CN102690789B - 分泌破伤风外毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由其制备的单克隆抗体、Fab抗体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分泌破伤风梭状芽孢杆菌外毒素单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株，保藏号为CCTCC NO.C201257；本发明还涉及由该鼠源杂交瘤细胞株制备的破伤风梭状芽孢杆菌外毒素单克隆抗体；本发明还提供一种Fab抗体，其包括κ链和Fd链，所述κ链和Fd链从上述的杂交瘤细胞株的总RNA中扩增获得。本发明还涉及预防或治疗破伤风梭状芽孢杆菌感染的药物，其包含上述的破伤风梭状芽孢杆菌外毒素单克隆抗体和/或Fab抗体，及药学上可接受的载体。本发明采用天然破伤风外毒素筛选到一种能有效中和破伤风外毒素的单克隆抗体，并以此为基础采用基因工程抗体技术制备了能在体外规模化生产的、具有中和毒素效力的Fab基因工程抗体。

Description

分泌破伤风外毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由其制备的单克隆抗体、Fab抗体与应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，尤其涉及分泌破伤风梭状芽孢杆菌外毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及由其制备的单克隆抗体、Fab抗体与应用。

背景技术

破伤风外毒素(tetanus toxin,TT)是破伤风梭状芽孢杆菌感染伤口后,在缺氧的条件下分泌产生的一种神经毒素，可导致患者因喉痉挛或继发严重的肺部感染而死亡，死亡率可高达20%～50％。全世界每年约有5万人死于破伤风。抗生素不能清除破伤风外毒素的毒性作用，具有中和毒素作用的抗破伤风外毒素的抗体可与游离毒素结合从而阻断毒素与靶细胞的结合，因此抗破伤风外毒素的抗体是预防和治疗破伤风的首选治疗药物。

目前临床上治疗破伤风的抗体药物：破伤风抗毒素（tetanus antitoxin,TAT）和人破伤风免疫球蛋白(human immunoglulin tetani，HIGT)存在严重缺陷。TAT系用破伤风类毒素免疫的马的血清经胃酶消化后，提纯制得的液体或冻干抗毒素球蛋白制剂，属动物来源的异源蛋白，容易诱发人体产生严重的过敏反应甚至导致致死亡；HIGT来源于破伤风疫苗或破伤风类毒素免疫的健康人血浆，属人源性同种蛋白，不易引过敏反应，但HIGT存在免疫人血浆来源困难、产量有限、且有HIV、HBV、HCV等外源病毒污染的安全隐患，使其工业生产和临床使用受到了很大限制。目前国内外HIGT的生产均不能满足市场需求。

基于TAT和HIGT在临床治疗和生产中存在的缺陷，研制一种能在体外规模化生产、安全、有效的新型基因工程破伤风毒素中和性单克隆抗体替代TAT和HIGT是十分必要的。

研究表明：破伤风外毒素蛋白分子量为150kDa。毒素经菌体释放后,在蛋白水解酶的作用下,被“裂解”成一条轻链(50kDa)和一条重链(100kDa),但轻链和重链之间仍有二硫键相连。轻链是锌依赖蛋白酶,通过水解突触囊泡蛋白-2来阻断神经抑制性介质的释放。C蛋白片段是重链的一部分,分子质量为50kDa,不具备神经毒素的活性,却保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质,是毒素的保护性抗原。由于C蛋白是破伤风毒素的非毒性片段,且有较高的免疫原性,因此是制备和筛选抗破伤风中和性单克隆抗体的一个理想靶标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分泌破伤风梭状芽孢杆菌外毒素单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株，保藏号为CCTCC NO.C201257。

本发明还提供一种破伤风梭状芽孢杆菌外毒素鼠源单克隆抗体，其由保藏号为CCTCC NO.C201257的鼠源杂交瘤细胞株产生。

本发明还提供一种Fab抗体，其包括κ链和Fd链，所述κ链和Fd链从上述的杂交瘤细胞株的总RNA中扩增获得。其中扩增所需要的引物如SEQ ID NO:5-21所示。

所述κ链具有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一种；

所述Fd链具有SEQ ID NO:3所述的氨基酸序列或将所述SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加而仍具有所述氨基酸序列功能的氨基酸序列的任一种。

编码所述κ链的核苷酸序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种；

编码所述Fd链的核苷酸序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或与所述SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列不同但具有相同编码产物的核苷酸序列中的任一种。

根据本发明所述的Fab抗体，所述κ链的互补决定区（CDR）的核苷酸序列如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示,所述Fd的链互补决定区（CDR）的核苷酸序列如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示。

所述κ链的互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQID NO:31所示；Fd链的互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示。

本发明还提供一种表达载体，其含有上述的Fab抗体的κ链和Fd链的核苷酸编码序列，其中，所述κ链的核苷酸编码序列如SEQ ID NO:2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的Fd链的核苷酸编码序列如SEQ ID NO:4所示，其编码的Fd链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，该表达载体包括裸DNA或质粒DNA中的至少一种。

