WO2013039373A2 - Extracto dializado de leucocitos de origen bazo de tiburón, para la obtención de factor de transferencia potencializado, y método de extracción, comprobación y conteo del mismo - Google Patents

Extracto dializado de leucocitos de origen bazo de tiburón, para la obtención de factor de transferencia potencializado, y método de extracción, comprobación y conteo del mismo Download PDF

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transfer factor
extract
spleen
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    • A61K35/60—Fish, e.g. seahorses; Fish eggs
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    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Definitions

  • the present invention is a method of extraction, testing and counting, of dialyzable leukocyte extract from leukocyte cells containing polypeptides equal to or less than 10,000 daltons of spleen origin of selacimorphs, commonly known as sharks, or also called sharks , to obtain a potentialized transfer factor.
  • the procedure involves sterilization, shark spleen extraction, counting and quantification, breaking or separation of components, dialysis, filtration and sterilization, formulation, chemical physical evaluation and biological activity evaluation.
  • the means for obtaining a dialysable leukocyte extract containing polypeptides less than or equal to 10,000 Daltons whose source or origin is from cells, tissues or organs of sharks, more specifically shark spleen, of the present invention, is considered novel.
  • methods were found for the extraction of leukocytes, white cells or transfer factor, by means of leukocyte packages from healthy (human) donors; reptile eggs, amphibians, fish and birds; in addition to colostrum (milk produced by mammals) and crocodile spleen.
  • TRANSFER FACTOR FROM AVE EGGS uses a method to obtain a transfer factor a from the egg yolk of animals, however, one skilled in the art knows that the method to extract transfer factor from eggs is very complicated, especially in the lipid separation. Like the transfer factor units obtained per egg, it is thousands of times smaller than the present invention.
  • the patent US 4816563 PROCESS FOR OBTAINING TRANSFER FACTOR FROM COLOSTRUM, TRANSFER FACTOR SO OBTAINED AND USE THERE OF, uses as a source of extraction the transfer factor to the colostrum of animals, specifically of mammals.
  • the amount of transfer factor units obtained from colostrum is minimal compared to the present invention, since the transfer factor found in from the sharks is 10 12 leukocytes x mm 3 , against 10 6 leukocytes x mm 3 of colostrum.
  • COMPOSITIONS CONTAINING DIFFERENT TYPES OF TRANSFER FACTOR, METHODS TO PREPARE COMPOSITIONS AND TREATMENT METHODS USING COMPOSITIONS It combines a composition to produce an immune response mediated by T cells in an individual, which contains the transfer factor of at least two different types of animals.
  • the composition may contain the mammalian transfer factor and a non-mammalian transfer factor.
  • An example of the composition may be a combination of a product derived from colostrum, which includes the mammalian transfer factor, and an egg derived product, which includes the non-mammalian transfer factor.
  • this patent presents two problems, eliminating the lipids contained in the egg yolk and the low amount of leukocytes x mm 3 , which reduces the power of said invention.
  • the patent MX 9504215 IMPROVED PROCEDURE FOR THE PURIFICATION OF OLIGOPEPTIDES WITH MOLECULAR WEIGHTS FROM 1000 TO 10,000 DALTONES, FROM LEUCOCIT ESTRACTS AND ITS PHARMACEUTICAL PRESENTATION It refers to an improved procedure for fractionation with high performance , from a set of oligopeptides (from 1,000 to 10,000 daltons), recovered from the breakdown of leukocytes and that have biological activity for the regulation of the immune response comprising the following steps: from leukocyte packages from healthy donors, ALL UNDER ASEPTIC CONDITIONS, the cells are broken, suspensions are made by adjusting volumes, and by ultracentrifugation, the suspension of the cell debris (cell detritus) is clarified, the oligopeptides are recovered by diafiltration and concentrated by tangential ultrafiltration.
  • the product is formulated based on its formula of finished product in pharmaceutical presentation.
  • human blood and its distilled derivatives or separate components from chemical procedures cannot be commercialized, since different laws in the world prohibit it and are classified as a crime. commercialization of human blood and its derivatives.
  • the transfer factor units obtained for every 450 ml of blood from healthy donors of the present invention although higher than the transfer factor units obtained from egg yolk and colostrum, is only 10 8 leukocytes x mm 3 .
  • WO 97/12915 PURIFICATION PROCEDURE OF THE TRANSFER FACTOR FROM LEUCOCITOS.
  • Transfer Factor oligopeptides of 1,000 to 10,000 daltons, which possess biological activity
  • leukocytes which comprises the following steps: the cells are lysed under sterile conditions, the suspension is clarified by ultrafiltration, recover the Transfer Factor by diafiltration and concentrate by tangential ultrafiltration.
  • the Transfer Factor is used pharmaceutically as a regulator of the immune response.
  • this patent is related to MX 9504215 and consists of the same problem of using human blood as a means of leukocyte extraction.
  • IMMUNE MODULATORS PREPARE TIONS AND COMPOSITIONS INCLUDING IMMUNE MODULATORS, TESTS FOR EVALUATING THE ACTIVITY OF IMMUNE MODULATORS AND PREPARATIONS AND COMPOSITIONS INCLUDING THE SAME, AND METHODS.
