CN107827981A - 抗绿脓杆菌外毒素a的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体及其应用，所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述应用为所述纳米抗体在制备抗绿脓杆菌外毒素A药物中的应用。本发明提供的抗绿脓杆菌外毒素A纳米抗体对绿脓杆菌外毒素A具有特异的识别和结合能力，并且能够有效中和绿脓杆菌外毒素A的毒性作用，从而对正常细胞起到保护作用。

Description

抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明公开了一种纳米抗体，属于免疫学领域。
背景技术
绿脓杆菌，又称铜绿假单胞菌(学名Pseudomonasaeruginos′)，是一种革兰氏阴性菌、好氧、呈长棒形的细菌，只有单向的运动性。绿脓杆菌是1882年首先由Gersard氏从伤口脓液分离得到。该菌在自然界广泛存在于水、土壤、空气以及动物的肠道和皮肤中，为一种条件性致病菌，在特定的情况下能引起人及动物感染发病。
1972年，P.v.Liu在临床分离株的培养液中，发现了导致绿脓杆菌感染的毒性因子——外毒素A，并指出绿脓杆菌外毒素A(Pseuduomonas Exotoxin A，PE)对皮肤黏膜有坏死作用，进入血液中能诱发败血症。在脏器组织细胞中，绿脓杆菌外毒素A与白喉毒素类似，具有阻碍蛋白质合成的作用；对小鼠和大鼠感受性高，具有致死作用，对培养细胞有“细胞崩坏毒性”。绿脓杆菌外毒素A的毒性非常强，能够对机体组织及器官造成极大危害，甚至能够破坏角膜基质细胞。为了探讨有效控制和治疗绿脓杆菌外毒素A相关疾病的方法，对绿脓杆菌外毒素A的生物学特性及其致病性的研究也越来越多。
已有的研究成果表明，绿脓杆菌外毒素A是一个66kD的单链毒素蛋白，它具有三个结构域，其中Ia区主要负责细胞的识别，使PE与靶细胞结合；Ⅱ区是转位区，使之能够进人细胞浆；Ⅲ区是活性区，催化延长因子2(Elongation Factor 2，EF2))ADP核糖基化，导致Ef2失活，阻碍蛋白合成，最终导致细胞死亡；Ib区功能至今不明，但是大部分氨基酸的缺失不影响其毒素分子的活性。PE是目前已知最有效的细胞毒素之一，由于其集细胞结合、转位及酶活性三种功能于一身，因此比其他毒素更适合于基因改造，从而达到构建重组免疫毒素的要求。经改构的缺失细胞识别区的PE是目前最常用的毒素蛋白之一，其可通过抑制细胞蛋白质合成，发挥损伤和杀死细胞的作用。由于上述特性，将PE与特定的载体结合(如单克隆抗体、细胞因子等)组成相应的免疫毒素，可用于肿瘤的靶向治疗研究。
基于PE毒素在临床病理学所表现出的突出特性以及在临床治疗领域特别是肿瘤治疗上作为免疫毒素组成部分所具有的巨大应用前景，研发出针对PE毒素的特异性中和抗体，改善临床诊断和治疗效率成为现有技术的迫切需求。
但是基于传统抗体的一些缺点，例如亲和力不高，免疫识别效率低下，对于一些隐蔽程度较高的抗原和毒素难以达到理想的结合和中和效果。
1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H2)的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kD，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识。这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。
相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。
纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
本发明的目的就是提供一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，又能克服其固有缺陷的抗PE毒素的纳米抗体，并进一步提供其在PE毒素检测和在制药学领域中的应用。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，
(1)CDR1序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.3所述氨基酸序列组成，或者
(2)CDR1序列由下述氨基酸序列组成:由SEQ ID NO.7所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.8所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.9所述氨基酸序列组成，或者
(3)CDR1序列由SEQ ID NO.13所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.14所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.15所述氨基酸序列组成。
在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列
(1)由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成，或者
(2)由SEQ ID NO.10所述氨基酸序列组成，或者
(3)由SEQ ID NO.16所述氨基酸序列组成。
在一个更为优选的技术方案呢中，所述纳米抗体还具有恒定区，所述纳米抗体的恒定区序列
(1)由SEQ ID NO.5所述氨基酸序列组成，或者
(2)由SEQ ID NO.11所述氨基酸序列组成，或者
(3)由SEQ ID NO.17所述氨基酸序列组成。
第二，本发明还提供了一种编码权利要求3所述纳米抗体序列的核苷酸编码序列，所述编码序列由SEQ ID NO.6所示，或者由SEQ ID NO.12所示，或者由SEQ ID NO.18所示。
第三，本发明提供了一种含有上述核苷酸编码序列的表达载体。
在一个优选的技术方案中，所述载体为pMES4。
第四，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。
在一个优选的技术方案中，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
第五，本发明还提供了上述的纳米抗体在制备制备抗PE毒素药物中的应用。
最后，本发明提供了一种纳米抗体的组合物，所述组合物含有下述纳米抗体的一种或多种，可变区由SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的纳米抗体、或者由SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的纳米抗体，和/或由SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的纳米抗体。
本发明提供的抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体，由于具有独特的CDR1、2和3区序列，使所述抗体对绿脓杆菌外毒素A抗原具有特异的识别和结合能力。筛选的两株纳米抗体亲和力均达到10-8，且两株纳米抗体分别为与抗原结合速度最快与解离速度最慢的抗体，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。
