CN106432433A - 羊传染性脓疱病毒保护性抗原b2l及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了上述羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因和关键性氨基酸构成以及应用。本发明获取了羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的详细结构特征，对B2L蛋白的关键性氨基酸进行分析，将有助于今后开发羊口疮基因工程疫苗。

Description

羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L及其应用

技术领域

本发明属于动物分子生物学领域，涉及一种羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L及其应用。

背景技术

羊口疮病毒(orf virus,ORFV)是痘病毒科(Poxviridae)、副痘病毒属(Parapoxvirus)中的成员，在副痘病毒属中还包含假牛痘病毒(PCPV)、牛丘疹性口炎病毒(BPSV)、松鼠副痘病毒(SPPV)和新西兰的马鹿病毒(PNZV)等，均与羊口疮病毒类似。典型的ORFV粒子外部有囊膜包裹，类似橄榄球形状，病毒粒子长230～290nm，宽140～200nm。电子显微镜观察下，可见羊口疮病毒粒子表面呈特征性的编织螺旋样结构相互交叉排列，围绕病毒粒子的长轴作“8”字形缠绕。羊口疮病毒粒子存在两种不同形态，第一种是细胞内成熟病毒(Intracellular mature virus,IMV)，该类型病毒表面不存在囊膜结构；另一种为细胞外包膜病毒(Extracellular enveloped virus,EEV)，这种类型的病毒具有囊膜结构。IMV型病毒粒子大多呈现上尖下宽的结构，表面没有特殊结构，IMV型病毒粒子可以由EEV型病毒粒子在有机溶剂或者在碱性溶液中脱去表面囊膜结构而形成。并且发现人工感染的病羊病变组织中，IMV型颗粒占多数，而自然发病的羊，病料中IMV型粒子仅占有少数，EEV型粒子则占多数。由于ORFV的生存能力较强，很难彻底清除羊群中存在的病毒。

ORFV基因组中的第11号基因为B2L基因，位于病毒基因组的保守区，该基因全长1137bp，编码蛋白质大小为42kDa，该基因的G+C含量约为63.6％。但是不同毒株的B2L蛋白也有一些小的差异，B2L基因编码的379个氨基酸中，可能有5～12个氨基酸出现差异。国内外常利用B2L基因的稳定性来分析比较各个毒株的同源性以及构建进化树，也利用该基因通过PCR检测病毒。从分子水平了解毒株间亲缘关系以及变异情况。ORFV 011(B2L)基因在病毒DNA开始复制后即活跃地开始翻译。42kDa蛋白是病毒囊膜的主要成分之一，可刺激机体产生强烈的抗体反应，并能引起淋巴细胞增殖。1994年，Sullivan等通过氨基酸同源性分析发现，ORFV的B2L蛋白不仅与VAC EEV的p37K囊膜蛋白高度同源，还与FPV和MCV的p43k蛋白具有较高的同源性，因此推测ORFV的B2L蛋白为病毒囊膜主要成分之一，是研究病毒与宿主细胞相互作用、结合的重要蛋白。

目前，基因工程疫苗已经成为国内外羊口疮新型疫苗研究的主要方向，并取得了多方面的进展。Sullivan曾报道ORFV产生IgG的囊膜蛋白为42kDa(B2L)，免疫羔羊能够产生较好的免疫原性，为羊口疮亚单位疫苗和基因工程疫苗设计的构建了雏形。国外一些研究者正着手用B2L基因与病毒囊膜亚单位中的其它保护性抗原基因进行重组，有望获得优良的基因工程苗。我国基因疫苗研究仍滞后于国外，主要表现在基础研究薄弱，自主知识产权产品较少，原始创新能力有待加强。

单克隆抗体保护性表位作图及功能性氨基酸残基的鉴定，对于确定表位疫苗的候选成分至关重要。1997年Czerny等利用ORFV突变株ORFV-D-1701株单抗通过竞争ELSIA鉴定出3个不同的抗原位点，其中一株单抗(IgM)能够中和病毒感染；同时确定其单抗针对39kDa和22kDa两种病毒表面蛋白。1998年Housawi等从28株针对CEV-F1L的单抗中获得1株可以识别8种副痘病毒的共享性单抗，预示该单抗所识别的抗原表位位于病毒基因组的保守区。我们通过B2L蛋白的中和性单抗2E4的B细胞构象型抗原表位精确作图，发现其表位的天然组成及关键性氨基酸残基，综合若干ORFV的T细胞表位，为研发羊口疮多表位DNA重组疫苗积累了数据。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的氨基酸序列。