  • compositions that include extracts from sources of immune modulators that include immune molecules of the nanofraction modulator (i.e., molecules that have molecular weights of about 3,000 DA and less). These compositions may also include other immune modulators, such as transfer factor.
  • US 4468379 LEUKOCYTE EXTRACTS FOR AFFECTING THE IMMUNE SYSTEM.
  • the invention relates to the substantially pure transfer factor with a specific activity of at least 5000 units per unit of absorption at 214 nanometers.
  • the present invention also relates to a process for preparing the cell lysate transfer factor.
  • the present invention includes the use of the substantially pure transfer factor with a specific activity of at least 5000 units per unit of absorption at 214 nm to treat infectious diseases.
  • the present invention refers to a leukocyte extract containing polypeptides equal to or less than 10,000 daltons of selacimorph cells, tissues or organs, specifically, but not limited to, shark spleen and its use as a cell exciter and signal enhancer chemicals in the body, that is, optimizer of the natural immune system of the individual.
  • NK cells provide protection against viruses as part of the natural immune defense system.
  • compositions and formulations that may comprise powdered, encapsulated presentation components, including, but not limited to, transfer factor in various presentations, whether encapsulated or powdered.
  • Figure 1 shows the method of checking the potency of the lebccnltario extract from the inoculation of the leukocyte extract in Balb-c mice.
  • the process of the present invention for the extraction of a dialysate extract; ' ⁇ leukocyte is as follows: Sterilization.- Involves that any instrument used for the extraction of the leukocyte extract is sterile.
  • Spleen Extraction - This step involves surgically removing the shark's spleen so that the leukocyte extract can be extracted.
  • Counting and quantification The number of leukocytes per field in the Neubauer grid is counted through the Neubauer Chamber and microscope, to know the power of the transfer factor that will be obtained, that is, the number of leukocytes per cubic millimeter, adjusting the count at 10 12 leukocytes x mm 3 , by adding shark spleen until the count of 10 12 leukocytes x mm 3 is achieved. Likewise, it is necessary to assess the quality of said cells, that there is no anisocytosis, that is, by microscopy it is observed that the cells are round and smooth.
  • Dialysis is the process of separating the molecules in a solution by the difference in their diffusion rates through a semipermeable membrane. Then, the leukocyte extract, after the separation and rupture of components has been carried out, is placed in a semipermeable dialysis bag, as for example, in a cellulose membrane with pores, and the bag is sealed. The sealed dialysis bag is placed in a container with a different solution, or pure water. Leukocyte extracts, being small enough to pass through the pores, tend to move in or out of the dialysis bag in the direction of the lowest concentration.
  • leukocyte extracts less than or equal to 10,000 Daltons are separated. Filtration and sterilization.- After dialysis, the leukocyte extract is filtered through a pore size membrane between 2 and 4 micrometers. Also, the solution is sterilized again.
  • Formulation.- A lyophilization process is carried out to remove the water from the leukocyte extract by means of the generation of a vacuum, likewise in this step the aggregation of a vehicle is carried out, such as milk, water, gel or artificial flavoring, to give a presentation and pleasant taste to the product.
  • a vehicle such as milk, water, gel or artificial flavoring
  • the leukocyte extract is analyzed by inoculating the extract in Balb-c mice at a concentration equivalent to that used in humans in weight-leukocyte extract ratio, inoculation kinetics is performed by having mice exposed to the extract for a certain time, for example 0, 2, 6, 24, 48 and 120 hours; Blood is extracted from the mouse, which the serum will serve to determine the activated cytosines by placing the serum on microarray membranes to determine the type of cytokine found in the leukocyte extract and the time of activity of the chemical signal in the induction of cytosines Making 3 ⁇ 4 further dilutions of the serum until finding the point where the cytosine is no longer found, which means that the last dilution is the cytosine titre present.
  • the present figure 1 illustrates the method of checking the potency of the leukocyte extract from inoculation of the leukocyte extract in Balb-c mice.
  • Groups of 8 mice are used, which will be used at each time of the kinetics, they will be inoculated with the amount equivalent to the weight-unit ratio of transfer factor (0.005 unit of transfer factor), also using origin transfer factor Human leukocytes and of a spleen crocodile origin for comparative purposes, the mice are maintained at the determined times, the time 0 being the basal level of induced cytosines of the mice, which will be eliminated with the intention of knowing the type, title and permanence of induced cytosines.
  • Whey is extracted from each mouse in its time according to the kinetics and 50 microliters of serum are used, exposed against the microarray membranes that contain the cytosine receptor antibodies and the wells that develop color will be the induced cytosines.
  • the serum is diluted with a regulatory solution in multiples of 2 initially and then diluted in multiples of 100.
  • the baseline dilution of time 0 and the dilution that preserves the color development in the microarrays prior to dilution where it is no longer present is eliminated.
  • Color development is the title of the leukocyte extract.
  • the group of mice that retain the maximum titer with the longest induction time will be the residence time of the cytosine induction.

