CN103301452A

CN103301452A - 一种猪乙型脑炎冻干疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN103301452A
Application number: CN2013102774248A
Authority: CN
Inventors: 邹桂荣; 管清江; 刘蕾; 申洪银; 陶晓珊; 张恒; 马爽; 郭莉莉
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2013-07-03
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2033-07-03
Also published as: CN103301452B

Abstract

本发明涉及一种猪乙型脑炎冻干疫苗，由猪乙型脑炎病毒抗原和保护剂组成，其中保护剂是由如下质量百分比浓度的物质组成的：2.4～4% NZ-胺、0.3～0.5%谷氨酸单钾盐、16～20%蔗糖、6～20%水解乳蛋白、1～1.6%明胶；余量为水。本发明的疫苗所用到的冻干保护剂采用的原料成本低，操作简单，可以大规模生产。由该保护剂制备的疫苗在2～8℃条件下保存24个月后，疫苗效价均≥10^5.7TCID₅₀/头份（国标），从而有效的延长了疫苗的保存期限。

Description

一种猪乙型脑炎冻干疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及耐热冻干保护剂，具体涉及一种猪乙型脑炎冻干疫苗及其制备方法。

背景技术

冻干活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，国内疫苗企业常用的冻干保护剂主要是蔗糖、脱脂奶粉和蔗糖、明胶简单配比，组方简单，保护性能差。如果在2～8℃条件下保存，保存期只有短短的3～6个月，大多需要在-15℃条件下保存。这就要求疫苗在保存、运输和使用过程中尽可能在低温条件下进行，否则疫苗的效价就会大打折扣。在疫苗生产、运输和使用过程中，如果任何一个环节的冷链系统控制不当，高温环境就会导致疫苗效力下降，最终因免疫失败而造成疫病流行。冻干保护剂可能影响生物制品的质量、效价和稳定性，耐热冻干保护剂有免疫活性而无药理活性，它不仅具有保护制品生物学活性的作用，而且具有赋形剂和抗氧化剂的作用，直接与疫苗的滴度和稳定性相关联，可在冻干和保存时维持疫苗的稳定性，确保制品在2～8℃条件下，保存期可长达24个月，效价无明显下降，即使在37℃条件下也可以保存十天以上。从而解决了常规疫苗在长途运输、长期保存和使用过程中不耐热、储存温度低、保存期短和苛刻的冷冻条件造成大量能源浪费等难题。但目前使用的冻干保护剂用于猪乙型脑炎疫苗的保存效果并不好。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪乙型脑炎冻干疫苗，即一种可以在2～8℃条件下长期保存仍能保持疫苗效价的耐热型猪乙型脑炎冻干疫苗。

本发明的猪乙型脑炎冻干疫苗，由猪乙型脑炎病毒抗原和保护剂组成，其中保护剂是由如下质量百分比浓度的物质组成的：2.5～3.5% NZ-胺、0.2～0.4%谷氨酸单钾盐、15～25%蔗糖、1.5～2.5%水解乳蛋白、4～6%明胶；余量为水。

上述的猪乙型脑炎冻干疫苗中还加入了青霉素和链霉素，其终浓度分别为青霉素100IU/ml，链霉素80μg/ml。

上述的耐热冻干保护剂，其制备方法如下：

1）首先称取NZ-胺、谷氨酸单钾盐、蔗糖和水解乳蛋白，溶解后过滤除菌制成过滤液；所使用的微孔滤膜孔径为0.22um。

2）称取明胶加入到70-80℃注射用水中，搅拌直至完全溶解，高压灭菌制成明胶溶液；明胶的浓度优选为W/V为25%；高压灭菌条件为116℃，20min。

3）将步骤1）制备的过滤液和步骤2）的明胶溶液4:1混合后，制成冻干保护剂。

本发明的耐热保护剂能最大限度地减少制品在分装及冻干过程中各种理化因素对病毒活性的损伤，使冻干前后病毒的效价损失较少，不超过0.2个滴度；本发明的耐热保护剂活疫苗耐老化程度高，在37℃条件下保存10天病毒的损失率不超过0.5个滴度，在2～8℃条件下保存24个月，疫苗效价仍不发生明显改变，从而有效的延长了疫苗的保存期限。

