PT1427817E - Multiplicação de vírus numa cultura celular - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MULTIPLICAÇÃO DE VÍRUS NUMA CULTURA CELULAR" A invenção refere-se a processos para a multiplicação de vírus seleccionados em cultura celular, em que se infectam células MDCK com um vírus e, após a infecção, se cultivam as células em cultura celular sob condições que possibilitam uma multiplicação dos vírus e, simultaneamente, uma multiplicação adicional específica das células, de, pelo menos, 2 vezes. A invenção refere-se, além disso, à utilização dos vírus assim obtidos ou das proteínas expressas por estes, para a preparação de medicamentos e meios de diagnóstico.

As doenças infecciosas, em particular as infecções virais, têm, como antes, grande importância médica. Persiste, por conseguinte, inalterada a necessidade de disponibilizar de processos melhores, por meio dos quais possam ser multiplicados vírus em cultura, de modo a possibilitar a investigação dos vírus e a preparação de vacinas. Em particular, a produção de vacinas contra infecção virai necessita, habitualmente, da multiplicação e isolamento de grandes quantidades do vírus em questão.

Na dependência do vírus correspondente, são utilizados no estado da técnica, diferentes sistemas de hospedeiro e condições de cultivo para a multiplicação de vírus. Como sistemas de hospedeiro são utilizados animais hospedeiros padronizados, ovos embrionários de galinha, culturas primárias de células de tecidos ou linhas celulares estabelecidas permanentes (Rolle e 1

Mayr [editor], Mikrobiologie, Infektions und Seuchenlehre, 1978; Mahy [editor], Virology, A Practical Approach, 1985; Horzinek [editor] Kompendium der algemeinen Virologie, 1985). A multiplicação de vírus em ovos embrionários de galinha está associada a elevados dispêndios de tempo e custos. Os ovos têm que ser chocados antes da infecção e, em seguida, testados quanto à viabilidade dos embriões. Apenas os embriões viáveis estão em condições de multiplicar vírus. Após a infecção bem sucedida com multiplicação do vírus e incubação adicional, os embriões são, finalmente, mortos. Os vírus isolados a partir dos ovos são libertos de impurezas e concentrados. Uma vez que multiplicação de vírus em ovos incubados não é possível sob condições estritamente estéreis, têm que ser eliminados microrganismos patogénicos contaminantes dos isolados, se se pretende que estes sejam para estar disponíveis para uma aplicação médica ou de diagnóstico.

As células hospedeiras eucariotas de linhas celulares definidas oferecem uma alternativa à multiplicação de vírus em ovos de galinha (Gregersen, J.P., Pharmazentische Biotechnologie, Kayser e Muller [editor], 2000, páginas 257 -281). Inúmeras linhas celulares não são, no entanto, adequadas para a preparação de vacinas ou preparados semelhantes utilizáveis em medicina, devido a contaminações persistentes de vírus estranhos ou à ausência de demonstração para a imunidade do vírus, origem pouco clara e história.

Os processos utilizados no estado da técnica para a multiplicação de vírus em cultura celular apresentam todos o mesmo esquema de base, em que, em primeiro lugar se multiplicam as células na ausência do vírus, em seguida é adicionado o vírus 2 e é multiplicado sob condições em que não ocorre qualquer multiplicação significativa das células e a cultura é recolhida após multiplicação máxima dos vírus.

Por exemplo, as células Vero derivadas de células renais de macacos foram empregues para a multiplicação de vírus individuais (poliovírus, vírus da raiva) para a preparação de vacinas. Estas células são obteníveis em diversos bancos de células (como por exemplo a American Type Culture Collection, ATCC) e são além disso postas à disposição pela Organização Mundial de Saúde (OMS) a partir de um banco de células testado para a investigação médica.

Estas células Vero, são linhas aderentes que necessitam de superfícies de suporte para o seu crescimento, como por exemplo frascos de vidro, placas de cultura de plásticos ou frascos de plástico. Numa cultura das células correspondentes em fermentador, o crescimento ocorre nos assim designados microssuportes, isto é, em regra pequenas esferas plásticas, sobre cuja superfície podem crescer as células. É conhecido que, a par das células Vero mencionadas acima, por exemplo, também células aderentes BHK ("Baby Hamster Kidney") e células aderentes MDCK ("Mandine Darby Canine Kidney") e outras células podem multiplicar activamente vários tipos de vírus, e são empregues para a utilização como substrato para a preparação de produtos farmacêuticos ou a sua utilização está a ser considerada. Na linha celular MDCK ATCC CRL34 (NBL-2) foram também multiplicados experimentalmente, a par de vírus influenza, o vírus da estomatite vesicular, o vírus de Coxsakkie B5 (mas não ο B3 ou B4), o reovírus de tipo 2 e 3, o adenovírus de tipo 4 e 5, bem como vírus vaccinia. Todas as publicações 3 correspondentes direccionam-se, no entanto, exclusivamente para culturas aderentes (conferir informação do produto da ATCC). Para a multiplicação de maiores quantidades de células é, no entanto, preferida a cultura em suspensão, em que até ao presente, apenas as células e algumas células transformadas podem ser multiplicadas neste sistema (Lindl [editor], Zell-und Gewebekultur, 2000, páginas 173 e seguintes). No documento WO 97/37000 é revelada uma linha celular MDCK que pode crescer em suspensão em meio de cultura livre de proteína. É igualmente descrita a multiplicação de vírus influenza sob utilização das células hospedeiras correspondentes. A par da selecção de um sistema de células ou de hospedeiro adequados, as condições de cultura sob as quais uma estirpe virai é multiplicada são, igualmente, de grande importância para o alcançar de um rendimento elevado aceitável. Para maximizar o rendimento da estirpe virai desejada, tanto o sistema hospedeiro como também as condições de cultivo têm, por conseguinte, que ser especificamente adaptadas para alcançar condições ambientais favoráveis para a estirpe virai desejada. Para alcançar um rendimento elevado das diferentes estirpes virais é, por conseguinte, necessário um sistema que crie condições de crescimento óptimas. Muitos vírus estão restringidos a sistemas de hospedeiro especiais, dos quais alguns são muito ineficientes relativamente ao rendimento virai. Os sistemas de produção eficientes baseiam-se, além disso, frequentemente, em adaptações da população de vírus ao respectivo sistema de cultura, frequentemente sob utilização de fases intermediárias com utilização de outros sistemas de hospedeiro e sob aplicação de aditivos proteicos - maioritariamente soro - de origem animal ou humana. 4 além disso,

Para pessoas adequadamente experientes é, conhecido que quase todas as culturas celulares, após multiplicação inicial sob adição de soro ou outros factores de crescimento, podem ser mantidas, pelo menos, durante um certo tempo sem aditivos de soro ou proteína. Assim, por exemplo, uma cultura celular qualquer pode ser transferida no momento da infecção virai ou pouco antes da colheita, para meio sem soro ou adição de proteína e ser subsequentemente mantida até à colheita. Isto é prática usual desde há anos, para obter material virai para vacinas ou testes de diagnóstico em condições que evitem ou reduzam proteínas estranhas. As vacinas celulares que foram mantidas sem esta prática durante a fase de infecção sob adição de soro, terão maiores problemas para serem admitidas para a aplicação em humanos ou animais, uma vez que os componentes do soro quase não se deixam eliminar de modo suficiente (conferir recomendações WHO "Proposed requirements for Measles Vaccine" (Live), Requirements for Biological Substances N°. 12, revisto 1978).

Também é conhecido que alguns vírus apenas se deixam multiplicar muito mal ou nem se deixam multiplicar em meios contendo proteína. Neste caso trata-se de vírus que para a sua multiplicação em sistemas de cultura dependem da actividade de enzimas que cindem proteínas (proteases) . Uma vez que estas proteases são competitivamente inibidas pelas adições de proteína ao meio, proíbe-se aqui, logicamente, a adição de proteínas pelo menos a partir do momento da infecção ou da fase de produção. Exemplos para vírus que habitualmente têm que ser multiplicados sob adição de proteases e, com isso, para o alcançar de bons rendimentos o mais possível sem adições de proteína ao meio de infecção, são os vírus influenza e rotavírus. Outros tipos de vírus, como p. ex. paramixovírus e 5 reovírus podem igualmente aproveitar, na multiplicação, meios o mais pobres possíveis em proteína (Ward et ai. (1984) J. Clin. Microbiol. 748 - 753 "Efficiency of Human Rotavirus Propagation in Cell Culture"). 0 documento WO 96/15231 propõe cultivar células Vero e outras células em cultura celular em gue deve ser utilizado um meio gue não precisa das adições de proteína usuais.

Outros vírus deixam-se multiplicar notoriamente mal, independentemente da composição do meio e das condições de cultura, por exemplo vírus da raiva, rotavirus, pneumovírus ou vírus da hepatite A (Provost e Hillemann, Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 160: 213 - 221 (1979); e Rolle e Mayr, em local citado).

Após a multiplicação do vírus, este é habitualmente isolado da cultura. São conhecidos inúmeros processos do estado da técnica por meio dos guais podem ser isolados vírus, produtos de expressão virai ou outras proteínas após a multiplicação, a partir do meio e/ou das células (Gregersen, em local citado; Mahy, em local citado; Reimer C., et al., Journal of Virology, Dez. de 1967, pág. 1207 - 1216; Navarro del Canizo, A., et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, vol. 61, 1996, 399; Prior, C., et al., BioPharm, Out. de 1996, 22; Janson, Jan-C. e Rydén, L. [editor], Protein Purification, 1997; e Deutscher M. [editor], Methods in Enzymology, vol. 182, 1990).

