» separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus índices de difusión a través de una membrana semipermeable, entonces, el extracto leucocitario, después de haber sido realizada la separación y rompimiento de componentes, es puesto en un bolso semipermeable de diálisis, como por ejemplo, en una membrana de la celulosa con poros, y el bolso es sellado, en donde el bolso de diálisis sellado se coloca en un envase con una solución diferente, o agua pura, dichos extractos ieucocitarios, ai ser lo suficientemente pequeños co o para pasar a través de ios poros tienden a moverse hacia adentro o hacía afuera del bolso de diálisis en la dirección de la concentración más baja, en donde as moléculas más grandes (a menudo proteínas, ADN, o poiisacáridos) que tiene dimensiones significativamente mayores que el diámetro del poro son retenidas dentro del bolso de diálisis, separando asi los extractos Ieucocitarios menores o iguales a 10,000 Daitonas: cortar una sección de la membrana para diálisis previamente tratada guardando la siguiente relación: por cada 5 mi de solución, debe cortarse 25 cm de membrana; cerrar la membrana con hilo cáñamo estéril por un extremo (2 dobleces y uno más sobre si mismo). Cada dos vueltas un nudo fuerte; utilizando el mismo líquido de hidratación d la membrana, colocar dentro de esta un volumen aproximado de 30 mi, con la finalidad de verificar que no existan fugas. Al finalizar se retira el líquido y se comienza el llenado con el sobrenadante proveniente de los tubos Paleen; Mota: Evitar la des idratación de la membrana ya que impide ia correcta distribución del liquido;
Henar hasta 5 ó 10 cm antes del extremo de la membrana, en el cual se hace un nudo similar al del otro extremo; Nota: Evitar la formación de burbujas, ya que estas dificultarían ©i proceso de diálisis; colocar en un matraz de 4 litros un volumen aproximado de 2 litros de agua destilada previamente esterilizada y filtrada. Antes de introducir en el la membrana, se recomienda enjuagar esta con agua destilada para eliminar los probables contaminantes presentes; enseguida introducir la membrana y sumergirla en el agua destilada, dejando atado a un extremo un trozo de hilo para su óptima manipulación durante el dialkado; Nota: El paso anterior debe repetirse 3 veces, siempre en un matraz con agua destilada estéril diferente; f) filtración y esterilización.- después de la diálisis se filtra eS extracto ieucocítario por medio de una membrana de tamaño de poro entre 2 y 4 micrómeíros, de Igual forma, se esteriliza la solución nuevamente; g) formulación.- se realza un proceso de liofifeción para quitar el agua de! extracto leucoeftario por medio de la generación de un vacío, as mismo en este paso se realiza la agregación de un vehículo, como puede ser leche, agua, gel o saborizante artificial, para darle una presentación y sabor agradable al producto;
h) evaluación fisicoquímica: en este punto se evalúan los procesos físico-químicos como son densidad, PHS color, olor y sabor. Cabe mencionar que si al producto no se le agregó ningún vehículo, el modulador de células T obtenido será inoloro, incoloro e insa oro; i) evaluación de actividad biológica: se analiza el extracto Ieucocitarío inoculando el extracto en ratones Balb~c a una concentración equivalente a la utilizada e humanos en relación peso-exfracío
Ieucocítario, se realiza una cinética de inoculación al tener ratones expuestos al extracto durante un tiempo determinado» por ejemplo 0, 2, 8S 24, 48 y 120 horas; se extrae sangre del ratón, la cual el suero servirá para la determinación de las citosinas activadas colocando el suero sobre membranas de mícroarregios para determinar el tipo de citocina que se encuentra en el extracto Ieucocitarío y el tiempo de actividad de la señal química en la inducción de citosinas. Realizando además diluciones del suero basta encontrar el punto donde ya no se encuentra la citosina, lo que quiere decir que la uJSma dilución e el título de la citosina presente, por lo que esto quiere decir que a mayor sea el titulo o factor de dilución mayor será la potencia del extracto leucocitario, asimismo mediante el estudio en tiempos, es decir la cinética, será indicativo del tiempo de inicio de la inducción de citosinas, el tiempo óptimo de inducción de citosinas y el tiempo de permanencia total de la inducción de citosinas.
