CN117882727A - 一种病毒灭活剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种病毒灭活剂及其制备方法与应用，所述病毒灭活剂包含蛋白保护剂和β‑丙内酯。本发明方案通过将β‑丙内酯、BSA和PBS复配得到病毒灭活剂，其中，采用β‑丙内酯灭活法代替传统的热灭活法，防止病毒抗原被过度破坏，使用pH7.0～7.4的PBS为底液生产灭活剂，维持pH稳定，使用牛血清白蛋白(BSA)作为抗原蛋白稳定剂，与疫苗稳定剂相比成本低廉，稳定性好，制备得到的病毒灭活剂在灭活病毒的同时保证抗原滴度稳定，可以用于大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种病毒灭活剂及其制备方法与应用。
背景技术
病毒具有传染性，因此需要灭活后才能作为参考品用于体外诊断试剂的生产。传统的、使用最广泛灭活方式是热灭活法。但是热灭活法具有改变蛋白质构造的缺陷，而多数抗原决定簇属于蛋白质类物质，因此热灭活法可能造成抗原滴度大幅下降，例如未灭活的病毒抗原滴度为1:10000，热灭活可能降低为1:1000甚至更低，这种情况下会造成10倍甚至更高的成本损失。为了避免以上情况发生，需要寻找可代替的灭活方法。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种病毒灭活剂，能够在灭活病毒的同时保证抗原滴度稳定。
本发明还提出一种上述病毒灭活剂的制备方法。
本发明还提出一种上述病毒灭活剂的应用。
本发明还提出一种病毒灭活方法。
根据本发明的一个方面，提出了一种病毒灭活剂，所述病毒灭活剂包含蛋白保护剂和β-丙内酯。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白保护剂包括明胶、蔗糖、BSA和海藻糖中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白保护剂为BSA。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白保护剂与β-丙内酯的质量体积比为2～6：1(g/mL)。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白保护剂与β-丙内酯的质量体积比为3～5。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白保护剂与β-丙内酯的质量体积比为3.5～4.5。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒灭活剂还包括溶剂。
在本发明的一些实施方式中，所述溶剂包括PBS缓冲液和NaCl溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述PBS缓冲液的pH为7.0～7.4。
在本发明的一些实施方式中，所述NaCl溶液的质量分数为0.9％。
根据本发明的第二方面，提出了一种上述病毒灭活剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：将各组分混合即得。
根据本发明的第三方面，提出了上述病毒灭活剂的应用，所述应用为在制备灭活病毒的药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒包括单链病毒和双链病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述单链病毒包括单链DNA病毒和单链RNA病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述双链病毒包括双链DNA病毒和双链RNA病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述双链DNA病毒包括腺病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述双链RNA病毒包括甲型流感病毒和乙型流感病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备灭活病毒的疫苗中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒包括腺病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备用于生产病毒的抗原参考品中的应用。
根据本发明的第四方面，提出了一种病毒灭活方法，采用上述病毒灭活剂对病毒进行灭活。
在本发明的一些实施方式中，病毒灭活剂与病毒的添加体积比为1:(0.5～3)。
在本发明的一些实施方式中，对病毒进行灭活的条件为在2～8℃放置68～75h后，35～40℃水浴1～3h。
根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案通过将β-丙内酯、BSA和PBS复配得到病毒灭活剂，其中，采用β-丙内酯灭活法代替传统的热灭活法，防止病毒抗原被过度破坏，使用pH7.0～7.4的PBS为底液生产灭活剂，维持pH稳定，使用牛血清白蛋白(BSA)作为抗原蛋白稳定剂，与疫苗稳定剂相比成本低廉，稳定性好，制备得到的病毒灭活剂在灭活病毒的同时保证抗原滴度稳定，可以用于大规模生产。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例制备了一种病毒灭活剂，包括底液磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0～7.4)100mL、蛋白保护剂(牛血清白蛋白BSA)0.4g，β-丙内酯0.1mL。
所述病毒灭活剂的使用方法为：病毒灭活剂将与病原体悬液1:1混合，在2～8℃冰箱内放置72h，再使用37℃水浴2h使β-丙内酯水解失去毒性。
方法所用试剂的优化
(1)β-丙内酯灭活病毒的浓度的优化
