因此，本發明提供一種用於製備不活化包膜病毒之方法，該方法包含：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段。該第一混合物中MBCD的濃度為至少5 mM至約100 mM。進一步而言，該第一混合物中MBCD的濃度為約20 mM至約40 mM。更進一步而言，該第一混合物中MBCD的濃度為約20 mM、約30 mM或約40 mM。 本發明提供一種用於製備不活化包膜病毒之方法，該方法包含：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段；其中該第二混合物中MBCD的濃度為至少10 mM至約100 mM。進一步而言，該第二混合物中MBCD的濃度為約30 mM至約50 mM。更進一步而言，該第二混合物中MBCD的濃度為約30 mM、約40 mM或約50 mM。 本發明提供一種用於製備不活化包膜病毒之方法，該方法包含：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段；其中該第一時間段為約15分鐘至約24小時。進一步而言，該第一時間段為約4小時至約24小時。更進一步而言，該第一時間段為約4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24小時。 本發明提供一種用於製備不活化包膜病毒之方法，該方法包含：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段；其中該第二時間段為約4小時至約48小時。進一步而言，該第二時間段為約24小時至約48小時。更進一步而言，該第二時間段為約24、30、36、40、44或48小時。 本發明提供一種用於製備不活化包膜病毒之方法，該方法包含：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段；其中在第一時間段期間該第一混合物之溫度為室溫或約20℃至約25℃。進一步而言，在第一時間段期間該第一混合物之溫度為約22℃至約24℃。 本發明提供一種用於製備不活化包膜病毒之方法，該方法包含：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段；其中在第二時間段期間該第二混合物之溫度為室溫或約20℃至約25℃。進一步而言，在第二時間段期間該第二混合物之溫度為約22℃至約24℃。 本發明提供一種用於製備不活化包膜病毒之方法，該方法包含：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段；其中在獲得該第二混合物之步驟之前將該包膜病毒與該第一混合物分離。或者且非限制性地，第二MBCD溶液可與第一混合物直接混合。可在與第一混合相同的不活化容器中進行該直接混合，或第一混合物先移至一個新的不活化容器後再與第二MBCD溶液混合。 本發明提供一種用於製備不活化包膜病毒之方法，該方法包含：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段；其中該第一時間段進一步包含混合該第一混合物。攪拌可為約30 rpm至約100 rpm。較佳地，攪拌可為約40 rpm至約60 rpm。最佳地，攪拌可為約50 rpm。 本發明提供一種用於製備不活化包膜病毒之方法，該方法包含：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段；其中該第二時間段進一步包含混合該第二混合物。攪拌可為約30 rpm至約100 rpm。較佳地，攪拌可為約50 rpm。 本發明提供一種用於製備不活化包膜病毒之方法，該方法包含：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段；其中該包膜病毒為豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)病毒。該包膜病毒亦可為豬流行性下痢病毒(PEDV)。 本發明提供一種去脂質包膜病毒，其藉由以下方法獲得：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段。較佳地，該第一混合物中MBCD的濃度為至少5 mM至約100 mM，或約20 mM至約40 mM。較佳地，該第二混合物中MBCD的濃度為至少10 mM至約100 mM，或約30 mM至約50 mM，或約30 mM、約40 mM或約50 mM。較佳地，該第一時間段為約15分鐘至約24小時，或約4小時至約24小時，或約4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24小時。較佳地，該第二時間段為約4小時至約48小時，或約24小時至約48小時，或約24、30、36、40、44或48小時。較佳地，在第一時間段期間該第一混合物之溫度為室溫，或約20℃至約25℃，或甚至約22℃至約24℃。較佳地，在第二時間段期間該第二混合物之溫度為室溫，或約20℃至約25℃，或甚至約22℃至約24℃。較佳地，在獲得第二混合物之步驟之前將包膜病毒與第一混合物分離。或者且非限制性地，第二MBCD溶液可與第一混合物直接混合。可在與第一混合相同的不活化容器中進行該直接混合，或第一混合物先移至一個新的不活化容器後再與第二MBCD溶液混合。較佳地，該第一時間段進一步包含混合該第一混合物，其中該攪拌可為約30 rpm至約100 rpm，約40 rpm至約60 rpm，或約50 rpm。較佳地，該第二時間段進一步包含混合該第二混合物，其中攪拌可為約30 rpm 至約100 rpm，約40 rpm至約60 rpm，或約50 rpm。