CN109336979A - 一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选方法和应用，属于免疫学技术领域。本发明提供了艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体的氨基酸序列。采用噬菌体展示技术，将带有恒定区特定基因序列插入到噬菌体编码外壳蛋白的载体中，经重组表达，外源基因表达产物融合在噬菌体外壳蛋白中，并呈现在噬菌体表面，形成噬菌体展示文库，经淘筛，表达纳米抗体的噬菌体单克隆，经测序得到纳米抗体。经phage‑ELISA鉴定，表面表达纳米抗体的噬菌体能够与艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原发生特异结合，且显色较强，说明所述纳米抗体与谷氨酸脱氢酶抗原具有较强的结合性能，因此纳米抗体替换常规抗体应用到艰难梭菌免疫检测试剂盒中。

Description

一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选 方法和应用
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选方法和应用。
背景技术
骆驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的重链抗体，该抗体只包含一个重链可变区和两个常规的CH2和CH3区。通过PCR技术克隆重链可变区所得到的单域抗体称之为VHH抗体(variable domain of heavy-chain antibody,VHH)，其分子量只有15KD，是普通IgG的十几分之一，结构直径2.5nm，长4nm，所以又称之为纳米抗体(nanobody,Nb)。纳米抗体是目前所知到的最小的具有完整抗原结合活性的抗体，由于其体积小，因此具有较强的抗原抗体结合能力，可以在原核细胞和真核细胞中高效表达。除此之外，还具有稳定的结构和高亲水性，并且由于VHH片段与人的VH序列具有高度同源性，可达到80％以上，具有较低的免疫原性所以可以对其进行人源化改造和修饰。基于以上优点，使得纳米抗体在一些疾病的诊断和治疗中具有的广泛的应用前景。
艰难梭菌是革兰氏阳性厌氧杆菌，广泛存在于自然界中，是人和动物肠道中的正常菌群，但是随着抗生素的不规范使用和其他化疗药物的应用，导致肠内稳定的微生态环境被破坏，导致艰难梭菌在适宜条件下过度繁殖，从而引起艰难梭菌感染，也成为艰难梭菌相关性腹泻，例如顽固性腹泻、伪膜性肠炎等。
艰难梭菌谷氨酸脱氢酶(GDH)是艰难梭菌的一种跨膜蛋白，具有稳定表达的特性，是不同菌株艰难梭菌的共同表膜抗原，并且在感染早期会大量产生GDH，因此可以针对艰难梭菌共同表膜抗原(GDH)进行ELISA检测或胶体金免疫层析的检测，作为临床初步筛查依据。目前检测中所用到的抗体主要是单克隆抗体或多克隆抗体，而单克隆抗体的制备过程较为复杂且周期长，多克隆抗体来源有限等问题，造成艰难梭菌免疫检测的困难。而基于纳米抗体稳定性强、特异性高、分子量小且制备相对简单等优势，使得纳米抗体可以大规模生产制备，降低成本并提高效率，因此，检测艰难梭菌的纳米抗体的研发会为今后检测艰难梭菌提供便利条件。但是目前国内外尚无相关GDH纳米抗体及其相关的检测试剂的产品。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选方法和应用，所述纳米抗体具有较强的与艰难梭菌谷氨酸脱氢酶特异性结合的能力，所述纳米抗体的应用为艰难梭菌的诊断和治疗提供更广泛的手段。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述纳米抗体包括抗原决定簇互补区CDR和骨架区FR；
所述抗原决定簇互补区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3；
所述骨架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4。
优选的，所述CDR1的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO:2；
所述CDR2的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO:3；
所述CDR3的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO:4；
所述FR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:5；
所述FR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:6；
所述FR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:7；
所述FR4的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:8。
本发明提供了所述艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体的编码序列，所述纳米抗体的编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示。
本发明提供了一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体的筛选方法，包括以下步骤：
(1)提取骆驼脾脏组织总RNA，从总RNA中抽提mRNA，反转录，得到cDNA；