本发明还提供一种表达宿主菌，其转入了上述的表达载体。

本发明所述的破伤风梭状芽孢杆菌外毒素单克隆抗体和/或Fab抗体可用于制备预防或治疗破伤风的药物。本发明还提供一种预防或治疗破伤风的药物，其包含上述的破伤风梭状芽孢杆菌外毒素单克隆抗体和/或Fab抗体，及药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体可以包含稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体中的至少一种。

本发明还提供一种预防或治疗破伤风的药物，其包含上述的破伤风梭状芽孢杆菌外毒素单克隆抗体和/或Fab抗体，及药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体包含稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体中的至少一种。

本发明提供上述的抗破伤风梭状芽孢杆菌外毒素的单克隆抗体和Fab抗体的制备方法，其主要包括以下步骤：

1）提供所述杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体的制备与生物学鉴定；

2）提取所述杂交瘤细胞的总RNA，获得RNA;

3）以步骤2）中的RNA为克隆模板，克隆所述单克隆抗体的κ链和Fd链基因；

4）将步骤3）获得的κ链和Fd链基因克隆到T载体中，进行鉴定；

5）将步骤4）获得的κ链和Fd链基因克隆到分泌表达Fab抗体的载体中，进行表达、鉴定、纯化，得所述的Fab抗体。

6）动物实验鉴定步骤4）获得的Fab抗体中和破伤风外毒素毒性的作用。

本发明所述的破伤风梭状芽孢杆菌外毒素单克隆抗体和/或Fab抗体还可用于制备ScFv抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体融合蛋白、蛋白单域抗体，具体来说，1）嵌合抗体：是用鼠单抗的V区与人IgG的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。由于其完整地保留了鼠单抗的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应；2）人源化抗体：是针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基修饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等从而降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠单抗的特异性和亲和力；3）单域抗体：由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等；4）双特异性抗体：是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体；5）重组抗体融合蛋白：把Fab基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。

本发明的思路如下：采用灭活的破伤风外毒素为免疫原，采用天然破伤风外毒素和破伤风外毒素C片段为筛选抗原，制备中和破伤风外毒素毒性的MAbs，并通过抗体的生物学鉴定证实单抗的中和作用。在此基础上，利用基因工程技术构建具有中和破伤风外毒素的Fab抗体，对Fab抗体的基因结构和蛋白质的序列进行分析，并对Fab抗体中和破伤风外毒素毒性的作用进行了鉴定。本发明的Fab抗体的重链Fd片段和κ轻链基因和多肽可以用来开发预防或治疗破伤风的抗体药物。

本发明利用天然破伤风外毒素和破伤风外毒素C片段为筛选抗原制备的TT5C4单克隆抗体能中和破伤风外毒素的毒性作用，将TT5C4单克隆抗体制备成Fab基因工程抗体，动物实验显示具有良好的破伤风外毒素毒性中和作用。说明基于TT5C4单克隆抗体改造的TT5C4 Fab基因工程抗体对破伤风具有潜在的预防和治疗作用。

本发明采用天然破伤风外毒素筛选到一种能有效中和破伤风外毒素的单克隆抗体，并以此为基础采用基因工程抗体技术制备了能在体外规模化生产、具有中和破伤风外毒素效力的Fab基因工程抗体。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1表示TT5C4单克隆抗体的免疫印迹；

图2表示琼脂糖电泳检测总RNA；

图3表示琼脂糖电泳检测κ轻链PCR产物

M.DNA Marker箭头所示为κ轻链；

图4表示琼脂糖电泳检测Fd链PCR产物

M.DNA Marker箭头所示为Fd链；

图5 T-A克隆pMD18-T-TT5C4Fd和pMD18-T-TT5C4κ重组质粒双酶切鉴定

M.DNA marker;

泳道1.用XhoI and SpeI双酶切pMD18-T-TT5C4Fd质粒；箭头所示为双酶切切出的700bp的片段；泳道2～3.用SacI and XbaI双酶切pMD18-T-TT5C4κ质粒；箭头所示为双酶切切出的700bp的片段；

图6表示表达TT5C4 Fab抗体的质粒Pcomb3X-TT5C4 Fab双酶切鉴定

M.DNA marker

泳道1～2.SacI and NotI双酶切Pcomb3X-TT5C4 Fab质粒；箭头所示为双酶切切出的1400bp的片段

图7表示SDS-PAGE分析Fab抗体的表达

M.蛋白质分子量标准

泳道1.IPTG诱导Pcomb3X/XL-blue空载体菌溶菌上清

泳道2.未诱导Pcomb3X-TT5C4Fab XL-blue重组菌溶菌上清

泳道3.IPTG诱导Pcomb3X-TT5C4Fab/XL-blue重组菌溶菌上清；

箭头所示为：表达的TT5C4Fab抗体轻重链蛋白分子

图8表示SDS-PAGE分析TT5C4Fab抗体的纯化

M.蛋白质分子量标准

泳道1.诱导Pcomb3X-TT5C4Fab/XL-blue重组菌溶菌上清

泳道2.TT5C4Fab抗体蛋白洗脱样品；

图9表示免疫印迹检测TT5C4Fab的特异性，箭头处为150Kda。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进，对本发明重链Fd片段和κ轻链多肽及其核苷酸序列的利用都属于本发明要求保护的范围。