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Abstract

Método de extracción, comprobación y conteo, de extracto dializable de leucocitos a partir de células leucocitarias que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones de origen bazo de selacimorfos, conocidos comúnmente con el nombre de tiburones, o también llamados escualos, para la obtención de factor de transferencia potencializado. Asimismo, la presente invención, se refiere a un extracto leucocitario que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones de origen células, tejidos u órganos de selacimorfos, en específico mas no limitativo bazo de tiburón y su utilización como excitador celular y mejorador de señales químicas en el cuerpo, es decir, optimizador del sistema inmunológico natural del individuo.

Description

EXTRACTO DIALIZADO DE LEUCOCITOS DE ORIGEN BAZO DE TIBURÓN, PARA LA OBTENCIÓN DE FACTOR DE TRANSFERENCIA POTENCIALIZADO Y, MÉTODO DE EXTRACCIÓN, COMPROBACIÓN Y
CONTEO DEL MISMO
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención es un método de extracción, comprobación y conteo, de extracto dializable de leucocitos a partir de células leucocitarias que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones de origen bazo de selacimorfos, conocidos comúnmente con el nombre de tiburones, o también llamados escualos, para la obtención de factor de transferencia potencializado.
El procedimiento involucra esterilización, extracción de bazo de tiburón, conteo y cuantificación, rompimiento o separación de componentes, diálisis, filtración y esterilización, formulación, evaluación físico química y evaluación de actividad biológica.
El medio para la obtención de un extracto dializable de leucocitos que contiene polipéptidos menores o iguales a 10,000 Daltones cuya fuente u origen es a partir de células, tejidos u órganos de escualos, más específicamente bazo de tiburón, de la presente invención, se considera novedoso, ya que al analizar el estado del arte actual se encontraron métodos para dicha extracción de leucocitos, células blancas o factor de transferencia, mediante paquetes leucocitarios de donadores sanos (humanos); huevos de reptiles, anfibios, peces y aves; además de calostro (leche producida por mamífero) y bazo de cocodrilo. Mas no se encontró documento alguno que mencione la posibilidad de extraer células leucocitarias a partir de selacimorfos, los cuales son un superorden de condrictios (peces cartilaginosos) conocidos comúnmente con el nombre de tiburones, o también llamados escualos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
No se encontró en el estado de la técnica fuente alguna que provea una concentración de factor de transferencia de alrededor de los 1012 leucocitos x mm3. Ya que en el estado del arte, las concentraciones de factor de transferencia de los medios de extracción antes descritos, oscila entre los 104 a 108 leucocitos x mm3.
Por ejemplo, la patente WO/2002/024746. FACTOR DE TRANSFERENCIA A PARTIR DE HUEVOS DE AVE. Utiliza un método para obtener un factor a de transferencia a partir de la yema de huevos de animales, sin embargo, un experto en la materia, sabe que el método para extraer factor de transferencia a partir de huevos es muy complicado, sobre todo en la separación de los lípidos. Al igual que las unidades de factor de transferencia obtenidas por huevo es miles de veces menor que la presente invención.
Así mismo, la patente US 4816563. PROCESS FOR OBTAINING TRANSFER FACTOR FROM COLOSTRUM, TRANSFER FACTOR SO OBTAINED AND USE THERE OF, utiliza como fuente de extracción del factor de transferencia al calostro de animales, en específico de mamíferos. Sin embargo, al igual que la patente anterior, la cantidad de unidades de factor de transferencia obtenidas a partir de calostro es mínima a comparación con la presente invención, ya que el factor de transferencia encontrado en a partir de los escualos es de 1012 leucocitos x mm3, contra 106 leucocitos x mm3 del calostro.
De la misma manera, la patente WO 2005/028622. COMPOSICIONES QUE CONTIENEN DIFERENTES TIPOS DE FACTOR DE TRANSFERENCIA, METODOS PARA PREPARAR LAS COMPOSICIONES Y METODOS DE TRATAMIENTO UTILIZANDO LAS COMPOSICIONES. Combina una composición para producir una respuesta inmunitaria mediada por células T en un individuo, que contiene el factor de transferencia de por lo menos dos diferentes tipos de animales. Por ejemplo, la composición puede contener el factor de transferencia de mamífero y un factor de transferencia no mamífero. Un ejemplo de la composición puede ser una combinación de un producto derivado de calostro, que incluya el factor de transferencia mamífero, y un producto derivado de huevo, que incluye el factor de transferencia no mamífero. Al igual que las anteriores, esta patente presenta dos problemas, eliminar los lípidos que contiene la yema de huevo y la baja cantidad de leucocitos x mm3, lo que resta potencia a dicha invención.