本发明的第二目的是提供上述羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因。

本发明的第三目的是提供上述羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因的特异性PCR引物。

本发明的第四目的是提供上述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的中和性构象表位的关键性氨基酸构成。

本发明的第五目的是提供上述羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

二、上述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

三、上述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因的特异性PCR引物，序列如下：

F:CCAAAGCTTTACATAATCGGGGTTGCC(SEQ ID No.3)，

R:CCGAATTCTCACACGATGGCCGTGACC(SEQ ID No.4)。

四、上述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的中和性构象表位的关键性氨基酸残基为N⁵⁶、Q⁸⁷和D⁹⁴。

五、上述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L在制备治疗羊口疮药物中的应用。

具体的，根据GenBank中羊传染性脓疱病毒(ORFV)标准株ORFV-NZ2(NCBIAccession:DQ184476)的DNA参考序列，设计囊膜蛋白B2L基因的特异性引物，以黑龙江流行株OV/HLJ/04提取的DNA为模板，通过PCR扩增，获得B2L基因。将B2L基因克隆于pMD18-T载体中，转化至DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，将PCR鉴定和酶切鉴定正确的阳性克隆送上海生工进行测序，根据测序结果进一步分析B2L产物：同源序列比对；分子进化分析；抗原特性分析；同源建模等。

B2L中和性构象表位作图，采取了综合性方法。首先通过饱和硫酸铵法和pro.G柱法纯化单抗2E4，进而针对2E4识别的模拟表位基序进行了生物淘选。采用噬菌体随机展示肽库技术获得10株阳性DNA突变体，通过阳性克隆之间的测序、比对，获得其模拟表位基序为VKVNPPQYDLxx(x代表任意氨基酸残基)。经与GeneBank中公开的ORFV同源基因氨基酸序列比对，推断2E4表位为构象型表位；继而，根据B2L分子同源建模在线搜索结果，结合DNAStar预测数据，将B2L蛋白分为前55aa残基、中31aa残基以及后38aa残基三个区段进行原核表达。通过Western blot分析验证，将2E4表位定位于前55aa残基区段内。第三，确定2E4构象表位中关键性的氨基酸残基。根据同源建模的3D模型，在表位相关区域内选择K⁶¹、K⁶⁹、K⁷⁵、D⁹⁴、E⁹⁵和L⁹⁶共6个疑似目标氨基酸，利用分丙氨酸扫描法构建突变重组质粒pGEX-6p-1-n(n代表6个不同位置的目标残基)，表达，纯化，Western blot验证。结果发现D⁹⁴位置取代后，使2E4与B2L蛋白反应能力显著下降，而其它氨基酸的替换对于B2L结合影响不大，而共同突变K⁶¹、E⁶²、D⁹²、D⁹⁴成丙氨酸后，使B2L蛋白与2E4反应几乎完全丧失，从而证明D⁹⁴为2E4表位的关键性氨基酸。根据综合分析结果，判定2E4表位的功能区依赖于N⁵⁶、Q⁸⁷和D⁹⁴等共同维系的空间构象。

采用上述技术方案的积极效果：本发明获取了羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的详细结构特征，对B2L蛋白的关键性氨基酸进行分析，将有助于今后开发羊口疮基因工程疫苗。

附图说明

图1是PCR扩增B2L基因，M:DNA Marker 1:B2L基因PCR产物；

图2是重组质粒酶切鉴定结果，M:DNA Marker 1:pET30a-B2L重组质粒用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切产物；

图3是重组B2L蛋白表达以及纯化，M:蛋白Marker 1:大肠杆菌BL21(DE3)2:pET30a-B2L重组菌诱导前3:用IPTG诱导3小时的pET30a-B2L重组菌 4:经过纯化的B2L蛋白；

