CN104017776A

CN104017776A - 一种羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104017776A
Application number: CN201410160855.0A
Authority: CN
Inventors: 刘湘涛; 王光祥; 尚佑军; 张志东; 王艳华; 黎摄儿; �田宏; 吴锦艳; 陈妍; 逯忠新
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2014-04-21
Filing date: 2014-04-21
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2034-04-21
Also published as: CN104017776B

Abstract

本发明公开了一种羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗及其制备方法和应用，在本发明的一种羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗中，其有效成分为经本发明发明人自行分离且经传代致弱培养后获得的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒，其保藏编号为CCTCC NO：V201406。攻毒保护试验结果显示，本发明所制备的ORFV细胞弱毒疫苗安全，且能够产生有效的免疫保护力。因此，本发明对于研制安全高效的弱毒疫苗以及用本发明公开的弱毒株规模化生产羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗来防控羊传染性脓疱病具有重要的现实意义。

Description

一种羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种弱毒疫苗及其制备方法和应用，特别涉及一种羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗及其制备方法和应用，本发明属于兽医生物制品领域。

背景技术

羊传染性脓疱病(Contagious ecthyma,CE)又名羊传染性脓疱性皮炎(Contagious pustular dermatitis)，俗称“羊口疮(Orf)”，是由是由副痘病毒成员羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)感染引起山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的的人兽共患传染病,以在患羊的口唇、蹄、乳房、外阴等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状厚痂为特征。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为需申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。

该病最早发现于欧洲，目前，几乎在所有养羊国家和地区均存在。自然情况下主要侵害绵羊和山羊，山羊较为多发。此外，骆驼、牛、鹿、麝牛、猫、幼犬、猴和人均有易感性。本病常呈群发性流行的趋势，3～6月龄羔羊最易感染，常引起群体发病，尤其是饲养密集的羊群。范春玲等报道了我国2006年在北京市亚福动物养殖中心暴发该病，该病传播速度快，发病率高达95.4％。近年来随着肉羊产业的发展和羊频繁流动，该病时有发生，甚至在一些大型种羊场都有该病的流行，给养羊业带来了巨大的经济损失，严重危害肉羊产业的健康发展。更为严重的是，此病可以通过伤口感染饲养人员，感染者表现为手背、指间和前臂部疱疹和破溃。例如2005年8月福建省永安市有8名羊场养殖工人因感染羊传染性脓疱病毒而发病。可见，羊传染性脓疱不但严重危害肉羊产业的健康发展，而且威胁人类的身体健康，是一种危害较为严重的人畜共患传染病。

目前，羊口疮流行地区尚无有效的治疗方法，所以，免疫接种成为了防控该病唯一有效的方法。爆发该病时许多基层养殖人员直接取病羊的痂皮研磨后与盐水混合制成自家疫苗对未感染羊只进行接种；虽然该方法能在一定程度上控制病情的发，展，但是却具有散布强毒的危险。目前疫苗的发展和应用主要集中在常规疫苗，如灭活疫苗和细胞弱毒疫苗，以及新型疫苗，如囊膜亚单位疫苗、核酸疫苗和重组疫苗上。但是目前，ORFV新型疫苗的研制还处于试验阶段，且新型疫苗往往制备过程繁琐、技术要求高，应用于临床还有很长一段路要走。灭活疫苗虽然国内外学者均有研究，但其免疫效果有限，从未真正应用于临床。目前，在临床上应用较为广泛的仍然是ORFV弱毒疫苗，因为它具有用量少，能诱导机体产生较强的细胞免疫和体液免疫能力，且产生免疫保护力的时间持久的特点。在国内，虽然羊口疮弱毒疫苗在青海省畜牧兽医科学院兽医研究所和甘肃省畜牧兽医研究所均有研制，但其弱毒都是上世纪80年代前后的毒株，目前国内流行毒可能发生变异，很难保证其免疫的有效性。

本发明选用分离获得的ORFV湖北通山县分离毒株作为疫苗研制的候选毒株，利用牛睾丸支持细胞系传代致弱，培育出符合“兽用新生物制品质量标准”的ORFV弱毒疫苗株，配比一定比例的耐热冻干保护剂制备冻干弱毒疫苗，攻毒保护试验结果显示所制备的ORFV细胞弱毒疫苗能够产生有效的免疫保护力。因此，本发明利用ORFV流行毒株研制安全高效的弱毒疫苗对于该病的防治具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有羊传染性脓疱弱毒疫苗的不足，本发明的目的在于提供一种羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗及其制备方法，以实现用简单实用的制备方法生产出产量高、稳定性好、成本低、并且安全可靠的疫苗。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