較佳地，該包膜病毒為豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)病毒或豬流行性下痢病毒(PEDV)。 本發明提供一種包含去脂質包膜病毒的疫苗，該去脂質包膜病毒藉由以下方法獲得：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段。較佳地，該第一混合物中MBCD的濃度為至少5 mM至約100 mM，或約20 mM至約40 mM。較佳地，該第二混合物中MBCD的濃度為至少10 mM至約100 mM，或約30 mM至約50 mM，或約30 mM、約40 mM或約50 mM。較佳地，該第一時間段為約15分鐘至約24小時，或約4小時至約24小時，或約4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24小時。較佳地，該第二時間段為約4小時至約48小時，或約24小時至約48小時，或約24、30、36、40、44或48小時。較佳地，在第一時間段期間該第一混合物之溫度為室溫，或約20℃至約25℃，或甚至約22℃至約24℃。較佳地，在第二時間段期間該第二混合物之溫度為室溫，或約20℃至約25℃，或甚至約22℃至約24℃。較佳地，在獲得第二混合物之步驟之前將包膜病毒與第一混合物分離。或者且非限制性地，第二MBCD溶液可與第一混合物直接混合。可在與第一混合相同的不活化容器中進行該直接混合，或第一混合物先移至一個新的不活化容器後再與第二MBCD溶液混合。較佳地，該第一時間段進一步包含混合該第一混合物，其中攪拌可為約30 rpm至約100 rpm，約40 rpm至約60 rpm，或約50 rpm。較佳地，該第二時間段進一步包含混合該第二混合物，其中攪拌可為約30 rpm至約100 rpm，或約50 rpm。較佳地，該包膜病毒為豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)病毒或豬流行性下痢病毒(PEDV)。 本發明提供一種包含去脂質包膜病毒之疫苗，該去脂質包膜病毒藉由以下方獲得：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段；其中該疫苗進一步包含佐劑、穩定劑、防腐劑及摻合稀釋劑中之至少一者。較佳地，該佐劑為水性聚合物佐劑，其中該聚合物為丙烯酸酯或聚丙烯酸酯。較佳地，該穩定劑包含糖、碳水化合物、蛋白質及明膠中之至少一者。較佳地，該防腐劑為延遲、抑制或妨礙微生物之生長、代謝活動或增殖的抗生素或生物穩定化合物。較佳地，該摻合稀釋劑為水、磷酸鹽緩衝鹽水、細胞培養基或包含生理鹽度及pH之其他溶液。 本發明提供一種去脂質包膜病毒之用途，該去脂質包膜病毒藉由以下方法獲得：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段；其中該用途包含治療由包膜病毒引起之疾病或症狀。 本發明提供一種去脂質包膜病毒之用途，其係用於製造用於治療由包膜病毒引起之疾病或症狀的藥劑；其中該去脂質包膜病毒藉由以下方法獲得：將包含包膜病毒之溶液與第一MBCD溶液混合，獲得第一混合物；培育該第一混合物第一時間段；將來自該第一混合物之該包膜病毒與第二MBCD溶液混合，獲得第二混合物；及培育該第二混合物第二時間段。 如本文所使用，「包膜病毒」為具有包圍核蛋白核心之脂質雙層膜或包膜的任何病毒。病毒包膜通常衍生自宿主細胞膜且含有磷脂、糖脂、鞘脂及固醇(諸如，膽固醇)。包膜病毒包括具有由DNA或RNA編碼之基因組的病毒。包膜病毒之種類包括(但不限於)：疱疹病毒、痘病毒、虹彩病毒(iridovirus)、肝炎病毒、反轉錄病毒、正黏液病毒、沙粒狀病毒、布尼亞病毒(bunyaviruses)、副黏液病毒、單股反鏈病毒、棒狀病毒、絲狀病毒、冠狀病毒、動脈炎病毒、黃病毒屬及披膜病毒。正不斷地發現新的包膜病毒，且包膜病毒被分類並且隨著每一病毒得到更佳表徵而再分類。可在諸如Fields Virology (D.M. Knipe及P.M. Howley編，Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, 2013) (現發行其第六版)之正文中找到包膜病毒之更完整描述。 如本文所使用之術語「病毒」可意謂病毒種類或可互換地意謂個別感染性單元或含有核酸、蛋白質及包膜之單元。「病毒粒子」為個別感染性單元，且此術語與術語「病毒體」同義。 「去脂質化」為自病毒包膜移除或去除脂質之過程。藉由用MBCD自病毒粒子移除之膽固醇的量來量測去脂質化。然而，MBCD亦可提取、移除或去除其他脂質，諸如磷脂。儘管本文中所述之過程由於MBCD介導之去脂質化而將病毒蛋白質之蛋白損失減至最少，但亦顯示MBCD與一些蛋白質相互作用。 「感染性」為病毒在宿主細胞內產生感染之能力，該宿主細胞為來自人類或非人類動物之能夠支援病毒複製的任何細胞。可(例如)藉由受一定數目的病毒粒子感染之宿主細胞的數目或百分比，或藉由感染宿主細胞所需之病毒粒子的數目或百分比來量測感染性。可以可操作方式計數病毒粒子，諸如藉由測定一定體積之病毒粒子內的溶菌斑形成單元(PFU)的數目。亦可以物理方式量測病毒粒子，諸如藉由所偵測之特定病毒蛋白質之存在，藉由酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)，或藉由量測溶液中所存在之病毒基因組的複本數目(例如藉由即時定量聚合酶鏈式反應(qPCR)偵測)。 「抗原」為能夠被生物體之免疫系統特異性地偵測到之任何分子。典型地，病毒抗原為由病毒基因組編碼之病毒蛋白質。病毒抗原之存在可被T淋巴細胞及B淋巴細胞兩者特異性地偵測到。