3. El Modulador de células T (TCM) potencializado de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho TCM se encuentra en una presentación en polvo, para ser fácilmente transportado y almacenado, sin requerir refrigeración. 4. El Modulador de células T (TCM) potencializado de conformidad con la reivindicación 1, en donde, el factor de transferencia equivalente a 1012 leucocitos x rrtm3 se refiere a la potencia a la concentración de leucocitos por mm3 y la calidad de las células (lisas, redondas e inoquas) cuya cantidad es necesaria para la excitación celular y optimización de las señales químicas,
5. Método de comprobación de la potencia del extracto feucoeííarío a partir de la inoculación del extracto leucocltario en ratones Balb-c, realizado en el paso de la comprobación de la actividad biológica, que comprende: utilizar grupos de 8 ratones, los cuales se utilizarán en cada tiempo de la cinética, se inocularán con la cantidad equivalente a la relación peso-unidad de modulador de células T (0.005 unidad de modulador de células T); mantener los ratones en los tiempos determinados, siendo el tiempo 0 el nivel basa! de citosinas inducidas de los ratones, la cual se eliminara con la intención de conocer el tipo, titulo y permanencia de las citosinas inducidas; extraer suero de cada ratón en su tiempo de acuerdo a la cinética y se utilizan 50 microiitros de suero, exponer frente a las membranas de microarregios que contienen los anticuerpos receptores de las citosinas y los pozos que desarrollen color serán las citosinas inducidas; diluir el suero con solución reguiadora en múltiplos de 2 iniciairnente para después realizar diluciones en múltiplos de 100; eliminar la dilución basa! del tiempo 0, en donde la dilución que conserve el desarrollo de color en los microarregios previo a la dilución donde ya no se presente el desarrollo de color, es el titulo del extracto leucocitarlo; y en donde el grupo de ratones que conserve el título máximo con mayor tiempo de inducción será el tiempo de permanencia de la inducción de citosinas, δ. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde a mayor título y tiempo de inducción encontrado, mayor potencia del Modulador de células T (TCM). ?, Ei método de conformidad con la reivindicación 8, en donde dicho
TCM promueve la excitación celular y optimización de las señales químicas dentro del organismo del individuo que lo consumió.
8. El Modulador de células T (TCM) potencializado de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho TCM promueve el incremento y la actividad de las cédulas K (Natural Killer) las cuales proporcionan la protección contra virus como parte del sistema de defensa inmune natural
9. B Modulador de células T (TCM) potencializado de conformidad con la reivindicación 1, en donde el incremento de Células NK se logra hasta en un aumento de 30-40% resultando en la reducción de de tamaño tumores, de modo que se encapsulen y se vuelvan operables,
10. El Modulador de células T (TCM) potencializado de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho TCM propicia el aumento en la presentación del antígeno y la actividad de lisosomas de los macrófagos permitiendo la destrucción de cuerpos extraños.
11. El Modulador de células T (TCM) potencializado de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho TCM promueve la adhesión y la unión necesaria para la migración de leucocitos, haciendo que las células inmunes viajen con más libertad, y como inductor de efectos antiviraíes.
12. Uso de Modulador de células T (TCM) potencializado capaz de modular la respuesta Inmune a través de la activación de moléculas especificas
Implicadas en ei control de la inmunidad innafas obtenido mediante un extracto dializable de leucocitos a partir de células leucocitarias que contienen polípéptídos iguales o menores a 10,000 daltones, cuya unidad de factor de transferencia de dicho TCM equivale a íún leucocitos x mm3 cuya fuente específica es el bazo de selaelmorfGS o escualos, o su sal farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de cáncer cervical,
13. El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el cáncer cervical es en particular de ia linea celular de células HeLa. 14. Uso de Modulador de células T (TCM) potenoializado capaz de modular la respuesta inmune a través de ia activación de moléculas específicas implicadas en el control de la inmunidad innata, obtenido mediante un extracto dializable de leucocitos a partir de células ieucocitarias que contiene poiipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones, cuya unidad de factor de transferencia de dicho TCM equivale a 1 2 leucocitos x mm3 cuya fuente especifica es el bazo de selacimorfos o escualos, o su sal farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de esclerosis múltiple.
15. Uso de Modulador de células T (TCM) pote oializado capaz de modular la respuesta inmune a través de la activación de moléculas especificas implicadas en el control de la inmunidad innata, obtenido medíante un extracto dializable de leucocitos a partir de células Ieucocitarias que contienen poiipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones, cuya unidad de factor de transferencia de dicho TC equivale a 1012 leucocitos x mm3 cuya fuente específica es el bazo de selacimorfos o escualos» o su sal farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de Infecciones del herpes.
16. Uso de ycdulado de células T (TCM) potencializado capaz de modular la respuesta inmune a través de la activación de moléculas específicas
Implicadas en el control de la inmunidad innata, obtenido medíante un extracto dializable de leucocitos a partir de células Ieucocitarias que contienen poíipéptidos iguales o menores a 10,000 faltones, cuya unidad de factor de transferenda de dicho TCM equivale a 1012 leucocitos x mm3 cuya fuente especifica es el bazo de seiadmorfos o escualos, o su sal farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento para la producción consistente de cstoc nas moduladores inmunitarias, incluyendo interferones y las interleuquínas.
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