实施例1中和破伤风外毒素的单克隆抗体的制备与鉴定

1.动物免疫

以甲醛灭活的破伤风类毒素为抗原同时免疫5只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠（购自第三军医大学实验动物中心），每只注射0.5ml，含抗原100μg，免疫时间分别为0、3、5、6周，共4次，第1次加入福氏完全佐剂皮下多点注射，第2次加福氏不完全佐剂，第3次不加佐剂同样剂量腹腔注射免疫，一周后取尾血采用间接ELISA法检测免疫Balb/c小鼠血清效价，取效价最高的小鼠脾细胞用于融合，融合前3d，不加佐剂抗原腹腔加强免疫注射1次，100μg/只。

2.杂交瘤细胞的制备

2.1收集B淋巴细胞

追加免疫后3天，摘除小鼠眼球放血，血清留作阳性对照。按无菌操作取出脾脏，并将脾脏放在10ml预温不完全培养基中，剥去周围结缔组织，置100目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，边研磨边滴加不完全培养基冲洗。收集过滤后的细胞悬液于离心管中，计数，取1×10⁸个细胞，离心，弃上清，置室温待用。

2.2小鼠骨髓瘤细胞的准备

融合前10天，将骨髓瘤细胞SP2/0(购自上海中科院细胞库)从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中10分钟内至冷冻液完全溶解。离心，弃上清，置含8-AG的DMEM完全培养基中于37℃，5%CO₂培养。根据细胞生长状况，换液，丢弃一部分细胞。融合前2天～3天，将1瓶细胞传至4瓶，并改用不含8-AG的DMEM完全培养基继续培养。将对数生长期细胞收集至离心管中，计数，取1×10⁷～2×10⁷个细胞，离心弃上清，置室温待用。

2.3细胞融合

融前一天将PEG细胞融合剂置37℃，5%CO₂细胞培养箱中调整pH值和温度。将1×10⁷～2×10⁷个骨髓瘤细胞悬液和1×10⁸个脾脏B淋巴细胞悬液移至一个50ml离心管中，补加30ml不完全培养基，1 500rpm，离心10分钟，弃去上清。轻轻弹击管底，使细胞团松散成糊状。一手均匀地转动离心管，另一手用1ml吸管吸取0.7ml预温的PEG融合剂，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，从加入到加完的时间控制在60秒左右，然后立即将细胞悬液全部吸入吸管，时间控制在30秒左右，静置30秒，在将其吹入离心管内，时间也控制在30秒左右。立即在5分钟内加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用，具体加法是第一分钟加1ml，第二分钟加4ml，随后的3分钟之内将剩余液体加完，（注意此时操作应轻柔），1500转/分离心10分钟，弃去上清，将融合细胞悬液移入已装有40ml ClonaCell-HY Hybridoma Recovery Medium的T-75cm的培养瓶中，37℃，5%CO₂细胞培养箱中16h～24h，离心，弃上清。

2.4一步法筛选阳性单克隆杂交瘤细胞

融合前一天，置ClonaCell-HY杂交瘤选择培养基Medium D（购自stem cell公司）于2℃～8℃融化过夜，融合当天，摇匀培养基并置室温或37℃备用。将融合后的细胞悬液移入50ml无菌离心管中，400×g（1350rpm），离心，10分钟，弃上清，加Medium C（购自stem cell公司）至10ml后混匀细胞。（注意总体积不能超过10ml）将10ml细胞悬液加入90ml Medium D中，上下反转数次试剂瓶混合杂交瘤细胞后，室温或37℃静止15分钟，让气泡升至顶层。用10ml刻度吸管吸取上述细胞混悬液铺入10个100mm细胞培养皿中（避免气泡），每个平皿9.5ml，置37℃，5%CO₂的细胞培养箱中培养10天～14天。注意：小心开关细胞养箱门，尽量避免振动；10天内不能移动细胞培养皿，否则会导致培养皿中细胞克隆混淆。用微量加样器吸取细胞培养皿中长出的肉眼可见的单克隆杂交瘤细胞于预先每孔加有200μl的MediumE（购自stem cell公司）的96孔细胞培养板中，每孔加入一个细胞克隆。大约3天～5天，当细胞长成单层时，分别以天然破伤风外毒素为包被抗原，间接ELISA检测各培养孔的上清，检测阳性的单克隆细胞转种于6孔细胞培养板，每孔加Medium E培养基1ml，置37℃，5%CO₂培养，以后依次转种至25ml和100ml细胞培养瓶内扩大培养。此时改用含10%小牛血清的DMEM完全培养基，转种前均作ELISA检测，持续呈阳性的细胞克隆可以定株、冻存。

3.单克隆抗体的生物学特性鉴定

采用本领域公知的常规方法制备小鼠腹水单抗，采用HiTrap Protein G层析柱纯化后，采用美国Roche公司Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit鉴定单抗的亚类亚型，采用Western blot鉴定抗体的特异性，BiAcore 3000鉴定单抗的亲和力，通过小鼠体内破伤风外毒素毒性中和试验鉴定。具体操作如下：