图4是B2L蛋白B细胞表位的预测结果；

图5是近年来国内外ORFV流行株B2L基因之间的遗传关系；

图6是近年来国内外ORFV流行株B2L蛋白之间的差异性分析结果(小方框表示发生变异)；

图7是McAb 2E4的阳性噬菌体克隆的筛选；

图8是B2L蛋白F1段蛋白同源建模结构，A、B图:F1段蛋白同源建模结果C图:单个突变的6个氨基酸在模型中的位置D图:共同突变4个氨基酸在模型中的位置；

图9是突变体PCR扩增；

图10是重组质粒酶切鉴定结果；

图11是重组蛋白表达，ALL：共同突变K61、E62、D92、D94成丙氨酸A；

图12是重组蛋白的纯化，ALL：共同突变K61、E62、D92、D94成丙氨酸蛋白；

图13是重组蛋白与单克隆抗体2E4的结合能力，6p-1：GST标签蛋白；B1：F1段(58-112位氨基酸)蛋白；

图14是重组蛋白与单克隆抗体2E4的结合能力，6p-1：GST标签蛋白；B1：F1段(58-112位氨基酸)蛋白；ALL：共同突变K61、E62、D92、D94成A；

图15是ORFV的B2L蛋白二级结构及2E4表位功能区。

具体实施方式

本发明中生物材料的来源：

1、Ph.D.-l2^TMM13噬菌体肽库购自NEB公司；

2、噬菌体宿主菌ER2738购自NEB公司；

3、所有引物为自行设计并委托上海生工生物公司合成。

下面通过具体的实施方式对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例说明B2L基因克隆测序。

(1)病毒DNA的提取取病料痂皮样品制备病毒悬液，接毒BT细胞和MDBK细胞，取细胞病变的上清200μL，按照TIANamp Virus DNA/RNA试剂盒说明书提取病毒DNA，获得的病毒DNA于-20℃保存。

(2)PCR扩增根据ORFV标准株NZ2(DQ184476)，利用primer 5设计一对引物，F:CCAAAGCTTTACATAATCGGGGTTGCC(SEQ ID No.3)，R:CCGAATTCTCACACGATGGCCGTGACC(SEQ IDNo.4)，分别带有HindⅢ(AAGCTT)和EcoRⅠ(GAATTC)酶切位点。PCR产物大小应该为1137bp。20μL PCR体系中加入模板1μL，dNTPs 2μL，Taq酶0.5μL，F引物0.5μL，R引物0.5μL，10×buffer 2.5μL，去离子水17μL。PCR反应条件是在95℃，5min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，30s，进行30个循环；最后在72℃延伸10min。取扩增产物4μL，1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。结果在1137bp处有一个条特异性亮带与预期大小相符(图1)。挑单菌落接种于含Kan+(100μg/mL)的LB液体培养基中37℃，200rpm培养6h，提取质粒，以提取的pET-30a-B2L质粒为模板进行PCR鉴定，在1137bp处扩增出单一条带，与预期相符，并用HindⅢ和EcoR I双酶切鉴定，酶切得到的两个片段一个大约5400bp与pET-30a大小相等，另一个片段大约1137bp与目的片段大小相符(图2)。

(3)克隆测序回收PCR产物分别克隆于pMD18-T载体中，16℃连接过夜，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选可能插人B2L片断的白色菌落。将PCR鉴定和酶切鉴定正确的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得B2L基因的全长序列。含重组表达质粒pET30a-B2L的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导处理后，利用His标签进行蛋白纯化后，进行SDS-PAGE跑胶。结果与预期一致在约49kDa处有一大量表达的蛋白条带，纯化后蛋白条带单一，表明已经成功将B2L蛋白纯化(1.65mg/mL)(图3)。

(4)B2L进化树分析将ORFV黑龙江分离株OV/HLJ/04进行进化树分析。采用MEGA5.1软件对以下分离株的B2L基因构建进化树，选择菜单中的phylogeny选项，然后进入construct/maximum likelihood tree模式，将步长调为1000构建进化树，并对分离株OV/HLJ/04和亲缘性近的分离株基于B2L基因在NCBI上进行Blast序列比对(表1)，其遗传关系比对结果如图5所示，氨基酸水平的差异性分析结果如图6所示。

表1列举国内外近年来发生的病例报道(GenBank数据)

注：▲表示国内流行株；表示OV-OV/HLJ/04株；表示NZ2标准株。

(5)B2L氨基酸序列免疫原性分析利用B细胞表位预测软件对B2L蛋白的二级结构进行抗原表位的预测，主要根据亲水性、抗原性、表面可及性、可塑性、电荷分布、二级结构预测等方案来进行分析B2L蛋白表位区域，利用DNASTAR软件进行预测。