「免疫原性」係指抗原誘發免疫反應之能力。對疫苗而言，病毒抗原之免疫原性將較佳地在動物中引起將減少、緩和或減輕病毒感染之保護性免疫。 與抗原相比而言，「佐劑」為免疫反應之非特異性刺激劑。佐劑可藉由結合模式識別受體(PRR)且使其活化來刺激先天性免疫反應。舉例而言，該等PRR刺激劑可為病毒或細菌核酸、來自細菌或寄生蟲之脂質，或細菌蛋白質或毒素，或該等分子之任何人工構建模擬物。佐劑亦包括(但不限於)：聚集抗原以促進B淋巴細胞之識別或吞噬細胞之吸收的無機化合物，諸如礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣氫氧化物或硫酸銨；油；以及清潔劑。佐劑亦可為免疫信號傳導之宿主介體，諸如(但不限於)細胞激素、淋巴激素、趨化激素、干擾素、過敏毒素、生長因子、分化因子及黏附分子。 如本文中所使用，術語「治療(treating/to treat/treatment)」包括抑制、延緩、終止、減輕、減緩或逆轉現有症狀、病症、病狀或疾病之進展或嚴重程度。可防治性地或治療性地施加治療。 如本文所用，「向動物投予」包括經皮膚、經皮下、肌肉內、經黏膜、經黏膜下層、經皮、經口或鼻內投與。投與可包括注射或表面投與。 以下實驗實例說明去脂質化製程。應瞭解，其他實施例及用途對熟習此項技術者而言將為顯而易見的，且本發明不限於此等特定說明性實例或較佳實施例。例如(但不限於)視包膜病毒及包膜病毒在其中進行複製之宿主細胞的類型及種類而定，包膜病毒在其包膜中含有不同水準之膽固醇。如熟習此項技術者將瞭解，本文中所述之去脂質化製程可能需要對每一特定病毒原液進行最佳化。微生物之膜可含有膽固醇、類藿烷或其他固醇及類固醇分子，且因此不為病毒之病原體亦可藉由本文中所揭示之方法不活化。
實例 1
使用以下程序對人類流感病毒H1N1 A/WSN/33病毒株進行去脂質。在以下實例中，流感病毒(IFV)之去脂質化削弱感染性。由於本發明之去脂質化方法保留病毒包膜蛋白質，故預期接種去脂質IFV之動物產生保護其免受致病劑量之毒性病毒感染的免疫原性反應。
試劑 ：
人類流感病毒H1N1 A/WSN/33病毒株及其宿主細胞株MDCK可購自Wuxi AppTec (中國，上海)。其他試劑包括MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA)；EMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)；ULTRAMDCK™無血清培養基(Lonza, Inc., Allendale, NJ)；胎牛血清(FBS；Invitrogen)；0.25%胰蛋白酶-EDTA (乙二胺四乙酸；Invitrogen)；甲基-β-環糊精(MBCD，Sigma-Aldrich)；AMPLEX Red膽固醇分析套組(Invitrogen)；PIERCE™ BCA蛋白質分析套組(Rockford，IL)；及MTT (Sigma-Aldrich)。
H1N1 A / WSN / 33 流感病毒在 MDCK 細胞株中之 增殖：
根據以下程序用IFV接種細胞。自在T-75燒瓶中生長之MDCK細胞中移除培養基，在室溫下用5 mL PBS沖洗MDCK細胞單層，且在37℃下用1.5 mL胰蛋白酶/EDTA分離細胞。將細胞再懸浮於含有10% FBS之10 mL MEM中，且藉由在4℃下以800 rpm離心5分鐘而集結成塊。將細胞再懸浮於含有10% FBS之MEM中，並且將細胞密度調整至2.5 × 10
5
個細胞/毫升。將十五毫升之MDCK細胞懸浮液接種至各T-75燒瓶中，且將燒瓶在37℃以及5% CO
2
下放置並且培育隔夜。 當MDCK細胞匯合超過90%時，自T75燒瓶移除MEM，添加含有1% FBS及1 μg/mL胰蛋白酶之5 mL EMEM維持液，且以0.01之感染倍率(MOI)用流感病毒感染細胞。在37℃以及5% CO
2
下培育燒瓶60分鐘至90分鐘，且每隔15分鐘輕輕地振盪。向各燒瓶中添加含有1% FBS及1 μg/mL胰蛋白酶之十毫升EMEM維持液，並且在37℃及5% CO
2
下培育燒瓶48小時。在達成病毒之大致80%細胞病變效應(CPE)時(通常在約48小時後)，收集培養物上清液以獲得IFV。
H1N1 A / WSN / 33 IFV 之 純化及滴定 ：
根據以下程序純化IFV。以3,000 rpm離心所採集之培養物上清液20分鐘以移除細胞碎屑，且採集上清液。以38,000 rpm離心該上清液60分鐘，以使IFV集結成塊。將IFV離心塊再懸浮於適當體積之生理緩衝鹽水(PBS)中，得到＞1.0 × 10
9
溶菌斑形成單元/mL (PFU/mL)之最終力價。在-80℃下儲存100 μL此經濃縮IFV儲備溶液之等分試樣。 使用以下程序針對活體外感染性滴定IFV。使用上述細胞培養物及轉移程序，以2.5 × 10
5
個細胞/毫升之最終密度將MDCK細胞懸浮於含有10% FBS之MEM中。向6孔培養盤之各孔中添加二毫升之MDCK細胞懸浮液，並且在37℃以及5% CO
2
下培育培養盤隔夜。在37℃水浴中使病毒儲備液解凍，之後在4℃下以500 ×
g
離心10分鐘。使用ULTRAMDCK™無血清培養基及2.5 μg/mL胰蛋白酶作為稀釋緩衝液，製備儲備溶液之1/10稀釋系列並且在使用之前在4℃下進行儲存。 當細胞匯合至少90%時，移除培養基，且向各孔中添加0.5 mL稀釋緩衝液及0.5 mL病毒稀釋液。對於陰性對照組，使用1.0 mL稀釋緩衝液。在添加各稀釋液之後立刻輕輕振盪培養盤。在37℃下、在5% CO
2
中培育培養盤60分鐘至90分鐘，且每隔15分鐘搖動培養盤。接著，在37℃下用含2.5%低熔點瓊脂糖之PBS溶液與稀釋緩衝液之3 mL的1:4混合物覆蓋各6孔培養盤之各孔。在室溫下培育培養盤15分鐘以使覆層混合物固化；接著在37℃以及5% CO