3.1Western blot鉴定抗体的特异性

取破伤风外毒素(150KDa)，并设定蛋白质分子量标准，在5%浓缩胶，10%分离胶上进行非变性SDS-PAGE，80V，30分钟，调整电压为150V，约1.5小时。电泳结束后，取下凝胶，一块用考马斯亮蓝R-250染液快速染色，另一块置于硝酸纤维素膜上，15V恒压电转移过夜。转移后的硝酸纤维素膜在丽春红S中染色1分钟，标记蛋白质分子标准，再用蒸馏水脱去红色。将转移膜置于封闭液(TTBS)中，37℃，150rpm，轻轻振摇封闭60分钟弃去封闭液，用洗涤液(TTBS)漂洗膜4次，每次10分钟～15分钟。加入以洗涤液1:2000稀释的单克隆抗体TT5C4，SP2/0细胞制备的小鼠腹水为阴性对照，37℃，150rpm，轻轻振摇反应60分钟；TBS漂洗膜4次，每次10～15分钟。加入以TBS稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG(1:20000)，150rpm，轻轻振摇反应60分钟。TBS漂洗4次，每次10～15分钟。加入DAB显色液，轻摇至显色，蒸馏水漂洗终止反应。

3.2单克隆抗体亲和常数测定

采用BiAcore 3000测定单克隆抗体亲和力。

3.3单克隆抗体的亚类亚型鉴定

采用美国Roche公司Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit鉴定单抗的亚类亚型，操作按说明书进行。

结果：筛选出一株能分泌特异抗破伤风外毒素的单克隆抗体TT5C4杂交瘤细胞株（该细胞株TT5C4已于2012年4月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201257，细胞株名称：鼠源杂交瘤细胞株TT5C4），对该细胞株分泌产生的单克隆抗体TT5C4的生物学特性鉴定显示TT5C4单抗为IgG1型，具有高特异性和高亲和力（Ka＝1.9×10^-10）Western blot(图1)结果显示：TT5C4单抗能与破伤风外毒素发生特异的抗原抗体反应。

3.4动物实验鉴定TT5C4单克隆抗体的中和保护作用

实验参照《中华人民共和国药典》2005年版三部(生物制品)中附录Ⅺ F中描述的方法进行，具体方法如下：实验动物选用体重17～20g昆明小鼠，每组10只，雌雄各半，共9组。将纯化的TT5C4单抗按以下浓度稀释：0.32mg/ml、0.16mg/ml、0.08mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml，0.01mg/ml分别与等体积的天然破伤风外毒素0.0008mg/ml混合，阴性对照组为硼酸盐缓冲液与等体积天然破伤风外毒素（0.0008mg/ml）的混合，阳性对照为0.08mg/ml的人抗破伤风免疫球蛋白与等体积天然破伤风外毒素（0.0008mg/ml）混合，同时设硼酸盐缓冲液空白对照组。混合后置37℃1h后，每只小鼠注射的0.4ml。TT5C4单抗注射剂量按小鼠mg/kg计算分别为3.2mg/kg、1.6mg/kg、0.8mg/kg、0.4mg/kg、0.2mg/kg、0.1mg/kg，阳性对照人抗破伤风免疫球蛋白为0.8mg/kg，阴性对照2A8单抗为3.2mg/kg，天然破伤风外毒素为0.008mg/kg（LD₁₀₀）。观察各组小鼠的死亡情况，在10d观察期后计算小鼠的存活率。实验数据采用PEMS统计软件经χ²检验进行统计学分析，P<0.05具有统计学意义，P<0.01差异极显著。试验结果如表1所示：

表1 动物体内TT5C4单克隆抗体中和保护试验结果

^**.P<0.01 vs 阴性对照组;^**.P<0.05 vs 阴性对照组;^*.P>0.05 vs 阴性对照组

结果分析：阴性对照组小鼠存活率为0，阳性对照和空白对照组小鼠存活率为100%,TT5C4单克隆抗体组的小鼠存活率呈现剂量依赖性递增，其中，1.6mg/kg以上剂量TT5C4单克隆抗体组的小鼠存活率为100%，说明TT5C4单克隆抗体对破伤风外毒素具有很强的中和保护作用。

实施例2破伤风外毒素中和性单克隆抗体TT5C4的κ轻链和Fd链基因的克隆

1.所用细胞株即为本发明人采用上述方法获得的能分泌高亲和力、高特异性的中和破伤风外毒素毒性作用的单克隆抗体TT5C4的杂交瘤细胞株，保藏号为CCTCC NO.C201257，其分泌的抗体分子亚类和亚型为IgG1型。

2.取对数生长期的TT5C4杂交瘤细胞（2×10⁶），采用TRIZOL一步法（Invitrogen公司）提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1%琼脂糖凝胶电泳检测。随后采用One step PT-PCR试剂盒（TaKaRa公司）扩增单抗TT5C4的κ轻链(VL+CL)和Fd链(VH+CH1)基因。将含有TT5C4的κ链和Fd链的扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶分离目的片段。通过胶回收试剂盒（Promega公司）纯化目的片段后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段的纯度，之后，将抗体κ轻链和Fd链基因克隆至pMD18-T Simple Vector（TaKaRa公司），采用双脱氧末端终止法，对测序结果进行同源性比较和胚系基因来源的分析。