(2)以所述cDNA为模板，用CALL001/CALL002引物对和VHH-F/VHH-R引物对进行巢式PCR扩增，得到VHH基因片段；
所述CALL001的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示；
所述CALL002的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示；
所述VHH-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示；
所述VHH-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示；
(3)将所述VHH基因片段和噬菌体载体pCANTAB 5E分别进行酶切，连接，得到噬菌体重组载体pCANTAB 5E-VHH；
(4)将所述噬菌体重组载体pCANTAB 5E-VHH转化至大肠杆菌中，得到重组菌；
(5)所述重组菌培养至OD6000.5时，将所述重组菌和辅助噬菌体混合感染1～1.5h，离心，将得到的菌体筛选培养，离心，回收噬菌体，得到VHH噬菌体展示文库；
(6)将所述VHH噬菌体展示文库加入包被有谷氨酸脱氢酶蛋白的96孔板中，经孵育、洗涤后，加入大肠杆菌侵染，分离出菌液，洗脱96孔板中VHH噬菌体展示文库，将得到的洗脱液、所述分离出的菌液和大肠杆菌混合侵染，得到的侵染液筛选培养，得到的菌液与辅助噬菌体混合后筛选培养，沉淀噬菌体，得到第一轮淘筛后的噬菌体展示文库；
(7)重复步骤(6)中的第一轮淘筛过程两次，得到表面表达有纳米抗体的噬菌体单克隆；
(8)对表面表达有纳米抗体的噬菌体单克隆进行测序，得到纳米抗体的氨基酸序列。
优选的，所述步骤(2)中用CALL001和CALL002引物对进行PCR扩增的程序为94℃5min；74℃30s，56℃30s，72℃45s，32个循环；72℃10min；
用所述VHH-F和VHH-R引物对进行PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃40s，64℃40s，72℃40s，5个循环；94℃40s，68℃45s，32个循环；72℃10min。
优选的，所述步骤(3)中酶切用内切酶包括NotI和SifI。
优选的，所述步骤(5)或步骤(6)中筛选培养用培养基为含有100μg/ml的Amp和50μg/ml的Kana的YT培养基。
优选的，所述步骤(5)或步骤(6)中辅助噬菌体的感染复数为20：1。
本发明提供了所述的纳米抗体或所述筛选方法筛选得到的纳米抗体在艰难梭菌免疫检测试剂盒中的应用。
本发明提供了一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。本发明采用噬菌体展示技术，将带有恒定区特定基因序列插入到噬菌体编码外壳蛋白的载体中，经过表达，使得外源基因的表达产物融合在噬菌体外壳蛋白中，并呈现在噬菌体表面，形成噬菌体展示文库，经过淘筛，表达纳米抗体的噬菌体单克隆，经测序得到纳米抗体。经phage-ELISA鉴定(图8)，表面表达所述纳米抗体的噬菌体能够与艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原发生特异结合，且显色较强，说明本发明提供的纳米抗体与谷氨酸脱氢酶抗原具有较强的结合性能。
本发明提供了所述艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体的筛选方法，采用噬菌体展示技术构建了噬菌体展示文库，经过三次淘筛操作，得到能够特异性与谷氨酸脱氢酶抗原结合的重组噬菌体。所述筛选方法操作简便，重复性好，能够在短时间内筛选得到有效结果，筛选效率高，对实验人员操作的有要求低，适合推广使用。
附图说明
图1为第一轮PCR扩增700bp DNA产物，M、1000bp标准DNA分子量标记物；1～3、700bp PCR扩增产物；
图2为第二轮PCR扩增VHH重链抗体可变区400bp DNA产物，M、1000bp标准DNA分子量标记物；1～5、400bp PCR扩增产物；
图3为菌落PCR鉴定噬菌体抗体展示库的插入率；M、1000bp标准DNA分子量标记物；1～20、随机挑取的单克隆菌落进行PCR鉴定；
图4为VHH抗体库中随机克隆的氨基酸序列MEGA系统进化树分析；
图5为VHH抗体库中9个随机克隆氨基酸多序列比对；
图6为初始噬菌体库经KM13辅助噬菌体救援后的噬菌体展示文库滴度测定结果图；
图7为phage-ELISA检测噬菌体多克隆上清实验结果图；
图8为phage-ELISA检测噬菌体单克隆上清实验结果图，其中图8a为噬菌体单克隆上清ELISA分布，图8b为吸光度值较高的阳性克隆间接Phage-ELISA。
具体实施方式
本发明提供了一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
在本发明中，所述纳米抗体优选包括抗原决定簇互补区CDR和骨架区FR。所述抗原决定簇互补区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3；所述骨架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4。所述CDR1的氨基酸序列优选为序列表中的SEQ ID NO:2。所述CDR2的氨基酸序列优选为序列表中的SEQ ID NO:3。所述CDR3的氨基酸序列优选为序列表中的SEQ ID NO:4。所述FR1的氨基酸序列优选为序列表中SEQ ID NO:5。所述FR2的氨基酸序列优选为序列表中SEQ ID NO:6。所述FR3的氨基酸序列优选为序列表中SEQ ID NO:7。所述FR4的氨基酸序列优选为序列表中SEQID NO:8。