2009年11月中旬，湖北省通山县某羊场有300多只1月～3月龄黑山羊羔羊发病，发病率达80％，主要表现为典型的口疮症状，经多种抗生素和驱虫药治疗无效，1周后有40多只病羊死亡。本发明发明人通过对该病料进行病例复制、病毒分离，最终得到一株病毒株，经病毒理化特性鉴定、针对羊传染性脓疱病毒B2L基因的特异性PCR检测及测序证明分离得到的病毒株该病原为羊传染性脓疱病毒病毒(王光祥等，湖北省羊口疮病毒的分离鉴定，动物医学进展，2012，33(11)：37－40)，并将该病毒命名为Orf Virus HB-TS09株，简称ORFV/HB/09株。

用MDBK细胞系对湖北株羊口疮病料进行适应分离的Orf Virus HB-TS09株病毒传代至17代，再将该细胞毒接种新生牛睾丸原代细胞进行传代致弱，传代至55代时进行本动物安全试验发现，该细胞毒已致弱。然后继续传代至85代，每隔五代取病毒(滴度TCID₅₀不低于10^6.0/0.1mL)的细胞毒进行本动物安全试验，证实该毒株传代至55代后对绵羊羔羊、成年绵羊以及山羊羔羊以及成年山羊均安全。故取75～85代之间的传代毒作为制苗毒种。其中，选择Orf Virus HB-TS09第65代细胞传代致弱毒作为羊传染性脓疱病毒弱毒疫苗株，命名为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株，分类命名为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒，并于2014年3月19日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO：V201406，保藏地址在武汉大学。

进一步的，本发明还提出了所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒在制备羊传染性脓疱病毒弱毒疫苗中的应用。

本发明的一种羊传染性脓疱病毒弱毒疫苗，其特征在于其有效成分为本发明所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒。

此外，本发明还提供了一种制备羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)病毒抗原的制备

选生长良好布满单层的新生牛睾丸原代细胞(BT)，倾去营养液，按原营养液体积的1-10％接种羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65或其传代毒的病毒液，吸附5-15分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养；培养40～72h，细胞病变(CPE)达到75％以上时收获病毒，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、安全检验、支原体检验、外源病毒检验合格达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且病毒滴度(TCID₅₀/0.1ml)不低于10⁶/0.1mL时，作为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原，备用。

(2)疫苗的配制和冻干

将步骤(1)制备的各项指标都合格的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原与耐热冻干保护剂以1︰1的比例混匀后，以2mL/瓶无菌条件下封装于链瓶内，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为成品弱毒疫苗，将其在2～8℃下保存。

在本发明所述的方法中，优选的，按原营养液体积的5％接种羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65的病毒液吸附10分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养。

在本发明所述的方法中，优选的，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖30～70g/L，脱脂奶粉10～30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L，明胶5～15g/L，精氨酸0.5～4g/L，维生素C1～5g/L，剩余成分为超纯水，更优选的，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖50g/L，脱脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C2.5g/L，剩余成分为超纯水。

所述的耐热冻干保护剂的制备方法包括：(1)对可高压灭菌的物质：海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脱脂奶粉、明胶按各自比例溶于超纯水中，加热至50～60℃溶解后，116℃灭菌30分钟；(2)将不耐高温的物质精氨酸、维生素C也按各自比例溶于超纯水中，用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌：各组分别将(1)、(2)两组份混合，得到所述的耐热冻干保护剂。

相较于现有技术，本发明的优点在于：

1、选用流行毒株的细胞传代致弱毒来制备疫苗，保证了疫苗的免疫保护力；

2、利用本实验室研制的针对ORFV病毒的耐热冻干保护剂，解决了羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗仅能在-15℃条件下保存和运输的瓶颈技术，使该疫苗储存、运输更方便。

本发明将为临床上针对羊传染性脓疱病的防控以及羊传染性脓疱病毒在羊群中的清除提供了重要的物质基础和技术支撑，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不多本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明的技术方案和细节形式和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护的范围内。

实施例1羊传染性脓疱病毒株(Orf Virus HB-TS09株)的分离和致弱

1.1羊传染性脓疱病毒株(Orf Virus HB-TS09株)的分离鉴定

2009年11月中旬，湖北省通山县某羊场有300多只1月～3月龄黑山羊羔羊发病，发病率达80％，主要表现为典型的口疮症状，经多种抗生素和驱虫药治疗无效，1周后有40多只病羊死亡。本发明发明人对该病料进行病例复制，病毒分离，最终得到一株病毒株，该病毒株经病毒理化特性鉴定、针对羊传染性脓疱病毒B2L基因的特异性PCR检测及测序证明该病毒株为羊传染性脓疱病毒病毒(王光祥等，湖北省羊口疮病毒的分离鉴定，动物医学进展，2012，33(11)：37－40)，命名为Orf Virus HB-TS09株，简称ORFV/HB/09株。