本发明的耐热冻干保护剂不仅耐热性能好、能有效保护病毒的活性，而且还具有配方成分及配制方法简单、成本低、可实现大批量生产等优点，降低了生产成本。

具体实施方式

在疫苗的冻干保护剂制备领域中，保护剂组分的选择及配比对疫苗的保存效果具有重要的影响。为了使本发明的猪瘟疫苗能够长期保存，申请人对本发明冻干保护剂的组分进行了长期的研究，并优化了彼此间的配比浓度，从而使各组分之间具有最大的复配效果。

对于本发明冻干保护剂所使用的组分，其性质如下：

1、NZ胺（NZ-Amine AS），又称为酪蛋白的酶促水解物；

2、谷氨酸单钾盐（L-谷氨酸钾盐）：是一种表面活性剂，可降低界面的张力，在冻结和脱水过程中既能降低冰、水界面张力所引起的冻结和脱水变形，又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂作用。

3、水解乳蛋白又称水解乳清蛋白，是蛋白酶水解浓缩乳清蛋白或乳白蛋白的产物，含足量的必须氨基酸。

4、蔗糖具有渗透作用，能抑制有害微生物生长，延长产品保藏期，具有很好的水溶性。可提高微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用，可防止活性组分变性。

对于本发明冻干保护剂的组分描述如下，NZ-胺购自SIGMA公司，谷氨酸单钾盐购自SIGMA，水解乳蛋白购自GIBCO，蔗糖购自德国默克，明胶购自SIGMA。

本发明的猪乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus) YBJE株，该病毒株于2012年10月31日保藏在北京市朝阳区大屯路中国科学院的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.6753。

下面对本发明的冻干疫苗进行详细的描述

一、冻干保护剂的配制

表1 本发明的耐热冻干保护剂各实施例的配方表（分A液和B液两部分,其中组份的含量浓度为质量体积百分比浓度g/ml）

1）A液配制：分别称取NZ-胺、谷氨酸单钾盐、蔗糖、水解乳蛋白，将以上成分按顺序溶于3500ml注射用水中，充分溶解后摇匀，补充注射用水至4000ml,，摇匀，用0.22μm滤膜过滤除菌， 37℃温室中保存备用。

2）B液配制：取明胶，用800ml 70-80℃的注射用水充分溶解后，补充注射用水至1000ml后搅匀，121℃、15磅高压灭菌20分钟，灭菌后保存在37℃温室中保存备用。

3）将A液和B液进行配比，混合均匀即为耐热冻干保护剂。

二、制备猪乙型脑炎冻干疫苗

1、猪乙型脑炎病毒液的制备

①BHK-21细胞的复苏、培养：从液氮中取出冻存的BHK-21细胞(购自美国ATCC细胞库)冻存管，迅速放在37℃水浴中使其快速融化。将每个冻存管中的细胞转移至盛有5ml细胞生长液的离心管中，500r/min离心5分钟，弃去上清液，用10ml细胞生长液（含10%小牛血清、1%L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、80ug/ml链霉素的MEM营养液）重悬细胞，将细胞移入一次性进口细胞培养瓶中吹打均匀，置37℃、5%CO2培养箱中静止培养。48～72小时形成良好单层后，弃去生长液，用PBS洗细胞面2次，用细胞消化液（0.25%胰酶-0.02%EDTA）将细胞消化下来，待细胞面出现针尖大小的缝隙时，吸弃细胞消化液，轻拍细胞瓶，细胞沿瓶壁均匀脱落，此时用吸管吸取细胞生长液，轻轻吹打分散细胞，使细胞分散为单个细胞，将分散的细胞悬液按1：3～1：4的比例进行扩大培养。

②病毒的增殖：当细胞长满瓶壁的80%～90%时，将猪乙型脑炎病毒YBJE株接种到细胞单层上，补足细胞维持液（MEM营养液中含2%小牛血清，100IU/ml青霉素、80ug/ml链霉素，pH7.4～7.6）置35℃～36℃培养，每天观察细胞病变，待细胞病变达到75%～80%时，收获猪乙型脑炎病毒培养液，-20℃冷库中保存备用。

2、将收获的乙脑病毒经无菌检验和病毒含量测定，合格的病毒液一部分与制备的耐热冻干保护剂按体积比4：1的比例进行混合，另一部分与5%蔗糖牛奶保护剂混合，二者分别按比例加入青、链霉素，使其终浓度分别为青霉素100IU/ml、链霉素80μg/ml，充分摇匀，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥。用牛奶蔗糖做保护剂冻干的疫苗为对照组常规疫苗。