本发明提供了所述艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体的编码序列。所述纳米抗体编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示。本发明对所述编码序列的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因合成方法即可。
在本发明中，所述纳米抗体的制备方法，优选采用原核生物表达系统重组表达的方法得到，具体优选包括以下步骤：
A.将所述纳米抗体的编码序列插入载体中，得到重组载体；
B.将所述重组载体转化至感受态中，转化后的感受态涂平板培养，筛选阳性克隆；
C.将所述阳性克隆扩大培养后，IPTG诱导培养，菌液离心后重悬菌体；
D.将所述菌体破碎，得到的上清液纯化，将得到的纯化蛋白溶液经过PBS透析复性，得到重组纳米抗体。
在本发明中，所述纳米抗体的编码序列插入载体的多克隆位点为为Nde I和XhoI。所述连接用酶为T4DNA连接酶。所述载体的种类优选为PET30a(+)。所述载体通过商业购买途径得到。
在本发明中，所述重组载体和感受态的体积比为1：20。所述重组载体的浓度为25ng/μl。本发明对所述感受态的来源没有特殊限制，采用本领域商品化感受态即可。
本发明对所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的转化方法即可。在本发明实施例中，所述转化的条件为：冰上放置30min,然后放入42℃中热激90s，冰浴15min。
在本发明中，所述菌体破碎的方法优选采用超声处理。所述超声处理的条件如下：100W，破碎3s，间歇3s，总工作时间15min。
在本发明中，所述PBS的浓度为0.0067mol/L。
在本发明中，所述纯化的方法优选如下将所述上清液过镍柱，用50～500mmol/L梯度的咪唑溶液洗脱得到目的纯化蛋白。
本发明提供了一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体的筛选方法，包括以下步骤：
(1)提取骆驼脾脏组织总RNA，从总RNA中抽提mRNA，反转录，得到cDNA；
(2)以所述cDNA为模板，用CALL001和CALL002引物对与VHH-F和VHH-R引物对进行巢式PCR扩增，得到VHH基因片段；
所述CALL001的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示；
所述CALL002的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示；
所述VHH-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示；
所述VHH-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示；
(3)将所述VHH基因片段和噬菌体载体pCANTAB 5E分别进行酶切，连接，得到噬菌体重组载体pCANTAB 5E-VHH；
(4)将所述噬菌体重组载体pCANTAB 5E-VHH转化至大肠杆菌中，得到重组菌；
(5)所述重组菌培养至OD6000.5时，将所述重组菌和辅助噬菌体混合感染1～1.5h，离心，将得到的菌体筛选培养，离心，回收噬菌体，得到VHH噬菌体展示文库；
(6)将所述VHH噬菌体展示文库加入包被有谷氨酸脱氢酶蛋白的96孔板中，经孵育、洗涤后，加入大肠杆菌侵染，分离出菌液，洗脱96孔板中VHH噬菌体展示文库，将得到的洗脱液、所述分离出的菌液和大肠杆菌混合侵染，得到的侵染液筛选培养，得到的菌液与辅助噬菌体混合后筛选培养，沉淀噬菌体，得到第一轮淘筛后的噬菌体展示文库；
(7)重复步骤(6)中的第一轮淘筛过程两次，得到表面表达有纳米抗体的噬菌体单克隆；
(8)对表面表达有纳米抗体的噬菌体单克隆进行测序，得到纳米抗体的氨基酸序列。
本发明提取骆驼脾脏组织总RNA，从总RNA中抽提mRNA，反转录，得到cDNA。
在本发明中，所述总RNA的提取方法优选采用常规Trizol法进行。抽提mRNA的方法优选采用mRNA纯化试剂盒进行。本发明对所述mRNA纯化试剂盒的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的mRNA纯化试剂盒即可。所述反转录优选采用cDNA反转录试剂盒完成即可。
得到cDNA后，本发明以所述cDNA为模板，用CALL001和CALL002引物对与VHH-F和VHH-R引物对进行巢式PCR扩增，得到VHH基因片段；
所述CALL001的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示；
所述CALL002的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示；
所述VHH-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示；
所述VHH-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示。