采用DNAStar针对B2L氨基酸序列进行免疫原性和抗原性分析，结果如图4所示。其中80～100位氨基酸的亲水性指数可达3左右，抗原指数可达1.5左右，表面可及性指数出现峰值。在205～235位氨基酸抗原指数也将近1.7。结合以上方案得出58～112位氨基酸，205～235位氨基酸，338～375位氨基酸三个段较易形成B细胞表位。

实施例2

本实施例说明2E4单抗腹水的制备、纯化及测定。

选取7只BALB/c小鼠，要求是8～12周龄、活泼、健康、体格强壮的雌性小鼠。通过腹腔注射灭菌的液体石蜡0.5mL/只。一周后，每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞(～4×10⁶个/只)。10d后，小鼠腹部逐渐膨大，利用注射器吸取小鼠体内腹水，3000rpm离心10min，分装后冻存于-20℃冰箱备用。

2E4腹水的纯化及检测采用如下方法步骤：

(1)粗纯选用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法进行纯化。为防止单抗变性，以下所有步骤都需要在冰上操作。取出腹水4℃融化，12000rpm，4℃离心10min。收集上清，除去腹水中的杂质。按照1:2的比例将腹水与0.06mol/L醋酸钠(pH4.8)混合均匀。然后用盐酸(2mol/L)调节pH至4.5，在室温下按照1mL腹水加33μL正辛酸(C₈H₁₆O₂)的比例，滴完再搅拌40min。随后将腹水和正辛酸混合液体移入4℃冰箱内，静置2h。将静置液体移入离心管内，12000rpm，4℃离心60min，取上清，上清用2mol/L的NaOH调结pH至7.4。在冰浴条件下，将上清逐滴加入等体积未调pH的饱和硫酸铵溶液(pH 4.53)，然后将混合的液体调节pH至7.3。样品充分混合后，随即将样品转入4℃冰箱内静置过夜，第二天，将样品转入离心管内，10000rpm，4℃离心30min，弃尽上清，用pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀，置于透析袋中透析过夜，次日使用PEG8000进行浓缩，浓缩后从透析袋中吸取液体至离心管中，用Nanodrop测定蛋白浓度，取样进行SDS-PAGE检测。

(2)精纯将初步纯化的2E4单抗使用Nab^TM Protein G Spin Kit进行精纯。具体操作方法：在室温下用Buffer平衡柱子，按照1：1的比例将样品和Binding buffer混合，撕掉柱子的底封，打开盖子，将柱子放在一个15mL离心管中，使柱子中原有的液体流淌干净收集，并保存。加5mL Binding buffer平衡柱子，将已稀释的样品加入柱子中，重复过柱三次，以保证绝大部分单抗结合到柱子上。用Binding buffer洗柱子，大约需要洗20个柱体积后。取5个15mL的离心管，每管加100μL Neutralization buffer，将柱子放入15mL离心管中，用5mL Elute buffer洗脱单抗，在每个含有Neutralization buffer的离心管中收集1mL洗脱的抗体。之后对蛋白浓度进行测定，并保存于-20℃。

(3)抗体效价检测将新纯化的B2L蛋白稀释至最佳包被浓度5μg/mL，包被到ELISA酶标板中，每孔100μL，4℃过夜，按照ELISA操作步骤进行，以精纯的2E4作为一抗，按1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200用PBS稀释。以SP2/0细胞培养上清作为对照。二抗用PBS按照1:5000稀释HRP-羊抗鼠IgG。步骤按照4(2)ELISA方法进行。