3、将分装好的病毒液装入冻干机箱内，选取预冻温度为-50℃、预冻时低温保持时间为2h、预冻前期控制在-15℃，待产品释放解吸热后快速冷冻：升华阶段产品温度为-33℃、板层温度设定为-8℃、升华时间为11h；解吸温度为26℃、解吸时间为4h,冻干全过程为24h，加塞出箱，得到耐热型猪乙型脑炎活疫苗。

实施例制备的冻干产品的各项指标测试

1、冻干前后病毒含量测定将成品疫苗用细胞维持液稀释至10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度，分别接种已长成单层的BHK-21细胞96孔细胞板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，在含5%CO₂、37℃条件下培养箱培养5～7日，用Reed-Muench法计算TCID₅₀，每头份病毒含量应≥10^5.7TCID₅₀，同时与对照组病毒含量作比较，结果见表2。

表2：各实施例耐热冻干保护剂活疫苗冻干前后病毒含量（TCID50/头份）变化

组别	冻干前	冻干后
			实施例1疫苗组	10^7.9	10^7.7
实施例2疫苗组	10^8.1	10^7.9
			实施例3疫苗组	10^8.0	10^7.8
常规疫苗对照组	10^8.0	10^7.6

由表2可见，采用本发明耐热保护剂制备的猪乙型脑炎活疫苗冻干前后病毒含量损失少，不超过0.2个滴度；而用牛奶蔗糖冻干的常规疫苗病毒含量损失较大，为0.4个滴度。说明本发明耐热保护剂较常规保护剂对乙脑病毒有更好的保护作用。

2、疫苗保存期试验将三个实施例中制备的疫苗连同常规疫苗分别放置-15℃、2～8℃、37℃条件下保存，定期取出几瓶，测定其性状、真空度、剩余水分和病毒含量。详细结果见表3。

表3：各实施例冻干样品37℃保存不同时间性状、真空度、剩余水分、效价检测结果

表4 ：各实施例冻干样品2～8℃保存不同时间性状、真空度、剩余水分、效价检测结果

表5：各实施例冻干样品-15℃保存不同时间性状、真空度、剩余水分、效价检测结果

从以上试验结果可以看出，本发明的耐热冻干保护剂对猪乙型脑炎病毒有很好的保护作用，从性状、剩余水分、真空度和效价几个方面保护效果明显优于用普通保护剂冻干的常规疫苗。

3、疫苗的安全性试验

3.1 对仔猪安全性试验用30～45日龄健康易感仔猪10头，随机分成2组，每组5头，分别大剂量肌肉注射本发明耐热保护剂疫苗和对照组常规疫苗，2ml/头（10头份）。注射后观察有无出现皮肤潮红、呼吸异常、口吐白沫等过敏反应，每日观察并记录仔猪体温、采食饮水、精神状况、粪便、生长情况，连续观察14日。结果详见表6。

表6 两种疫苗对仔猪安全性试验结果

注：“4/5正常”表示注射常规疫苗对照组有1头猪出现一过性呼吸急促过敏反应。

试验结果表明，用本耐热保护剂冻干的疫苗对仔猪的安全性明显优于常规疫苗对照组。

3.2 小鼠脑内致病力试验取体重12～14g清洁级小鼠20只，随机分成2组，每组10只，分别接种本发明耐热冻干保护剂冻干的实施例2疫苗和常规疫苗对照组，每只小鼠脑内接种毒种液0.03ml。连续观察14日，记录接种后小鼠的健活情况，尤其要密切观察接种后72小时内出现的非特异性死亡的小鼠数量，结果详见表7

表7 两种疫苗对小鼠安全性检验结果

试验结果表明，用本发明耐热冻干保护剂冻干的乙脑疫苗对本病毒最敏感的动物小鼠脑内致病力为0，说明该疫苗是非常安全的。

4、免疫持续期和抗体消长规律检测

4.1 母猪免疫持续期和抗体消长规律检测用6~7月龄健康易感后备母猪10，随机分成2组，每组5头，分别肌肉注射保存于2～8℃24个月的本发明耐热保护剂疫苗和对照组常规疫苗，每头猪肌肉注射疫苗1ml （含1头份），分别于免疫后2周、3周、4周、2、4、6、7个月各采一组血液分离血清，用血清中和试验测定中和抗体效价，进行免疫持续期及抗体消长规律检测。