Com base no decurso esquemático dos processos (multiplicação celular, multiplicação do vírus, colheita), os processos conhecidos do estado da técnica possibilitam, no entanto, somente uma multiplicação do vírus e colheita limitadas. 6 0 documento WO 01/02548 descreve um processo para a multiplicação de organismos liticos num biorreactor de fibras ocas. O problema que está na base da presente invenção consiste, por conseguinte, em proporcionar processos para a multiplicação de vírus em cultura celular que possibilitem uma maior multiplicação virai e colheita simplificada de maiores quantidades de vírus.

Este problema foi agora é solucionado pelo processo para a preparação de um medicamento ou meio de diagnóstico compreendendo passos de: (a) infectar células MDCK com um vírus; (b) cultivar, as células MDCK, após a infecção em cultura celular cultivam-se sob condições que possibilitam uma multiplicação dos vírus e, simultaneamente, uma multiplicação adicional específica das células, de pelo menos 2 vezes, por aumento do volume total de cultura, em que o vírus é seleccionado do grupo consistindo de vírus da meningoencefalite transmitido por carraça (TBE), bem como das formas orientais apresentadas (Russa ou outras), vírus japonês da encefalite, vírus da dengue, vírus da febre amarela, vírus da raiva, vírus da hepatite A ou rotavírus.

De um modo surpreendente consegue-se um processo substancialmente melhorado para a multiplicação de vírus em cultura celular quando o decurso do processo é fundamentalmente 7 alterado no sentido de ser possibilitado um crescimento das células também durante a multiplicação do vírus. Isto tem a vantagem de poder obter-se significativamente mais vírus em tempo mais curto. Além disso é melhorado o aproveitamento das instalações para a cultura celular.

De acordo com a invenção, a cultura celular é efectuada de modo a que as células aumentem em pelo menos 2 vezes ou 5 vezes, de um modo preferido, pelo menos, 10 vezes, após a infecção. A multiplicação das células também faz com que a cultura possa ser efectuada durante um período de tempo de pelo menos 7 dias após a infecção, no entanto, de um modo preferido, as células e os vírus são multiplicados durante pelo menos 21, 28 ou 35 dias em cultura celular.

Consoante a condução do processo, pode ser vantajoso, durante a multiplicação dos vírus e das células, adicionar meio fresco, concentrado de meio ou componentes do meio, pelo menos uma vez, ou transferir pelo menos uma parte dos vírus e células para um recipiente de cultura que contenha meio fresco, concentrado de meio ou componentes do meio. É no, entanto preferido, adicionar meio fresco, concentrado de meio ou componentes do meio, pelo menos, uma vez durante a multiplicação dos vírus e das células. A adição do meio, do concentrado de meio ou dos componentes do meio é, de um modo preferido, repetida pelo menos uma vez ou várias vezes.

De acordo com uma forma de realização preferida adicional da presente invenção, durante a cultura das células infectadas, 8 o meio de cultura é trocado por meio de cultura fresco ou o volume de cultura é aumentado por adição de meio de cultura fresco. A troca ou a suplementação do meio de cultura também pode efectuar-se por concentrado de meio ou componentes do meio, como, por exemplo, aminoácidos, vitaminas, fracções lipidicas, fosfatos ou substâncias semelhantes. Estes passos também podem ser realizados várias vezes durante a cultura das células.

Isto possibilita o aumento do rendimento em vírus por colheitas múltiplas de vírus a partir de sobrenadantes de cultura, bem como, em particular, por aumento do volume total de cultura e, neste caso, também do número de células por adição de meio fresco. Colheitas múltiplas correspondentes representam uma vantagem significativa do processo de acordo com a invenção, uma vez que o rendimento do sistema é claramente melhorado.

No processo da presente invenção são utilizadas células MDCK para a multiplicação dos vírus.

No caso das células que chegam à aplicação nos processos de acordo com a invenção, trata-se de células que têm a propriedade de crescer em cultura em suspensão ou como células aderentes. São designadas como células que crescem em cultura em suspensão, as linhas que também podem crescer na ausência de partículas de suporte em fermentador à escala técnica, o que apresenta vantagens consideráveis face a outras células no caso do manuseamento das culturas, no caso do aumento da escala das culturas e no caso da multiplicação de vírus. São conhecidos, no estado da técnica, processos para a adaptação de células MDCK à cultura em suspensão (documento WO 97/37000). As células MDCK podem derivar, por exemplo, da linha celular MDCK33016. 9

De acordo com uma forma de realização adicional da invenção, são utilizadas células que apresentam a propriedade de, tanto antes como após a infecção, crescerem de modo aderente e como cultura em suspensão. Esta forma de realização apresenta a vantagem particular de poder ser utilizado um sistema de cultura celular e, com isso, também um meio para o desenvolvimento das células desde a escala laboratorial até à grande produção técnica. Sistemas correspondentes simplificam, consideravelmente, a autorização de medicamentos, uma vez que apenas tem que ser testada a segurança de um sistema individual de cultura celular. 0 vírus pode apresentar um genoma de ácido ribonucleico em cadeia dupla (ARNds) ou de ácido ribonucleico em cadeia única. As moléculas de ácido ribonucleico de cadeia única podem apresentar neste caso a polaridade de um ARN mensageiro ("ARNm"), ARN(+), ou ser de polaridade oposta, ARN(-).

No caso do vírus, pode tratar-se de um vírus mencionado abaixo. Os vírus que encontram aplicação no âmbito do processo de acordo com a invenção podem ser obtidos de diferentes colecções como, p. ex., a ATCC (American Type Culture Collection) ou a ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures) . Em regra, recorre-se, neste caso, a estirpes de produção existentes ou estirpes de vírus já previamente multiplicadas em cultura celular. Além disso podem ser estabelecidos isolados próprios, desde que estes se adeqúem melhor para a respectiva aplicação. De acordo com uma forma de realização, o vírus que é empregue no processo é seleccionado do grupo consistindo de: vírus da hepatite A, vírus da encefalite japonesa, vírus da meningoencefalite transmitida por carraça, 10 bem como das formas orientais apresentadas (Russa ou outras), virus do dengue, vírus da febre amarela.

De acordo com uma forma de realização adicional da presente invenção, o genoma do vírus pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que codifique para uma proteína heteróloga, funcional, com um tamanho de pelo menos 10 kDa. No estado da técnica são conhecidos inúmeros vectores para a expressão de proteínas heterólogas, que se baseiam num genoma virai, por exemplo num genoma de herpes, vaccinia ou de adenovírus (Galler R. et al., Braz. J. Med. Biol. Res., 1997 Fev., 30 (2) : 157 -68; Willemse MJ. et al., Vaccine 1996 Nov., 14 (16) : 1511 - 6; Efstathiou S.; Minson AC., Br. Med. Buli., 1995 Jan. 51 (1): 45 - 55; Hammerschmidt W., Curr. Opin. Mol. Ther., 2000 Out., 2 (5) : 532 - 9; Graham Fl. ; Prevec, L., Mol. Biotechnol., 1995, Jun; 3 (3) : 207 - 20; Carroll MW. , Moss B.; Curr. Opin. Biotechnol., 1997 Out.; 8 (5) : 573 7; Wojcik J., Acta.

Microbiol. Pol., 1995, 44 (2): 191 - 6; Ramirez JC. et al., J.

Virol., 2000 Ago. ; 74 (16): 7651 - 5; Hagen, Anna, et al.,

Biotechnol. Prog., 1996, 12, 406 - 408; Huyghe, Bernard, et al., Human Gene Therapy, 1995 Nov., 6: 1403 - 1416).

No âmbito da presente invenção também estão compreendidos processos para a multiplicação de vírus em que o genoma virai foi alterado por adição ou substituição de sequências, de forma a que o genoma codifique para uma proteína heteróloga, funcional, portanto não pertencente ao vírus original, com um tamanho de pelo menos 10 kDa. De acordo com a invenção, neste caso, uma proteína designa-se como uma proteína funcional quando a proteína está pelo menos em condições de desencadear uma reacção imunitária contra essa proteína. Naturalmente, a proteína pode apresentar outras actividades biológicas a par da 11 actividade imunológica, por exemplo actuar como enzima ou citocina.

Os vírus que são empregues no processo de acordo com a invenção podem apresentar além disso delecções de genes individuais no genoma virai. Assim, podem, por exemplo, ser delectados de forma específica genes de um vírus que deverá ser utilizado como vacina, que codifiquem para factores de patogenicidade. As delecções correspondentes compreendem, de um modo preferido, não mais dos que 500 ou 1000 nucleótidos.

Naturalmente o vírus empregue para o processo de acordo com a invenção pode também compreender um genoma virai completo. A multiplicação dos vírus na cultura em suspensão pode efectuar-se de acordo com o processo de acordo com a invenção na presença ou ausência de soro no meio. Resultam vantagens particulares pela ausência de soro, uma vez que estas condições de cultura celular simplificam a autorização da utilização médica de produtos assim produzidos. Por se prescindir de adições de soro ao meio de cultura são, além disso, evitados passos de purificação dispendiosos para a eliminação das contaminações do meio. Com isso, conseguem-se, assim, também alcançar melhorias relativamente à qualidade do produto e também se evitam custos.