(4)SDS-PAGE鉴定采用常规方法进行SDS-PAGE鉴定2E4纯度。

实施例3

本实施例说明生物淘洗过程。

将纯化的2E4经SDS-PAGE鉴定纯度后用于生物淘洗，用Ph.D.-l2^TMM13噬菌体展示随机线性十二肽库对单抗2E4进行表位作图。生物淘洗参照试剂盒说明书进行：第1轮淘洗时于微孔板中包被单抗10μg/孔，第2、3轮分别按5μg/孔、1μg/孔的单抗使用量包被，4℃过夜；用0.05％TBST洗涤后，以10g/L BSA封闭，加入1.5×10¹¹pfu/100μLM13噬菌体，于室温轻摇1h，用TBST洗涤10次，用洗脱缓冲液将结合的噬菌体于室温轻摇10min洗脱下来，加入缓冲液中和洗脱的噬菌体，接种大肠杆菌ER2738进行扩增。对扩增后的噬菌体进行回收并测定滴度，取1.5×10¹¹pfu噬菌体进入下一轮淘洗。第4轮淘洗时，采用Protein G进行液相结合，该轮单抗使用量为300ng。之后，挑取单个噬菌体克隆进行扩增，用噬菌体亲和捕获ELISA鉴定其活性。期间，使用1μL洗脱后产物通过LB/IPTG/X-Gal平板测定效价，并且贮存于4℃。次日观察平板上的蓝斑数，通过计数，根据公式：噬菌体滴度＝噬菌斑的平均数×稀释倍数，计算出噬菌体加入量和淘洗过程中的投入产出比。

为鉴定单抗2E4识别的构象表位，利用一个展示随机线性十二肽的噬菌体文库对纯化的单抗2E4进行4轮生物淘洗，在第3、4轮共挑取32个噬菌体克隆进行扩增，用噬菌体亲和捕获ELISA鉴定其反应活性，设立封闭液BSA作为对照，以排除BSA的干扰，最终获得10个针对抗体可变区的阳性噬菌体克隆(图7)，其中噬菌体克隆A3、A5、A6、A7和A8具有较高的亲和力。

对上述10个阳性噬菌体克隆的12肽序列进行序列分析(表2)，其中，克隆1和克隆3、克隆5和克隆6、克隆9和克隆10属于重复序列。经过序列比对后，推断其Motif是VKVNPPQYDLxx，与真实序列中VDVQSKDKDADELR存在相似之处。由于58～112位氨基酸当中，不同位置均出现VKV序列，其中VKV可能位于65～75位氨基酸，也有可能位于101～106位氨基酸。对F1段截断表达后可以排除101～106位氨基酸序列，NPPQ序列中的NPP均没有在序列中出现，只有Q出现在第87位氨基酸，Motif中的YDL可能是序列中的D94和E95以及L96，即DEL结构。据此结果初步判断该表位为构象型。

表2单抗2E4阳性克隆与B2L氨基酸序列比对

实施例4

本实施例说明噬菌体阳性克隆的筛选。

将纯化的单抗2E4稀释成10μg/mL，包被加到ELISA孔板中，放入4℃包被过夜，次日用0.5％的TBST洗涤液洗3次，加入200μL封阻缓冲液，放入4℃冰箱封闭2h，再洗涤6次，取100μL纯化的噬菌体加入反应孔中，室温下作用2h，每个样品重复3个孔，轻轻摇晃洗涤10遍，甩干后每孔加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶抗M13噬菌体抗体100μL，室温作用1h，用TMB显色液显色15min，观察反应情况，用2mol/L硫酸终止显色，用酶标仪测OD₄₅₀读数，同时要设立BSA阴性对照包被孔，根据结果P/N＞2.1判定是为阳性。

实施例5

本实施例说明噬菌体DNA的制备与测序。

第4轮洗脱的噬菌体被测定滴度后，随机挑选噬菌体克隆，用白色枪头把培养板中蓝色噬菌斑挑出放入1mL低盐LB ER2738菌培养液中，在37℃摇床中210rpm快速震荡培养4.5h。12000rpm离心1min，上清转入新离心管，再次离心1min，上清即为增殖噬菌体贮液。从上清中抽取500μL液体，转入新离心管中，加200μL PEG/NaCl混匀后静置10min，4℃10000rpm离心10min，弃去上清液，短暂离心5min，留沉淀，加100μL碘化物缓冲液和250μL乙醇温育10min。离心后弃掉上清再用70％的乙醇重新悬起沉淀离心10min。用30μL TE重悬沉淀，就可作为测序模板，送金唯智测序部测序。测序的引物为-96III(5-TGAGCGGATAACAATTTCAC-3)，测序后的噬菌体序列经过DNAStar与B2L的氨基酸序列进行比对分析。剩余的增殖噬菌体贮液用灭菌甘油保存并标记。