1.2羊传染性脓疱病毒株(Orf Virus HB-TS09株)的致弱

用MDBK细胞系对湖北株羊口疮病料进行适应分离的Orf Virus HB-TS09株病毒传代至17代，病毒TCID₅₀达到10^5.4/0.1mL。利用牛睾丸原代(BT)细胞进行传代致弱。传代至55代(每代次细胞毒致细胞病变(CPE)良好)，毒价均在10^6.0/0.1mL以上，回归本动物进行本动物安全试验发现，该细胞毒已致弱。然后继续传代至85代，进行进一步的试验。

1.3毒种纯净性检验

分别取传代致弱毒55代、60代、65代、70代、75代、80代、85代7代次细胞毒，按现行《中国兽药典》，2010版，附录42页进行无菌检验。各代次细胞毒无菌落生长；按现行《中国兽药典》，2010版，附录49页进行支原体检验。各代次细胞毒无支原体生长；按现行《中国兽药典》，2010版，附录40页进行外源病毒检验。各代次细胞毒无外源病毒污染；证明各代次致弱细胞毒纯净、无污染。

1.2致弱毒株安全性检验

分别取传代致弱毒55代、60代、65代、70代、75代、80代、85代(各代次细胞病毒TCID₅₀不小于10^6.0/0.1mL)，每代次细胞毒，以1ml的接种剂量(羊口腔黏膜划线接种0.4mL、股内侧皮内接种0.6mL)接种1年龄左右健康易感绵羊(从未患过羊传染性脓疱病毒病、也未注射过羊传染性脓疱病疫苗的健康易感绵羊)3只；以1ml的接种剂量(羊口腔黏膜划线接种0.4mL、股内侧皮内接种0.6mL)分别接种1年龄左右健康易感山羊(从未患过羊传染性脓疱病毒病、也未注射过羊传染性脓疱病疫苗的健康易感山羊)3只，共接种8组。随机挑选绵羊、山羊各一只以1mL剂量接种生理盐水(羊口腔黏膜划线接种0.4mL、股内侧皮内接种0.6ml)做对照。口腔粘膜划线接种后每日测定接种羊和对照羊的体温和口腔粘膜的病变情况，观察15日，进行致弱毒株安全性评价。

结果：

接种各代次Orf Virus HB-TS09株致弱毒株的羊只组在观察期内，各试验组羊只，在口腔粘膜均出现红点，在接种后3天自行消失。对照羊正常。证明致弱毒株Orf Virus HB-TS09株对绵羊、山羊均安全、无致病性，是一株安全的疫苗弱毒株。

选择Orf Virus HB-TS09第65代致弱毒株作为羊传染性脓疱病毒弱毒疫苗株，命名为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65，并于2014年3月19日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO：V201406，保藏地址在武汉大学。

实施例2羊传染性脓疱细胞弱毒疫苗的制备

2.1羊传染性脓疱弱毒抗原的制备

选生长良好布满单层的新生牛睾丸原代细胞(BT)，倾去营养液，按原营养液体积的5％接种羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65的病毒液(CCTCC NO：V201406)，吸附10分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养。培养48h，细胞病变(CPE)达到80％时收获，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、安全检验、支原体检验合格达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，Reed-Muench法测定Orf Virus HB-TS09F65的病毒滴度(TCID₅₀/0.1ml)为10^6.5/0.1ml。共制备羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒病毒液5000ml作为制备疫苗的病毒抗原。

2.2.疫苗的配制和冻干

将2.1制备的各项指标都合格的羊传染性脓疱病毒细胞弱毒抗原与耐热冻干保护剂(海藻糖5g/L、脱脂奶2g/L、聚乙烯吡咯烷酮2g/L、明胶1g/L、精氨酸0.15g/L、Vc0.25g/L、剩余成分为超纯水，经无菌处理得到的保护剂。)以体积比1︰1的比例混匀后，以2mL/瓶无菌条件下封装于链瓶内，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为成品弱毒疫苗，并将其在2℃-8℃温度下保存。共制备弱毒冻干疫苗三批每批1700瓶，批号为：20130526、20130822、20130829。

实施例3羊传染性脓疱细胞弱毒疫苗成品检验

3.1物理性状

产品为微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

3.2无菌检验

从制备保存的20130526、20130822、20130829三批羊传染性脓疱细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录42页进行，疫苗成品无细菌生长。