本发明提供的纳米体还显示了在中和毒素方面中的应用。在本发明的实施例中，所述纳米抗体具有显著的中和毒素及保护细胞的效应，能够有效降低PE毒素对细胞的抑制率，从而起到保护细胞的作用。
附图说明
图1.重组PE免疫毒素载体质粒双酶切鉴定图；
图2.重组PE免疫毒素表达纯化SDS-PAGE电泳鉴定图；
图3.重组PE免疫毒素切除HIS标签SDS-PAGE电泳鉴定图；
图4.PMES4表达载体结构示意图；
图5.第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图6.第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图7.pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；
图8.抗体文库电转化结果图；
图9.菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；
图10.纳米抗体纯化SDS-PAGE鉴定图；
图11.纳米抗体与PE抗原结合解离曲线图；
图12.纳米抗体体外细胞PE毒性中和效果曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1.重组PE免疫毒素的原核表达及纯化
1.1 重组PE免疫毒素的原核表达
将全基因合成的PE毒素部分序列(AE004091.2)质粒PE-PUC57(金唯智公司合成)与载体pET28a同时经NcoⅠ和NotⅠ(购自NEB公司)双内切酶酶切，回收1.4kb的目的基因片段，用T4DNA连接酶连接，命名为PE-Pet28a，转化BL21宿主菌后，经卡那霉素抗性筛选，挑选阳性菌落，扩增并提取质粒，利用NcoⅠ和NotⅠ双酶切酶鉴定(图1：M为Trans 2K plus DNAmarker；1为PE-Pet28a经NcoⅠ和NotⅠ双酶切产物)。将鉴定正确的菌株经过夜扩增后按1：50比例接种于200ml Kan+LB培养基中，37℃扩增至OD600≈0.6时，加IPTG至终浓度1mmol/L，诱导6小时。
1.2 重组PE免疫毒素的纯化
4℃条件下8000r/分钟离心收集菌体10分钟，按1：20的比例加入PBS溶液，超声破菌至菌体澄清，再次8000r/分钟收集上清液。使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析(图2：M为PageRulerTMPrestained Protein Ladder；1为20mM咪唑洗脱产物；2为80mM咪唑洗脱产物；3为100mM咪唑洗脱产物；4为200mM咪唑洗脱产物)，最后将PE毒素透析到PBS中。
1.3 重组PE免疫毒素切除HIS标签
将肠激酶1：8000进行稀释后，向纯化后的重组PE免疫毒素加入稀释后的肠激酶，37℃酶切3小时，将酶切后的PE毒素蛋白进行还原型蛋白电泳分析(图3：M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为未酶切重组PE免疫毒素蛋白；2为PE免疫毒素蛋白酶切2小时产物；3为PE免疫毒素蛋白酶切3小时产物)。利用Ni-NTA树脂对切除HIS标签的PE蛋白进行回收，收集穿透液。
实施例2.抗PE纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选
2.1 羊驼的免疫
选取健康成年羊驼一只羊，将重组蛋白PE与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/Kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。
2.2 驼源淋巴细胞的分离
按照本技术领域常规程序从采集的驼源抗凝全血中分析淋巴细胞，每2.5×107个活细胞加入1mL RNA分离试剂，取1mL进行RNA提取，其余-80℃保存。
2.3 总RNA提取
按照本技术领域常规程序提取总RNA，用RNase-free水调整浓度到1μg/μL。
2.4 反转录合成cDNA
根据逆转录试剂盒说明书(Roche公司的transcripor first stand cDNAsynthesis KIT)以2.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。
2.5 抗体可变区基因扩增
将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl(图5：M为Trans 2K DNA Marker；1为第一轮PCR产物)。
第二轮PCR的引物序列如下：
VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃7分钟使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物(图6：M为Trans 2K DNA Marker；1为第二轮PCR产物)。
2.6 载体构建
将pMES4(购自Biovector，其结构示意图见图4)与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μL T4DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μL总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μL水洗脱。1％琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果(图7：M为Trans 2K DNA Marker；1为pMES4载体未酶切质粒；2为pMES4载体双酶切后产物)。
2.7 电转化及库容测定
取10μL纯化后的连接产物，加入到含有50μL大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子(图8为转化培养平板)。随机挑选18个克隆，进行菌落PCR鉴定(图9：M为Trans 2K DNAMarker；1-18为随机挑选的单克隆PCR鉴定产物)。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10)。
引物序列如下：
MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG
GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG
2.8 噬菌体扩增
取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD600＝0.5。取出10ml菌液加入4×1010VCSM13，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。
测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD600＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。
噬菌体滴度(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑数目×100