Como "meio livre de soro" entende-se no âmbito da presente invenção, um meio que não apresenta quaisquer adições de soro do tipo humano ou animal. Às culturas correspondentes podem ser adicionadas a quantidades definidas de determinadas proteínas que não tenham o 12 efeito de perturbar a cultura e subsequente utilização. Um meio de cultura deste tipo é designado como meio quimicamente definido. A este meio são adicionadas proteínas seleccionadas, como péptidos mitogénicos, insulina, transferrina ou lipoproteínas, que podem ser obtidos de diferentes fabricantes, conhecidos do especialista. Por péptidos mitogénicos entendem-se no âmbito da presente invenção de um modo preferido hidrolisados de plantas, p. ex., hidrolisado de proteínas de feijões de soja ou lisados de proteínas de outras plantas de cultura.

De acordo com uma forma de realização preferida de um modo particular, os meios são no entanto completamente "livres de proteína". Por "livres de proteína" entendem-se culturas em que a multiplicação das células ocorre sob exclusão de proteínas, factores de crescimento, outro aditivos proteicos e proteínas que não sejam do soro. Naturalmente, as células a crescer em culturas deste tipo contêm, elas próprias, proteínas.

Os meios conhecidos livres de soro são por exemplo meio de Iscove, meio ultra-CHO (BioWhittaker) ou EX-CELL (JHR Bioscience). Meios contendo soro usuais são, por exemplo, meio basal de Eagle (BME) ou em Meio Mínimo Essencial (MEM) (Eagle, Science 130, 432, (1959)) ou meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM ou EDM), que são normalmente empregues com até 10% de soro fetal de vitelo ou aditivos semelhantes. Também são bastante conhecidos, no estado da técnica, meios livres de proteína, como por exemplo PF-CHO (JHR-Bioscience), meio quimicamente definidos, como ProCHO 4CDM (Bio Whittaker) ou SMIF 7 (Gibco/BRL-Life Technologies), e péptidos mitogénicos, como por exemplo Primactone, Pepticase ou HyPep™ (todos de Quest International) ou hidrolisado de lactoalbumina (Gibco e outros fabricantes) . Em particular os aditivos do meio que se baseiam 13 em hidrolisados de plantas apresentam a vantagem particular de poder ser excluída uma contaminação com vírus, micoplasmas ou agentes infecciosos desconhecidos.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, durante a cultura das células infectadas, é adicionado meio fresco, concentrado de meio ou componentes do meio como por exemplo, aminoácidos, vitaminas, fracções lipídicas ou fosfatos. 0 processo de acordo com a invenção pode ser efectuado, neste caso, num sistema de perfusão ou num sistema de lotes. Como "sistemas de perfusão" designam-se sistemas de cultura em que meio é continuamente alimentado e eliminado. Em alternativa a isso as células podem ser cultivadas também num "sistema de lotes", em que o sistema é conduzido como sistema consideravelmente fechado sem adição de meio desde a inoculação até à colheita.

As condições da cultura celular a utilizar para a aplicação desejada (temperatura, densidade celular, valor de pH, etc.) são variáveis numa gama muito larga devido à adequação da linha celular utilizada de acordo com a invenção e podem ser adaptadas às necessidades da aplicação. Por conseguinte, as informações seguintes representam somente valores de referência. A multiplicação das células antes da infecção pode ser realizada a partir de culturas de sementeira ou pequenos recipientes de cultura num sistema de perfusão sob utilização de processos de retenção usuais, como por exemplo centrifugação ou filtração. Mostrou-se como sendo vantajoso trocar o meio de cultura no caso da propagação das células num sistema deste tipo com uma taxa de até 3 enchimentos de fermentador por dia. As 14 células podem ser multiplicadas sob estas condições até densidades celulares de, por exemplo, 2 x 107. O controlo da taxa de perfusão efectua-se durante o cultivo de um modo preferido com base em parâmetros conhecidos do especialista como, por exemplo, número de células, teor em glutamina, em glucose ou em lactato.

No caso da utilização de um sistema de lotes podem alcançar-se, por exemplo, densidades celulares até cerca de 8 -25 x 105 células/mL no caso de uma temperatura de 37 °C e um tempo de geração de 20 - 30 horas.

Além disso, as células também se podem multiplicar de acordo com a invenção antes da infecção, num sistema de lotes com alimentação. Como "sistema de lotes com alimentação" designa-se, no âmbito da presente invenção, um sistema de cultura em que as células são, em primeiro lugar, cultivadas num sistema batch e o esgotamento dos nutrientes (ou de uma parte dos nutrientes) no meio é compensado através de uma alimentação controlada de nutrientes concentrados. Num sistema de lotes com alimentação as células podem ser multiplicadas, por exemplo, até uma densidade celular de cerca de 1 - 10 x 106.

Além disso mostrou-se como vantajoso ajustar o valor de pH do meio na multiplicação das células antes da infecção, para um valor entre pH 6,6 e pH 7,8 e, de um modo preferido, em particular para um valor entre pH 7,2 e pH 7,3. A cultura das células antes da infecção efectua-se, de um modo preferido, a uma temperatura entre 30 °C e 40 °C e, de um modo mais preferido, a uma temperatura entre 33 °C e 37 °C. A pressão parcial de oxigénio é ajustada na cultura antes da 15 infecção, de um modo preferido, para um valor entre 25% e 95% e, de um modo mais preferido, para um valor entre 35% e 60%. Os valores da pressão parcial de oxigénio indicados no âmbito da invenção baseiam-se na saturação do ar.

Para o processo de acordo com a invenção mostrou-se como vantajoso que a infecção das células se efectuasse a uma densidade celular, de um modo preferido, de cerca de 8 - 25 x 105 células/mL no sistema de lotes ou, de um modo preferido, de cerca de 5 - 20 x 106 células/mL no sistema de perfusão. No processo de acordo com a invenção, as células podem ser infectadas com uma dose virai (valor m.o.i., "multiplicity of infection"; correspondente ao número em unidades virais por célula no momento da infecção) entre 1CT8 e 10, de um modo preferido, entre 0,0001 e 0,5. A cultura das células após a infecção pode efectuar-se igualmente no sistema de perfusão, de lotes ou lotes com alimentação. Neste caso podem ser empregues as mesmas condições de cultura como anteriormente (temperatura entre 30 °C e 40 °C, pressão parcial de oxigénio entre 5% e 100%, valor de pH do meio entre pH 6,6 e pH 7,8).

De acordo com a invenção são disponibilizados ainda processos adicionais que compreendem uma colheita e isolamento dos vírus ou das proteínas produzidas por estes. No caso do isolamento dos vírus ou das proteínas, as células são separadas do meio de cultura por métodos padronizados, como, por exemplo, por separação, filtração ou ultrafiltração. Em seguida, os vírus ou as proteínas são concentrados de acordo com métodos bastante conhecidos do especialista, como, p. ex., centrifugação de gradiente, filtração, precipitação, cromatografia, e 16 semelhantes, e em seguida são purificados. De acordo com a invenção, é preferido, além disso, que os vírus sejam inactivados durante ou após a purificação. Pode efectuar-se uma inactivação dos vírus, por exemplo, por β-propiolactona ou por formaldeído em qualquer ponto dentro do processo de purificação.

Os processos de acordo com a invenção adequam-se de uma maneira particular para a preparação de medicamentos, em particular, para a preparação de vacinas e de meios de diagnóstico. A preparação do medicamento pode compreender, neste, caso a multiplicação e o isolamento de um vírus ou de proteína produzida por este e a mistura com um adjuvante, substância auxiliar, tampão, diluente e/ou suporte de medicamento adequados. Por adjuvantes entendem-se, no âmbito da presente invenção, substâncias que aumentam a resposta imunitária. Entre estas contam-se, por exemplo, hidróxidos de diferentes metais, como hidróxido de alumínio, componentes da parede celular bacteriana, óleos ou saponinas. As vacinas adequam-se, em particular, para tratamentos profilácticos ou terapêuticos de infecções virais. A imunogenicidade e/ou eficácia das vacinas correspondentes pode ser comprovada por métodos conhecidos do especialista como, p. ex., experiências de protecção com infecções de carga ou determinação do título de anticorpo necessário para a neutralização. A determinação da quantidade de vírus ou da quantidade em anticorpos produzidos pode efectuar-se, por exemplo, por determinação do título ou da quantidade em antigénio de acordo com processos padronizados bastante conhecidos do especialista como, p. ex., titulação de vírus, 17 teste de hemaglutinaçao, determinação de antigénios ou determinação de proteínas de diferentes tipos.

Os processos de acordo com a invenção adequam-se além disso para a preparação de uma composição de diagnóstico. As composições podem compreender um vírus obtenível pelos processos ou uma proteína daí produzida. Em combinação com os aditivos usuais do estado da técnica e reagentes de detecção podem utilizar-se estas composições como teste de diagnóstico, que são adequadas para a detecção de vírus ou anticorpos anti-vírus.