De la misma manera, se encontró que la patente MX 9504215 PROCEDIMIENTO MEJORADO PARA LA PURIFICACION DE OLIGOPEPTIDOS CON PESOS MOLECULARES DE 1000 A 10,000 DALTONES, A PARTIR DE ESTRACTOS LEUCOCITOS Y SU PRESENTACION FARMACEUTICA, Se refiere a un procedimiento mejorado para el fraccionamiento con alto rendimiento, de un conjunto de oligopéptidos (de 1000 a 10000 daltones), recuperados a partir del rompimiento de leucocitos y que poseen actividad biológica para la regulación de la respuesta inmune que comprende los siguientes pasos: a partir de paquetes leucocitarios de donadores sanos, TODO BAJO CONDICIONES ASEPTICAS, se rompen las células, se hacen suspensiones ajustando volúmenes, y mediante ultracentrifugación, se clarifica la suspensión de los restos celulares (detritus celulares), se recuperan los oligopéptidos por medio de diafiltración y se concentran por ultrafiltración tangencial. Se formula el producto con base en su fórmula de producto terminado en presentación farmacéutica. Sin embargo, un experto en la materia sabe que el uso o utilización de sangre humana y sus derivados destilados o componentes separados a partir de procedimientos químicos, no pueden ser comercializados, ya que diferentes legislaciones en el mundo lo prohiben y se cataloga como delito la comercialización de sangre humana y sus derivados. Así mismo, las unidades de factor de transferencia obtenidas por cada 450 mi de sangre de donadores sanos de la presente invención, aunque superior a las unidades de factor de transferencia obtenidas a partir de yema de huevo y de calostro, es tan solo de 108 leucocitos x mm3. Así mismo, la patente WO 97/12915. PROCEDIMIENTO DE PURIFICACION DEL FACTOR DE TRANSFERENCIA A PARTIR DE LEUCOCITOS. Denota un procedimiento de purificación del Factor de Transferencia (oligopéptidos de 1.000 a 10.000 daltones, que poseen actividad biológica), a partir de leucocitos, que comprende los siguientes pasos: se lisan las células en condiciones estériles, se clarifica la suspensión mediante ultrafiltración, se recupera el Factor de Transferencia por diafiltración y se concentra por ultrafiltración tangencial. El Factor de Transferencia se utiliza farmacéuticalmente como regulador de la respuesta inmune. Sin embargo, esta patente se encuentra relacionada con la MX 9504215 y consta del mismo problema de utilizar sangre humana como medio de extracción de leucocitos.
La patente MX20089296A, OPTIMISED PROCESS FOR THE OBTENTION OF DIALYZABLE LEUKOCYTE EXTRACT, CONTAINING PEPTIDES WITH MOLECULAR WEIGHT EQUAL TO OR LOWER THAN 10, 000 DALTONS, FROM CROCODILE LYMPHOID TISSUE AND THE PREPARATION THEREOF IN AN ORAL AND/OR INJECTABLE PHARMACEUTIC, se refiere a un procedimiento optimizado para la obtención del extracto leucocitario que contiene péptidos con peso molecular igual o inferior a 10,000 Daltones, a partir de células de tejido linfoide provenientes de cocodrilo y que posee la propiedad de regular la respuesta inmune en humanos y animales. Sin embargo, la potencia del factor de transferencia obtenido es de 108 leucocitos x mm3.
Así mismo, en el estado de la técnica se encuentra la patente: US 2009/0053197 TRANSFER FACTOR COMPOSITIONS AND METHODS, la cual menciona la posibilidad de utilizar factor de transferencia como adyuvante, cuya característica principal radica en que la composición que comprende factor de transferencia y un anticuerpo, cada una es derivada independientemente de una fuente seleccionada del grupo que consiste en huevos, calostro, sangre, y combinaciones de los mismos. Esto quiere decir que el extracto leucocitario tiene como fuente huevos, calostro, sangre o sus combinaciones. Sin embargo, para un experto en el estado de la técnica, es bien sabido que esta patente presenta los siguientes problemas, si se utiliza yema de huevo, resulta muy difícil eliminar los lípidos que contiene, así mismo, tanto la yema de huevo, como las demás fuentes constan de una baja cantidad de leucocitos x mm3, lo que resta potencia a dicha invención. Así mismo, la síntesis de las anteriores fuentes de extracto leucocitario resulta muy complicada para separar las células leucocitarias de las proteínas, lípidos, carbohidratos y toxinas.
