CN103933561B

CN103933561B - 一种猪流行性腹泻活疫苗

Info

Publication number: CN103933561B
Application number: CN201410082924.0A
Authority: CN
Inventors: 陶晓珊; 刘蕾; 申洪银; 邹桂荣; 邹敏; 胡潇; 张维; 范根成; 孙健
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2034-03-07
Also published as: CN103933561A

Abstract

本发明提供一种猪流行性腹泻疫苗，包含有抗原和保护剂，其中抗原是保藏编号为CGMCC？No.8503的猪流行性腹泻病毒SD10株。本发明的疫苗所使用的抗原猪流行性腹泻病毒SD10株的毒性低，免疫原性好，制成的疫苗免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，在配种前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒的攻击，提高仔猪的存活率。

Description

一种猪流行性腹泻活疫苗

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪流行性腹泻活疫苗及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，本病对不同年龄的猪均易感，尤其哺乳仔猪危害最严重，是一种高度接触性传染病。该病于1971年首发于英国，20世纪80年代初我国陆续发生本病。近几年，全国猪流行性腹泻呈爆发流行，给养殖业造成了巨大的经济损失。该病感染目前还没有有效的治疗方法，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，国外主要是韩国的弱毒苗，国内主要是哈兽研研制的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻灭活疫苗等，但临床应用效果不是很理想。因此，有必要筛选出低毒，且保持高免疫原性的猪流行性腹泻病毒来制备疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻活疫苗，即由一种弱毒性作为抗原制备的疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明的猪流行性腹泻疫苗，包含有抗原和保护剂，其中抗原是保藏编号为CGMCCNo.8503的猪流行性腹泻病毒SD10株。

其中的保护剂可以为目前使用的任一种病毒疫苗用保护剂，

优选保护剂为蔗糖和明胶，其在疫苗中的质量百分比终浓度分别为5%和1%；

更优选在保护剂中添加酪蛋白酸钠，添加的质量百分比浓度为0.5%。

优选在保护剂中添加用于防止细菌感染的抗生素。

本发明的疫苗所使用的抗原猪流行性腹泻病毒SD10株的毒性低，免疫原性好，制成的疫苗免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，在配种前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒的攻击，提高仔猪的存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的疫苗进行详细的描述。

实施例1：猪流行性腹泻病毒SD10株的筛选

1.1猪流行性腹泻病毒SD10株的分离和鉴定在进行流行病学调查时，从山东莱西某猪场送检的腹泻猪小肠内容物中分离到一株猪流行性腹泻病毒（命名为SD10A1株），猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测阳性，盲传至第8代出现细胞病变，第16代出现规律、稳定的细胞病变，病毒含量≥10^5.0TCID₅₀/0.1ml，能够被抗猪流行性腹泻病毒特异性血清中和，传至第121代时，传代的病毒对3～5日龄健康未吃初乳仔猪安全，纯净，无细菌、霉菌、支原体和外源病毒（猪瘟、猪细小病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合症、猪口蹄疫病毒）污染。将最终传代分离的SD10株（猪流行性腹泻病毒PorcineEpidemicDiarrheaVirus）进行保藏，于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.8503。

1.2本毒株接种母猪后，母猪未见流产、早产等不良反应，所产仔猪未有腹泻发生。

1.3本发明毒株的病毒含量≥10^5.0TCID₅₀/0.1ml。

1.4本发明毒株安全性好，对3～5日龄健康未吃初乳仔猪安全。

1.5本发明毒株病毒液与冻干保护剂混合，经冷冻真空干燥制备的疫苗，免疫母猪后，所产仔猪能够100%抵抗强毒的攻击。

1.6克隆SD10株的ORF3基因,其全长为675bp,编码有224个氨基酸。通过在NCBI中进行blastn分析，结果分离的ORF3基因与已报道的猪流行性腹泻病毒的ORF3基因都存在3-5个氨基酸的差别。表明本发明所分离的SD10株与已有的猪流行性腹泻病毒都存在遗传上的差异，为一新的病毒株。