Nos exemplos seguintes forma determinados todos os títulos virais de acordo com o método de diluição final conhecido do especialista e a determinação estatística do ponto final a 50% de acordo com Spearman-Kaerber (conferir Horzinek, Kompendium der allegemeiner Virologie, 2o. edição, 1985, Parey Verlag, páginas 22 - 33). Foram infectadas, respectivamente, 8 culturas de teste em placas de microtitulação com quantidades de 100 pL de uma diluição de vírus, em que foram empregues a diluições do material virai de 10_1 até 10~8. A avaliação das titulações de vírus efectuou-se microscopicamente, com base no efeito citopático das culturas de teste, ou com auxílio de métodos de detecção imunológicos, sob utilização de anticorpos específicos para os vírus. A ligação dos anticorpos específicos para os vírus foi tornada visível, como imunofluorescência, com anticorpos marcados com fluoresceína ou sob utilização de anticorpos secundários marcados com biotina e um complexo de amplificação de estreptavidina/biotina/peroxidase, bem como um corante precipitável (Gregersen et al., Med. Microbiol. Immunol., 177: 91 - 100). A unidade dos títulos virais é a dose de cultura infecciosa a 50% (KID50) . As células de detecção específicas para os vírus respectivamente utilizadas para os 18 diferentes tipos de vírus e - desde que seja o caso - os processos de detecção imunológicos são indicados nos exemplos específicos para os vírus.

Exemplos

Exemplo 1: Manuseamento do sistema de cultura celular como cultura em suspensão em fases de trabalho iniciais e à escala laboratorial Células MDCK de ampolas de células de sementeira, que são armazenadas em azoto líquido, foram rapidamente descongeladas por imersão num banho de água e imediatamente diluídas em meio de cultura (Ultra CHO com suplemento, BioWhittaker, "meio estandardizado") para um número de células de cerca de 1 x 105 células/mL, em regra, diluídas cerca de 1:100. Depois disso, as células foram separadas do meio por centrifugação (10 minutos a 800 x g) , de novo recolhidas em meio fresco e utilizadas para encher frascos de cultura rotativos (100 mL de volume de trabalho, Bellco ou Techne). Estas preparações de cultura foram incubadas a 37 °C sobre um agitador magnético com 50 - 60 rotações/minuto. O crescimento das células foi vigiado por controlo do número de células. Ao alcançar números de células de 8 x 105 até no máximo de 1,6 x 106 células/mL, as culturas foram transferidas por diluição das células em meio estandardizado fresco e semeadas em novos frascos de cultura rotativos de 100 até 1000 mL de volume de trabalho e incubadas até ao alcançar de densidades celulares máximas ou desejadas sob agitação, como descrito acima. Nestas passagens de células a diluição da respectiva cultura foi adaptada na gama entre 1:4 e 1:10 ao tipo do crescimento celular, de modo a que o número 19 máximo de células, de acordo com a necessidade, fosse alcançado dentro de 3 até 5 dias. Em alternativa foi testado o mesmo tipo de cultura celular sem adição dos suplementos ao meio e pôde ser mantido sem problemas durante pelo menos 10 passagens.

Exemplo 2: Manuseamento do sistema de cultura celular como cultura aderente

Culturas em suspensão estabelecidas (conferir exemplo 1) forma diluídas em diferentes meios de modo a que o número de células perfizesse cerca de 1 x 105 células/mL e, em seguida, foram utilizadas para encher os mais diferentes recipientes de cultura celular (ver tabela 1). O volume de cultura celular correspondeu neste caso às quantidades usuais para os respectivos recipientes de cultura, isto é, cerca de 4 mm de meio de cultura acima da superfície de inoculação ou cerca de 1 mL de meio por 2,5 cm2 de superfície de cultura. As culturas foram incubadas em regra à temperatura usual para a maioria das culturas celulares de 37 °C, no entanto também eram possíveis divergências consideráveis da temperatura de incubação sem perda apreciável (ver tabela 1). Os sistema de cultura testados, bem como os resultados do crescimento celular com isso alcançados, estão representados na tabela 1 e mostram que este sistema de células se comporta de modo aproximadamente semelhante e robusto em diferentes meios e sistemas de cultura.

As culturas de monocamada preparadas deste modo foram utilizadas para a titulação de s de vírus em placas de microtitulação, bem como para a propagação de vírus, sob controlo microscópico ou para pesquisas de imunofluorescência, testes de hemoadsorção e outros métodos virológicos ou 20 imunológicos padronizados que se podem realizar melhor em culturas aderentes em monocamada do que em culturas em suspensão. Além disso estas culturas eram particularmente adequadas para obter estirpes de virus puras, por purificação em placa ou diluição. Finalmente, as culturas aderentes foram também utilizadas para a multiplicação de virus em escalas pequenas e grandes; quantidades maiores, neste caso, de um modo preferido em frascos rolantes.

Sistema de Sementeira Meios Aditivos Incubação Cultura cultura de células utilizados utilizados # confluente celular (x 105 células/mL) após ... dias (8-20 x 105 células/mL) Frascos de 0,8 - 1,0 MEM, EDM, 1-5% FCS 33 ou 37 4-5 cultura Opti-MEM*, ou supl.* °C plásticos Ultra CHO*, Frascos de 2,0 MEM, EDM, 1-5% FCS 33 ou 37 2-3 cultura Opti-MEM*, ou supl.* °C plásticos Ultra CHO*, Placas de 2,0 - 4,0 MEM, EDM, 0,5 - 3% 33 ou 37 1-2 microtitulação Opti-MEM*, FCS ou °C Ultra CHO*, supl.* Placas de 2,0 - 4,0 MEM, EDM, 1% FCS 37 °C 1 microtitulação Opti-MEM*, durante 1 Ultra dia, CHO*, depois sem aditivos Frascos 1,0 EDM, Opti- 0,5 - 3% 33 ou 37 4-5 rolantes MEM*, FCS ou °C Ultra CHO*, supl.* Frascos 1,0 EDM, Opti- 1% FCS ou 33 ou 37 5-7 rolantes MEM*, supl.* °C Ultra durante 3 CHO*, dias, depois sem aditivos Rotação + 2,0 BME 0,5 - 3% 33 ou 37 5-7 microssuporte MEM FCS ou °C EDM supl.*

Tabela 1: Crescimento celular em sistemas de cultura aderentes, diferentes 21 ΒΜΕ: Meio basal de Eagle; suplemento de bicarbonato (2 - 2,5% de uma solução principal a 5%) MEM: Meio mínimo essencial; suplemento de bicarbonato (2 - 2,5% de uma solução principal a 5%) EDM: Meio de Eagle modificado por Dulbecco; suplemento de bicarbonato (2 - 2,5% de uma solução principal a 5%)

FCS: soro fetal de vitelo Supl.: suplemento ultra CHO

#): Valores ajustados; valores efectivamente medidos com desvios em +2 °C e -3 °C *): fabricante: Bio-Whittaker

Exemplo 3: Isolamento de vírus, obtenção e preparação de preparações de sementeira de vírus

Isolados primários, como por exemplo amostras de órgãos, tecidos ou fluidos de tecidos, zaragatoas ou amostras de fezes contendo vírus foram suspendidos em banho de gelo em meio Standard (são igualmente possíveis outros meios quaisquer ou tampão fosfato) com adição de antibióticos (PSN: 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 50 pg/mL de neomicina) e eventualmente homogeneizados (finamente cominuídos com almofarizes, lâminas de escalpelo ou um assim designado homogeneizador "Douncer" ou "Potter"). A suspensão obtida foi filtrada com o auxílio de um filtro adaptador de seringa usual de laboratório com um tamanho de poro de 0,45 pm (para o isolamento de vírus menores, não revestidos, também 0,2 pm). O filtrado foi inoculado em pequenos frascos de cultura (25 cm2, ver exemplo 2) com meio de cultura fresco e adição de antibióticos. Para aumentar o rendimento, foram providas várias culturas com um inoculo de por exemplo 100 pL até 1 mL e em 22 seguida incubadas a 37 °C. Para isolados de vírus a partir das vias respiratórias superiores recomendam-se culturas adicionais a uma temperatura de incubação mais baixa de 33 °C.

Isolados de vírus purificados, já multiplicados em cultura, foram empregues para a infecção directa no sistema de cultura de acordo com a invenção de acordo com o exemplo 1 ou 2. Uma vez que neste caso no entanto em regra pôde ser presumido um teor elevado de vírus da preparaçao virai, foram utilizadas quantidades menores de inoculo de 100 pL ou menos. Para infecções primárias deste tipo no sistema de cultura de acordo com a invenção foi preferido um MOI (multiplicity of infection) de 0,1 e 0,01; no caso de resultado pouco satisfatório, a infecção foi repetida com MOI em etapas decrescentes num factor de 10, de 10 até 0,0001.

As culturas infectadas foram em seguida pesquisadas microscopicamente, diariamente, relativamente a lesões celulares condicionadas por vírus (CPE, efeito citopático) e comparadas com lesões em culturas de controlo. Alternativamente, bem como em vírus que não provoquem qualquer CPE, a cultura foi pesquisada relativamente à presença de antigénios de vírus específicos ou os seus genes (p. ex., de acordo com o tipo de vírus, testes HA específicos; ELISA, PCR) . Após 3 até 4 dias ou resultado positivo (contracção das células, morte celular, arredondamento e dissolução do gramado de células no caso de culturas aderentes, formação de placa) foram congelados como amostra sobrenadantes de cultura centrifugados livres de células, no caso de resultado negativo ou duvidoso, pelo contrário, a totalidade da cultura foi ajustada com meio fresco para um número de células de 1 x 105 células (diluição das culturas em suspensão ou tratamento com tripsina das culturas 23 aderentes com subsequente diluição das células individualizadas) e foram adicionalmente incubadas, distribuídas em novas culturas. Uma vez que isto correspondeu na maioria dos meios a uma diluição das culturas de 1:4 até 1:20, para evitar uma multiplicação logarítmica do número das culturas, o mais tardar após a segunda passagem de cultura deste tipo foi apenas mantida subsequentemente uma parte das culturas possíveis. Após 3-4 passagens puderam em regra ser isolados com sucesso e detectados isolados de vírus a partir de material de partida adequado, contendo vírus.