Por último, se mencionan las patentes: WO/2008/042604. IMMUNE MODULATORS, PREPARA TIONS AND COMPOSITIONS INCLUDING IMMUNE MODULATORS, TESTS FOR EVALUATING THE ACTIVITY OF IMMUNE MODULATORS AND PREPARATIONS AND COMPOSITIONS INCLUDING THE SAME, AND METHODS. Que divulga las composiciones que incluyen los extractos de fuentes de moduladores inmunes que incluyan las moléculas inmunes del modulador del nanofraction (es decir, moléculas que tienen pesos moleculares de cerca de 3.000 DA y menos). Estas composiciones pueden también incluir otros moduladores inmunes, tales como factor de transferencia. US 4468379, LEUKOCYTE EXTRACTS FOR AFFECTING THE IMMUNE SYSTEM. Que describe a un grupo de sustancias derivadas de los leucocitos humanos (glóbulos blancos) que amplifican, suprime, o modula de otra manera la respuesta del sistema inmune a la reintroducción de antígenos. Y US 5840700, METHODS OF PRODUCING TRANSFER FACTOR. Que ilustra que la invención se relaciona con el factor de transferencia substancialmente puro con una actividad específica por lo menos de 5000 unidades por unidad de la absorción en 214 nanómetros. La actual invención también se relaciona con un proceso para preparar el factor de transferencia de lisados de la célula. La actual invención incluye el uso del factor de transferencia substancialmente puro con una actividad específica por lo menos de 5000 unidades por unidad de la absorción en 214 nanómetro para tratar enfermedades infecciosas. En ia actualidad no se dispone de una fuente leucocitaria para la producción de factor de transferencia potencial izado y sin efectos adversos. Se ha intentado utilizar factor de transferencia a partir de yema de huevo, leche y sangre, que aunque el producto funge como inmunomodulador, existe una baja concentración de leucocitos en dichas fuentes, lo que se traduce en una baja excitación celular y acoplamiento a señales químicas deficiente. Asimismo, éstas fuentes para extracción de extracto leucocitario, al administrarlas, pueden provocar a los pacientes reacciones alérgicas, tal es el caso del huevo. Todas las anteriores, aunque con métodos diversos de sintetizar los extractos leucocitarios, utilizan como fuente leucocitaria ya sea huevos de mamíferos, peces o aves, calostro, sangre o sus combinaciones. Sin embargo, para un experto en el estado de la técnica, es bien sabido que las patentes anteriores presentan en general los siguientes problemas, si se utiliza yema de huevo, resulta muy difícil eliminar los lípidos que contiene, así mismo, tanto la yema de huevo, como las demás fuentes constan de una baja cantidad de leucocitos x mm3, lo que resta potencia a dicha invención. Así mismo, la síntesis de las anteriores fuentes de extracto leucocitario resulta muy complicada para separar las células leucocitarias de las proteínas, lípidos, carbohidratos y toxinas. De la misma manera, cabe mencionar que diversas legislaciones en el mundo prohiben la comercialización de sangre humana y sus derivados. En el estado de la técnica no se encontró invención alguna que refiera a un método para el conteo de leucocitos y comprobación de las señales químicas activadas del extracto leucocitario.
OBJETOS DE LA INVENCIÓN
Es objeto de la presente invención proporcionar una fuente de extracto leucocitario cuyo origen no sea a partir de mamíferos, huevos, ni calostro, y que nnde una potencia de 1012 leucocitos x mm3 (entendiéndose por potencia a la cantidad de leucocitos y calidad de las células lisas, redondas e inoquas)), cantidad necesaria para la excitación celular y optimización de las señales químicas.
Por lo que la presente invención, se refiere a un extracto leucocitario que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones de origen células, tejidos u órganos de selacimorfos, en específico mas no limitativo bazo de tiburón y su utilización como excitador celular y mejorador de señales químicas en el cuerpo, es decir, optimizador del sistema inmunológico natural del individuo.
Así mismo, es también objeto de la presente invención proporcionar un método para el conteo de leucocitos y comprobación de las señales químicas activadas del extracto leucocitario.
Uno de los efectos específicos del factor de transferencia es una actividad perceptiblemente creciente de las células NK (asesino natural por sus siglas en inglés). Las células NK proporcionan la protección contra virus como parte del sistema de defensa inmune natural.
Los aspectos adicionales de la invención se relacionan con las composiciones y las formulaciones que pueden comprender componentes en presentación en polvo, encapsulados, incluyendo, pero no limitado a, factor de transferencia en diversas presentaciones, ya sea encapsulado o en polvo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra el método de comprobación de la potencia del extracto lebccnltario a partir de la inoculación del extracto leucocitario en ratones Balb-c.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El procedimiento de la presente invención para la extracción de un extracto dializ;'■ bie de leucocitos es el siguiente: Esterilización.- Involucra que todo instrumento utilizado para la extracción del extracto leucocitario se encuentre estéril.
Extracción de bazo - Este paso consiste en extraer el bazo del tiburón quirúrgicamente para así poder extraer el extracto leucocitario.
Conteo y cuantificación.- Mediante la Cámara de Neubauer y microscopio se cuenta el número de leucocitos por campo en la cuadrícula de Neubauer, para saber la potencia del factor de transferencia que se obtendrá, es decir, el número de leucocitos por milímetro cúbico, ajustando el conteo a 1012 leucocitos x mm3, mediante la adición de bazo de tiburón hasta lograr la cuenta de 1012 leucocitos x mm3. Así mismo se requiere valorar la calidad de dichas células, que no exista anisocitosis, es decir, mediante el microscopio se observa que las células sean redondas y lisas.