2.9 纳米抗体筛选
通过ELISA方法以重组PE抗原筛选阳性克隆。以重组PE抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。
2.10 纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化
挑选噬菌体ELSIA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，并将周质提取物透析至PBS，使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。
通过羊驼免疫、细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，共筛选出3株抗PE的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行分析，登录IMGT(http://www.imgt.org/ IMGT_vquest)，对抗体轻链和重链基因进行分析，以确定可变区的框架区(FrameworkRegions，FR)和互补决定区(Complementary Determining Regions，CDR)。
纳米抗体VHH-PE 1重链核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示，可变区氨基酸序列为SEQID NO.4所示，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-37位氨基酸序列为CDR1，第38-51位氨基酸序列为FR2，第52-68位氨基酸序列为CDR2，第69-100位氨基酸序列为FR3，第101-120位氨基酸序列为CDR3，第121-126位氨基酸序列为FR4，恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。
纳米抗体VHH-PE 2重链核苷酸序列为SEQ ID NO.12，可变区氨基酸序列为SEQ IDNO.10所示，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-32位氨基酸序列为CDR1，第33-46位氨基酸序列为FR2，第47-63位氨基酸序列为CDR2，第64-95位氨基酸序列为FR3，第96-111位氨基酸序列为CDR3，第112-117位氨基酸序列为FR4，恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示。
纳米抗体VHH-PE 3重链核苷酸序列为SEQ ID NO.18，可变区氨基酸序列为SEQ IDNO.16，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-32位氨基酸序列为CDR1，第33-46位氨基酸序列为FR2，第47-63位氨基酸序列为CDR2，第64-95位氨基酸序列为FR3，第96-111位氨基酸序列为CDR3，第112-117位氨基酸序列为FR4，恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO.17所示。
实施例3.抗PE纳米抗体的制备
3.1 纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1：1000比例接种于5mL新鲜的LB-A培养基，37℃，200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit(OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μl转化于100μl感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μl，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。
3.2 纳米抗体的诱导表达和提取
挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1：100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3小时至菌液OD600＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5mL的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0mlTES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5mL的上清(周质提取物)，将上清进行蛋白电泳分析。
3.3 纳米抗体的纯化和鉴定
将IMAC Sepharose(GE公司)重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30分钟，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液(0.1M)，按照约8秒/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6秒/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6秒/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20％乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20％乙醇来保存柱子。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测(图10:M为彩虹180广谱蛋白Marker；1-3为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体VHH-PE1、VHH-PE 2和VHH-PE 3)。
实施例4.抗PE纳米抗体与PE抗原的亲和活性
4.1 芯片抗原偶联
将抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液(pH 5.5，pH 5.0，pH 4.5，pH 4.0)配制成20μg/mL的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片(GE公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60分钟。
4.2 分析物浓度设置条件探索及再生条件优化
采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30μL/分钟。进样条件均为120秒，30μL/分钟。再生条件均为30秒，30μL/分钟。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200μg/mL，150μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，2μg/mL。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/mL分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。