有关操作具体步骤如下：

2.1RT-PCR扩增TT5C4抗体的κ链和Fd链

2.1.1引物设计

参照美国Scripps研究所设计的引物，根据鼠源免疫球蛋白基因不同家族的可变区基因序列设计合成了8对Fd链引物（引入限制性酶切位点XhoI/SpeI），7对κ链（引入限制性酶切位点SacI/XbaI）引物，序列如下:

κ链上游引物：按顺序依次表示为SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:11

LC1 5’-CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT-3’

LC2 5’-CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC-3’

LC3 5’-CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA-3’

LC4 5’-CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA-3’

LC5 5’-CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA-3’

LC6 5’-CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA-3’

LC7 5’-CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA-3’

                     SacI

κ链下游引物：SEQ ID NO:12

CK 5’-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGAA-3’

                XbaI

Fd链上游引物:按顺序依次表示为SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:20

HC1 5’-AGG TCC AGC TGC TCG AGT CTGG-3’

HC2 5’-AGG TCC AGC TGC TCG AGT CAGG-3’

HC3 5’-AGG TCC AGC TTC TCG AGT CTGG-3’

HC4 5’-AGG TCC AGC TTC TCG AGT CAGG-3’

HC5 5’-AGG TCC AAC TGC TCG AGT CTGG-3’

HC6 5’-AGG TCC AAC TGC TCG AGT CAGG-3’

HC7 5’-AGG TCC AAC TTC TCG AGT CTGG-3’

HC8 5’-AGG TCC AAC TTC TCG AGT CAGG-3’

                         XhoI

Fd链下游引物:SEQ ID NO:21

IgG1 5’-AGG CTT ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3’

                              SpeI

2.1.2 TT5C4杂交瘤细胞的总RNA提取

对数生长期的TT5C4杂交瘤细胞(5×10⁶～10×10⁶)于10ml离心管中，离心1 000rpm，5分钟，弃上清，加1ml不完全培养基悬浮细胞，移入DEPC水处理的2ml EP管中，离心1500rpm，5分钟，弃上清，置液氮冻存备用或用于总RNA的提取。取上述对数生长期的F2杂交瘤细胞(1×10⁶～10×10⁶)，加入1ml的TRIZOL试剂（购自invitrogen公司），以移液器吹打细胞数次，室温放置5分钟,确保核蛋白复合物有充分的时间解离。按每毫升的TRIZOL加入200μl氯仿，振荡15秒，混匀后室温（15℃～30℃）孵育2～3分钟。4℃离心，12 000×g，15分钟，混合物被分成3层，低层为红色液相，顶层为无色液相(RNA包含其中)。吸取上层水相至另一个DEPC购自invitrogen公司）处理的2ml EP管中，按每毫升原始体积的TRIZOL加入0.5ml异丙醇，置室温10min，4℃离心，12 000×g，10分钟，沉淀RNA，弃上清加入1ml75%的乙醇悬浮沉淀。（洗涤RNA，RNA可在乙醇中4保存1周）。4℃离心，7 500×g，10分钟，尽量弃去上清。温晾干或真空干燥5～10分钟，（注意RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。加入DEPC处理过的双蒸水50μl，溶解RNA样品，取5μl琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的总RNA。A溶液1μl，分别以500μl DEPC处理过的双蒸水稀释，取稀释液100μl测定A₂₆₀、A₂₆₀/A₂₈₀，从而获知所抽提的RNA的含量：CRNA（ng/μl）＝A₂₆₀×40×稀释倍数）及纯度，余下样品分装后-70℃冻存或用于RT-PCR。以提取的总RNA为模板，采用上述7对κ轻链和8对Fd链的引物，使用Takara公司的One Step RNA PCR试剂盒，分别扩增TT5C4单克隆抗体κ轻链和Fd链基因，体系如下：

将反应体系振荡混匀，离心处理后，进行PCR。反应条件：

反应完毕后取3μl反应产物，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。

结果：从分泌破伤风外毒素中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株TT5C4中提取总RNA（图2），以总RNA为模板，采用7对鼠源κ轻链及8对Fd链引物，通过一步法RT-PCR扩增TT5C4κ轻链及TT5C4Fd链。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR扩增分别得到大小约为650bp的TT5C4κ轻链（图3）和TT5C4Fd链基因（图4），均与预期片段大小相符，初步证实扩增产物为所需目的片段，下一步可对PCR产物进行回收。

3.PCR产物的克隆与基因序列测定及结构分析

3.1.将抗体κ链和Fd片段的PCR产物分别克隆至PGEM-T Easy载体，构建成发明人命名的pMD18-T-TT5C4Fd和pMD18-T-TT5C4κ重组质粒，然后对插入片段酶切鉴定。