Para a maioria dos tipos de vírus, consoante o teor de vírus e qualidade do material de partida, foi determinado um CPE condicionado por vírus após incubação de 2 - 7 dias (ver também outros exemplos específicos de vírus). Alguns tipos de vírus multiplicam-se no entanto muito lentamente ou não mostram qualquer CPE e têm por conseguinte que ser detectados através de passagens e durações de incubação mais prolongadas ou por testes específicos (os métodos respectivamente necessários são apresentados nos exemplos de vírus específicos). Como exemplo para um vírus sem CPE com multiplicação lenta, que além disso necessita de um sistema de detecção particular, remete-se para o exemplo especial do vírus da hepatite A. O teste de detecção descrito neste caso adequa-se igualmente, no caso da utilização de respectivos antissoros, para a detecção de outros vírus, em particular aqueles sem CPE específico.

Um vírus isolado de novo deverá ser subsequentemente utilizado de um modo conveniente apenas após três vezes de purificação em placa ou preparação de um isolado puro através da assim designada técnica de diluição limitante. Os métodos necessários para o efeito correspondentes ao estado da técnica 24 podem ser retirados de manuais adequados (ver, p. ex: B.W. Mahy: Virology - a practical approach; IRL Press, Oxford, 1985).

Caso se apresentem agora preparações de vírus adequados de um isolado primário ou de uma estirpe estabelecida, então estas são subsequentemente utilizadas para a infecção de culturas rotativas, para obter vírus de sementeira homogéneo para finalidades de produção. Sem limitar a isso o objectivo da invenção, é recomendada efectuar em primeiro lugar uma primeira infecção em pequenas culturas rotativas com 100 mL de meio de cultura propondo-se testar com MOI de 10 até 0,00001, de um modo preferido 0,1 até 0,0001. Daí foram seleccionadas as condições mais favoráveis (em particular em relação a MOI e tempos de colheita) para o alcançar de títulos de vírus ou rendimentos mais rápidos e mais elevados, para produzir vírus de sementeira num sistema de cultura do tamanho requerido - consoante a escala de produção prevista e número das corridas de produção - numa passagem de vírus adicional. Consoante os rendimentos de vírus alcançados e tamanho de produção previsto, a escala para esta passagem de vírus de sementeira de algumas culturas rotativas pôde perfazer até a escala de 1000 mL, até f ermentadores mais pequenos até cerca de 10 litros de volume ou mais. 0 vírus recolhido foi libertado de eventuais restos celulares por filtração ou centrifugação e armazenado em alíquotas de quantidades pequenas adequadas para a produção, a temperaturas o mais possível abaixo de -70 °C. 25

Exemplo 4: Manuseamento do sistema como cultura de microssuporte aderente para finalidades de produção A propagação das células MDCK aderentes efectuou-se em frascos rolantes de acordo com o exemplo 2, tabela 1 com BME mais 3% de soro fetal de vitelo (FCS) . Após a propagação neste sistema, as células foram separadas da superfície dos frascos rolantes. Isto ocorreu enzimaticamente com auxílio de uma solução de tripsina adequada, com processos usuais, conhecidos do especialista. Alternativamente foram propagadas células em suspensão em culturas rotativas de acordo com o exemplo 1 e utilizadas directamente para a cobertura dos microssuportes. 0 fermentador de produção foi cheio com microssuportes do tipo Cytodex 3 (Pharmacia). Os microssuportes (peso específico 5 g/L) foram autoclavados e condicionados com meio nutritivo. 0 processo assegurou uma adesão das células à superfície dos microssuportes. As células obtidas pelo modo descrito acima foram transferidas para o sistema de produção de modo a que a densidade celular perfizesse 1 x 105 células/mL. As células aderiram aos microssuportes e foram cultivadas até à confluência ou ato se alcançar uma densidade celular de 3 x 106 células/mL.

Após a fase de propagação celular, o meio nutritivo existente foi trocado por meio nutritivo fresco. Para o efeito foi empregue meio nutritivo livre de proteína. Foram conduzidos 2 ciclos de lavagem.

Um ciclo de lavagem consistiu no desligar do mecanismo de agitação, na deposição dos microssuportes, na retirada do meio nutritivo consumido, na adição do meio nutritivo fresco e na 26 ressuspensao dos microssuportes. Após o passo de lavagem, a cultura celular foi misturada com tripsina (2,5 mg/L).

Em seguida efectuou-se a infecção da cultura celular com vírus de sementeira. Este vírus de sementeira foi obtido e empregue de acordo com o exemplo 3. 0 MOI foi neste caso específico para o vírus e perfez entre 0,1 e 0, 000001, de um modo preferido entre 0,01 até 0,0001. Depois de terminada a fase de infecção, cuja duração é determinada por um lado pelo vírus específico (ver exemplos específicos), por outro lado também pelo MOI seleccionado, o mecanismo de agitação foi deixado parado e os microssuportes sedimentaram. O sobrenadante contendo vírus foi retirado e purificado por meio de processos de separação adequados de resíduos celulares. Para a separação das células foram empregues centrífugas ou separadores, filtros e instalações de filtração em contracorrente usuais, conhecidas do especialista.

Exemplo 5: Manuseamento do sistema como cultura em suspensão até o volume de produção à escala de 1000 L sob utilização de meio livre de soro A propagação de culturas em suspensão para um volume de produção de 1000 L efectuou-se com o auxílio de frascos rotativos (firma Techne) em escala pequena até um volume de cultura de 1000 mL (ver exemplo 1) . A densidade celular no caso da aplicação da rotação perfez 1 x 105 células/mL. As células foram cultivadas em processo de lotes e, a uma densidade celular de 1 x 106 células/mL, foram transferidas por diluição simples em meio fresco na razão de 1:10. Como meio para a propagação celular foi empregue meio livre de soro (UltraCHO, 27

BioWhitakker). A partir de um volume de 10 L foram empregues fermentadores agitados (30 rotações por minuto) com arejamento permanente e controlo de temperatura (temperatura de regulação de 37 °C para a propagação celular) , valor de pH (gama de regulação de 7,1 até 7,3) e pressão parcial de oxigénio (45 até 55% p02) (detalhes técnicos como na tabela 2). De forma correspondente, os volumes de aumento de escala de 10 L, 100 L, 1000 L perfizeram uma razão de transferência de 1:10. A uma densidade celular inicial de 1 x 105 células/mL, os fermentadores alcançaram a densidade celular final de 1 x 106 células/mL num tempo de 3 - 4 dias. À escala de 1000 L foi adicionalmente conduzido um lote com alimentação com solução de glucose (100 -200 g/L), para aumentar a densidade celular para 3 x 106 células/mL. Os rendimentos celulares alcançados estão representados comparativamente na tabela 2.

Exemplo 6: Manuseamento do sistema como cultura em suspensão até o volume de produção até um volume de 1000 L sob utilização de meio quimicamente definido A propagação de culturas em suspensão para um volume de produção de 1000 L efectuou-se de forma análoga ao descrito no exemplo 5. Em oposição, foi empregue como meio, alternativamente, meio quimicamente definido (ProCHChCDM) para a propagação celular. Mostrou-se como sendo vantajoso realizar 3 até 5 passagens prévias para a adaptação neste meio. Os rendimentos celulares alcançados estão representados comparativamente na tabela 2. 28

Exemplo 7; Manuseamento do sistema como cultura em suspensão até um volume de produção à escala de 1000 L sob utilização de meio livre de proteína A propagação de culturas em suspensão para um volume de produção de 1000 L efectuou-se de forma análoga ao descrito no exemplo 5. Como meio foi empregue meio livre de proteína (SMIF7, LifeTechnologies) para a propagação celular. Mostrou-se como sendo vantajoso realizar 5-10 passagens prévias para a adaptação neste meio. Os rendimentos celulares alcançados estão representados comparativamente na tabela 2. N° . Processo Meio N/T/p02/pH Xo X 1 Lote UltraCHO 30 min"1 37 °C 45 - 55% 7,1 - 7,3 1 x 105 mL"1 1 x 106 mL"1 2 Lote com alimentação UltraCHO 30 min"1 37 °C 45 - 55% 7,1 - 7,3 1 x 105 mL"1 3, 1 x 106 mL"1 3 Lote Pr0CHO4CDM 30 min"1 37 °C 45 - 55% 7,1 - 7,3 1 x 105 mL"1 1 x 106 mL"1 4 Lote com alimentação ProCH04CDM 30 min"1 37 °C 45 - 55% 7,1 - 7,3 1 x 105 mL"1 3,3 x 106 mL"1 5 Lote SMIF7 30 min"1 37 °C 45 - 55% 7,1 - 7,3 1 x 105 mL"1 1 x 106 mL"1 6 Lote com alimentação SMIF7 30 min"1 37 °C 45 - 55% 7,1 - 7,3 1 x 105 mL"1 3, 0 x 10b mL"1

Tabela 2: Propagação de células (MDCK 33016) para a escala de produção em fermentador sob utilização de diferentes processos e meios 29 X0: densidade celular de partida X: densidade celular final N/T/p02/pH: rotações de agitação, temperatura, pressão parcial de

oxigénio, valor de pH

Exemplo 8: Manuseamento do sistema na fase de produção com meio livre de soro

Após a propagação de culturas em suspensão até à escala de produção de acordo com o exemplo 5, as células foram distribuídas em três fermentadores de igual volume de 3 x 1000 L e cheios com meio fresco. Com isso cada fermentador recebeu 1/3 do volume da pré-cultura e 2/3 de volume de meio fresco. Foi utilizado o mesmo meio gue na fase de propagação (UltraCHO, BioWhittaker) . Após o enchimento, a cultura celular foi misturada com tripsina a 10 mg/L.