Rompimiento o separación de componentes.- Se deben separar las células leucocitarias de las proteínas, lípidos, carbohidratos y toxinas. Diálisis.- La diálisis es el proceso de separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus índices de difusión a través de una membrana semipermeable. Entonces, el extracto leucocitario, después de haber sido realizada la separación y rompimiento de componentes, es puesto en un bolso semipermeable de diálisis, como por ejemplo, en una membrana de la celulosa con poros, y el bolso es sellado. El bolso de diálisis sellado se coloca en un envase con una solución diferente, o agua pura. Los extractos leucocitarios, al ser lo suficientemente pequeños como para pasar a través de los poros tienden a moverse hacia adentro o hacia afuera del bolso de diálisis en la dirección de la concentración más baja. Las moléculas más grandes (a menudo proteínas, ADN, o polisacáridos) que tiene dimensiones significativamente mayores que el diámetro del poro son retenidas dentro del bolso de diálisis. De ésta manera, se separan los extractos leucocitarios menores o iguales a 10,000 Daltones. Filtración y esterilización.- Después de la diálisis se filtra el extracto leucocitario por medio de una membrana de tamaño de poro entre 2 y 4 micrómetros. Así mismo, se esteriliza la solución nuevamente.
Formulación.- Se realiza un proceso de liofilización para quitar el agua del extracto leucocitario por medio de la generación de un vacío, así mismo en este paso se realiza la agregación de un vehículo, como ouede ser leche, agua, gel o saborizante artificial, para darle una presentación y sabor agradable al producto.
Evaluación Fisicoquímica. En este punto se evalúan los procesos físico-químicos como son densidad, PH, color, olor y sabor. Cabe mencionar que si al producto no se le agregó ningún vehículo, el factor de transferencia obtenido será inoloro, incoloro e insaboro.
Evaluación de actividad biológica. Se analiza el extracto leucocitario inoculando el extracto en ratones Balb-c a una concentración equivalente a la utilizada en humanos en relación peso-extracto leucocitario, se realiza una cinética de inoculación al tener ratones expuestos al extracto durante un tiempo determinado, por ejemplo 0, 2, 6, 24, 48 y 120 horas; se extrae sangre del ratón, la cual el suero servirá para la determinación de las citosinas activadascolocando el suero sobre membranas de microarreglos para determinar el tipo de citocina que se encuentra en el extracto leucocitario y el tiempo de actividad de la señal química en la inducción de citosinas. Realizando ¾demás diluciones del suero hasta encontrar el punto donde ya no se encuentra la citosina, lo que quiere decir que la última dilución es el vítulo de la citosina presente. Esto quiere decir a mayor sea el título o ?actor de dilución mayor será la potencia del extracto leucocitario. •Mediante el estudio en tiempos, es decir la cinética, será indicativo del ■■empo de inicio de la inducción de citosinas, el tiempo óptimo de inducción de citosinas y el tiempo de permanencia total de la aducción de citosinas. El resultado del proceso anterior es un factor de transferencia potencializado en presentación en polvo, lo que le da la virtud de ser fácilmente transportado y almacenado, no requiere refrigeración y se obtiene una potencia de factor de transferencia de 1012 leucocitos x mm3, lo cual es altamente superior a cualquier factor de transferencia conocido, entendiéndose por potencia a la concentración de leucocitos por mm3 y la calidad de las células (lisas, redondas e inoquas).
La presente figura 1 ilustra el método de comprobación de la potencia del extracto leucocitario a partir de la inoculación del extracto leucocitario en ratones Balb-c. Se utilizan grupos de 8 ratones, los cuales se utilizarán en cada tiempo de la cinética, se inocularán con la cantidad equivalente a la relación peso-unidad de factor de transferencia (0.005 unidad de factor de transferencia), utilizando además factor de transferencia de origen leucocitos humano y de origen bazo de cocodrilo con fines comparativos, se mantienen los ratones en los tiempos determinados, siendo el tiempo 0 el nivel basal de citosinas inducidas de los ratones, la cual se eliminará con la intención de conocer el tipo, título y permanencia de las citosinas inducidas.
Se extrae suero de cada ratón en su tiempo de acuerdo a la cinética y se utilizan 50 microlitros de suero, se exponen frente a las membranas de microarreglos que contienen los anticuerpos receptores de las citosinas y los pozos que desarrollen color serán las citosinas inducidas. El suero se diluye con solución reguladora en múltiplos de 2 inicialmente para después realizar diluciones en múltiplos de 100. Se elimina la dilución basal del tiempo 0 y la dilución que conserve el desarrollo de color en los microarreglos previo a la dilución donde ya no se presente el desarrollo de color, es el titulo del extracto leucocitario. El grupo de ratones que conserve el título máximo con mayor tiempo de inducción será el tiempo de permanencia de la inducción de citosinas.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Extracto dializable de leucocitos a partir de células leucocitarias que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones, cuya fuente específica es el bazo que forma parte del sistema linfático y es el centro de actividad del sistema inmune de los selacimorfos, los cuales son el superorden de los condrictios, conocidos comúnmente como escualos, para la obtención de factor de transferencia potencializado. 2. Extracto dializable de leucocitos a partir de células leucocitarias que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones, cuya fuente específica es el bazo que forma parte del sistema linfático y es el centro de actividad del sistema inmune de los selacimorfos, los cuales son el superorden de los condrictios, conocidos comúnmente como escualos, para la obtención de factor de transferencia potencializado, que de acuerdo a la reivindicación 1 , se caracteriza porque su método de extracción, comprobación y conteo consiste en los siguientes pasos:
Esterilización.- Involucra que todo instrumento utilizado para la extracción del extracto leucocitario se encuentre estéril.
