CN107475204A - 一种囊膜病毒保护剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种囊膜病毒保护剂及其制备方法，主要由卵磷脂、牛血清蛋白、蔗糖、生理盐水按比例制备而成。使用时，该保护剂以100：1~20：1体积比添加于病毒保存液内，保护活的囊膜病毒，降低病毒在保存过程中的死亡率，延长病毒的有效保存时间。本发明提供了卵磷脂在囊膜病毒保护方面的一种新用途，利用卵磷脂与蛋白质结合后对蛋白质分解的拮抗作用、对病毒囊膜脂质分解的拮抗作用，保护病毒囊膜及衣壳免于降解，较传统的蛋白类和糖类保护剂均可大大延长其存活时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种囊膜病毒保护剂及其制备方法，涉及动物病毒学及疫苗学，属于生物制品保护技术领域。
背景技术
病毒是一类非细胞形态，靠细胞内寄生增殖的微生物，由核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质、脂质等构成。人类、动物、植物的大量疾病都是由病毒感染导致的，大量的研究已经表明，严重威胁人类和动物健康的传染性疾病，甚至某些肿瘤，都是由病毒感染引起的。如天花病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、SARS冠状病毒、流感病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、口蹄疫病毒等，已经给人类生存和发展制造了巨大的威胁，甚至灾难。
病毒学研究的领域之一，是分离获得某些病毒并对其进行深入研究，以获得预防或治疗病毒感染的技术和手段。因为病毒只能在细胞内寄生和增殖，所以病毒离开细胞后的最长生存时间受其自身特性和环境条件的明显影响，从几小时至数月不等。延长病毒在样品以及培养物中的保存时间一直是病毒学研究的重要课题之一。
根据病毒本身结构的不同，可分为无囊膜病毒和有囊膜病毒两大类，其中有囊膜病毒的感染力主要与囊膜上的特定结构有关，而囊膜结构容易被破坏而导致病毒去感染力。这种特性一方面有利于病毒的消毒和灭活，另一方面给其研究和利用增加了困难。有效延长囊膜病毒在培养物中的保存时间，可以大大降低毒种更新和保存的成本，对于病毒的理化特性、生物学性质研究、疫苗研究等都具有极大的帮助。
卵磷脂是一类提取自大豆或鸡蛋的脂类物质混合物，其构成成分包括磷脂、胆碱、脂肪酸、甘油、糖脂等。卵磷脂可与多种蛋白质结合，以脂蛋白形态存在。在临床上，卵磷脂具有乳化分解油脂、清除过氧化物，减少脂肪在血管内壁滞留时间，防止由胆固醇引起的血管内膜损伤等作用。同时，卵磷脂也是胎儿和婴儿神经发育的必需品，可以促进大脑神经系统与脑容积的增长、发育，是美国食品与药物管理局（FDA）规定在婴儿奶粉中必须添加的物质。
经检索卵磷脂在囊膜病毒保护方面的文件未见报道。
发明内容
本发明提供了一种囊膜病毒保护剂，利用卵磷脂与蛋白质结合后对蛋白质分解的拮抗作用、对病毒囊膜脂质分解的拮抗作用，保护病毒囊膜及衣壳免于降解，较传统的蛋白类和糖类保护剂均可大大延长其存活时间。
本发明进一步提供了一种囊膜病毒保护剂制备方法，使其在保存液内免于被降解失活，延长其存活时间的制剂，并提供了该制剂的制备工艺和使用方法。
本发明提供的一种囊膜病毒保护剂，其特征在于主要由以下原料按重量份数比制成的：
卵磷脂0.5份～2份、牛血清白蛋白0.5份～2份、蔗糖2份～10份、生理盐水100份。
本发明所述的囊膜病毒保护剂的制备方法，其特征在于：
将卵磷脂粉碎后加入生理盐水中，在10000rpm～30000rpm条件下高速剪切制备为混悬液，再通过高压均质机进行均质化，制备为均质乳剂，然后加入牛血清白蛋白及蔗糖，充分溶解并混匀后，以0.22μm滤膜过滤除菌，即得病毒保护剂。