Em seguida efectuou-se a infecção da cultura celular com um vírus de sementeira (Influenza B/Harbin/7/94) a um MOI de 0,001 e uma incubação adicional sob as mesmas condições de fermentação como na propagação das células, no entanto a 33 °C, durante 96 horas. 0 sobrenadante contendo células foi retirado em seguida e as células foram neste caso separadas por meio de um separador. Seguiu-se um passo de filtração adicional por filtro de cartucho com um tamanho de poro de 0,45 pm para a separação de partículas finas adicionais.

As s de vírus foram testadas relativamente ao seu teor em vírus com auxílio de métodos padronizados no teste HA com 0,5% de eritrócitos de galinha e por titulação de vírus em células 30 aderentes MDCK: o teor de HA medido perfez 1024 unidades, o título virai encontrou-se em 108'2 KID50/mL.

Exemplo 9: Manuseamento do sistema na fase de produção com meios quimicamente definidos A preparação das células de produção efectuou-se como descrito no exemplo 8. No entanto, foi utilizado meio quimicamente definido (ProCH04CDM, BioWhittaker) como meio fresco. Após o enchimento, a cultura celular foi misturada com tripsina a 2,5 mg/L. A infecção subsequente foi realizada como descrito no exemplo 8. O teor de HA medido perfez 1024 unidades, o título virai encontrou-se em 107'5 KID5o/mL.

Exemplo 10: Manuseamento do sistema na fase de produção com meio livre de proteína A preparação das células de produção efectuou-se como descrito no exemplo 8. No entanto, foi utilizado meio livre de proteína (SMIF7, Life Technologies) como meio fresco. Após o enchimento, a cultura celular foi misturada com tripsina a 2,5 mg/L. A infecção subsequente foi realizada como descrito no exemplo 8. O teor de HA medido perfez 1024 unidades, o título virai encontrou-se em 107'9 KID50/mL. 31

Exemplo 11: Propagação e infecção com meio quimicamente definido A propagação das células efectuou-se como descrito no exemplo 6, a infecção como descrito no exemplo 9. Com isso, a totalidade da cultura celular, desde a propagação até à da infecção, efectuou-se em meio quimicamente definido.

Exemplo 12: Propagação com meio quimicamente definido e infecção em meio livre de proteína A propagação das células efectuou-se como descrito no exemplo 6 em meio quimicamente definido, a infecção como descrito no exemplo 10 em meio livre de proteína.

Exemplo 13: Propagaçao e infecção em meio livre de proteína A propagação das células efectuou-se como descrito no exemplo 7. A infecção como descrito no exemplo 10. Com isso, a totalidade da cultura celular, desde a propagação até à colheita da infecção, efectuou-se em meio livre de proteína.

Exemplo 14: Descrição geral da purificação de vírus

Após a conclusão da fase de multiplicação virai, a colheita da cultura celular foi filtrada através de um filtro de profundidade com um tamanho de poro de 0,45 ou 0,5 pm, para separar células e fragmentos celulares. Alternativamente esta separação foi realizada com auxílio de um separador. Os vírus contidos na colheita clarificada foram concentrados em caso de 32 necessidade por meio de ultrafiltraçao e purificados, em que foi utilizada uma membrana com um limite de exclusão entre 50.000 e 1.000.000, de um modo preferido 100.000 até 500.000. 0 concentrado de vírus obtido foi carregado numa coluna de crornatografia, que estava empacotada com CS (sulfato de cellufine, Millipore). Após terem sido eliminadas as impurezas por lavagem com tampão, os virus foram eluidos com uma solução de cloreto de sódio 0,3 até 3 Μ. O eluato foi dessalinizado por meio de ultrafiltração e adicionalmente concentrado. Alternativamente ou em combinação com uma purificação cromatográfica pode alcançar-se um efeito de purificação adicional por ultracentrifugação. A maioria dos tipos de virus pode além disso ser purificada por ultracentrifugação, de forma correspondente à sua densidade de suspensão, num gradiente de sacarose com fraccionamento subsequente do gradiente. Pode ser introduzida uma inactivação virai com formaldeido ou β-propiolactona em qualquer ponto dentro do processo de purificação, no entanto, é empregue, de um modo preferido, após a concentração ou após a purificação, uma vez que o volume a inactivar é, então, já consideravelmente reduzido.

Exemplo 15: Obtenção de preparações de vírus inactivadas, puras, para a formulação de vacinas

Foram propagados flavivírus (vírus da meningoencefalite transmitida pela carraça, estirpe K 23) de acordo com o exemplo 5, 6 e 7 em diferentes meios a uma dose de inoculação de 0,2 MOI (para detalhes adicionais conferir exemplo 19). O meio de cultura recolhido, contendo o vírus, foi libertado de resíduos celulares eventualmente contidos por 33 centrifugação e filtração através de filtros com um tamanho de poro de 0,45 pm. Por razões de segurança, este material foi já inactivado após a filtração por adição de β-propiolactona numa diluição de 1 :2000 ou 1:2500 e incubação a 2 - 8 °C durante 24 horas. Um teste de cultura celular, das preparações inactivadas após hidrólise de 2 horas do agente de inactivação a 37 °C, mostrou que até um limite de detecção menor do que 0,03 unidades infecciosas/mL não estava contido mais nenhum vírus activo.

Para a análise dos passos de purificação subsequentes descritos foi empregue um teste de BCA (Pierce) para a determinação do teor total em proteína. O teor especifico em antigénio foi determinado com auxílio de uma sanduíche ELISA sob utilização de anticorpos monoclonais específicos contra a glicoproteína E (Niedrig et al., 1994, Acta Virologica 38: 141- 149) e um antissoro policlonal, produzido pelos próprios, contra vírus purificado de coelhos. Os valores para o material de partida inactivado foi neste caso tomado como valor de referência (correspondente a 100%) .

Purificação por centrifugação de gradiente:

Preparações de vírus inactivadas foram purificadas de acordo com métodos conhecidos através de uma ultracentrifugação de gradientes de densidade (15 - 60% de sacarose) a 80.000 x g. Em seguida o gradiente foi fraccionado e foi determinada a extinção a 280 nm em amostras das fracções, para a identificação do pico de vírus. Foi comprovado um forte aumento da extinção respectivamente na gama de uma concentração de sacarose entre 30 e 40%, o máximo encontrou-se em 34 e 35%. Nesta gama foi também medido o teor mais elevado em proteína específica do vírus e a 34 pureza mais elevada (determinada como razão de proteína de vírus relativamente à proteína total). Na totalidade, mais de 50% do teor de antigénio específico determinado no material de partida foi reencontrado nestas fracções de picos.

Purificação cromatográfica:

As preparações de vírus inactivadas (ver acima) foram aplicadas numa coluna CS, que foi previamente equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão fosfato 50 mM, pH 7,5. Em seguida foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão fosfato, para eliminar material não ligado. O material ligado foi subsequentemente eluído com o mesmo tampão fosfato sob mistura em modo de etapas de quantidades crescentes do mesmo tampão com adição de NaCl a 3 M. No fluxo, aquando da aplicação do material virai, foram reencontrados analiticamente entre 3,2 e 3,9% do antigénio específico e 79 até 83% da proteína total. No tampão de lavagem encontravam-se 6 - 11% da proteína total e 0 - 2,3% do antigénio. Mais de 95% do antigénio ficou com isso ligado ao material da coluna. No caso da eluição com 0,6 até 1,8 M de NaCl foram reencontrados cerca de 60,0% do antigénio, a pureza mais elevada foi alcançada no caso de uma eluição com 1,2 M de NaCl. Concentrações de sal mais elevadas até 3 M de NaCl eluiram quantidades diminutas adicionais (< 15%) em antigénio com menor pureza específica.

Purificação por combinação de cromatografia e ultracentrifugação

Eluatos reunidos após eluição com 0,6 e 1,2 M de NaCl de uma purificação cromatográfica como descrito acima foram 35 sujeitos a uma ultracentrifugação durante 2,5 horas a 80000 x g. O pellet de vírus foi ressuspendido em tampão fosfato 50 mM pH 7,5 e analisado. A concentração total de proteína desta preparação foi reduzida para 0,7% do teor de partida, o grau de purificação tinha sido aumentado em dez vezes através deste passo.

Esta preparação de vírus foi sujeita a uma purificação em gradiente como descrito acima. Após fraccionamento foi descoberto um perfil de gradiente muito semelhante àquele alcançado após purificação directa em gradiente. A ponta do pico de vírus tinha-se no entanto deslocada ligeiramente e encontrava-se agora a 37% de sacarose.