实施例6

本实施例说明B2L蛋白表位预测区段基因表达载体的构建。

根据DNAStar软件分析得出的结果，将B2L蛋白分为三段，利用原核表达载体pGEX-6p-1进行表达，第一段58～112位氨基酸命名为F1，第二段205～235位氨基酸命名为F2，第三段338～375位氨基酸命名为F3。利用Primer 5软件对B2L碱基序列进行引物设计，如表3。

表3.B2L截短肽重组蛋白引物序列

PCR扩增程序：25μL PCR体系中加入基因组2μL、dNTPs 2μL、Taq酶0.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、10×buffer 2.5μL、ddH₂O 17μL。PCR反应条件是在95℃，5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。取扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将已经鉴定正确的PCR产物。利用OMEGA胶回收试剂盒进行纯化。将回收的DNA片段用BamH I和Xho I进行双酶切，酶切体系为40μL，其中BamH I和Xho I内切酶各2μL、10×K Buffer 4μL，目的片段36μL。37℃水浴1h，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，并且对条带进行回收、纯化。与同样经过双酶切的pGEX-6p-1载体，在T4连接酶作用下16℃、4h，构建原核表达载体，转化至BL21感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培养，挑单菌落培养，并进行质粒的提取，利用BamH I和Xho I双酶切鉴定和PCR检测，筛选阳性克隆。取经酶切鉴定为阳性的质粒测序。

实施例7

本实施例说明预测表位区段重组蛋白的表达、纯化及检测。

对三段重组蛋白的诱导表达，利用GST标签进行蛋白纯化。纯化步骤如下：将250mL诱导后的菌体离心收集，加入破菌缓冲液10～15mL后进行超声破碎，离心取上清，让离心上清至少通过2次纯化柱，过柱完成后，使用破菌缓冲液对柱上的杂蛋白进行洗脱，保证所有杂蛋白被洗掉，使用5mL洗脱缓冲液将所需要的蛋白从柱上洗脱。纯化结束以后，使用醋酸、PBS、大量纯水洗柱，最后加入5mL 20％乙醇，保存在4℃。

为了初步确定B细胞表位的位置，利用Western blot方法进行检测。将纯化后的三段重组蛋白蛋白F1、F2、F3进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结束后用考马斯亮蓝染色一部分胶，其余进行转膜，在低温条件下，100V恒压转膜90min。转膜完成后，将膜浸泡在5％脱脂乳中，室温水平封闭1h，用PBST洗涤3次后，加入用封闭液稀释的单抗2E4，37℃作用1h后，洗涤3次，加入用PBS稀释的羊抗鼠二抗，室温作用1h，再洗六遍。用DAB显色。

实施例8

本实施例说明2E4表位确定及其关键性氨基酸检测。

针对F1段(58～112位氨基酸)进一步缩短为58～100位氨基酸，检测其能否与单克隆抗体继续反应。利用Primer 5进行引物设计，上游引物为：5-CGGGATCCAGCTCCACCAAGGAGGG-3(SEQ ID No.3)，下游引物为：5-CCTCGAGGCCCGCCGCGCGCAGCTCG-3(SEQ ID No.4)。以ORFV DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃、3min；94℃、45s，58℃、45s，72℃、50s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。将全部PCR产物进行跑胶回收，将回收产物进行BamHI和XhoI双酶切，条件37℃、1h，将目的条带回收，回收的产物与经过相同的内切酶酶切的pGEX-6p-1载体进行连接2h后，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，次日进行鉴定及测序。鉴定为阳性的克隆对其进行蛋白的诱导表达和纯化。得到纯化蛋白再次检测与单克隆抗体2E4的反应情况。

关键性氨基酸分析，根据噬菌体展示结果以及结合生物信息学的预测，共选出6个目标氨基酸，分别为第61位的赖氨酸(K⁶¹)、第69位的赖氨酸(K⁶⁹)、第75位的赖氨酸(K⁷⁵)、第94位的天冬氨酸(D⁹⁴)、第95位的谷氨酸(E⁹⁵)、第96位的亮氨酸(L⁹⁶)。利用分子生物学的方法，构建6种单个氨基酸突变成丙氨酸(A)的重组质粒，利用pGEX-6p-1原核表达6种突变蛋白并纯化。合成一段共同突变第61位的赖氨酸(K⁶¹)、第62位的谷氨酸(E⁶²)、第92位的天冬氨酸(D⁹²)以及第94位的天冬氨酸(D⁹⁴)四个氨基酸突变成丙氨酸的序列，用pGEX-6p-1原核表达纯化后，分别检测其与单克隆抗体的结合能力。利用分子生物学方法，在引物上设计突变，PCR合成的目的片段就会将目的氨基酸突变成丙氨酸。引物设计如下表4。