在本发明中，用CALL001和CALL002引物对进行PCR扩增的程序优选为94℃5min；74℃30s，56℃30s，72℃45s，32个循环；72℃10min。CALL001和CALL002引物对扩增的条带的大小为700bp。用所述VHH-F和VHH-R引物对进行PCR扩增的程序优选为：94℃5min；94℃40s，64℃40s，72℃40s，5个循环；94℃40s，68℃45s，32个循环；72℃10min。所述VHH-F和VHH-R引物对扩增的条带大小为400bp。两次PCR扩增体系不相同，第一次PCR扩增体系为20μl：cDNA 2μl，PCR Mix 10μl，CALL001 1μl，CALL002 1μl，ddH2O 6μl。第二次PCR扩增体系为50μl：第一轮PCR的DNA产物2μl，VHH-F 1μl，VHH-R 1μl，PCRMix 25μl，ddH2O 21μl。
得到VHH基因片段后，本发明将所述VHH基因片段和噬菌体载体pCANTAB 5E分别进行酶切，连接，得到噬菌体重组载体pCANTAB 5E-VHH。
在本发明中，所述酶切用内切酶优选包括NotI和SifI。所述NotI酶切的条件：37℃温育4h。所述NotI酶切的体系如下：NotI 1μl，目的片段14μl，载体14μl，10×NEB Buffer5μl(总体系50μl)。所述Sfi I酶切的条件如下：50℃温育4h。所述Sfi I的酶切体系如下：SfiI酶1μl，目的片段14μl，载体14μl，10×NEB Buffer5μl(总体系50μl)。
在本发明中，所述连接用酶为T4DNA连接酶。所述连接的条件为16℃连接4h，4℃连接过夜。
得到噬菌体重组载体pCANTAB 5E-VHH后，本发明将所述噬菌体重组载体pCANTAB5E-VHH转化至大肠杆菌中，得到重组菌。
本发明对所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可。在本发明实施例中，所述转化的方法为电转化。所述电转化的条件为2.5kv，25μF，200Ω，共进行电转化5次。所述大肠杆菌的菌株优选为TG1菌株。所述TG1菌株的来源为中科院赠送，也可以通过商品途径购买。
得到重组菌后，本发明所述重组菌培养至OD600 0.5时，将所述重组菌和辅助噬菌体混合感染1～1.5h，离心，将得到的菌体筛选培养，离心，回收噬菌体，得到VHH噬菌体展示文库。
本发明对所述辅助噬菌体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的辅助噬菌体即可。在本发明实施例中，所述辅助噬菌体的种类优选为KM13。所述辅助噬菌体的感染复数优选为20：1。由于噬菌粒载体只含噬菌体的部分遗传信息,因而建库与筛库都需要辅助噬菌体(helperphage)为大肠杆菌内部的噬菌粒DNA提供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白，从而具有感染性，并使目的基因展示在噬菌体表面的外壳蛋白。
在本发明中，所述筛选培养用培养基优选为含有100μg/ml的Amp和50μg/ml的Kana的YT培养基。本发明对所述YT培养基的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的YT培养基即可。
得到VHH噬菌体展示文库后，本发明将所述VHH噬菌体展示文库加入包被有谷氨酸脱氢酶蛋白的96孔板中，经孵育、洗涤后，加入大肠杆菌侵染，分离出菌液，洗脱96孔板中VHH噬菌体展示文库，将得到的洗脱液、所述分离出的菌液和大肠杆菌混合侵染，得到的侵染液筛选培养，得到的菌液与辅助噬菌体混合后筛选培养，沉淀噬菌体，得到第一轮淘筛后的噬菌体展示文库。
在本发明中，所述谷氨酸脱氢酶蛋白的包被浓度优选为20μg/ml。所述洗涤用溶液为含体积浓度1％吐温-20的PBST溶液。第一轮淘筛的具体步骤如下：洗涤后的96孔板，向每孔中加入的新鲜TG1菌侵染15min；移去菌液每孔加入100μl 0.2mol/L甘氨酸(pH＝2.7)，37℃温育10min进行洗脱；将洗脱液回收至离心管中，按1:0.2比例加入1M Tris溶液(pH＝9.1)；将回收的洗脱液和菌液混合后加入OD600＝0.5的新鲜TG1，37℃侵染30min。所述辅助噬菌体的感染复数优选为20：1。
本发明重组第一轮淘筛过程两次，得到表面表达有纳米抗体的噬菌体单克隆。由于纳米抗体中包含有变异区，因此，本发明构建的VHH噬菌体展示文库中纳米抗体的编码基因由于变异区序列的不同，能够产生多种纳米抗体表达蛋白，而这些蛋白的特异亲和特性不一致，导致与GDH酶抗原的特异性结合性不同，经过多次淘筛，能够得到表面表达与GDH酶抗原结合能力强的纳米抗体的噬菌体。
得到表面表达有纳米抗体的噬菌体单克隆后，本发明对表面表达有纳米抗体的噬菌体单克隆进行测序，得到纳米抗体的氨基酸序列。
本发明对所述测序的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的测序方案即可。
本发明提供了所述的纳米抗体或所述筛选方法筛选得到的纳米抗体在艰难梭菌免疫检测试剂盒中的应用。
在本发明中，所述艰难梭菌免疫检测试剂盒包括涉及到抗体检测的所有种类试剂盒，例如ELLISA试剂盒、胶体金免疫层析试剂盒、化学发光检测试剂盒等。本领域所述免疫检测试剂盒的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的免疫检测试剂盒即可，不同之处为将纳米抗体替换常规抗体即可。
本发明提供的所述纳米抗体使得艰难梭菌相关疾病的诊断和治疗中具有广泛应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、脾脏血RNA提取及反转录
从-80℃中取出骆驼脾脏组织后(取自于内蒙古阿拉善左旗某屠宰场经检验检疫健康的双峰驼)，加入液氮将标本碾碎，按照一定的比例加入Trizol试剂，利用氯仿和异丙醇对总RNA进行抽提。抽提后的RNA经mRNA纯化试剂盒提取mRNA，并通过cDNA反转录试剂盒，以Oligo dT获得cDNA。
2、VHH基因的扩增和重组载体构建