Exemplo 16: Multiplicação de flavivírus

Culturas em suspensão da célula MDCK 33016 com uma densidade celular de 1 - 1,5 x 106 células/mL foram infectadas sob as condições estandardizadas (meio estandardizado, 37 °C de temperatura de cultura e infecção) com o vírus da meningoencefalite transmitida pela carraça (estirpe K23, Niedrig et al., 1994, Acta Virologica 38: 141-149). De forma divergente em relação aos exemplos acima mencionados, foram empregues para a infecção MOI fortemente variáveis. Além disso as culturas de infecção foram mantidas parcialmente em meio quimicamente definido ou em meio sem aditivos contendo proteína. Foram utilizados diferentes processos de cultura e, que mostram a título de exemplo que também no caso de alteração de diferentes parâmetros se podem alcançar rendimentos elevados com o sistema, e são mesmo possíveis múltiplas s. Estas alterações estão resumidas na tabela 3. As titulações de vírus efectuaram-se em 36 células A 549 (ECACC N°. 86012804) e foram avaliadas após 5 dias com base no CPE. Foi notável o facto de a repetida de uma e da mesma cultura implicar respectivamente uma troca do meio de cultura, de modo a que as células fossem abastecidas com meio novo em cada e com isso pudessem crescer subsequentemente. Sem estas s a cultura não teria permanecido viável e produtiva durante períodos de tempo mais longos. Uma vez que estas trocas frequentes de meio em intervalos curtos não conseguiram compensar o elevado rendimento metabólico das culturas, efectuaram-se suplementos de meio adicionais e aumentos das culturas após 4 ou 5 dias de tempo de infecção. MOI Rendimento (i°g 10 KID50/mL) por após ... dias Meio 1 2 3 4 5 6 7 8 Meio utilizado Preparações com s múltiplas no caso de troca total de meio: 2, 0 9, 0 8, 8 8, 8 Meio estandardizado 2, 0 9, 0 (M+30)+ 8, 4 Meio estandardizado 2, 0 6,1 (M+30) 6,1 Meio livre de proteína 0, 2 7, 8 (M+30) 7,8 Meio quimicamente definido 0, 2 8, 7 8, 0 7, 7 Meio estandardizado 0, 2 8, 3 (M+30) 8, 6 Meio estandardizado 0, 2 9,0 (M+30) 9,0 Meio estandardizado 0, 2 8, 6 9,2 9,0 Meio estandardizado 0, 2 9,0 9,0 8,6 Meio estandardizado 0, 2 7,3 (M+30) 8,2 Meio livre de proteínas 0, 2 7,2 (M+30) 8,6 Meio quimicamente definido Preparações com toma de amostras sem troca ou suplemento de meio: 1(TU'3 7, 7 8,3 9,2 9,4 9,3 Meio (=- estandardizado 0,5) 10-°.3 6,3 7,5 8,4 8,6 8,9 Meio MEM, cultura aderente, 1% FCS IO-1'3 5,2 6,3 6,6 6,8 6, 8 Meio (=- estandardizado, 0, 05) excedida de temperatura por agitação ΚΓ1'3 5,1 6, 2 7,1 8, 0 8,4 Meio 37 estandardizado 10^'J 4,8 6, 2 7,6 7,5 8,1 Meio estandardizado 10-3.3 3,4 4, 7 4,9 5,6 6, 0 Meio estandardizado 10-4.3 2, 7 3, 7 4,3 4,3 4,4 Meio estandardizado Iq-5.3 2, 5 2, 6 3,4 3,7 4,3 Meio estandardizado

Tabela 3: Multiplicação de vírus FSME /K23 em culturas de MDCK 33016 em meio estandardizado bem como em meios alternativos sob utilização de diferentes MOI e variantes de +)(M+30) significa suplementação do meio de + 30% do volume de cultura no dia indicado

Exemplo 17: Multiplicação de picornavírus

Foram cultivadas culturas de MDCK33016 aderentes para a infecção com vírus da hepatite A (HAV, estirpe HM 175, ATCC VR-1358) em meio MEM com adição de 5% de soro fetal de vitelo e bicarbonato (comparar exemplo 2). No âmbito da pesquisa foi além disso utilizado um isolado virai adicional "Munchen" (comparar Frõsner et al. 1979; Infection 7: 303 - 305) . O vírus foi diluído na cultura semeada de fresco, e as culturas foram incubadas a 37 °C. As culturas foram passadas subsequentemente a 1:4 em turnos alternados de 3 - 4 dias.

As culturas em suspensão de células MDCK33016 foram cultivadas em meio estandardizado de acordo com o exemplo 1, inoculadas com HM 175 e incubadas a 33 °C e subsequentemente passadas a 1:10 semanalmente. As células aderentes e culturas em suspensão foram adicionalmente mantidas durante até 35 dias após a infecção. Depois disso efectuou-se a detecção da replicação de vírus activa com base no CPE (estirpe HM 175) ou de acordo com 38 um método já descrito (ver Virustitration, página 93 em Gregersen et al. 1988; Med. Microbiol. Immunol. 177: 91 - 100).

De uma forma divergente foi empregue como anticorpo específico para o vírus um anticorpo humano anti-HAV como IgG purificada (designação F 86012, amavelmente cedido pela firma Dade Behring). Como anticorpo IgG anti-humano com marcação de biotina foi empregue o número de produto 39015 (firma Sigma). A detecção específica de uma multiplicação activa de vírus com este sistema fornece células coradas de rosa acastanhado, que podem ser facilmente reconhecidas com aumento diminuto no microscópio. As células negativas para vírus mostram-se pelo contrário não coradas ou apresentam apenas uma coloração muito insignificante. Com os mesmos métodos de detecção foram também avaliadas titulações de vírus três semanas após a preparação, gue foram empregues como sistema de cultura para as células humanas diplóides (MRC-5).

Em todas as preparações de infecção descritas acima e com ambos os isolados virais utilizados pôde ser observada uma replicação activa de HAV nas células MDCK. Em culturas em suspensão foi observada uma multiplicação de vírus surpreendentemente rápida com a estirpe HM 175. No dia 7 após a infecção, o título virai medido no sobrenadante encontrava-se em 105'4 KID50/mL; esta cultura foi passada semanalmente por diluição simples de 1:10 e forneceu títulos de vírus semelhantes novamente após 7 dias adicionais nas culturas resultantes. No final do cultivo e após duas passagens adicionais de células foram determinados os títulos de vírus numa amostra do meio livre de células. Adicionalmente foi tomada uma amostra da cultura total e as células aí contidas foram abertas por congelação a -20 °C e congelamento por duas vezes. Os componentes celulares foram eliminados por centrifugação antes 39 destas amostras serem tituladas. Os rendimentos virais obtidos a partir desta preparação estão resumidos na tabela 4 e mostram que, sem prejuízo dos rendimentos específicos, é possível uma multiplicação semanal das culturas de dez vezes, em que apesar do aumento massivo da quantidade podem ser recolhidos bons títulos de vírus por unidade de volume. De um modo notável encontra-se neste caso uma parte considerável de vírus no sobrenadante, o que é igualmente surpreendente para este vírus fortemente ligado às células (ver tabela 4).

Dia após a infecção Passagem de células (aumento do volume da cultura) Volume de relativo (dia 0=1) Rendimento total de vírus ( kid50 ) no meio após abertura das células 7 1:10 1 107'4 107'8 14 1:10 10 108'5 108'2 21 1:10 100 n.d. n.d. 28 1:10 1000 1010'8 1011'4 35 final 10000 lõ1773 1014'2

Tabela 4: Multiplicação de vírus da hepatite A (estirpe HM 175) em culturas em suspensão de MDCK 33016 sob multiplicação contínua e aumento do volume de cultura.

Exemplo 18: Multiplicação de rabdovírus

Foram inoculadas culturas em suspensão em meio estandardizado de acordo com o exemplo 1 em frascos de cultura celular, com uma densidade celular de 1 x 106 células por mL de meio. Após o crescimento das culturas foram infectadas respectivamente duas culturas com um MOI de 0,01 e uma cultura com um MOI de 0, 001 com um vírus da raiva (estirpe Pitman-Moore, 40 estirpe de vírus da vacina). As culturas foram incubadas a 37 °C e todos os 4 ou 3 dias foram soltas com tripsina e foram passadas na razão de 1:10 (após 4 dias) ou de 1:8 (após 3 dias) e mantidas assim durante 18 dias (ver tabela 5) . O sucesso da infecção foi observado em cada passagem. Uma cultura foi provida com uma solução de formalina a 3,5% e foi incubada nesta solução durante três dias à temperatura ambiente, para alcançar uma inactivação dos vírus. Após eliminação da solução de formalina, a cultura foi lavada com PBS e incubada 25 minutos com Triton-X100 a 1% em PBS à temperatura ambiente. Após eliminação desta solução, a cultura foi lavada três vezes com PBS e foi aplicado um anticorpo marcado com FITC contra vírus da raiva (50 pL anti-raiva-IgG-FITC de coelho diluído a 1:400, Dade Behring, OSHY 005). Após 90 minutos de incubação a 37 °C, foi novamente lavado com PBS e a cultura foi observada sob um microscópio de fluorescência invertido.

Alternativamente, foram realizadas titulações de vírus dos sobrenadantes das culturas celulares MRC-5 de acordo com métodos padronizados, que foram igualmente avaliados por meio de imunofluorescência como descrito acima, após tratamento prévio de formalina/Triton. Com base nos títulos de vírus alcançados com este sistema foi efectuada uma correlação grosseira aos rendimentos no processo de preparação correspondente sob utilização de culturas MRC-5 para uma vacina humana autorizada (Rabivac) , que possibilita uma orientação sobre quanto antigénio de vacina está contido por mL de colheita de cultura (ver tabela 5) .