4.3 亲和力测试
按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60秒，30μL/分钟；解离时间：600秒；再生条件：30秒，30μL/分钟)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200分钟。在具体实验中，将芯片上的PE纳米体俘获到适当的信号值，然后用系统运行缓冲液HBS-EP(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％P20)以30μL/分钟的流速注射到芯片上，获得纳米抗体与PE抗原相互作用的动态过程。分别使用该方法测试了3个PE纳米抗体与PE抗原结合和解离的能力。
4.4 结果分析
选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1：1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数。筛选的三株纳米抗体亲和力均达到10-8。VHH-PE 1结合的最快，VHH-PE 2解离的最慢，且结合时间较VHH-PE 1长(结合解离曲线见图11)。VHH-PE 3亲和力值最高。
表1：纳米抗体亲和力数据
样品编号 结合常数 解离常数 亲和力
VHH-PE 1 3.684×10+5 0.004483 1.22E-08
VHH-PE 2 1.953×10+4 9.469×10-5 4.85E-09
VHH-PE 3 1.607×10+6 0.005506 3.42E-09
实施例5.体外肿瘤细胞实验检测抗PE纳米抗体中和免疫毒素效应
5.1 天然PE免疫毒素对A431细胞和SK-OV3细胞的抑制率
选择亲和力适中的两株纳米抗体VHH-PE 1和VHH-PE 2进行体外细胞实验。由于PE免疫毒素对细胞的毒性作用与细胞表面EGFR数量有关。因此本实验采用的肿瘤细胞A431细胞(购自ATCC)和SK-OV3细胞(购自ATCC)为细胞表面EGFR数量差别较大的两种肿瘤细胞。A431细胞表面EGFR数量大约为3×106，而SK-OV3细胞表面的EGFR数量则小于2×105。利用MTT测定(MTT细胞增殖和细胞毒性测定试剂盒)进行细胞毒性实验。将A431(购自ATCC)细胞接种到96孔培养板中，每孔6,000个细胞，并在37℃，5％CO2下孵育24小时。加入最终浓度为5ug/ml的天然PE抗原(购自SIGMA)，随后加入2种抗体，最终浓度分别为160μL/ml、80μL/ml、40μL/ml、20μL/ml、10μL/ml、5μL/ml、2.5μL/ml，每个抗体浓度做三次重复孔。用PBS溶液设置空白对照，用纯抗原设置阴性对照，纯抗体作为阳性对照。置于恒温培养箱中，37℃，5％CO2，孵育24小时。弃去培养基，加入10ul MTT和100ul新鲜培养基，孵育4小时。然后弃去培养基，加入110ul Formazan solvent溶剂，低速震荡10分钟。最后，通过酶联免疫吸附测定(570nm)测量各孔的吸光度，比较天然PE免疫毒素对A431和SK-OV3肿瘤细胞在加入纳米抗体前后抑制率的变化。
5.2 结果分析
不加抗体时天然PE毒素对A431细胞的抑制率达到92％，对SK-OV3细胞的抑制率为100％。加入不同浓度的纳米抗体后，A431细胞的抑制率逐渐下降，SK-OV3细胞的抑制率没有变化。结果显示抗体浓度为40ug/ml时就对细胞产生明显的保护作用。抗体浓度达到80ug/ml时，对细胞的保护趋于平稳(抑制率曲线图见图12)。
序 列 表
<110> 深圳国创纳米抗体技术有限公司
<120> 抗绿脓杆菌外毒素A的纳米抗体及其应用
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 1
Gly Arg Thr Phe Ser Ser Thr Gly His Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
1 5 10 15
Gly
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 2
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 3
Arg Phe Trp Asp Tyr Gly Leu Gly Ser Ser Asp Leu Lys Ser Pro Arg
1 5 10 15
Glu Tyr Asp Tyr
20
<210> 4
<211> 126
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 4
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Thr Gly His Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Trp Asp Tyr Gly Leu Gly Ser Ser Asp Leu
100 105 110
Lys Ser Pro Arg Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
115 120 125
<210> 5
<211> 231
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 5
Ala His His Ser Glu Asp Pro Ser Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Gly
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Thr Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Val Leu Ser Ile Thr Arg Lys Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Gly Lys Glu Asp Pro Glu Ile Glu Phe Ser Trp Ser Val
50 55 60
Asp Asp Thr Glu Val His Thr Ala Glu Thr Lys Pro Lys Glu Glu Gln
65 70 75 80
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Ala Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala
130 135 140
Lys Asp Thr Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Phe Pro Ala
145 150 155 160
Asp Ile Asn Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly
165 170 175
Thr Tyr Ala Thr Thr Leu Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe
180 185 190
Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly Glu
195 200 205
Val Phe Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Ser Thr
210 215 220
Gln Lys Ser Ile Ser Gln Ser
225 230
<210> 6
<211> 1086
<212> DNA
<213> Lama pacos
<400> 6
gagtctgggg gaggattggt gcaggccggg ggctctctga gactctcctg tgcagcctct 60
ggacgcacct tcagtagcac tggacacacc ttcagcagct atgccatggg ctggttccgc 120
caaactccag ggaaggagcg tgagtttgta gcagctatta gctggagtgg tacgagcact 180
tactatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaacacg 240
gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaacct gaggacacgg ccgtttatta ctgtgcagca 300
aggttctggg actacgggtt agggtcatcc gacctgaagt cccccaggga gtatgactac 360
tggggtcagg ggacccaggt caccgtctcc tcggcgcacc acagcgaaga ccccagctcc 420
aagtgtccca aatgcccagg ccctgagctc cttggagggc ccacggtctt catcttcccc 480
ccgaaaccca aggacgtcct ctccatcacc cgaaaacctg aggtcacgtg cgttgtggtg 540
gacgtgggta aggaagaccc tgagatcgag ttcagctggt ccgtggatga cacagaggta 600
cacacggctg agacaaagcc aaaggaggaa cagttcaaca gcacgtaccg cgtggtcagc 660
gtcctgccca tccagcacca ggactggctg acggggaagg aattcaagtg caaggtcaac 720
aacaaagctc tcccagcccc catcgagagg accatctcca aggccaaagg gcagacccgg 780
gagccgcagg tgtacgccct ggccccacac cgggaagagc tggccaagga caccgtgagc 840
gtaacctgcc tggtcaaagg cttcttccca gctgacatca acgttgagtg gcagaggaac 900
gggcagccgg agtcagaggg cacctacgcc accacgctgc cccagctgga caacgacggg 960
acctacttcc tctacagcaa actctccgtg ggaaagaaca cgtggcagca gggagaagtc 1020
ttcacctgtg tggtgatgca cgaggctcta cacaatcact ccacccagaa atccatctcc 1080
cagtct 1086
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 7
Arg Arg Thr Phe Cys Asn Tyr Leu Asp Ala Met Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 8
His Ile Thr Gly Asn Arg Gly Asp Val Met Tyr Leu Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 9
Lys Ala Thr Gly Phe Phe Ser Pro Lys Glu Glu Glu Lys Tyr Asn Trp
1 5 10 15
<210> 10
<211> 117
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 10
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Gly Val Ala Ser Arg Arg Thr Phe Cys Asn Tyr Leu Asp Ala Met Gly
20 25 30
Trp Leu Ser Leu Val Thr Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala His Ile
35 40 45
Thr Gly Asn Arg Gly Asp Val Met Tyr Leu Asp Ser Val Lys Ala Gly
50 55 60
Ser Thr Ile Ser Arg Val Lys Thr Asn Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Met Lys Pro Glu Asp Thr His Val Tyr Tyr Trp Ala Pro Lys
85 90 95
Ala Thr Gly Phe Phe Ser Pro Lys Glu Glu Glu Lys Tyr Asn Trp Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln
115
<210> 11
<211> 231
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 11
Ala His His Ser Glu Asp Pro Ser Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Gly
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Thr Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Val Leu Ser Ile Thr Arg Lys Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Gly Lys Glu Asp Pro Glu Ile Glu Phe Ser Trp Ser Val
50 55 60
Asp Asp Thr Glu Val His Thr Ala Glu Thr Lys Pro Lys Glu Glu Gln
65 70 75 80
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Ala Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala
130 135 140
Lys Asp Thr Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Phe Pro Ala