设计目的片段巢氏PCR的两对上下游引物，引物序列为：
CALL001：5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAAG-3’(SEQ ID NO:10)
CALL002：5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’(SEQ ID NO:11)
VHH-F：5'-TCGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGG-3'(SEQ ID NO:12)；
VHH-R5'-ATAAGAATGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCCC-3'(SEQ ID NO:13)。
(1)采用巢氏PCR法获得重链可变区，以cDNA为模板，使用第一对引物CALL001和CALL002进行第一轮PCR反应(反应体系为20μl，具体如下：cDNA 2μl，PCR Mix 10μl，CALL001 1μl，CALL002 1μl，ddH2O 6μl.反应条件：94℃预变性5min；74℃30s,56℃30s，72℃45s，32个循环；72℃延伸10min)，获得约700bp左右片段。PCR产物经过凝胶电泳进行回收并测定浓度(见图1)。
(2)然后以700bp片段为模板，引物采用VHH-F和VHH-R进行第二轮PCR扩增，并优化PCR反应条件(反应体系为50μl，具体如下：第一轮扩增DNA产物2μl，VHH-F 1μl，VHH-R 1μl，PCRMix 25μl，ddH2O 21μl。反应条件：94℃预变性5min；94℃40s，64℃40s，72℃40s，5个循环；94℃40s，68℃45s，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存)。将第二轮PCR获得的400bp VHH片段进行跑胶验证并分离回收(见图2)。
(3)用NotI和SifI对目的片段和pCANTAB 5E载体进行双酶切，Not I酶切在37℃温育4h，酶切体系如下：NotI 1μl，目的片段14μl，载体14μl，10×NEBBuffer5μl(总体系共50μl)；SfiI酶切在50℃温育4h，酶切体系如下：SfiI 1μl，目的片段14μl，载体14μl，10×NEBBuffer 5μl(总体系50μl)，两次酶切后产物进行凝胶电泳跑胶鉴定回收，之后用T4DNA连接酶将目的片段和载体进行连接，反应条件为16℃连接4h，4℃连接过夜。连接后将连接产物保存于-20℃。
3、电转化感受态的制备及噬菌体文库构建
(1)采用甘油重悬的方法制备TG1电转化感受态，将制备好的电转化感受态分装保存于-80℃备用。取10μl连接产物电转化到TG1感受态细胞中，条件为2.5kv，25μF，200Ω，共进行电转化5次。
(2)将电转化后的菌液37℃培养复苏1h，取10μl复苏后的菌液采用倍比稀释后涂布于SOBAG培养基，次日计算转化效率，其余全部涂布于20个SOBAG培养基平板上，37℃过夜培养。
(3)次日，每个平板用5ml的2×YT培养基将固体平板上的菌落全部用细胞刮刀刮洗收集，加入终浓度25％的甘油，分装于EP管中，每管1ml，保存于-80℃。
4、噬菌体文库的鉴定
从转化后的平板上随机挑取20个菌落进行菌落PCR(测定400bp VHH片段)，并对PCR产物进行验证，鉴定片段插入阳性率(见图3)。随机挑取其中10个菌落(VHH-1～VHH10)进行测序后，MEGA软件进行系统进化树分析(见图4)及DNAMAN分析其氨基酸同源性(见图5)，鉴定文库的多样性。图4为MEGA系统进化树分析。对测序的序列进行MEGA系统进化树分析，得出其具有较好的多样性。图5为VHH抗体库中9个随机克隆氨基酸多序列分析。虚线所示为VHH基因在FR2中四个特征性的疏水氨基酸突变位点，从而增强亲水性，维持稳定结构。
结果显示，随机挑取的菌落中仅有一个未扩增出目的片段，因此噬菌体文库片段插入率在95％以上，将测序后序列经DNAMAN比对分析后得出其氨基酸同源性为66.17％，且具有较好的多样性。由于VHH的结构是包含3个抗原结合区(可变区)和四个抗体骨架区(恒定区)，因此在扩增时其可变区的序列并不完全一致，会出现各种多样性，正因为多样性才可能会出现不同的抗原结合区域，因此可能会筛选出靶向目的抗原的VHH序列。
5、辅助噬菌体的扩增和救援
将KM13进行倍比梯度(用100倍系列稀释KM13辅助噬菌体，稀释度分别为102,104,106,108,1010)稀释，取各稀释度10μl加入200μl TG1(OD600＝0.5)37℃感染30min，加入3ml融化好的上层琼脂倒入2×YT平板中。次日挑取单个噬菌斑于2×YT液体培养基中，加入Kana抗生素(工作浓度50μg/ml)，30℃震荡过夜。将过夜培养产物离心后在上清中加入1/5体积20％PEG/NaCl溶液，冰浴1h沉淀噬菌体，离心后回收分装，测定辅助噬菌体滴度，保存-80℃备用。
取1支1ml文库菌接种到2×YT/Glu/Amp(培养基是在2×YT培养基的基础上加入葡萄糖(Glu)和氨苄抗生素。2×YT配方如下：1.6g蛋白胨，1g酵母提取物，0.5gNaCl，用纯水定容至100ml。葡萄糖浓度为2％，氨苄抗生素浓度为100μg/ml)中，37℃培养至大肠杆菌OD600＝0.5时加入感染复数为MOI＝20:1的辅助噬菌体，感染1h后离心，用2×YT/Amp/Kana培养基(2×YT配方：1.6g蛋白胨，1g酵母提取物，0.5gNaCl，用纯水定容至100ml。Amp抗生素浓度为100μg/ml，Kana抗生素浓度为50μg/ml)重悬菌体30℃过夜振荡。次日离心取上清加入1/5体积PEG/NaCl溶液冰浴并回收噬菌体，离心后沉淀用PBS重悬，测定拯救后的VHH噬菌体展示文库的滴度并保存-20℃，用于之后的文库淘筛。辅助噬菌体救援后噬菌体文库滴度测定结果见图6，通过计算后得出其展示文库滴度为4×1012CFU/ml。