使用时，本发明保护剂以100：1～20：1体积比添加于病毒保存液内，延长病毒的存活时间。
本发明的积极效果在于：
提供了卵磷脂在囊膜病毒保护方面的一种新用途，利用卵磷脂与蛋白质结合后对蛋白质分解的拮抗作用、对病毒囊膜脂质分解的拮抗作用，保护病毒囊膜及衣壳免于降解，较传统的蛋白类和糖类保护剂均可大大延长其存活时间。
具体实施方式
下面结合具体实施例，说明本发明的一种囊膜病毒保护剂的制备、使用方法及效果，但本发明内容并不仅限于实施例。
实施例1
称取卵磷脂30g，压成碎块，置于1000ml生理盐水内，以高速剪切机20000转/分剪切5-8分钟乳化，形成均匀乳白色混悬液；以高压均质机在600-650bar压力下进行均质化；完成均质化的卵磷脂乳液内加入30g牛血清白蛋白和150g蔗糖，充分溶解并混匀中，定容至2000ml；无菌条件下进行0.22μm滤膜过滤，分装至100ml无菌瓶内，即得囊膜病毒保护剂，2-8℃保存备用。
实施例2
称取卵磷脂20g，压成碎块，置于800ml生理盐水内，以高速剪切机20000转/分剪切5-8分钟乳化，形成均匀乳白色至淡黄色混悬液；以高压均质机在600-650bar压力下进行均质化；完成均质化的卵磷脂乳液内加入20g牛血清白蛋白和100g蔗糖，充分溶解并混匀中，定容至2000ml；无菌条件下进行0.22μm滤膜过滤，分装至100ml无菌瓶内，即得囊膜病毒保护剂，2-8℃保存备用。
实施例3
称取卵磷脂10g，压成碎块，置于500ml生理盐水内，以高速剪切机20000转/分剪切5-8分钟乳化，形成均匀乳白色混悬液；以高压均质机在600-650bar压力下进行均质化；完成均质化的卵磷脂乳液内加入10g牛血清白蛋白和20g蔗糖，充分溶解并混匀中，定容至2000ml；无菌条件下进行0.22μm滤膜过滤，分装至100ml无菌瓶内，即得囊膜病毒保护剂，2-8℃保存备用。
试验例1
囊膜病毒保护剂对狂犬病病毒的保护效果
1、取狂犬病病毒弱毒SRV9株（滴度不低于107.0TCID50/ml）细胞培养物120ml，均分为12份，每份10ml。编号分别为1号至12号。
2、12份狂犬病病毒SRV9株的处理方式和检测方案如下：
1号：不加保护剂，于室温（20℃）保存，从0时（保存前）起，每24小时取1ml，测定病毒滴度，直至第7天；
2号：不加保护剂，于2-8℃保存，从0时（保存前）起，每24小时取1ml，测定病毒滴度，直至第7天；
3号：不加保护剂，于-20℃保存，从0时（保存前）起，每周取1ml，测定病毒滴度，直至第7周；
4号：不加保护剂，于-70℃保存，从0时（保存前）起，每月取1ml，测定病毒滴度，直至第7个月；
5号：按1%体积（0.1ml）加入实施例1制备的保护剂，于室温（20℃）保存，从0时（保存前）起，每24小时取1ml，测定病毒滴度，直至第7天；
6号：按1%体积（0.1ml）加入实施例2制备的保护剂，于2-8℃保存，从0时（保存前）起，每24小时取1ml，测定病毒滴度，直至第7天；
7号：按1%体积（0.1ml）加入实施例3制备的保护剂，于-20℃保存，从0时（保存前）起，每周取1ml，测定病毒滴度，直至第7周；
8号：按1%体积（0.1ml）加入实施例1制备的保护剂，于-70℃保存，从0时（保存前）起，每月取1ml，测定病毒滴度，直至第7个月；
9号：按1%体积（0.1ml）加入无卵磷脂成份的保护剂，于室温（20℃）保存，从0时（保存前）起，每24小时取1ml，测定病毒滴度，直至第7天；
10号：按1%体积（0.1ml）加入无卵磷脂成份的保护剂，于2-8℃保存，从0时（保存前）起，每24小时取1ml，测定病毒滴度，直至第7天；