2
下培育培養盤3天。 使用以下程序使溶菌斑顯色。在溶菌斑充分形成之後(感染後3天)，添加1 mL 4%多聚甲醛，且在室溫下培育培養盤1小時。棄去溶解的瓊脂糖，且向各孔中添加0.1 mL之0.5%結晶紫。在培育15分鐘之後對溶菌斑數目進行計數，且基於稀釋因數轉換為力價。
去脂質 化 ：
在兩個並行反應中進行經純化IFV之去脂質化程序：溶劑處理，其包含使IFV與MBCD接觸；以及模擬處理，其中IFV以相同方式加以處理但不暴露於MBCD。在模擬處理及溶劑處理兩者中使用相同力價的IFV。可滴定模擬處理中之IFV，以得到在溶劑處理之後剩餘的去脂質IFV之量的間接量測值。 根據以下程序進行溶劑處理及模擬處理。在艾本德(Eppendorf)試管中將上文所製備之IFV儲備液之等分試樣(100 μL) (＞1.0 × 10
9
PFU/mL)稀釋至900 μL PBS中，以達成1.0 - 5.0 × 10
8
PFU/mL之最終力價。對於溶劑處理，添加含MBCD之PBS，達至50 mM之最終濃度，或向模擬處理中添加相同體積之PBS。隨後用封口膜封蓋且密封艾本德試管。將所有樣本固持在預加熱至37℃之SHZ-82恆溫定軌氣浴震盪器(中國，Changzhou Guohua Appliance Co.)中。在37℃下使經溶劑處理樣本及經模擬處理樣本以220 rpm之定軌旋轉速度旋轉30分鐘或45分鐘。在微離心機中使樣本旋轉1分鐘，且將含有IFV之上清液轉移至超離心機試管。以200,000 ×
g
(OPTIMA
TM
L-100XP；Beckman Coulter, Inc.，Indianapolis IN)離心試管30分鐘，以使IFV集結成塊，且棄去上清液。將IFV離心塊再懸浮於上文添加至每一艾本德試管之1/10初始體積中，並且在進一步分析之前在-80℃下進行儲存。
去脂質 IFV 之表徵：
根據製造商的說明使用BCA分析(PIERCE™ BCA蛋白質分析套組)來測定去脂質及經模擬處理之IFV的蛋白質含量。使用根據製造商之說明進行的膽固醇分析(AMPLEX® Red膽固醇分析套組，Life Technologies，Grand Island，NY)來測定膽固醇含量。使用與如上文所闡述相同的滴定程序來量測活體外感染性。 如下測定血球凝集(HA)活性。用PBS洗滌新鮮分離的雞血三次，且使紅細胞(RBC) 再懸浮於濃度為1%之PBS中。在PBS中製得病毒稀釋液(50 μL)，且將該等稀釋液與50 μL之RBC懸浮液混合。向96孔培養盤中之個別孔中添加混合物，且使RBC靜置45分鐘。若存在RBC斑點或集結粒，則判定孔呈HA陰性(亦即，無RBC凝集)，且若存在平滑的RBC懸浮液，則判定孔呈陽性。 根據上文所述之程序製備兩個批次的去脂質及經模擬處理之IFV樣本。用於測試之IFV儲備液具有2.2 × 10
10
PFU/mL之力價。在第一批次(「製劑A」)中，去脂質化時間為30分鐘；在第二批次(「製劑B」)中，去脂質化時間為45分鐘。在超離心之後，表徵去脂質及經模擬處理之樣本。 活體外感染性展示：去脂質樣本之PFU為對應模擬樣本之PFU的約1/7,000。感染性結果示於下表1中。儘管存在力價差異，但各種樣本之蛋白質含量在彼此的10%內。來自製劑A之去脂質IFV的蛋白質含量為模擬樣本的97%；且來自製劑B之去脂質IFV的蛋白質含量為模擬樣本的93% (
參見
表1)。亦觀測到，在處理後，大致20%之起始物質恢復，如藉由蛋白質含量所測定。基於蛋白質含量之恢復百分比可與起始物質(2.2 × 10
9
PFU/mL)及經模擬處理樣本(4.0 × 10
8
PFU/mL，其為起始力價的18%)之經量測力價相比。與模擬處理相比，在去脂質化之後，少於2%之膽固醇保留(
參見
表1)。 表1
註：
a
與模擬處理相比之感染性分數；
b
與模擬處理相比之百分比。 模擬處理表明，物理處理(震盪及離心)造成力價及蛋白質之損失。藉由MBCD進行之去脂質化較佳地自IFV移除膽固醇但不移除蛋白質。此外，經MBCD處理之IFV具有更小活體外感染性，但感染性並未完全消除。
用二異丙基醚及 MBCD 進行 IFV 去脂質 化 之 比較：
除MBCD之外，使用另一脂質溶劑二異丙基醚(DIPE)來對IFV進行去脂質。用不同濃度之DIPE或用50 mM MBCD處理相同起始物質之IFV樣本。在37℃下用2%、4%、8%或12% DIPE或50 mM MBCD處理相同數量IFV之等分試樣30分鐘。在以2,000 ×
g
短暫離心3分鐘之後，移除可見溶劑，且將含水物質在通風櫥中放置20分鐘至乾燥。隨後，以200,000 ×
g
離心樣本30分鐘，以恢復病毒粒子。IFV之活體外感染性、HA活性、蛋白質含量及膽固醇含量示於表2中。 在相同條件下，濃度高達12%之DIPE處理並不如50 mM MBCD般有效地移除膽固醇。12% DIPE自IFV移除約80%之膽固醇，而50 mM MBCD移除超過98%之膽固醇。如藉由比較PFU/mL所測定，此等兩種處理之IFV感染性與模擬處理相比分別減少32倍及2250倍。藉由兩種溶劑對膽固醇質移除為相對特異性的，因為在各種處理中蛋白含量減少小於20%。在定量血球凝集(HA)活性之能力內，50 mM MBCD以與2%至8% DIPE相同的程度影響HA活性。 表2
註：
a
與模擬處理相比之百分比。
用溶劑處理 45 分鐘：
除了MBCD處理持續時間自30分鐘延長至45分鐘之外，重複以上處理。結果展示於下表3中。 表3
註：
a
在37℃下翻滾旋轉30分鐘。
b
在37℃下翻滾旋轉45分鐘。
c