二、用筛选的SD10株制备疫苗

1.1疫苗的制备

1.2按照常规方法制备Vero细胞(Vero细胞购自美国ATCC)，生长液为含8%新生牛血清的MEM，培养细胞长成单层时接种SD10株病毒；

1.3取SD10株毒种（≥10^5.0TCID₅₀/0.1ml）按1%接种长势良好的Vero细胞单层，置37℃吸附1.5小时，加含2%新生牛血清MEM维持液继续培养；

1.4接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，细胞病变达75%以上时收获，反复冻融3次；

1.5取冻融后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于10^5.0TCID₅₀；

1.6将检验合格的细胞毒液与保护剂按常规方法制备成疫苗。

其中的保护剂可以为目前使用的任一种病毒疫苗用保护剂，例如蔗糖牛奶冻干保护剂；以及蔗糖和明胶的保护剂其在疫苗中的质量百分比终浓度分别为5%和1%。

为了提供疫苗的保存时间，本申请对疫苗的保护剂进行优化，最终制成的疫苗中包含有质量百分比浓度为5%的蔗糖、1%明胶和0.5%的酪蛋白酸钠（将1ml疫苗视为1g）。通过添加上述的组分，可以使疫苗在长期保存后，还能保持活力。在4℃条件下放置180日，其效价基本不变，放置360日，其抗体阻断率稍有下降，但仍高于规定的标准；而用普通保护剂冻干的产品，在4℃条件下放置180日，其抗体效价基本上能达到规定的标准，但放置360日后抗体效价下降很快，尤其720日后不可再使用，只能按报废品处理。

2.疫苗检验方法及结果

2.1性状检验3批活疫苗外观呈淡黄色海绵状疏松团块，加入稀释液后迅速溶解，易与瓶壁脱离。

2.2无菌检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。

2.3支原体检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均无支原体生长。

2.4外源病毒检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均无猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒污染。

2.5剩余水分检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，剩余水分分别为2.5%、2.2%、2.4%。

2.6真空度检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均呈紫色辉光。

2.7安全检验取猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的3日龄仔猪20头，随机分成4组，每组5头，口服10头份疫苗，临床观察14日，均5/5健活，未见不良反应发生。

2.8效力检验用细胞维持液将疫苗稀释为每1.0ml含1头份，再作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-64个稀释度，分别接种长势良好的Vero细胞（96孔细胞培养板），每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设细胞阴性对照孔。接种后，置37℃、含5%CO₂培养72～96小时，观察细胞病变，出现CPE者判为感染，计算TCID₅₀。3批活疫苗每头份病毒含量分别为10^5.5TCID₅₀、10^5.7TCID₅₀、10^5.5TCID₅₀，均不低于10^5.0TCID₅₀。

表1：3批活疫苗检验结果

实施例2猪流行性腹泻活疫苗的安全试验

1.材料与方法

1.1单剂量试验

1.1.1对妊娠母猪的单剂量试验取产前4～6周猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪6头，随机分成2组，每组3头，第1组肌肉注射201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组不进行注射作为对照组，观察至母猪产仔。

1.1.2对仔猪的单剂量试验取1日龄仔猪12头，随机分成2组，每组6头，第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组不进行口服作为对照组，观察14日。

1.2单剂量重复试验

1.2.1对妊娠母猪的单剂量重复试验取产前4～6周猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪6头，随机分成2组，每组3头，第1组肌肉注射201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组不进行注射免疫，免疫后2周第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，观察至母猪产仔。

1.2.2对仔猪的单剂量重复试验取1日龄仔猪12头，随机分成2组，每组6头，第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，第2组不进行口服作为对照组，免后2周第1组口服201001批猪流行性腹泻活疫苗1头份/头，观察14日。

1.3超剂量试验

1.3.1对妊娠母猪的超剂量试验取产前4～6周猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的妊娠母猪12头，随机分成4组，每组3头，第1、2、3组分别肌肉注射201001、201002、201003批猪流行性腹泻活疫苗各10头份/头，第4组不进行注射作为对照组，观察至母猪产仔。

1.3.2对仔猪的超剂量试验取1日龄仔猪24头，随机分成4组，每组6头，第1、2、3组分别口服201001批猪流行性腹泻活疫苗各10头份/头，第4组不进行口服作为对照组，观察14日。