11号：按1%体积（0.1ml）加入无卵磷脂成份的保护剂，于-20℃保存，从0时（保存前）起，每周取1ml，测定病毒滴度，直至第7周；
12号：按1%体积（0.1ml）加入无卵磷脂成份的保护剂，于-70℃保存，从0时（保存前）起，每月取1ml，测定病毒滴度，直至第7个月。
结论：
上述12份狂犬病病毒，经保护剂处理与对照组未处理的病毒在不同条件保存后不同时间的存活病毒滴度如表1和表2。结果显示，按1%体积添加病毒保护剂后，在室温、冷藏、冷冻及超低温冷冻条件下，对狂犬病病毒的感染力较无保护剂组及添加无卵磷脂成分的保护剂组均有明显的保护效果，病毒感染力维持时间明显延长。无卵磷脂成分的保护剂对病毒有一定程度的保护效果，但不显著，可见，卵磷脂是保护囊膜病毒感染力的关键物质。
表1 病毒保护剂对室温和2-8℃保存病毒的保护效果（病毒滴度，10XTCID50/ml）
表2. 病毒保护剂对-20℃和-70℃保存病毒的保护效果（病毒滴度，10XTCID50/ml）
试验例2
囊膜病毒保护剂对新城疫病毒的保护效果
1、取新城疫病毒弱毒LaSota株（血凝效价不低于29）尿囊液80ml，均分为8份，每份10ml。编号分别为1号至8号。
2、8份新城疫病毒LaSota株尿囊液的处理方式和检测方案如下：
1号：加不含卵磷脂的保护剂，于室温（20℃）保存，从0时（保存前）起，每24小时取1ml，测定血凝效价，直至第7天；
2号：加不含卵磷脂的保护剂，于2-8℃保存，从0时（保存前）起，每24小时取1ml，测定血凝效价，直至第7天；
3号：加不含卵磷脂的保护剂，于-20℃保存，从0时（保存前）起，每周取1ml，测定血凝效价，直至第7周；
4号：加不含卵磷脂的保护剂，于-70℃保存，从0时（保存前）起，每月取1ml，测定血凝效价，直至第7个月；
5号：按1%体积（0.1ml）加入实施例1制备的保护剂，于室温（20℃）保存，从0时（保存前）起，每24小时取1ml，测定血凝效价，直至第7天；
6号：按1%体积（0.1ml）加入实施例2制备的保护剂，于2-8℃保存，从0时（保存前）起，每24小时取1ml，测定血凝效价，直至第7天；
7号：按1%体积（0.1ml）加入实施例3制备的保护剂，于-20℃保存，从0时（保存前）起，每周取1ml，测定血凝效价，直至第7周；
8号：按1%体积（0.1ml）加入实施例1制备的保护剂，于-70℃保存，从0时（保存前）起，每月取1ml，测定血凝效价，直至第7个月；
结论：
上述8份新城疫病毒，经添加保护剂处理与添加不含卵磷脂的保护剂处理的病毒在不同条件保存后不同时间的存活病毒血凝效价如表3和表4。由表中数据可知，按1%体积添加含卵磷脂的病毒保护剂后，在室温、冷藏、冷冻及超低温冷冻条件下，对新城疫病毒的感染力均有明显的保护效果，病毒感染力维持时间明显延长。可见，卵磷脂是保护该囊膜病毒保护持久血凝活性的关键物质。
表3.病毒保护剂对室温和2-8℃保存病毒的保护效果（血凝效价，2X）
表4. 病毒保护剂对-20℃和-70℃保存病毒的保护效果（血凝效价，2X）
Claims (2)
1.一种囊膜病毒保护剂，其特征在于主要由以下原料按重量份数比制成的：
卵磷脂0.5份~2份、牛血清白蛋白0.5份~2份、蔗糖2份~10份、生理盐水100份。
2.根据权利要求1所述的囊膜病毒保护剂的制备方法，其特征在于：
将卵磷脂粉碎后加入生理盐水中，在10000rpm~30000rpm条件下高速剪切制备为混悬液，再通过高压均质机进行均质化，制备为均质乳剂，然后加入牛血清白蛋白及蔗糖，充分溶解并混匀后，以0.22μm滤膜过滤除菌，即得病毒保护剂。
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