结果：从pMD-T-TT5C4Fd载体和pMD-T-TT5C4κ载体上均切出约650bp左右的目的片段（图5）。

3.2.将酶切鉴定正确的pMD-T-TT5C4Fd载体和pMD-T-TT5C4κ载体进行序列测定；分别应用下列二个数据库对所得序列与现有已报道的其它各种抗体基因进行同源性比较，并分析其胚系基因来源，数据库网址如下：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/

用ANTHEPROT软件(V5.0)对κ链和Fd片段的氨基酸序列和理化性质进行分析；将氨基酸序列提交SWISS-MODEL在线工具通过分子模建预测κ链和Fd链的蛋白三级结构并提交PDB数据库比对。

基因测序结果表明：TT5C4κ链基因为642bp（SEQ ID NO:2），经比对与鼠抗体的κ链的胚系基因具有较高的一致性，为96.3%，TT5C4Fd链基因为654bp（SEQID NO:4），经比对与鼠抗体重链的胚系基因具有较高的一致性，为95%。

TT5C4κ链的胚系基因来源：V-GENE：12-44；J-GENE：JK1

TT5C4κ链通过FR-IGMT和CDR-IGMT分析显示：依次如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25所示

CDR1：CGAGTAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCA

CDR2：AATGCAAAAACCTTAGTAGAA

CDR3：CAACGTCATTATGGAACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAA

      CTGGAAATCAAACGG

TT5C4 Fd片段的胚系基因来源：V-GENE：VHQ52.a8.22；D-GENE：DFL16.1j；J-GENE：JH4

TT5C4 Fd片段通过FR-IGMT and CDR-IGMT分析显示：依次如SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28所示

CDR1：AACTATGGTATACAT

CDR2：GTTATATGGAGTGATGGAGACACAACCTATAATTCAGCTCTCAAATCC

CDR3：AATTTCCCTTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCA

      GTCACCGTCTCCTCA

TT5C4κ链基因编码214个氨基酸（SEQ ID NO:1），分子量约为23691Da，可变区位于1～114位氨基酸，CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为24aa～34aa、50aa～56aa和89aa～108aa，依次如SEQ ID NO29:、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31所示；

TT5C4Fd链基因编码218个氨基酸(SEQ ID NO:3)，分子量约为23547Da,可变区位于1～108位氨基酸，CDR1、CDR2和CDR3的区域分别为27aa～31aa，46aa～61aa和94aa～114aa，依次如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34所示；TT5C4κ链氨基酸序列的第23、88、134、194、214位氨基酸和TT5C4Fd链氨基酸序列的第18、91、141、196、216位氨基酸均为半胱氨酸，可以形成链内和链间二硫键。

TT5C4κ链基因编码的氨基酸序列：(SEQ ID NO:1)

ELVLTQSPASLSASVGETVTITCRVSENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLVEG

                         CDR1                      CDR2

VPSRFSGSGSGTQFSLRINSLQPEDFGSYFCQRHYGTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTV

                                    CDR3

SIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTY

SMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

TT5C4Fd链基因编码的氨基酸序列：(SEQ ID NO:3)

LESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLNNYGIHWIRQPPGKGLEWLVVIWSDGDTTYNSALKSR

                            CDR1               CDR2

LNITKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARNFPYYYAMDYWGQGTSVTVSSTKTTPPS

                                         CDR3

VYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVT

VPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCTS

经比对κ链和Fd链的基因和氨基酸序列与现已报道的各种其它已知抗体基因序列和氨基酸序列均不完全一致。说明单克隆抗体TT5C4基因序列的确来自小鼠胚系基因，是属于一种新的有功能的针对破伤风外毒素的抗体基因。下一步可以采用TT5C4κ链和TT5C4Fd链构建TT5C4抗体的Fab基因工程抗体。

实施例3破伤风外毒素中和性单克隆抗体TT5C4的Fab形式抗体的构建和可溶表达

首先将分析正确的TT5C4κ链和TT5C4Fd链基因克隆至分泌表达Fab抗体的载体pcomb3X（购自重庆金麦生物技术公司）之中，构建pcomb3X-TT5C4Fdκ质粒，酶切鉴定后，切除pcomb3X载体上的噬菌体外壳蛋白Ⅲ基因后自连，构建成pcomb3X-TT5C4Fab表达质粒，经限制性酶切鉴定及ＤＮＡ测序分析，证实基因构建正确后转化到大肠杆菌XL-blue（购自上海杰瑞生物工程公司）中，构建成pcomb3X-TT5C4Fab/XL-blue重组子，IPTG诱导TT5C4Fab抗体蛋白的表达。SDS-PAGE电泳ELISA和Western-blot分析表明Fab基因在大肠杆菌中的表达。有关操作具体步骤如下：