與模擬處理相比之百分比。 如同30分鐘處理一樣，與模擬處理相比，用50 mM MBCD處理45分鐘移除IFV之約97%膽固醇且使得病毒呈現低於超過10,000倍的活體外感染性。相比之下，10% DIPE (30分鐘處理)在移除膽固醇方面不太有效(約80%)，並使得活體外感染性降低約120倍。MBCD對HA活性之影響不顯著，而10% DIPE顯著地降低HA活性。與50 mM MBCD減少6%蛋白質含量相比，在10% DIPE處理之後蛋白質含量減少至50%。 本文中所呈現之兩組實驗表明，50 mM MBCD選擇性地移除膽固醇且使去脂質IFV呈現較低感染性，同時維持大部分蛋白質。然而，此等處理均不能完全地消除感染性且因此不能完全地使病毒不活化，故需要進一步最佳化程序以使流感病毒完全不活化。進一步最佳化可包括(但不限於)增加MBCD處理時間及用MBCD處理病毒第二時間段。
實例 2
用MBCD處理PRRSV選擇性地移除膽固醇、降低病毒感染性且維持大部分病毒蛋白質含量。
試劑 ：
此實例中所使用之PRRSV病毒株為RESP (中國，Jiangsu Academy of Agriculture Sciences)。所使用之宿主細胞為Marc-145 (中國，Wuxi AppTec, Shanghai)。除了在培養Marc-145細胞時使用的DMEM (Invitrogen)之外，所使用之其他試劑與上述實例1相同。
PRRSV 在 Marc-145 細胞中之增殖：
根據以下程序用PRRSV接種細胞。自在T-75燒瓶中生長之Marc-145細胞中移除培養基，在室溫下用5 mL PBS沖洗Marc-145細胞單層，並且在37℃下用1.5 mL胰蛋白酶/EDTA分離細胞。使細胞再懸浮於含有10% FBS之10 mL DMEM培養基中，且藉由在4℃下以800 rpm離心5分鐘而集結成塊。使細胞再懸浮於含有10% FBS之DMEM培養基中，並且將細胞密度調整至2.5 × 10
5
個細胞/毫升。將十五毫升之Marc-145細胞懸浮液接種至各T75燒瓶中，且將燒瓶在37℃以及5% CO
2
下放置且培育隔夜。 當Marc-145細胞匯合超過90%時，自T-75燒瓶移除DMEM，添加含有2% FBS之5 mL EMEM維持液，且以0.1之MOI用PRRSV感染細胞。在37℃以及5% CO
2
下培育燒瓶60分鐘至90分鐘，且每隔15分鐘輕輕地振盪。向各燒瓶中添加含有2% FBS之十毫升EMEM維持液，並且在37℃以及5% CO
2
下培育燒瓶96小時。在達到80%之CPE時(通常96小時)，收集培養物上清液以獲得PRRSV。
PRRSV 之純化
根據以下程序純化PRRSV。以3,000 rpm離心所採集之培養物上清液20分鐘以移除細胞碎屑，且採集上清液。以100,000 x
g
離心該上清液60分鐘，以使PRRSV集結成塊。使PRRSV離心塊再懸浮於適當體積之生理緩衝鹽水(PBS)中至約1 × 10
9
PFU/mL之力價。在-80℃下儲存100 μL經濃縮PRRSV之等分試樣。 使用以下程序針對活體外感染性滴定PRRSV。使用上述細胞培養物及轉移程序，使Marc-145細胞以1.5 × 10
5
個細胞/毫升之最終密度懸浮於含有10% FBS之DMEM中。向6孔培養盤之各孔中添加兩毫升之Marc-145細胞懸浮液，並且在37℃以及5% CO
2
下培育培養盤隔夜。在37℃水浴中使病毒樣本解凍，之後在4℃下以500 ×
g
離心10分鐘。使用EMEM作為稀釋緩衝液，製備病毒之1/10稀釋系列且在使用之前在4℃下進行儲存。 當Marc-145細胞匯合至少90%時，移除培養基，且向各孔中添加0.5 mL稀釋緩衝液及0.5 mL病毒稀釋液。對於陰性對照組，使用1.0 mL稀釋緩衝液。在添加各稀釋液之後立刻輕輕振盪培養盤。在37℃下、在5% CO
2
中培育培養盤60分鐘至90分鐘，且每隔15分鐘搖動培養盤。接著，在37℃下用含2.5%低熔點瓊脂糖之PBS溶液與稀釋緩衝液之3 mL的1:4混合物覆蓋各6孔培養盤之各孔。在室溫下培育培養盤15分鐘以使覆層混合物固化，且接著在37℃以及5% CO
2
下培育培養盤96小時。 使用以下程序使溶菌斑顯色。在溶菌斑充分形成之後(感染96小時後)，添加1 mL 4%多聚甲醛，且在室溫下培育培養盤1小時。棄去溶解的瓊脂糖，並且向各孔中添加0.5 mL之0.5%結晶紫。在與結晶紫一起培育15分鐘之後對溶菌斑數目進行計數，且基於稀釋因數轉換為力價。
PRRSV 之活體外增殖：
對於蛋白質及膽固醇分析而言，大於1 × 10
7
PFU/mL之PRRSV力價係較佳的。PRRSV-RESP病毒株在Marc-145細胞中之增殖產生力價＞ 1 × 10
8
PFU/mL之經濃縮病毒樣本。
PRRSV 之去脂質化：
根據以下程序進行溶劑處理及模擬處理。在艾本德試管中將約1 × 10
9
PFU/mL之經濃縮PRRSV儲備液之一百微升等分試樣稀釋至900 μL PBS中，以達到1.0 - 5.0 × 10
8
PFU/mL之最終力價。對於溶劑處理，添加含MBCD之PBS至所需濃度，或對於模擬處理添加相同體積之PBS。隨後用封口膜封蓋且密封艾本德試管。將所有樣本固持在預加熱至37℃之SHZ-82恆溫定軌氣浴震盪器(中國，Changzhou Guohua Appliance Co.)中。在37℃下以220 rpm之定軌旋轉速度使經溶劑處理樣本及經模擬處理樣本旋轉所需時間。在微離心機中使各別樣本旋轉1分鐘，且將含有IFV之上清液轉移至超離心機試管。以100,000 ×
g
(OPTIMA
TM
L-100XP；Beckman Coulter, Inc.，Indianapolis IN)離心試管30分鐘以使PRRSV集結成塊，且棄去上清液。使PRRSV離心塊再懸浮於200 µL PBS中，且在進一步分析之前在-80℃下進行儲存。