Extracción de bazo.- Este paso consiste en extraer el bazo del tiburón quirúrgicamente para así poder extraer el extracto leucocitario.
Conteo y cuantificación.- Mediante la Cámara de Neubauer y microscopio se cuenta el número de leucocitos por campo en la cuadrícula de Neubauer, para saber la potencia del factor de transferencia que se obtendrá, es decir, el número de leucocitos por milímetro cúbico, ajusfando el conteo a 1012 leucocitos x mm3, mediante la adición de bazo de tiburón hasta lograr la cuenta de 012 leucocitos x mm3. Así mismo se requiere valorar la calidad de dichas células, que no exista anisocitosis, es decir, mediante el microscopio se observa que las células sean redondas y lisas. d) Rompimiento o separación de componentes.- Se deben separar las células leucocitarias de las proteínas, lípidos, carbohidratos y toxinas. e) Diálisis.- Es el proceso de separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus índices de difusión a través de una membrana semipermeable. El extracto leucocitario, después de haber sido realizada la separación y rompimiento de componentes, es puesto en un bolso semipermeable de diálisis, como puede ser, una membrana de la celulosa con poros, y el bolso es sellado. El bolso de diálisis sellado se coloca en un envase con una solución diferente, o agua pura. Los extractos leucocitarios, al ser lo suficientemente pequeños como para pasar a través de los poros tienden a moverse hacia adentro o hacia afuera del bolso de diálisis en la dirección de la concentración más baja. Las moléculas más grandes (a menudo proteínas, ADN, o polisacáridos) que tiene dimensiones significativamente mayores que el diámetro del poro son retenidas dentro del bolso de diálisis. De ésta manera, se separan los extractos leucocitarios menores o iguales a 10,000 Daltones. f) Filtración y esterilización.- Después de la diálisis se filtra el extracto leucocitario por medio de una membrana de tamaño de poro entre 2 y 4 micrómetros. Así mismo, se esteriliza la solución nuevamente.
g) Formulación.- Se realiza un proceso de liofilización para quitar el agua del extracto leucocitario por medio de la generación de un vacío, así mismo en este paso se realiza la agregación de un vehículo, como puede ser leche, agua, gel o saborizante artificial, para darle una presentación y sabor agradable al producto.
h) Evaluación Fisicoquímica. En este punto se evalúan los procesos físico- químicos como son densidad, PH, color, olor y sabor. Cabe mencionar que si al producto no se le agregó ningún vehículo, el factor de transferencia obtenido será inoloro, incoloro e insaboro.
i) Evaluación de actividad biológica. Se analiza el extracto leucocitario inoculando el extracto en ratones Balb-c a una concentración equivalente a la utilizada en humanos en relación peso-extracto leucocitario, se realiza una cinética de inoculación al tener ratones expuestos al extracto durante un tiempo determinado, por ejemplo 0,
2, 6, 24, 48 y 120 horas; se extrae sangre del ratón, la cual el suero servirá para la determinación de las citosinas activadas, colocando el suero sobre membranas de microarreglos para determinar el tipo de citocina que se encuentra en el extracto leucocitario y el tiempo de actividad de la señal química en la inducción de citosinas. Realizando además diluciones del suero hasta encontrar el punto donde ya no se encuentra la citosina, lo que quiere decir que la última dilución es el título de la citosina presente. Esto quiere decir a mayor sea el título o factor de dilución mayor será la potencia del extracto leucocitario. Así mismo, mediante el estudio en tiempos, es decir la cinética, será indicativo del tiempo de inicio de la inducción de citosinas, el tiempo óptimo de inducción de citosinas y el tiempo de permanencia total de la inducción de citosinas.
3. Extracto dializable de leucocitos a partir de células leucocitarias que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones, cuya fuente específica es el bazo que forma parte del sistema linfático y es el centro de actividad del sistema inmune de los selacimorfos, los cuales son el superorden de los condrictios, conocidos comúnmente como escualos, para la obtención de factor de transferencia potencializado, que de acuerdo a la reivindicación 1 , se caracteriza porque el producto obtenido es un factor de transferencia potencializado en presentación en polvo, el cual puede ser fácilmente transportado y almacenado, así mismo no requiere refrigeración.
4. Extracto dializable de leucocitos a partir de células leucocitarias que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones, cuya fuente específica es el bazo que forma parte del sistema linfático y es el centro de actividad del sistema inmune de los selacimorfos, los cuales son el superorden de los condrictios, conocidos comúnmente como escualos, para la obtención de factor de transferencia potencializado, que de acuerdo a la reivindicación 1 , se caracteriza porque se obtiene una potencia de factor de transferencia de 1012 leucocitos x mm3, entendiéndose por potencia a la concentración de leucocitos por mm3 y la calidad de las células (lisas, redondas e inoquas).
