CN105561317B - 重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成：海藻糖4‑8%、蔗糖0‑3%、山梨醇0.2‑0.8%、聚乙烯吡咯烷酮K‑30 1‑3%、大豆分离蛋白4‑7%、小麦蛋白酶解物0.5‑1%，余量为注射用水。本发明还提供该重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法。本发明提供的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂配方简单，制备容易，适于大规模生产。本发明重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂具有提高疫苗稳定性和延长疫苗保存时间等优点，同时本发明提供的疫苗耐热冻干保护剂不含明胶和动物源性成分，应用于疫苗，疫苗安全性高。

Description

重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法，具体涉及重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法。
背景技术
伪狂犬病病毒（PRV）又称猪疱疹病毒I型，是引起猪繁殖障碍的主要病原之一。PRV基因组庞大，含有多个可缺失的病毒增殖非必须的基因，可供外源基因插入，插入外源基因的重组病毒在增殖的同时可稳定表达外源基因，从而提供对伪狂犬病病毒和其他相应传染病的抵抗力，因而其可作为重组病毒载体应用于重组疫苗的研制。重组伪狂犬病病毒的研究主要涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环II型病毒（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）、口蹄疫病毒（FMDV）等，如保藏在中国典型培养物培养中心、保藏号为：CCTCC-V201408的重组伪狂犬病毒，是一种PCV2-PRV重组病毒，可用于制备PCV2-PRV二联基因工程疫苗。
现有的疫苗中，弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物用疫苗中活疫苗占相当大的比例。将活疫苗进行冻干保存，为疫苗的运输、保存和使用提供了很多的方便。冻干保护剂是冻干活疫苗生产工艺中的一项关键技术，对疫苗的保存、运输和使用均产生影响。目前国内常规的保护剂主要为脱脂牛奶、蔗糖、明胶等组分，组方简单，但热稳定性和保护功能差，保存时间较短，在2℃-8℃条件下，保存期只有3-6个月，且多需要在-15℃以下保存，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制。中国专利CN102727904A公开了一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征-伪狂犬病二联活疫苗耐热保护剂，该活疫苗耐热保护剂按重量百分比计由明胶0.8~1.2%、大豆蛋白胨4~6%、甘氨酸0.5~1.5%、蔗糖3~5%、海藻糖2~3%、聚乙烯吡咯酮1~2%、甘露醇0.5~1%、维生素E0.1~0.2%和注射用水通过高温灭菌、微孔滤膜过滤除菌、混合步骤制备，具有良好的保护功能，但其成分中含有明胶，明胶是疫苗内毒素的主要来源，易导致接种的动物产生发热反应。现有的疫苗耐热冻干保护剂多保护性能不理想，或含有明胶或血清白蛋白、胰蛋白胨等动物源性成分，可能会对疫苗造成安全性的影响。因此，研制一种耐热稳定性好、保护功能强、安全性高的活疫苗耐热冻干保护剂显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供具有良好保护性能，能较长时间保存重组伪狂犬病病毒疫苗且不含明胶和动物源性成分的耐热冻干保护剂。此外，本发明还提供该耐热冻干保护剂的制备方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成：海藻糖4-8%、蔗糖0-3%、山梨醇0.2-0.8%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1-3%、大豆分离蛋白4-7%、小麦蛋白酶解物0.5-1%，余量为注射用水。
优选地，所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂由按照重量百分数计的如下组分制成：海藻糖5%、蔗糖1%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1.5%、大豆分离蛋白5%、小麦蛋白酶解物0.8%，余量为注射用水。
相应地，本发明还提供所述重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其包括如下步骤：
S1、制备小麦蛋白酶解物；
S2、取海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮K-30和山梨醇，然后溶于注射用水总量3/5-4/5的注射用水中，110-120℃的温度下进行灭菌处理10-20min，得到溶液A；
S3、取大豆分离蛋白和步骤S1制得的小麦蛋白酶解物，溶于剩余部分的注射用水中，然后用孔径为0.18-0.24μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
S4、将步骤S2制得的溶液A与步骤S3制得的溶液B混合，即得本发明重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂。