去脂質 PRRSV 之表徵 ：
根據製造商的說明使用BCA分析(PIERCE™ BCA蛋白質分析套組)來測定去脂質及經模擬處理之PRRSV的蛋白質含量。亦使用根據製造商之說明進行的膽固醇分析(Amplex® Red膽固醇分析套組，Life Technologies，Grand Island，NY)來測定膽固醇含量。使用與上文所闡述相同的程序來量測活體外感染性。
MBCD 之濃度依賴性：
在第一去脂質化實驗中，在37℃下用5 mM、10 mM、20 mM、30 mM及50 mM MBCD對PRRSV進行去脂質化，持續60分鐘。在超離心之後，使用上述程序，測試經模擬處理樣本及去脂質樣本在Marc-145細胞中之活體外感染性且測定蛋白質及膽固醇含量。去脂質PRRSV之感染性、蛋白質含量及膽固醇含量示於表4中。 表4
註：
a
與模擬處理相比之百分比。 起始PRRSV-RESP儲備液之力價為1.0 × 10
8
PFU/mL，將0.1 mL之儲備液與0.9 mL PBS以及適當量之MBCD混合。在37℃下以220 RPM定軌震盪60 min之後，藉由超速離心使病毒樣本集結成塊且將其懸浮於最終體積0.2 mL之PBS中。經模擬處理樣本之力價為1.6 × 10
7
PFU/mL (表4)，表明在模擬處理之後病毒活性恢復超過30%。MBCD處理以很大程度上濃度依賴性方式減少感染性及膽固醇含量，而在所有MBCD濃度下總蛋白質含量恢復88%至98%(
參見
表4)。與模擬樣本相比，在用50 mM MBCD處理之後，去脂質PRRSV保留約28%之起始膽固醇量，且PRRSV感染性減少約380倍，但同樣未完全消除。
去脂質 PRRSV 樣本之盲傳分析
去脂質PRRSV樣本中之一者(100 mM MBCD持續90分鐘)的力價在檢測限度內。此引發樣本中是否存在任何感染性病毒粒子之問題。為解決是否存在該等感染性病毒粒子之問題，用100 mM MBCD對新樣本進行去脂質90分鐘且使該新樣本經受下述盲傳分析。雖然對照PRRSV-RESP樣本具有1.6 × 10
6
PFU/mL之力價，但藉由盲傳分析未自用100 mM MBCD去脂質90分鐘之PRRSV樣本檢測到溶菌斑。用100 mM MBCD去脂質90分鐘很可能完全地使PRRSV-RESP不活化。 根據以下程序進行盲傳分析。將藉由上述程序製備之一百微升去脂質PRRSV樣本轉移至含有Marc-145細胞之6孔培養盤的各孔。在37℃下在5% CO
2
中培育培養盤4天。預進行三個連續冷凍-解凍循環來使細胞溶解，且收集含有PRRSV之上清液且在4℃下以800 rpm離心5 min。將四百微升上清液轉移至含Marc-145細胞之燒瓶。在37℃及5% CO
2
下培育燒瓶4天。重複冷凍-解凍循環，且再次如前所述收集、離心上清液，並將其轉移至含Marc-145細胞之燒瓶。再次重複冷凍-解凍循環，再次收集且離心上清液，且含有PRRSV之上清液在進一步使用之前在-80℃下冷凍。如上所述，使用Marc-145細胞測定最終所收集樣本之PRRSV力價。
實例 3
此研究之目標為經由利用甲基β環糊精(MBCD)之去脂質化方法來測定PRRSV病毒株ND 99-14之不活化的時間依賴性。自CTD, Inc. (Alachua, FL)購買呈粉末形式的MBCD。藉由向280 g MBCD中添加1000 mL水來製備300 mM儲備溶液，以產生儲備溶液。
病毒去脂質 化 ：
使用在2016年2月18日申請之同在申請中的申請案US第62/296,658號中所描述的PRRSV病毒株ND99-14來進行不活化動力學實驗。一般而言，方法涉及添加最終濃度為40 mM之MBCD以及在室溫及恆定混合下培育總共72小時。MBCD之添加發生在2個步驟中，添加20 mM開始不活化過程，24小時之後添加額外20 mM MBCD且在室溫及恆定混合下培育額外48小時。室溫在約20℃與約25℃之間，且最佳在約22℃與約24℃之間。 初始地向病毒中添加MBCD溶液之300 mM儲備液 (藉由向8.5 L病毒原液中添加567 mL MBCD溶液)直至20 mM之最終濃度。在室溫及以50 rpm混合下培育病毒24小時。在添加MBCD後的0小時、15分鐘、4小時、8小時、12小時、16小時、20小時及24小時處採集30 mL病毒。各時間點之等分試樣在進一步使用之前在4℃及-70℃下進行儲存。 在採集24小時樣本之後，將病毒轉移至新的容器。添加額外20 mM MBCD (向9.75 L病毒原液中添加650 mL MBCD)以達成40 mM之最終濃度。在室溫下培育病毒額外48小時。在第一次添加MBCD之後的30、36、42、48、60、72、84及96小時處採集30 mL病毒。各時間點之等分試樣在進一步使用之前在4℃及-70℃下進行儲存。
病毒量測：
向在96孔培養盤上培養之MARC145細胞中添加模擬不活化病毒及不活化病毒之十倍連續稀釋液(10
- 1
至10
- 9
)。在37℃及5% CO
2
下培育培養盤96小時，使活病毒感染細胞。藉由觀測由於病毒感染MARC145細胞而引起之細胞病變效應(CPE)來測定病毒複製。就CPE而言將含有病毒稀釋液之各孔評分為陽性或陰性，且使用Reed-Muench TCID
50
計算，將每一稀釋液之所得陽性或陰性孔數用於測定TCID
50
/mL。以與處理不活化病毒相同的介質及溫度條件(不添加不活化劑)來處理模擬不活化病毒。 使用培養在T-225燒瓶上之MARC145細胞來進行模擬不活化病毒及不活化病毒以及僅對照培養基的三次連續盲傳。向MARC145細胞之2天培養物中添加不活化樣本及對照樣本(將3 mL樣本添加至27 mL培養基中)，且在37℃及5% CO
2