试验结果：本发明实施例2疫苗免疫健康易感后备母猪，2周后血清抗体2/5阳性（中和指数≥10），4周抗体全部阳性，至7个月抗体阳性率仍为5/5；而常规疫苗对照组血清抗体免后4周只有1/5为阳性，至7个月时阳性率为0/5。结果详见表8。

表8 两种疫苗接种母猪免疫持续期试验结果

注：当中和抗体≥10时，抗体呈阳性；当中和抗体<10时，为阴性，记为0。

4.2 仔猪免疫持续期和抗体消长规律检测用28～35日龄健康易感仔猪10头，随机分成2组，每组5头，分别肌肉注射保存于2～8℃24个月的本发明耐热保护剂疫苗和对照组常规疫苗，每头猪肌肉注射疫苗1ml （含1头份），分别于免疫后2周、3周、4周、2、4、6、7个月各采一组血液分离血清，用血清中和试验测定中和抗体效价，进行免疫持续期及抗体消长规律检测。

试验结果用本发明实施例2疫苗免疫健康易感仔猪，2周后血清抗体1/5阳性（中和指数≥10），3周3/5抗体阳性，4周5/5抗体阳性，至7个月抗体阳性率仍为5/5；而常规疫苗对照组血清抗体3周仅1/5阳性，至7月阳性率仅为1/5。结果详见表9。

表9 两种疫苗接种仔猪的免疫持续期试验结果

试验结果表明，本发明耐热保护剂疫苗在2～8℃条件下保存24个月，疫苗仍有很好的免疫原性，免疫效果确实，抗体产生快，抗体阳性率高，母猪和仔猪免后4周即可100%产生抗体，免疫持续期长，抗体持续长达7个月之久，免疫效果明显优于常规疫苗对照组。

5、后备母猪攻毒保护试验用6~7月龄健康易感后备母猪10头，随机分成2组，每组5头，每头肌肉注射1ml。28日后配种并采血，分离血清，用血清中和试验测定血清抗体。怀孕30~45日后，每头猪肌肉注射乙脑强毒P3株 2ml，观察直至分娩。攻毒后7、14日采血，检测乙脑病毒。分娩时记录所产健仔数和异常仔数（弱仔数、死胎和木乃伊胎），每头异常仔采脐带血或组织，PCR检测乙脑病毒。以每头母猪所产仔猪至少有1头乙脑病毒阳性，判该母猪发病。结果详见表10。

表10 两种疫苗初产母猪攻毒保护试验结果

试验结果表明，本发明耐热保护剂疫苗在2～8℃条件下保存24个月，免疫猪100%能产生很高的抗体水平，免疫猪能很好地抵抗强毒的攻击；而常规疫苗对照组在2～8℃条件下保存24个月，免疫效果差，只有20%猪产生抗体并能抵抗强毒的攻击。该试验说明本发明耐热保护剂冻干的疫苗免疫效果明显优于常规疫苗对照组。

综上所述，本发明耐热保护剂对病毒的保护效果明显高于普通冻干保护剂。

Claims

1.一种猪乙型脑炎冻干疫苗，由作为抗原的猪乙型脑炎病毒和保护剂组成，其中保护剂的组成如下：2.5～3.5% NZ-胺、0.2～0.4%谷氨酸单钾盐、15～25%蔗糖、1.5～2.5%水解乳蛋白、4～6%明胶；余量为水。

2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于还加入了青霉素和链霉素，其终浓度分别为青霉素100IU/ml，链霉素80μg/ml。

3.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述的猪乙型脑炎病毒的保藏编号为CGMCC No.6753。

4.如权利要求1所述的疫苗，其特征在所述的耐热冻干保护剂，其制备方法如下：

1）首先称取NZ-胺、谷氨酸单钾盐、蔗糖和水解乳蛋白，溶解后过滤除菌制成过滤液；

2）称取明胶加入到沸水中，搅拌直至完全溶解，高压灭菌制成明胶溶液；

3）将步骤1）的过滤液和步骤2）的明胶溶液混合后，制成冻干保护剂。

5.如权利要求3所述的疫苗，其特征在于所述的步骤1）的过滤除菌是用0.22μm滤膜过滤除菌。

6.权利要求1所述的疫苗用于预防猪乙型脑炎。