表4突变关键氨基酸引物设计

以F1的质粒为模板，利用以上6对引物进行PCR扩增，PCR反应条件是在94℃3min；94℃45s，60℃45s，72℃50s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。在经过BamHI和XhoI内切酶进行双酶切与同样经过双酶切的pGEX-6p-1载体相连转入大肠杆菌BL21(DE3)中，进行双酶切鉴定以及测序。重组载体蛋白表达纯化方法同上。

为了更近一步研究构象表位的结构，对F1段的氨基酸进行蛋白质三级结构的同源建模，从模型中可以看出从58～78位氨基酸形成1个α螺旋，79～88位氨基酸被折叠在蛋白质的内部，并不暴露在表面，不会形成B细胞表位，89～98位氨基酸形成一条线性的结构，并且暴露在蛋白质表面，99～112位氨基酸形成的结构沿着98位氨基酸延伸到后侧(如图8)。依据噬菌体展示结果以及蛋白质同源建模结果，选出在空间距离比较接近的、并且属于极性、暴露在蛋白质表面的氨基酸进行突变，共选择6个氨基酸区域内的可疑性残基(K⁶¹、K⁶⁹、K⁷⁵、D⁹⁴、E⁹⁵、L⁹⁶)进行逐一突变成丙氨酸(Ala)，以及在空间距离比较接近的4个氨基酸共同突变成丙氨酸。

为进一步鉴定VDVQSKDKDADELR附近区域的结合性和功能性，根据噬菌体展示结果，并结合生物信息学的预测，共选出6个关键氨基酸，分别为第61位的赖氨酸(K⁶¹)、第69位的赖氨酸(K⁶⁹)、第75位的赖氨酸(K⁷⁵)、第94位的天冬氨酸(D⁹⁴)、第95位的谷氨酸(E⁹⁵)、第96位的亮氨酸(L⁹⁶)。对6个疑似的关键氨基酸进行单个突变成丙氨酸，在引物上设计突变，利用原核表达载体pGEX-6p-1表达突变的蛋白并纯化(如图9、图10、图11、图12)，以及由金唯智生物技术有限公司合成一段共同突变第61位的赖氨酸(K⁶¹)、第62位的谷氨酸(E⁶²)、第92位的天冬氨酸(D⁹²)以及第94位的天冬氨酸(D⁹⁴)四个氨基酸突变成丙氨酸的基因序列，利用原核表达载体pGEX-6p-1表达并纯化后，分别检测与单克隆抗体的结合能力。其中发现当D⁹⁴突变成丙氨酸后，突变体蛋白与单抗的结合能力明显下降，但仍然有结合的能。在第94位的天冬氨酸(D⁹⁴)周围选取了另外3个距离比较接近的极性氨基酸共同突变成丙氨酸后，发现与单抗的结合能力几乎完全丧失(图13、图14)。最终确定2E4表位结构域为六肽结构K⁹¹D⁹²A⁹³D⁹⁴E⁹⁵L⁹⁶，其中D⁹⁴为表位关键性氨基酸。

通过综合分析，确定2E4构象表位的功能区依赖于N⁵⁶、Q⁸⁷和D⁹⁴等共同维系的空间构象，其中，D⁹⁴在该功能区承担关键性氨基酸的作用，如图15所示。

本发明获取了羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的详细结构特征，对B2L蛋白的关键性氨基酸进行分析，将有助于今后开发羊口疮基因工程疫苗。

Claims (5)

1.一种羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求2所述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的编码基因的特异性PCR引物，序列如下：

F:CCAAAGCTTTACATAATCGGGGTTGCC(SEQ ID No.3)，

R:CCGAATTCTCACACGATGGCCGTGACC(SEQ ID No.4)。

4.权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L的中和性构象表位的关键性氨基酸残基为N⁵⁶、Q⁸⁷和D⁹⁴。

5.权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒保护性抗原B2L在制备治疗羊口疮药物中的应用。