145 150 155 160
Asp Ile Asn Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly
165 170 175
Thr Tyr Ala Thr Thr Leu Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe
180 185 190
Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly Glu
195 200 205
Val Phe Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Ser Thr
210 215 220
Gln Lys Ser Ile Ser Gln Ser
225 230
<210> 12
<211> 1059
<212> DNA
<213> Lama pacos
<400> 12
gagtctggag gaggattggt gcaggcaggg ggctctctga gactctcggg agtagcctct 60
agacgcactt tctgtaacta tctcgatgcc atgggctggt taagcctggt tacagggaag 120
gagcgtgaat tggtagcaca tattacaggg aataggggtg atgtcatgta tttagattcc 180
gtgaaggccg gatccaccat ctccagagtt aagaccaaca gcacggtgta tctccaaatg 240
aacagcatga aacctgagga tacgcacgtt tattattggg caccaaaggc cacaggcttt 300
ttttccccga aggaagagga gaaatataac tggtggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctcggcgc accacagcga agaccccagc tccaagtgtc ccaaatgccc aggccctgag 420
ctccttggag ggcccacggt cttcatcttc cccccgaaac ccaaggacgt cctctccatc 480
acccgaaaac ctgaggtcac gtgcgttgtg gtggacgtgg gtaaggaaga ccctgagatc 540
gagttcagct ggtccgtgga tgacacagag gtacacacgg ctgagacaaa gccaaaggag 600
gaacagttca acagcacgta ccgcgtggtc agcgtcctgc ccatccagca ccaggactgg 660
ctgacgggga aggaattcaa gtgcaaggtc aacaacaaag ctctcccagc ccccatcgag 720
aggaccatct ccaaggccaa agggcagacc cgggagccgc aggtgtacgc cctggcccca 780
caccgggaag agctggccaa ggacaccgtg agcgtaacct gcctggtcaa aggcttcttc 840
ccagctgaca tcaacgttga gtggcagagg aacgggcagc cggagtcaga gggcacctac 900
gccaccacgc tgccccagct ggacaacgac gggacctact tcctctacag caaactctcc 960
gtgggaaaga acacgtggca gcagggagaa gtcttcacct gtgtggtgat gcacgaggct 1020
ctacacaatc actccaccca gaaatccatc tcccagtct 1059
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 13
Arg Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Asp Ala Met Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 14
Ala Ile Ser Trp Asn Ser Ala Thr Thr Arg Tyr Leu Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 15
Lys Pro Thr Gly Ser Phe Pro Pro Val Glu Glu Glu Lys Tyr Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 16
<211> 117
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 16
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Val Ser Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Ala Ser Arg Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Asp Ala Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile
35 40 45
Ser Trp Asn Ser Ala Thr Thr Arg Tyr Leu Asp Ser Val Lys Ala Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Val Asn Ala Asn Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys
85 90 95
Pro Thr Gly Ser Phe Pro Pro Val Glu Glu Glu Lys Tyr Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln
115
<210> 17
<211> 231
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 17
Ala His His Ser Glu Asp Pro Ser Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Gly
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Thr Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Val Leu Ser Ile Thr Arg Lys Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Gly Lys Glu Asp Pro Glu Ile Glu Phe Ser Trp Ser Val
50 55 60
Asp Asp Thr Glu Val His Thr Ala Glu Thr Lys Pro Lys Glu Glu Gln
65 70 75 80