实施例2
制备GDH重组蛋白方法
1.参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，对医院检验科提供的艰难梭菌CD630菌株进行基因组提取。
2.设计扩增GDH蛋白基因的PCR引物，以全基因组为模板，扩增目的基因。
3.将PCR产物目的基因与表达载体PET30a进行连接，用T4DNA连接酶16℃连接4h，4℃过夜连接。
4.取10μl连接产物加入到100μl的BL21感受态中，混合后静置于冰上30min，然后置于42℃水浴中热激90s，然后置于冰上5min，加入900μl的LB/kana培养基，37℃200rpm振荡1h，5000rpm离心10min，留取100μl上清重悬菌体，涂布于LB/Kana固体培养基，37℃过夜培养。
5.次日挑取单个菌落于5ml LB/Kana液体培养基37℃200rpm摇菌8h，然后取200μl菌液以1:500的比例接种于100ml液体培养基，180rpm摇菌4h至大肠杆菌对数期，加入终浓度为0.8mM的IPTG进行诱导，继续摇菌4h后收集菌液，9000rpm离心30min，弃去上清，用超声裂解液(含有20mM NaH2PO4溶液，500mM NaCl，20mM咪唑，4M尿素)重悬沉淀，在冰浴条件下进行超声裂解，超声条件为：100w,破碎3s，间歇3s，总工作时间15min。
6.超声后10000rpm离心吸取上清，进行镍柱纯化。将洗脱液收集，经超滤管脱盐浓缩，测定浓度并保存于-80℃。
实施例3
噬菌体文库的淘筛过程
(1)包被及封闭：将实施例2制备的GDH重组蛋白表达，并经镍柱纯化回收，以20μg/ml GDH抗原包被酶标板4℃过夜，次日用2％PBSM进行封闭处理。
(2)噬菌体预处理：将实施例1制备的噬菌体展示文库以1:3的比例与2％PBSM进行预处理，将处理好的文库加入到96孔板中，150rpm振荡30min，37℃孵育2h。
(3)洗涤：弃去液体，用含1％吐温-20的PBST洗涤10遍。
(4)侵染和洗脱：向每孔中加入的新鲜TG1菌侵染15min。移去菌液每孔加入100μl0.2M甘氨酸(pH＝2.7)，37℃温育10min进行洗脱。将洗脱液回收至离心管中，按1：0.2比例加入1M Tris(pH＝9.1)。将回收的洗脱液和菌液混合后加入OD600＝0.5的新鲜TG1，37℃侵染30min。
(5)取部分侵染液进行倍比稀释涂板测定筛选输出率，剩余侵染液离心后全部涂板于2×YT/Amp/Glu平板，过夜培养。
(6)次日将平板上的菌落用细胞刮刀刮洗收集，取适量菌液加入100ml2×YT/Amp/Glu液体培养基，摇至对数期OD600＝0.5，按感染复数20:1加入辅助噬菌体KM13，37℃静置2min,振荡30min，离心后弃上清，用200ml2×YT/Amp/Kana重悬，200rpm振荡过夜。
(7)次日离心收集上清加入1/5体积的PEG/NaCl沉淀3小时收集噬菌体。将第一轮筛选扩增的噬菌体文库测定滴度并保存于-20℃。
(8)第二轮淘筛：以20μg/ml GDH抗原包被酶标板4℃过夜，封闭处理后加入第一轮淘筛后扩增的噬菌体文库，按第一轮淘筛的步骤进行第二轮淘筛，同理，测定第二轮淘筛后的噬菌体文库滴度并保存。
(9)第三轮淘筛：以20μg/ml GDH抗原包被酶标板4℃过夜，封闭处理后加入第二轮淘筛后扩增的噬菌体文库，按第二轮淘筛的步骤进行第三轮淘筛，同理，测定第三轮淘筛后的噬菌体文库滴度并保存，筛选后得到的是能够与GDH抗原结合噬菌体。
经过三轮淘筛后得到的噬菌体富集变化如下表1所示。
表1 三轮筛选后噬菌体的富集度变化
测定三轮筛选的投入量和洗脱量，计算回收率，观察富集变化，结果显示：噬菌体抗体库中阳性噬菌体的富集度逐渐增加，说明噬菌体抗体库中能与GDH抗原特异性结合的噬菌体得到了有效的富集。
实施例4
phage-ELISA鉴定阳性克隆
(1)从第三轮筛选后的平板上随机挑选500个菌落，5个菌落为一孔，接种于96孔深孔板2×YT/Amp/Glu(培养基是在2×YT培养基的基础上加入葡萄糖Glu和氨苄抗生素。2×YT配方如下：1.6g蛋白胨，1g酵母提取物，0.5g NaCl，用纯水定容至100ml。葡萄糖浓度为2％，氨苄抗生素浓度为100μg/ml)过夜摇菌。
(2)另取一个96孔深孔板，加入新鲜的2×YT/Amp/Glu，从上一板每孔吸取50μl接种至新板，37℃摇至对数期，加入感染复数20:1的KM13,37℃静置20min,振荡30min。
(3)离心后每孔加入2×YT/Amp/Kana过夜振荡，次日离心后上清保存4℃，进行间接ELISA检测。
(4)包被：用10μg/ml GDH包被酶标板，4℃过夜包被。
(5)封闭：弃去包被液，用PBST洗涤三遍后，每孔加入300μl 5％的PBSM，4℃过夜封闭。
(6)噬菌体预处理：将噬菌体上清液与5％PBSM混合，37℃孵育2h，进行预处理。
(7)在96孔酶标板中加入预处理的噬菌体上清液结合2h，PBST洗涤三遍后，拍干。
(8)孵育二抗：每孔加入200μl HRP标记的anti-M13酶标二抗反应1h，洗涤4遍后拍干。
(9)显色：每孔加入100μl TMB显色液37℃孵育25分钟后，加入终止液，并记录吸光度值。
结果见图7所示。图7为phage-ELISA检测噬菌体多克隆上清的结果柱形图。第三轮筛选后的平板随机挑取500个单菌落制备噬菌体多克隆上清，用间接phage-ELISA进行鉴定，实验组为阴性对照组的2倍以上为阳性值。