5. Extracto dializable de leucocitos a partir de células leucocitarias que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones, cuya fuente específica es el bazo que forma parte del sistema linfático y es el centro de actividad del sistema inmune de los selacimorfos, los cuales son el superorden de los condrictios, conocidos comúnmente como escualos, para la obtención de factor de transferencia potencializado, que de acuerdo a la reivindicación 1 , se caracteriza porque el método de comprobación de la potencia del extracto leucocitario a partir de la inoculación del extracto leucocitario en ratones Balb-c, realizado en el paso de la comprobación de la actividad biológica, consiste en: Se utilizan grupos de 8 ratones, los cuales se utilizarán en cada tiempo de la cinética, se inocularán con la cantidad equivalente a la relación peso-unidad de factor de transferencia (0.005 unidad de factor de transferencia), se mantienen los ratones en los tiempos determinados, siendo el tiempo 0 el nivel basal de citosinas inducidas de los ratones, la cual se eliminará con la intención de conocer el tipo, título y permanencia de las citosinas inducidas. Se extrae suero de cada ratón en su tiempo de acuerdo a la cinética y se utilizan 50 microlitros de suero, se exponen frente a las membranas de microarreglos que contienen los anticuerpos receptores de las citosinas y los pozos que desarrollen color serán las citosinas inducidas. El suero se diluye con solución reguladora en múltiplos de 2 inicialmente para después realizar diluciones en múltiplos de 100. Se elimina la dilución basal del tiempo 0 y la dilución que conserve el desarrollo de color en los microarreglos previo a la dilución donde ya no se presente el desarrollo de color, es el titulo del extracto leucocitario. El grupo de ratones que conserve el título máximo con mayor tiempo de inducción será el tiempo de permanencia de la inducción de citosinas.
6. Extracto dializable de leucocitos a partir de células leucocitarias que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones, cuya fuente u origen son los selacimorfos, conocidos comúnmente con el nombre de tiburones, o también llamados escualos, para la obtención de factor de transferencia potencializado, que de acuerdo a la reivindicación 5, se caracteriza porque a mayor título y tiempo de inducción encontrado, mayor potencia del factor de transferencia.
7. Extracto dializable de leucocitos a partir de células leucocitarias que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones, cuya fuente específica es el bazo que forma parte del sistema linfático y es el centro de actividad del sistema inmune de los selacimorfos, los cuales son el superorden de los condrictios, conocidos comúnmente como escualos, para la obtención de factor de transferencia potencializado, que de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, se caracteriza porque promueve la excitación celular y optimización de las señales químicas dentro del organismo del individuo que lo consumió.
8. Extracto dializable de leucocitos a partir de células leucocitarias que contiene polipéptidos iguales o menores a 10,000 daltones, cuya fuente específica es el bazo que forma parte del sistema linfático y es el centro de actividad del sistema inmune de los selacimorfos, los cuales son el superorden de los condrictios, conocidos comúnmente como escualos, para la obtención de factor de transferencia potencializado, que de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, se caracteriza porque promueve una actividad perceptiblemente creciente de las células NK (asesino natural por sus siglas en inglés), las cuales proporcionan la protección contra virus como parte del sistema de defensa inmune natural.
PCT/MX2012/000084 2011-09-13 2012-09-13 Extracto dializado de leucocitos de origen bazo de tiburón, para la obtención de factor de transferencia potencializado, y método de extracción, comprobación y conteo del mismo WO2013039373A2 (es)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016195470A1 (es) * 2015-06-04 2016-12-08 Zepeda López Hector Manuel Modulador de células t potencializado capaz de modular la respuesta inmune, método de extracción, comprobación y conteo de extracto dializable de leucocitos de origen bazo de tiburón para su obtención y su uso terapéutico

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080081076A1 (en) * 2006-09-29 2008-04-03 Lisonbee David A Nanofraction immune modulators, preparations and compositions including the same, and associated methods
MX2008009296A (es) * 2008-07-18 2010-01-18 Carlos Adolfon Perez De La Mora Procedimiento optimizado para la obtencion del extracto dializable leucocitario que contiene peptidos con peso molecular igual o inferior a 10,000 daltones, a partir de tejido linfoide de cocodrilo y su preparación en una forma farmaceutica oral y/o
ES2353208T3 (es) * 2002-02-28 2011-02-28 Luis Antonio Calzada Nova Extracto dializado de leucocitos para el tratamiento de enfermedades infecciosas en animales.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2353208T3 (es) * 2002-02-28 2011-02-28 Luis Antonio Calzada Nova Extracto dializado de leucocitos para el tratamiento de enfermedades infecciosas en animales.
US20080081076A1 (en) * 2006-09-29 2008-04-03 Lisonbee David A Nanofraction immune modulators, preparations and compositions including the same, and associated methods
MX2008009296A (es) * 2008-07-18 2010-01-18 Carlos Adolfon Perez De La Mora Procedimiento optimizado para la obtencion del extracto dializable leucocitario que contiene peptidos con peso molecular igual o inferior a 10,000 daltones, a partir de tejido linfoide de cocodrilo y su preparación en una forma farmaceutica oral y/o

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016195470A1 (es) * 2015-06-04 2016-12-08 Zepeda López Hector Manuel Modulador de células t potencializado capaz de modular la respuesta inmune, método de extracción, comprobación y conteo de extracto dializable de leucocitos de origen bazo de tiburón para su obtención y su uso terapéutico

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