2.结果

2.1单剂量试验结果免疫组3头妊娠母猪与对照组比较，采食、饮水、妊娠产仔均未见异常，注射部位均未见不良反应。免疫组6头仔猪与对照组比较，吃乳、诱饲、粪便均未见异常。

2.2单剂量重复试验结果免疫组3头妊娠母猪与对照组比较，采食、饮水、妊娠均未见异常，注射部位均未见不良反应。免疫组6头仔猪与对照组比较，吃乳、诱饲、粪便均未见异常。

2.3超剂量试验结果3批疫苗免疫组的9头妊娠母猪，采食、饮水、妊娠均未见异常，注射部位均未见不良反应。免疫组18头仔猪与对照组比较，吃乳、诱饲、粪便均未见异常。

实施例3猪流行性腹泻活疫苗的效力试验

1.主动免疫试验

1.1材料和方法取产前4～6周妊娠母猪8头，随机分成2组，每组4头，第1组颈部肌肉注射201001批猪流行性腹泻活疫苗，第2组不注射作为对照组，母猪产仔后，3日龄、7日龄、14日龄、21日龄仔猪各取14头，随机分成2组，每组7头，均口服猪流行性腹泻强毒5ml，观察攻毒后仔猪的临床表现。

1.2结果免疫母猪所产的仔猪，3日龄攻毒后，7头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。7日龄攻毒后，免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。14日龄攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。21日龄攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；7头对照仔猪攻毒后，6/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。

表2免疫母猪所产的仔猪攻毒保护率

攻毒日龄	免疫组攻毒保护率	对照组攻毒保护率
			3日龄	7/7	0/7
7日龄	7/7	0/7
			14日龄	7/7	0/7
21日龄	7/7	1/7

2.被动免疫试验

2.1材料和方法1-3日龄仔猪42头，随机分成2大组，每组21头，第1组颈部肌肉注射201001批猪流行性腹泻活疫苗，第2组不口服作为对照组，于免后7日、14日、21日各取14头，再随机分成2组，每组7头，均口服猪流行性腹泻强毒5ml，观察攻毒后仔猪的临床表现。

2.2结果免后7日攻毒后，7头免疫仔猪哺乳、精神、粪便未见异常，均健活；7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。免后14日攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；7头对照仔猪攻毒后，7/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。免后21日攻毒后，7头免疫仔猪采食、精神、粪便未见异常，均健活；7头对照仔猪攻毒后，6/7表现典型的猪流行性腹泻症状，6/7死亡。

表3主动免疫仔猪攻毒保护率

免后时间	免疫组攻毒保护率	对照组攻毒保护率
			7日	7/7	0/7
14日	7/7	0/7
			21日	7/7	1/7

2.3疫苗的特异性检测

免疫实验的结果表明，本发明制备的疫苗能够有效的预防目前流行的猪流行性腹泻病毒的侵染，效果与目前使用的猪流行性腹泻病毒疫苗的效果相似.但对于SD10A1株的浸染的免疫能力上,本发明制备的疫苗具有更高的免疫效力,推测是由SD10A1株及由SD10A1株传代获得的SD10株相比于已有的猪流行性腹泻病毒的遗传差异导致的。

Claims

1.一种猪流行性腹泻疫苗，包含有抗原和保护剂，其特征在于，所述的抗原是保藏编号为CGMCCNo.8503的猪流行性腹泻病毒SD10株。

2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻疫苗，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒SD10株是由强毒株经过传代后获得的。

3.如权利要求1所述的猪流行性腹泻疫苗，其特征在于，所述的保护剂为蔗糖和明胶，其在疫苗中的质量百分比终浓度分别为5％和1％；

4.如权利要求3所述的猪流行性腹泻疫苗，其特征在于，所述的保护剂中添加有酪蛋白酸钠。

5.如权利要求4所述的猪流行性腹泻疫苗，其特征在于，所述的酪蛋白酸钠添加的质量百分比浓度为0.5％。

6.权利要求3或4所述的猪流行性腹泻疫苗，其特征在于，所述的保护剂中添加有用于防止细菌感染的抗生素。