选取上述10个吸光度值较高的阳性克隆菌液，重新挑取各孔菌液划板与2×YT/Amp/Glu培养基复苏，从各板挑取10个单菌落接种于96孔深孔板，重复实施例4中1)～3)的步骤，制备噬菌体单克隆上清。对噬菌体单克隆上清进行phage-ELISA鉴定，重复实施例4中(4)～(9)的步骤筛选阳性克隆。结果见图8所示。
图8为噬菌体单克隆上清间接ELISA鉴定结果柱形图，其中图8a为噬菌体单克隆上清ELISA分布，图8b为吸光度值较高的阳性克隆间接phage-ELISA。由上述结果可知，选取阳性克隆特异结合性高的菌株进行测序鉴定，最终得到一个重复率高且ELISA结合较好的阳性克隆株，该阳性克隆株表达的纳米抗体具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁夏医科大学
<120> 一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选方法和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Pro Gly Pro Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Pro Gly Leu Ile Ser Asn Asp
20 25 30
Cys Gly Val Asp Trp Phe Arg Gln Pro Ala Gly Gly Gln Arg Gln Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Ala Arg Val Gly Gly Pro Gly Tyr Ala Arg Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Ala Ala Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Arg Ala Asn Pro Arg Gly Lys Val Ala Gly Arg Ser Gly Asp Cys Glu
100 105 110
Tyr Asp His Pro Gly Gln Gly Thr Gln Val Tyr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Leu Ile Ser Asn Asp Cys Gly
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ile Ala Arg Val Gly Gly Pro Gly Tyr
1 5
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Ala Asn Pro Arg Gly Lys Val Ala Gly Arg Ser Gly Asp Cys Glu
1 5 10 15
Tyr Asp His Pro
20
<210> 5
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Pro Gly Pro Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Pro
20 25
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Val Asp Trp Phe Arg Gln Pro Ala Gly Gly Gln Arg Gln Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 7
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Arg Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Ala Ala Lys
1 5 10 15
Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Gly
20 25 30
Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Gln Gly Thr Gln Val Tyr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggcccaggtc cactgcagga gtctggggga ggctcggcgc agcctggggg gtctctgaga 60
ctctcctgct cagcccctgg actcatctcc aatgactgtg gtgttgattg gttccgccag 120
cctgcaggcg gtcagcgcca atgggtcgcg tctattgctc gcgttggtgg accaggttac 180
gcgcgctccg ttgagggccg attcaccatc tccatagacg ccgccaagga tactgtttat 240
ttgcaaatgg acagcctgag acctgacgac acgggcacgt atttctgtag agccaacccg 300
cgcggcaaag tggccgggcg atcgggtgat tgtgagtacg accacccagg tcaggggacc 360
caggtcaccg tctcctca 378
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcctggctg ctcttctaca aag 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgcggccca gccggcccag gtccaactgc aggagtctgg gg 42