1.质粒DNA抽提（使用Omega公司质粒抽提试剂盒）

挑取平板上分隔良好的菌落转种于带相应抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；取菌液分装于1.5mL离心管中，12000g离心3分钟，留取沉淀。每管加100μL SolutionⅠ悬浮，充分振荡混匀。加入100μL SolutionⅡ，轻柔混匀，冰水浴5分钟；加入250μL SolutionⅢ，轻振混匀，室温放置10分钟。4℃、12000g离心10分钟，将上清移至分离管中；12000g离心1分钟，倾倒收集管中的废液；加入500μL washing buffer于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液。重复洗涤一次；12000g离心1分钟，使乙醇完全挥发；将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE buffer，65℃水浴5分钟，12000g离心1分钟；取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20℃保存备用。

2.感受态菌的制备（CaCl₂法）

无菌接种环蘸取-70℃冻存的E.coli DH5α（购自TKARA公司）或XL-Blue细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16小时。挑取单个菌落接种于2mL LB培养液中，37℃摇床培养12～16小时；将过夜培养的DH5α或XL-Blue菌按1%比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.2～0.4时，8000g离心5分钟收集细菌；加入1mL预冷的0.1M CaCl₂重悬沉淀，冰水浴3小时；4℃8000g离心5分钟，弃上清；加入100μL预冷的0.1M CaCl₂悬浮沉淀，冰水浴1小时，备用。

3.构建重组质粒Pcomb3X-TT5C4Fd

pMD18-TT5C4Fd质粒经XhoI+SpeI双酶切回收目的片段后与同样经XhoI+SpeI双酶切回收的载体Pcomb3X相连接，构建重组质粒Pcomb3X-TT5C4Fd。

3.1大量抽提质粒pMD18-TT5C4Fd及Pcomb3X，操作方法同前。

3.2酶切反应

载体Pcomb3X及pMD18-TT5C4Fd均用XhoI+SpeI双酶切，反应体系如下：

混匀，37℃水浴4小时。

3.3酶切后目的片段的回收

将上述酶切反应体系中分别加入5μl 10×Loading Buffer，电泳，100V，待指示剂迁移至距凝胶前沿1.5cm时停止电泳。分别回收Fd基因片段，以及载体Pcomb3X的大片段，具体操作同前。

3.4连接反应

紫外分光光度计检测回收产物核酸含量，目的基因片段为10ng/μl，载体片段为50ng/μl。根据目的片段与载体摩尔数比一般为1:2～10的原则，确连接反应体系如下：

22℃连接1小时，65℃灭活10分钟。

3.5连接产物转化及阳性重组子的筛选、鉴定

感受态细菌E.coli DH5α的制备(CaCl₂法)同前；Amp⁺LB平板的制备同前；连接产物转化，方法同前；阳性重组子的筛选与鉴定，采用XhoI+SpeI双酶切，其余方法同前。

4.构建重组质粒Pcomb3X-TT5C4Fdκ（含噬菌体外壳蛋白Ⅲ基因）

pMD18-TT5C4κ质粒经ScaI+XbaI双酶切回收目的片段后与同样经ScaI+XbaI双酶切回收的载体Pcomb3X-TT5C4Fd大片段相连接，构建重组质粒Pcomb3X-TT5C4Fdκ（含噬菌体外壳蛋白Ⅲ基因，PⅢ）。

4.1.大量抽提质粒pMD18-TT5C4κ及Pcomb3X-TT5C4Fd，操作方法同前。

4.2.酶切反应

载体pMD18-TT5C4κ及Pcomb3X-TT5C4Fd均用ScaI+XbaI双酶切，反应体系如下：

混匀，37℃水浴4小时。

4.3.酶切后目的片段的回收

灌制1%琼脂糖回收胶，将上述酶切反应体系中分别加入5μl 10×LoadingBuffer，电泳，100V，待指示剂迁移至距凝胶前沿1.5cm时停止电泳。分别回收κ基因片段以及载体Pcomb3X-TT5C4Fd的大片段，具体操作同前。

4.4.连接反应

紫外分光光度计检测回收产物核酸含量，目的基因片段为10ng/μl，载体片段为

50ng/μl。根据目的片段与载体摩尔数比一般为1:2～10的原则，确连接反应体系如下：

22℃连接1小时，65℃灭活10分钟。

4.5.连接产物转化及阳性重组子的筛选、鉴定

阳性重组子的筛选与鉴定 采用SacI和XbaI、XhoI和SpeI双酶切鉴定，其余方法同前。

结果：分别用SacI和XbaI、XhoI和SpeI双酶切，分别获得642bp、654bp的基因片段，片段大小分别与TT5C4单抗的κ轻链、Fd片段大小相符，说明Pcomb3X-TT5C4Fdκ重组质粒构建成功，下一步可将构建成功的Pcomb3X-TT5C4Fdκ质粒采用NheI和SpeI双酶切，切除PⅢ基因后自连，构建Pcomb3X-TT5C4Fab表达载体。

5.构建Pcomb3X-TT5C4Fab表达载体（无PⅢ基因）

重组质粒Pcomb3X-TT5C4Fdκ（含PⅢ基因），经SpeI+NheI双酶切（切除PⅢ基因）回收Pcomb3X-TT5C4Fdκ大片段后自连，转化大肠杆菌XL-Blue感受态菌，构建Pcomb3X-TT5C4Fab表达载体。