下培育7天。目測燒瓶中是否存在CPE。就CPE而言將每一燒瓶評分為陽性(+)或陰性(-)且記錄。收集來自燒瓶之上清液，且將其添加至含有MARC-145細胞之2天培養物的一組新T-225燒瓶中，並且在37℃及5% CO
2
下培育7天。重複上述程序兩次，以獲得3次連續病毒繼代之CPE觀測值。 使用在如所示之2個不同溫度下儲存的樣本來測定在96小時培育期間的所有採集時間點之PRRS病毒力價。0表明力價不可檢測或未藉由PRRS活病毒TCID
50
測定分析測定。表5中所呈現之結果表明，在2步過程中添加40 mM能夠在力價為至少8 log
10
TCID
50
/mL的情況下使PRRS病毒不活化。較高力價表明在20 mM MBCD的情況下未完全失活，但在第二次添加MBCD使濃度升至40 mM之後，病毒係不可檢測的。該等結果亦顯示時間為不活化之較次要促成因素。在給定MBCD濃度的情況下，更長的培育時間並未提高不活化程度。在培育15分鐘之後，20 mM濃度之MBCD減少活病毒大致2.5 log，且檢測到之活病毒水準持續24小時保持不變。在培育24小時第二次添加20 mM MBCD使病毒在下一次樣本採集時間點時(30小時)不活化至不可檢測水準。在不同儲存溫度之40 mM MBCD存在下亦觀測到存活性差異。在-70℃下儲存之具有可檢測活病毒之時間點樣本比4℃下之彼等者具有至少少100倍的病毒。 表5
a
Log
10
TCID
50
/mL
實例 4
此研究之目標為在接種疫苗攻擊研究中評估實驗性不活化PRRSV疫苗之安全性及功效。基於疫苗減少肺病變及降低病毒血症水準之能力評估疫苗。所關注之疫苗特徵包括儲存溫度、劑量(1相較於2)及佐劑添加。在Veterinary Resources, Inc. (Cambridge, Iowa)之BSL-2設施中進行該研究。在愛荷華州立大學獸醫診斷實驗室(Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory) (Ames, Iowa)及南達科塔州立大學獸醫診斷實驗室(South Dakota State University Veterinary Diagnostic Laboratory) (Brookings, South Dakota)處進行實驗室分析。PRRSV血清反應陰性之六十(60)隻約3週齡的臨床上健康的斷奶小豬參與該研究。按遞減的體重來排序小豬，且形成10個區塊，每個區塊6隻動物。小豬被隨機分配至六個處理組中之一組(每組10隻小豬)。處理組包括一個未疫苗接種對照組(T01)及五個疫苗接種實驗性不活化PRRSV疫苗之組。藉助使用甲基-β-環糊精(MBCD)去脂質化之手段使疫苗不活化。組T02及組T03疫苗不含佐劑，且在2℃至8℃ (T02)或-20℃ (T03)下儲存。組T04及組T05疫苗含有MONTANIDE
™
Gel 01佐劑(Seppic)，且投與一次(T04)或兩次(T05)。組T06疫苗含有MONTANIDE
™
IMS 1313 VG N PR佐劑(Seppic)，且給予兩次。 經由頂載式飼料槽用標準市售藥用(CTC/DENAGARD
®
)開口飼料(NRC，2012)隨意餵養小豬。小豬經由乳頭飲水器隨意飲用乾淨的飲用水。在接種疫苗(DPV)後第10天，用EXCEDE
®
處理所有研究小豬。此外，用單次劑量之VITAL E
®
-500及EXCEDE
®
21 DPV之另一處理來處理所有小豬。根據標籤說明投與所有藥劑。
疫苗
PRRSV病毒株SD 11-21 (繼代程度84)用作當前研究之抗原。SD11-21為被調適用於在MARC-145細胞系之細胞培養物中生長經過84次繼代以及三回溶菌斑純化及蔗糖梯度離心之野生病毒株，如在2016年2月18日申請之同在申請中的申請案US第62/296,658號中所描述。在接種有連接至HILLEX II微載體(Pall Corporation, Port Washington, NY)之MARC-145的5 L BioBLU一次性生物反應器(Eppendorf, Hamburg, Germany)中，在補充有2%胎牛血清(Sigma, St. Louis, MO)及50 ug/mL健大黴素(Gentamycin) (Life Technologies, Grand Island, NY)之OPTI-MEM培養基(Life Technologies, Grand Island, NY)中產生第85次繼代(p85)。如藉由實例3中所描述之病毒滴定分析所測定，所收集之p85病毒原液的力價為7.3 log
10
TCID
50
。 在1 L瓶中，將19.7 mL之300 mM MBCD (Sigma, St. Louis, MO)儲備溶液添加至300 mL之SD11-21病毒原液中。在室溫及以50 rpm恆定混合下培育混合物24小時。在培育24小時之後，添加額外9.8 mL之MBCD儲備溶液，且在室溫及以50 rpm恆定混合下培育混合物額外24小時。在總共48小時之室溫培育的情況下，MBCD之最終濃度為30 mM。亦製備模擬不活化病毒原液，添加等量水代替MBCD，培育時間及混合與不活化病毒相同。模擬不活化病毒用作病毒量測分析之對照組。處理之後，模擬不活化病毒以6.5 log
10
TCID
50
/mL存在，而在MBCD不活化病毒溶液中未檢測到活病毒。病毒原液在進一步使用之前在4℃下進行儲存。 疫苗經調配以包括穩定劑及防腐劑。OPTI-MEM
®