Ambas as preparações (MOI 0,01 e 0,001) mostraram resultados positivos já após 4 dias e, depois disso, um decurso de infecção semelhante, no entanto, no caso do MOI mais diminuto 41 o decurso da infecção - detectável nos títulos de vírus que até ao dia 11 se encontravam cerca de 1,2 até 0,5 log KID50 menores -estava ligeiramente retardado. A partir da 3a passagem das culturas no dia 11, mostrou-se, em todas as culturas, uma imunofluorescência específica, muito intensa, com destruição inicial de células que, depois disso, aumentou adicionalmente, até no decurso da 5a passagem no dia 18 uma grande parte das células estar completamente destruída, de modo a que a infecção foi terminada. O teor em vírus específico aumentou continuamente até ao dia 14, para depois disso, em consequência da crescente destruição celular, diminuir novamente. Os resultados deste decurso da infecção estão resumidos na tabela seguinte e mostram que - medido na multiplicação virai reconhecidamente mais lenta de vírus da raiva - pode-se esperar nestas células uma multiplicação virai muito rápida sem adaptação, em que podem ser recolhidos bons rendimentos em antigénio, apesar da multiplicação adicional contínua das células em intervalos regulares e de forma repetida.

Dia após a infecção Passagem das células Volume de cultura relativo Antigénio da raiva (doses de vacina/mL) 4 1: 4 1 não determinado 7 1:3 4 não determinado 11 1: 4 12 0,2 - 0,4 14 1:3 36 0,4 - 0,5 18 suprimida 108 0,4 - 0,5

Tabela 5: Multiplicação de vírus da raiva em culturas de MDCK 33016 no caso de aumento contínuo do volume de cultura

De forma semelhante foi inoculado o mesmo vírus directamente em culturas em suspensão de acordo com o exemplo 1, em que foi empregue adicionalmente um MOI de 0,0001. Foi novamente empregue exclusivamente meio estandardizado para a 42 totalidade do decurso da infecção e as culturas foram igualmente transferidas duas vezes semanalmente de 1:8 ou 1:10. A transferência efectuou-se neste caso respectivamente apenas por diluição simples das células em meio fresco e nova sementeira. O sucesso da infecção foi neste caso apenas observado com base em titulações de vírus em células MRC-5 como descrito acima. As infecções forneceram em todos os três MOI títulos de vírus positivos no sobrenadante da cultura logo após 4 dias. Os títulos de vírus aumentaram continuamente, após perdas iniciais de diluição, após o 7o dia de passagem em passagem e apesar da diluição exponencial, sempre novamente realizada, não conduziram no entanto a qualquer destruição celular massiva nestas culturas em suspensão. A infecção foi observada até à 8a passagem (dia 28 após a infecção) e, depois, interrompida.

Foram congeladas amostras de vírus destas infecções a partir do vírus de sementeira e foram utilizadas para uma nova infecção de culturas em suspensão, a começar com 100 mL e igualmente em meio estandardizado e sob condições de passagem iguais como descrito acima. O MOI foi reduzido neste caso para 0,000025. A infecção foi mantida durante 6 passagens de células (21 dias). Em títulos de vírus lentamente crescentes apesar das diluições massivas de passagens, foram medidos no final desta corrida de infecção títulos de vírus que, calculados, produziram cerca de 0,3 doses de vacina por mL de sobrenadante de cultura. Caso efectivamente a totalidade do volume de cultura e não respectivamente apenas uma parte dela tivesse sido passada, teria sido possível recolher cerca de 500 litros de cultura após 6 passagens, o rendimento em vírus teria correspondido neste caso a cerca de 150 000 doses de vacinas. 43

Exemplo 19; Multiplicação de reovírus

Culturas em suspensão da célula MDCK 33016 em meio estandardizado foram infectadas com reovírus de tipo 3 (obtido da firma Bio Doc, Hannover) a um MOI de 0,01 e foram subsequentemente incubadas 3 ou 5 dias a 33 °C ou 3 7 °C. Foram recolhidas amostras dos sobrenadantes das culturas após 5 e 7 dias e foram titulados no sistema conhecido sob utilização de células BHK em meio MEM com 3% de FCS. A avaliação das titulações efectuou-se após 7 dias.

Os rendimentos em virus das culturas em suspensão perfizeram 108'1 KID5o/mL após 5 dias a 37 °C, 108'° KID5o/mL a 33 °C. Após 7 dias os títulos encontravam-se em ambas as preparações de temperatura em IO8,0 KID50/mL.

Foi utilizada a mesma estirpe de vírus em meios quimicamente definidos e livres de proteína de modo análogo ao exemplo 12 em culturas de MDCK-33016 para a infecção a um MOI de 0,01. Nos dias 3, 7 e 10 de infecção foram retirados respectivamente 22% do volume de cultura e foram substituídos por meio fresco. No dia 7 foram retirados 50% do volume de cultura, incluindo as células e foram substituídos por meio fresco. Com isso, no decurso da infecção, a totalidade do volume de cultura foi quase completamente trocado e por suplementação do meio foi dada às células a oportunidade de se multiplicarem adicionalmente conforme a diluição. O processo utilizado corresponde na totalidade a cerca de uma passagem da cultura de 1:2, em que apenas foram eliminados os excessos de quantidade. A passagem ou diluição das culturas consideravelmente mais elevada, possível em particular na fase inicial, não foi aqui de longe totalmente explorada. 44

Foram medidos os seguintes rendimentos em vírus:

Dia de infecção: 3 7 10 14 log KID50/mL: 5,4 7,1 6,6 6,6 (Valores médios de testes em duplicado)

Lisboa, 2 de Agosto de 2010 45

Claims (27)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparaçao de um medicamento ou meio de diagnóstico, compreendendo passos de (a) infectar células MDCK com um vírus; (b) cultivar as células MDCK após a infecção em cultura celular sob condições que possibilitam uma multiplicação dos virus e, simultaneamente, uma multiplicação adicional especifica das células, de pelo menos 2 vezes, por um aumento do volume total de cultura, em que o virus é seleccionado do grupo consistindo de vírus da meningoencefalite transmitida pela carraça (TBE), bem como das formas orientais apresentadas (Russa ou outras), vírus japonês da encefalite, vírus do dengue, vírus da febre amarela, vírus da raiva, vírus da hepatite A ou rotavírus.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as células, após a infecção, serem cultivadas sob condições que provocam uma multiplicação das células de pelo menos 5 vezes, de um modo preferido, de pelo menos 10 vezes.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por as células, após a infecção, serem cultivadas pelo menos 7, 21 ou 28 dias, de um modo preferido, pelo menos 35 dias em cultura celular. 1
4. 4. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por durante a multiplicação específica dos vírus e das células ser adicionado, pelo menos uma vez, meio fresco, concentrado de meio ou componentes do meio, ou pelo menos uma parte dos vírus e células serem transferidos para um recipiente de cultura que contém meio fresco, concentrado de meio ou componentes do meio.
5. 5. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a adição do meio fresco, do concentrado de meio ou dos componentes do meio ou a transferência das células e vírus para um outro recipiente de cultura ser repetida pelo menos uma vez.
6. 6. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a adição do meio fresco, do concentrado de meio ou dos componentes do meio ou a transferência das células e vírus para um outro recipiente de cultura ser repetida várias vezes.
7. 7. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser retirado meio durante a multiplicação dos vírus e das células.
8. 8. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por durante a multiplicação dos vírus e das células ser continuamente retirado meio e ser adicionado meio fresco, concentrado de meio ou componentes do meio.
9. 9. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por as células, antes da infecção, serem cultivadas de modo aderente ou como cultura em suspensão. 2 10 .
10. 10 .
11. 11.
12. 12.
13. 13.
14. 14.
15. 15.
16. 16.
17. 17. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado por as células, após a infecção, serem cultivadas de modo aderente ou como cultura em suspensão. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado por as células MDCK derivarem da linha celular MDCK 33016. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizado por o meio ser livre de soro. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado por o meio ser um meio quimicamente definido. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizado por o meio ser livre de proteína. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizado por a multiplicação dos vírus e das células ser realizada num sistema de perfusão. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15, caracterizado por a multiplicação dos virus e das células ser realizada num sistema de lote. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 16, caracterizado por as células, para a multiplicação dos vírus e das células, serem cultivadas a uma temperatura entre 30 0 - 40 °C. 3
18. 18. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 17, caracterizado por as células serem cultivadas a uma pressão parcial de oxigénio entre 35% - 60% para a multiplicação dos virus.
19. 19. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18, caracterizado por o valor de pH do meio se encontrar entre pH 6,8 e pH 7,8 para a multiplicação dos vírus.
20. 20. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 19, caracterizado por o vírus ser introduzido nas células por _ o infecção com um valor m.o.i. entre 10 e 10.
21. 21. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 20, caracterizado por os vírus ou uma proteína expressa por estes serem isolados do sobrenadante da cultura ou das células recolhidas.
22. 22. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por pelo menos uma parte do meio de cultura ser separada de pelo menos uma parte das células para o isolamento dos vírus ou da proteína.
23. 23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por a separação se efectuar por meio de um filtro de profundidade ou um separador.
24. 24. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 23, caracterizado por a purificação compreender uma ultracentrifugação para a concentração. 4
25. 25. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 24, caracterizado por a purificação compreender uma cromatografia.
26. 26. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 25, caracterizado por os virus serem inactivados durante a purificação.
27. 27. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 - 26, caracterizado por se misturarem os virus isolados ou a proteína com um adjuvante, substância auxiliar, tampão, diluente ou suporte medicamentoso adequado. Lisboa, 22 de Agosto de 2010 5