优选地，步骤S1所述小麦蛋白酶解物的制备方法包括如下步骤：取小麦蛋白粉，加入其重量15~20倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入8~10mol/L HCL调节溶液pH值为2.0~4.0，加入1200~1800U/g的酶，35~45℃下酶解6~10h，用1~2mol/L HCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶解结束后95℃灭酶15~20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶解物。
优选地，所述的酶解小麦蛋白的酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种或多种。优选地，所述的酶解小麦蛋白的酶为胃蛋白酶。
优选地，所述步骤S2中，在115℃的温度下进行灭菌处理15min。
优选地，所述步骤S3中，滤膜孔径为0.22μm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1）本发明耐热保护剂不含明胶和动物源性成分，避免了疫苗内毒素的产生和血清蛋白质潜在的血源性病原体污染疫苗带来的风险，提高了疫苗的安全性；2）本发明的耐热保护剂保护性能好，冻干前后重组病毒的损失率不超过0.3个滴度；
3）应用本发明耐热保护剂的重组伪狂犬病病毒活疫苗耐老化程度高，在37℃条件下存放21天后，物理性状良好，每瓶疫苗的病毒滴度仅下降0.1-0.2个滴度，2℃-8℃可存放24个月，每瓶疫苗病毒含量无明显下降，说明本发明耐热保护剂能有效提高疫苗的保存期，解决了常规保护剂活疫苗需冷冻运输、储存不便等问题；
4）本发明的耐热保护剂在保证耐热性能好、能有效保护活疫苗的前提下，还具有成本低、制备方法简单、可实现大量生产等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1 本发明重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂
重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成：海藻糖7%、蔗糖1%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1%、大豆分离蛋白6%、小麦蛋白酶解物0.7%，余量为注射用水。
制备方法：
S1、取小麦蛋白粉，加入其重量15倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入10mol/LHCL调节溶液pH值为3.0，加入1800U/g的酸性蛋白酶，40℃下酶解8h，用2mol/L HCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶解结束后95℃灭酶20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶解物；
S2、取海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮K-30和山梨醇，然后溶于注射用水总量3/5的注射用水中，118℃的温度下进行灭菌处理12min，得到溶液A；
S3、取大豆分离蛋白和步骤S1制得的小麦蛋白酶解物，溶于剩余部分的注射用水中，然后用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
S4、将步骤S2制得的溶液A与步骤S3制得的溶液B混合，即得本发明实施例1重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂。
实施例2 本发明重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂
重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成：海藻糖5%、蔗糖1%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1.5%、大豆分离蛋白5%、小麦蛋白酶解物0.8%，余量为注射用水。
制备方法：
S1、取小麦蛋白粉，加入其重量15倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入8mol/LHCL调节溶液pH值为2.0，加入1200U/g的胃蛋白酶，42℃下酶解10h，用1mol/L HCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶解结束后95℃灭酶20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶解物；
S2、取海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮K-30和山梨醇，然后溶于注射用水总量4/5的注射用水中，115℃的温度下进行灭菌处理15min，得到溶液A；
S3、取大豆分离蛋白和步骤S1制得的小麦蛋白酶解物，溶于剩余部分的注射用水中，然后用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
S4、将步骤S2制得的溶液A与步骤S3制得的溶液B混合，即得本发明实施例2重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂。
实施例3 本发明重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂
重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成：海藻糖4%、蔗糖3%、山梨醇0.7%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 2%、大豆分离蛋白5%、小麦蛋白酶解物0.8%，余量为注射用水。
制备方法同实施例2。
对比例1