I血清減少的培養基用作摻合稀釋劑。佐劑包括MONTANIDE™ Gel 01 (Seppic)及MONTANIDE™ 1313 VG N PR (Seppic)之市售調配物。對照組產品為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)之市售製劑(Corning Cellgro, Mediatech Inc.)。無佐劑之疫苗含有去脂質病毒、25%穩定劑B、作為防腐劑之25 μg/ml健大黴素及摻合稀釋劑。含佐劑之疫苗含有20%之指定佐劑。穩定劑B含有2.5% D-甘露醇(Sigma)、1.2% A型明膠(Fisher, Pittsburgh, PA)、1% NZ胺酪蛋白水解產物(Sigma)、5%蔗糖(Sigma)及pH 7.0至7.2之含6.2%海藻糖(Fisher)之超純水(Life Technologies)。
接種疫苗及攻擊
參與研究之60隻小豬中之每一者在攻擊前第35天接種疫苗。在頸部右側給T01至T05中之小豬注射呈1.0 mL肌肉內劑量之指定治療劑。給T06中之小豬注射1.5 mL。T01至T03及T05以及T06中之小豬在第14天後(攻擊前第-21天)以相同方式再次接種疫苗。在0 DPC時，藉由在攻擊前立即解凍病毒株NADC-20之冷凍等分試樣來製備攻擊物質。在於具有伊格爾鹽(Earle's salts)及來自Mediatech, Inc.之L-麩醯胺酸(MEM)的伊格爾最低必需培養基(Minimum Essential Medium Eagle)中稀釋之後，力價經測定為1.26×10
5 . 0
TCID
50
/ml。每一小豬以物理方式被限制為頭朝上，以便攻擊。使用3 mL非魯爾(luer)鎖定注射器經鼻內遞送2 mL劑量，每鼻孔大致1 mL。
結果
在14 DPC時，在每一位點程序將動物人道地安樂死。切下肺臟，且由對處理方式不知情之研究調查人員評分。以目測及觸診兩種方式檢測七個肺葉中每一者之由PRRSV引起的整體特徵病變。每一肺葉中病變/固結的量經評分為肺葉之0與100%之間的實際值。將每一肺葉之得分鍵入重量公式，以計算肺病變之百分比。根據下式計算總肺病變之百分比：總肺病變之百分比 = {(0.10 × 左頂端) + (0.10 × 左心臟) + (0.25 × 左隔膜) + (0.10 × 右頂端) + (0.10 ×右心臟) + (0.25 ×右隔膜) + (0.10 ×中部)}。 此外，在進一步分析之前，使用反正弦平方根轉換總肺病變之百分比。藉由包括固定處理因素(SAS中之混合程序)及隨機區塊因素之混合線性模型來分析經轉換數據。 肺病變得分之統計學分析結果概述於表6中。主要處理作用係統計顯著的(P = 0.0003)。與對照組(T01)之比較表明Gel 01佐劑組(T04及T05)中顯著較低的(P ＜ 0.05)肺損害%。又，投與兩次且儲存在2℃至8℃下之非佐劑疫苗(T02)相比於用儲放在-20℃下之疫苗處理的類似組(T03)，產生顯著更低的(P ＜ 0.05)病變得分。 表6. 平均肺病變得分 - 經反正弦轉換之肺損害% (主要處理作用：P = 0.0003)
*在P ＜ 0.05的情況下，T01對比T04及T05顯著地不同
1
未經轉換之平均值
2
經反向轉換之平均值 在攻擊前第-35天及第-21天採集血液樣本以用於測定病毒血症水準。此外，在0、3、7、10及14 DPC時採集血液樣本以用於測定病毒血症水準。使用qRT-PCR技術測試樣本是否存在PRRS病毒核酸。 在非正態分佈的情況下，在分析之前將血清學及病毒血症數據轉換為log
10
單位。使用重複量測混合模型(混合程序)來分析經轉換值。統計模型包括處理、時間及作為固定因素之處理×時間相互作用。區塊作為隨機因素包括於模型中。若處理×時間相互作用顯著(P ＜ 0.05)，則評估處理時間內之作用。若相互作用並不顯著，則評定主要處理作用。呈現最小均方值(經反向轉換)及標準誤差。 病毒血症水準之分析概述於表7中。在PRRSV攻擊之前未在任一小豬中觀測到病毒血症，從而確證疫苗病毒係不活化的。自統計分析排除攻擊前之時間點。在攻擊之後，處理×天數相互作用並不顯著(P = 0.0974)，因此評估主要處理作用。處理作用顯著(P = 0.0107)。與對照組(T01)之比較表明所有佐劑疫苗組(T04、T05及T06)中顯著較低的(P ＜ 0.05)水準。之前進行之對比中無一者為統計顯著的。 表7. 病毒血症 - 3、7、10及14 DPC時之PRRSV基因組複本/毫升之幾何平均值(經log
10
轉換) (主要處理作用：P = 0.011；處理×天數相互作用：P = 0.097)
*在P ＜ 0.05的情況下，T01對比T04、T05、T06顯著地不同。
1
未經轉換之log
10
平均值
2
經反向轉換之平均值
結論
與對照組相比，用經一次劑量或兩次劑量之MBCD不活化的Gel 01佐劑疫苗接種小豬有效地顯著減少肺病變及病毒血症水準兩者。在用儲存在2℃至8℃下之經其他MBCD不活化之疫苗(T02及T06)接種的小豬中，肺病變在數值上減少。由於肺病變得分存在變化，故此等差異在P ＜ 0.05水準下並不顯著。含有佐劑(MONTANIDE
™
Gel 01或1313)之所有MBCD疫苗顯著地減少病毒血症。在將來的研究中，當NADC-20病毒株用作攻擊物質以檢測肺病變及病毒血症兩者中有意義的生物差異時，可能需要更大的樣本容量。 儲存溫度似乎對疫苗功效具有影響。相比於儲存在2℃至8℃下之疫苗，將疫苗儲存在-20℃下對疫苗功效具有負面影響。 在疫苗接種含Gel 01佐劑之經MBCD不活化之疫苗的小豬中，在第一次接種14天之後添加額外接種疫苗未進一步改良疫苗功效。 將Gel 01佐劑包括於經MBCD不活化之疫苗中並不影響疫苗功效。 如藉由在第二次接種疫苗之後，Seppic MONTANIDE
™
Gel 01佐劑組中無接種疫苗後全身性反應、無注射位點病變且僅出現短暫(1或2天)發熱反應所證實，經MBCD不活化之疫苗對生長豬類係安全的。