3.3支原体检验

从制备保存的20130526、20130822、20130829三批羊传染性脓疱细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录49页进行支原体检验。各代次细胞毒无支原体生长；

3.4外源病毒检验

从制备保存的20130526、20130822、20130829三批羊传染性脓疱细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录40页进行外源病毒检验。各代次细胞毒无外源病毒污染；证明各代次致弱细胞毒纯净、无污染。

3.5冻干弱毒疫苗安全性检验

选健康羊传染性脓疱病病史的成年绵羊(1年龄)和成年山羊(1年龄)各4只。进行疫苗安全检验。具体方法同1.2。

试验结果表明，试验羊只均未发现明显的体温变化和口腔病变。说明该弱毒疫苗对绵羊和山羊安全、无致病性。安全检测合格。

3.6冻干羊传染性脓疱细胞弱毒疫苗剩余水分测定

从制备保存的20130526、20130822、20130829三批羊传染性脓疱细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录38页进行测定，三批疫苗均符合规定。

3.7冻干羊传染性脓疱细胞弱毒疫苗真空度测定

从制备保存的20130526、20130822、20130829三批羊传染性脓疱细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按现行《中国兽药典》，2010版，附录48页进行测定，三批疫苗均符合规定。

实施例4冻干弱毒疫苗效力检验

4.1从制备保存的20130526、20130822、20130829三批羊传染性脓疱细胞弱毒疫苗中每批苗随机取三瓶，按原量稀释混合，用犊牛睾丸原代细胞测定半数感染量(TCID₅₀)，要求羊口疮冻干疫苗TCID₅₀不低于10⁶/0.1mL。

4.2每批疫苗用6月龄健康羔羊4只，于口腔下唇粘膜划痕接种疫苗0.2mL，另用同样条件的健康羔羊作对照，21～25天用强毒Orf Virus HB-TS09株攻击(100ID₅₀/0.2mL)。观察10～15天，结果如表1所示。说明使用本发明的羊传染性脓疱细胞弱毒株Orf Virus HB-TS09F65株所制备的冻干弱毒疫苗对绵羊和山羊免疫保护力好，可用临床免疫预防羊羊传染性脓疱病.

表1冻干弱毒疫苗效力检验

疫苗批号	接种羊只数	发病羊只数	保护效率
				20130526	4	1	75％
20130822	4	0	100％
				20130829	4	0	100％

对照组

4

0

实施例5羊传染性脓疱细胞弱毒疫苗中试试验

将无菌检验、安全检检、效力检验合格的三批羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗，在2013年6月至11月期间分别发往甘肃、昆明、四川、内蒙、贵州、河南、河北、安徽、辽宁等省肉羊产业技术体系综合试验站开展了共计4万头份疫苗，进行中试试验。就目前收集结果来看，使用该疫苗的综合试验站羊群，无论成年羊还是羔羊，羊口疮的发病率明显低于往年，证明该弱毒疫苗临床使用有效，可以有效预防羊传染性脓疱病的发生。

Claims

1.羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒，命名为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2014年3月19日，保藏编号为CCTCC NO：V201406。

2.权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒在制备羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗中的应用。

3.一种羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗，其特征在于有效成分为权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒或其传代毒。

4.一种制备权利要求3所述的羊传染性脓疱病毒细胞弱毒疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)病毒抗原的制备

选生长良好布满单层的新生牛睾丸原代细胞，倾去营养液，按原营养液体积的1-10％接种权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒或其传代毒的病毒液，吸附5-15分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养；培养40～72h，细胞病变达到75％以上时收获病毒，置-20℃冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、安全检验、支原体检验、外源病毒检验，达到《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》中规定的各项指标，且病毒滴度不低于10⁶TCID₅₀/0.1ml时，作为羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原，备用；

(2)疫苗的配制和冻干

将步骤(1)制备的各项指标都合格的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒抗原与耐热冻干保护剂以体积比1︰1的比例混匀后，以2mL/瓶无菌条件下封装于链瓶内，在低温冷冻干燥机内进行冻干，即为成品弱毒疫苗，将其在2℃-8℃下保存。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，按原营养液体积的5％接种权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒细胞传代致弱毒的病毒液，吸附10分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行培养。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖30～70g/L，脱脂奶粉10～30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10～30g/L，明胶5～15g/L，精氨酸0.5～4g/L，维生素C1～5g/L，剩余成分为超纯水。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述耐热冻干保护剂中含有海藻糖50g/L，脱脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明胶10g/L，精氨酸1.5g/L，维生素C2.5g/L，剩余成分为超纯水。