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Ala Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala
130 135 140
Lys Asp Thr Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Phe Pro Ala
145 150 155 160
Asp Ile Asn Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly
165 170 175
Thr Tyr Ala Thr Thr Leu Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe
180 185 190
Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly Glu
195 200 205
Val Phe Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Ser Thr
210 215 220
Gln Lys Ser Ile Ser Gln Ser
225 230
<210> 18
<211> 1059
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<213> Lama pacos
<400> 18
gagtctggag gaggattggt gcaggctggg ggctctgtga gtctctcctg tgtagcctct 60
agacgcactt tcagtaacta tgccgatgcc atgggctggt tccgccaggc tccagggaag 120
gagcgtgaat ttgtagcagc tattagctgg aatagtgcta ctaccaggta tttagactcc 180
gtgaaggccc gattcaccat ctccagagtt aacgccaaca acacggtgta tctgcaaatg 240
aacagcctga aacctgagga cacggccgtt tattattgtg cagcaaagcc tacaggctct 300
tttcccccgg tggaagagga gaaatataac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctcggcgc accacagcga agaccccagc tccaagtgtc ccaaatgccc aggccctgag 420
ctccttggag ggcccacggt cttcatcttc cccccgaaac ccaaggacgt cctctccatc 480
acccgaaaac ctgaggtcac gtgcgttgtg gtggacgtgg gtaaggaaga ccctgagatc 540
gagttcagct ggtccgtgga tgacacagag gtacacacgg ctgagacaaa gccaaaggag 600
gaacagttca acagcacgta ccgcgtggtc agcgtcctgc ccatccagca ccaggactgg 660
ctgacgggga aggaattcaa gtgcaaggtc aacaacaaag ctctcccagc ccccatcgag 720
aggaccatct ccaaggccaa agggcagacc cgggagccgc aggtgtacgc cctggcccca 780
caccgggaag agctggccaa ggacaccgtg agcgtaacct gcctggtcaa aggcttcttc 840
ccagctgaca tcaacgttga gtggcagagg aacgggcagc cggagtcaga gggcacctac 900
gccaccacgc tgccccagct ggacaacgac gggacctact tcctctacag caaactctcc 960
gtgggaaaga acacgtggca gcagggagaa gtcttcacct gtgtggtgat gcacgaggct 1020
ctacacaatc actccaccca gaaatccatc tcccagtct 1059

Claims (10)

1.一种抗PE毒素的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，
(1)CDR1序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.3所述氨基酸序列组成，或者
(2)CDR1序列由SEQ ID NO.7所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.8所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.9所述氨基酸序列组成，或者
(3)CDR1序列由SEQ ID NO.13所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.14所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.15所述氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区序列
(1)由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成，或者
(2)由SEQ ID NO.10所述氨基酸序列组成，或者
(3)由SEQ ID NO.16所述氨基酸序列组成。
3.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体还具有恒定区，所述纳米抗体的恒定区序列
(1)由SEQ ID NO.5所述氨基酸序列组成，或者
(2)由SEQ ID NO.11所述氨基酸序列组成，或者
(3)由SEQ ID NO.17所述氨基酸序列组成。
4.一种编码权利要求3所述纳米抗体序列的核苷酸编码序列，所述编码序列由SEQ IDNO.6所示，或者由SEQ ID NO.12所示，或者由SEQ ID NO.18所示。
5.一种含有权利要求4所述的核苷酸编码序列的表达载体。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体为pMES4。
7.一种含有权利要求6所述表达载体的宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
9.权利要求1-3任一所述的纳米抗体在制备抗PE毒素药物中的应用。
10.一种纳米抗体的组合物，其特征在于，所述组合物含有下述纳米抗体的一种或多种，可变区由SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的纳米抗体、由SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的纳米抗体，和/或由SEQ ID NO.16所示氨基酸序列的纳米抗体。
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