重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成：海藻糖5%、蔗糖1%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1.5%、大豆分离蛋白5.8%，余量为注射用水。
制备方法与实施2类似，不同的是不需要制备小麦蛋白酶解物。
对比例2
重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成：蔗糖6%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1.5%、大豆分离蛋白5%、小麦蛋白酶解物0.8%，余量为注射用水。
制备方法同实施例2类似。
试验例
对本发明的实施例1-3、对比例1-2制得的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的性能进行测试。
本发明试验例所述的重组伪狂犬病病毒疫苗保藏于中国典型培养物培养中心，保藏号为：CCTCC-V201408，该重组病毒（rPRV-ORF2）可有效表达PCV2的ORF2基因，可用于制备PCV2-PRV二联基因工程疫苗。本发明所述的ST细胞购自中国兽药监察所。
1、制苗用毒液的制备与毒价测定
选用生长良好的单层ST细胞，倾去细胞生长液，加入0.2‰重组病毒rPRV-ORF2病毒液，37℃吸附1h后，加入适量细胞维持液，37℃继续培养，当全部细胞出现CPE时，冻融收获病毒，置-80℃以下保存备用。按Reed-Muench两氏法测定与计算病毒滴度TCID50。测得其毒价TCID50为107.2/0.1mL。
2、PCV2-PRV二联基因工程活疫苗冻干前后毒价变化
取实施例1-3、对比例1-2的耐热冻干保护剂，与上述rPRV-ORF2病毒悬液以1∶1混合配苗分装，2mL/瓶，然后立即进行冷冻干燥。冻干前毒价为107.78TCID50/瓶，冻干后测定毒价，结果见表1。
从表2的结果可以看出，本发明的耐热保护剂保护性能好，采用本发明耐热保护剂制备的PCV2-PRV二联基因工程活疫苗冻干前后重组病毒的损失率不超过0.3个滴度。
3、PCV2-PRV二联基因工程活疫苗耐老化试验和保存期试验
将上述冻干后的活疫苗分别置37℃、2℃-8℃条件下保存，定期取出若干瓶，观察其形状变化并测定其毒价以监测疫苗病毒含量变化情况。结果见表2和表3。
应用本发明耐热保护剂的PCV2-PRV二联基因工程活疫苗冻干产品在37℃存放21天后，物理性状良好，由表2的结果可知，每瓶疫苗的病毒滴度仅下降0.1-0.2个滴度。由表3的结果可知，应用本发明耐热保护剂的PCV2-PRV二联基因工程活疫苗冻干产品在2℃-8℃可保存24个月，每瓶疫苗病毒含量无明显下降，可见本发明耐热保护剂的配方能有效提高疫苗的保存期。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于由按照重量百分数计的如下组分制成：海藻糖4-8%、蔗糖0-3%、山梨醇0.2-0.8%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1-3%、大豆分离蛋白4-7%、小麦蛋白酶解物0.5-1%，余量为注射用水；
所述重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备小麦蛋白酶解物；
S2、取海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮K-30和山梨醇，然后溶于注射用水总量3/5-4/5的注射用水中，110-120℃的温度下进行灭菌处理10-20min，得到溶液A；
S3、取大豆分离蛋白和步骤S1制得的小麦蛋白酶解物，溶于剩余部分的注射用水中，然后用孔径为0.18-0.24μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
S4、将步骤S2制得的溶液A与步骤S3制得的溶液B混合，即得本发明重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂；
所述小麦蛋白酶解物的制备方法包括如下步骤：取小麦蛋白粉，加入其重量15~20倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入8~10mol/LHCL调节溶液pH值为2.0~4.0，加入1200~1800U/g的酶，35~45℃下酶解6~10h，用1~2mol/L HCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶解结束后95℃灭酶15~20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶解物。
2.根据权利要求1所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于由按照重量百分数计的如下组分制成：海藻糖5%、蔗糖1%、山梨醇0.6%、聚乙烯吡咯烷酮K-301.5%、大豆分离蛋白5%、小麦蛋白酶解物0.8%，余量为注射用水。
3.根据权利要求1所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于：所述的酶解小麦蛋白的酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于：所述的酶解小麦蛋白的酶为胃蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于：所述步骤S2中，在115℃的温度下进行灭菌处理15min。
6.根据权利要求1所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于：所述步骤S3中，滤膜孔径为0.22μm。
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