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ataagaatgc ggccgctgag gagacggtga cctgggtccc c 41

Claims (10)

1.一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括抗原决定簇互补区CDR和骨架区FR；
所述抗原决定簇互补区CDR包括CDR1、CDR2和CDR3；
所述骨架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4。
3.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，所述CDR1的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO:2；
所述CDR2的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO:3；
所述CDR3的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO:4；
所述FR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:5；
所述FR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:6；
所述FR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:7；
所述FR4的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:8。
4.一种权利要求1～3任意一项所述艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体的编码序列，其特征在于，所述纳米抗体的编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示。
5.权利要求1～3任意一项所述艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取骆驼脾脏组织总RNA，从总RNA中抽提mRNA，反转录，得到cDNA；
(2)以所述cDNA为模板，用CALL001/CALL002引物对和VHH-F/VHH-R引物对进行巢式PCR扩增，得到VHH基因片段；
所述CALL001的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示；
所述CALL002的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示；
所述VHH-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示；
所述VHH-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示；
(3)将所述VHH基因片段和噬菌体载体pCANTAB 5E分别进行酶切，连接，得到噬菌体重组载体pCANTAB 5E-VHH；
(4)将所述噬菌体重组载体pCANTAB 5E-VHH转化至大肠杆菌中，得到重组菌；
(5)所述重组菌培养至OD6000.5时，将所述重组菌和辅助噬菌体混合感染1～1.5h，离心，将得到的菌体筛选培养，离心，回收噬菌体，得到VHH噬菌体展示文库；
(6)将所述VHH噬菌体展示文库添加到包被有谷氨酸脱氢酶蛋白的96孔板中，经孵育、洗涤后，加入大肠杆菌侵染，分离出菌液，洗脱96孔板中VHH噬菌体展示文库；将得到的洗脱液、所述分离出的菌液和大肠杆菌混合侵染，得到的侵染液筛选培养，得到的菌液与辅助噬菌体混合后筛选培养，沉淀噬菌体，得到第一轮淘筛后的噬菌体展示文库；
(7)重复步骤(6)中的第一轮淘筛过程两次，得到表面表达有纳米抗体的噬菌体单克隆；
(8)对表面表达有纳米抗体的噬菌体单克隆进行测序，得到艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)中用CALL001和CALL002引物对进行PCR扩增的程序为94℃5min；74℃30s，56℃30s，72℃45s，32个循环；72℃10min；
用所述VHH-F和VHH-R引物对进行PCR扩增的程序为：94℃5min；94℃40s，64℃40s，72℃40s，5个循环；94℃40s，68℃45s，32个循环；72℃10min。
7.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中酶切用内切酶包括NotI和SifI。
8.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(5)或步骤(6)中筛选培养用培养基为含有100μg/ml的Amp和50μg/ml的Kana的YT培养基。
9.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(5)或步骤(6)中辅助噬菌体的感染复数为20：1。
10.权利要求1～3任意一项所述的纳米抗体或权利要求4～9任意一项所述筛选方法筛选得到的纳米抗体在艰难梭菌免疫检测试剂盒中的应用。
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