使用浓度≥1.0×107TCID50/mL的腺病毒(ADV)、甲型流感病毒(IAV)、乙型流感病毒(IBV)作为研究对象，分别使用病毒灭活剂与病毒的添加体积比(v/v)为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000比例在4℃处理24h、48h、72h、96h。达到时间后再37℃水浴水解2h，然后接种对应宿主细胞，观察是否产生CPE(细胞病变效应)，有CPE为“+”，无CPE为“-”。
表1β-丙内酯灭活病毒浓度与时间
结果如表1所示，从表1可以看出，灭活1.0×107TCID50/mL以上浓度的病毒液至少需要1:1000浓度48h或1:2000浓度72h以上。
(2)蛋白保护剂种类优化
常用的蛋白保护剂有明胶、蔗糖、BSA、海藻糖，以这4种蛋白保护剂进行研究，研究浓度为0.1％。阳性对照使用未灭活的病毒液原液。阴性对照使用不含保护剂的β-丙内酯稀释液灭活病毒。实验组使用含不同保护剂(分别为明胶、蔗糖、BSA、海藻糖)的病毒灭活剂进行灭活病毒。病毒灭活后，使用广东和信健康科技有限公司生产的甲乙流腺病毒三重胶体金试剂盒检测病毒抗原滴度。
表2
| 名称 | 阴性对照 | 阳性对照 | 0.1％明胶 | 0.1％蔗糖 | 0.1％BSA | 0.1％海藻糖 |
| ADV | 1:64000 | 1:4000 | 1:8000 | 1:16000 | 1:32000 | 1:8000 |
| IAV | 1:64000 | 1:10000 | 1:20000 | 1:20000 | 1:40000 | 1:10000 |
| IBV | 1:1600 | 1:100 | 1:400 | 1:400 | 1:800 | 1:800 |
结果如表2所示，从表2可以看出，4种保护剂的效果以BSA最优，在病毒液内加入0.1％BSA作为保护剂，能有效保护病毒蛋白的稳定性，其抗原滴度水平与未灭活的病毒差异在2倍以内。
(3)BSA浓度优化
将BSA应用于产品生产，处于产品稳定性考虑进行了以下研究。实验使用PBS稀释BPL，稀释比例为1:2000，并加入含有不同浓度的BSA的病毒灭活剂进行实验。结果如表3所示，从表3中可以看出，证实0.1％～0.8％浓度的BSA在保护抗原滴度上无显著差异。
表3不同浓度BSA保护抗原滴度效果研究
| 病毒 | 无BSA | 0.1％BSA | 0.2％BSA | 0.4％BSA | 0.8％BSA |
| ADV | 1:4000 | 1:32000 | 1:32000 | 1:32000 | 1:32000 |
| IAV | 1:10000 | 1:40000 | 1:40000 | 1:40000 | 1:40000 |
| IBV | 1:100 | 1:800 | 1:800 | 1:800 | 1:800 |
(4)底液种类优化
分别使用pH7.0～7.4的PBS与0.9％NaCl溶液作为底液配制病毒灭活试剂灭活病毒，灭活后检测各自抗原的滴度水平，进行对比。
表4
| 名称 | 阴性对照 | PBS | 0.9％NaCl |
| ADV | 1:64000 | 1:32000 | 1:10000 |
| IAV | 1:64000 | 1:40000 | 1:8000 |
| IBV | 1:1600 | 1:800 | 1:160 |
结果如表4所示，从表4中可以看出，使用PBS为底液配比使用0.9％NaCl作为底液更稳定，没有pH缓冲体系的0.9％NaCl底液可能导致抗原滴度效价降低10倍以上。
β-丙内酯(Beta-Propiolactone，BPL)是1984年起应用最广泛的最理想的疫苗灭活剂，化学式为C3H4O2，无色有刺激气味的液体，用作药物、树脂和纤维改性剂的中间体，也用作血浆、疫苗的杀菌消毒剂，其衍生物β-巯基丙酸是PVC稳定剂和医药的原料。作为一种疫苗灭活剂，其最主要特点有2种：①对病毒核酸具有强烈破坏作用，对蛋白质无影响。②在低温时稳定，在高温时水解为无毒的人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸，水解速度随温度的升高而加快，水溶液半衰期10℃时仅为18hr，25℃时为3.5hr，37℃时为2hr，50℃时为20min，75℃时为5min。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种病毒灭活剂，其特征在于，所述病毒灭活剂包含蛋白保护剂和β-丙内酯。
2.根据权利要求1所述的病毒灭活剂，其特征在于，所述蛋白保护剂包括明胶、蔗糖、BSA和海藻糖中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的病毒灭活剂，其特征在于，所述蛋白保护剂与β-丙内酯的质量体积比为2～6：1。
4.根据权利要求1所述的病毒灭活剂，其特征在于，所述病毒灭活剂还包括溶剂；优选地，所述溶剂包括PBS缓冲液和NaCl溶液。
5.一种如权利要求1～4任一项所述的病毒灭活剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将各组分混合即得。
6.权利要求1～4任一项所述的病毒灭活剂在制备灭活病毒的药物中的应用。
7.权利要求1～4任一项所述的病毒灭活剂在制备灭活病毒的疫苗中的应用。
8.权利要求1～4任一项所述的病毒灭活剂在制备用于生产病毒的抗原参考品中的应用。
9.根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，所述病毒包括单链病毒和双链病毒；优选地，所述单链病毒包括单链DNA病毒和单链RNA病毒；优选地，所述双链病毒包括双链DNA病毒和双链RNA病毒；更优选地，所述双链DNA病毒包括腺病毒；更优选地，所述双链RNA病毒包括甲型流感病毒和乙型流感病毒。
10.一种病毒灭活方法，其特征在于，采用如权利要求1～4任一项所述的病毒灭活剂对病毒进行灭活。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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