5.1.大量抽提质粒Pcomb3X-TT5C4Fdκ，操作方法同前。

5.2.酶切反应

质粒Pcomb3X-TT5C4Fdκ用SpeI+NheI双酶切，反应体系如下：

混匀，37℃水浴4小时。

5.3.酶切后目的片段的回收

灌制1.0%琼脂糖回收胶，将上述酶切反应体系中分别加入5μl 10×LoadingBuffer，电泳，100V，待指示剂迁移至距凝胶前沿1.5cm时停止电泳。分别回收经SpeI+NheI双酶切后的Pcomb3X-TT5C4Fdκ的大片段，具体操作同前。

5.4.连接反应

紫外分光光度计检测回收产物核酸含量，载体片段为30ng/μl，连接反应体系如下：

22℃连接1小时或过夜，65℃灭活10分钟。

5.5.连接产物转化及阳性重组子的筛选、鉴定

连接产物转化XL-Blue菌，阳性重组子采用SacI与NotI双酶切鉴定。NheI与SpeI是同为酶，双酶切自连后酶切位点消失，如果NheI与SpeI双酶切自连成功，则采用SacI与NheI下游的NotI双酶，可切出约1400bp的片段，如果NheI与SpeI双酶切比成功，则切除约2000bp的片段，其余方法同前。

结果（图6）：将经NheI和SpeI双酶切后自连的Pcomb3X-TT5C4Fab载体，采用SacI与NotI进行双酶切，切出约1400bp的基因片段，与预期片段大小相符。酶切鉴定结果表明：表达载体Pcomb3X-TT5C4Fab构建成功，质粒送生物技术公司测序。序列测定结果表明：插入Fab抗体表达质粒Pcomb3X的κ链与Fd链的基因序列与TT5C4单抗的κ轻链及Fd链的序列完全一致，无突变发生，且方向为5’κ-pelB-Fd 3’，噬菌体衣壳蛋白Ⅲ(PⅢ)的基因已切出，该结果证明：TT5C4κ链及TT5C4Fd链正确插入Pcomb3X载体，来源于TT5C4单克隆抗体的Fab基因工程抗体表达载体Pcomb3X-TT5C4Fab构建成功。

Pcomb3X-TT5C4Fab的序列如下：SEQ ID NO:22

GAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTC

GAGTAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAACAGAAGCAGGGAAAATCTCCTCAGCTCC

TGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGTAGAAGGTGTGCCTTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAC

AGTTTTCTCTGAGGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTTCTGTCAACGTCATTATGG

AACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATC

CATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTC

TACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAG

TTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACG

AGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATCGTCAAGA

GCTTCAACAGGAATGAGTGTTAATTCTAGATAATTATATGGAGGAATTTAAAATGAAATACCTATTGCC

TACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACAAGCCATGGCCGAGGT

      pelB

GCAGCTGCTCGAGTCTGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTC

AGGATTCTCATTAAATAACTATGGTATACATTGGATTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCT

GGTAGTTATATGGAGTGATGGAGACACAACCTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAACATCACCAA

GGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAGACTGATGATACAGCCATGTACTA

CTGTGCCAGAAATTTCCCTTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCC

TCAACCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGG

TGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCC

TGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGAC

TGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAA

GGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTACTAGC

实施例4 TT5C4Fab抗体的可溶表达

1.取含表达质粒Pcomb3X-TT5C4Fab的XL-blue工程菌菌种，按1%的浓度接种4ml SB-A⁺培养液中（含100μg/ml氨苄青霉素），37℃过夜培养后，按2%的浓度转种50ml SB-A⁺培养液中，37℃振荡培养至A₆₀₀＝0.8，加入1mmol/L IPTG,置30℃振荡培养10h～12h，同时设空载体菌诱导对照；4℃4 000rpm离心15min。弃上清，用1/10体积PBS（pH7.4）重悬细菌沉淀，冰浴下超声破碎，功率300W，超声10S，间歇10S，50次，每个油镜视野未破菌少于2个为裂菌完全；4℃10 000rpm离心20min；收集上清，间接ELISA和SDS-PAGE鉴定TT5C4Fab抗体的表达。

2.SDS-PAGE鉴定TT5C4Fab抗体的表达

灌制5%浓缩胶，15%的分离胶，以含表达质粒Pcomb3X-TT5C4Fab的XL-blue工程菌超声上清为样品进行SDS-PAGE，Pcomb3X空载体菌超声上清为阴性对照。

3.间接ELISA鉴定TT5C4Fab抗体的表达

将羊抗鼠Fab抗体用包被液（pH 9.6碳酸盐缓冲液）1∶1 000稀释,100μl/孔包被ELISA，4℃放置10h后，300μl/孔1%BSA封闭过夜加含表达质粒Pcomb3X-TT5C4Fab的XL-blue工程菌超声上清，37℃室温30min，加入HRP标的羊抗鼠Fab抗体，37℃室温30min，加OPD显色于波长492nm测定吸光度值（具体操作同前），鼠TT5C4单克隆抗体为阳性对照，Pcomb3X空载体菌超声上清为阴性对照，PBS为空白对照。

结果：将重组子Pcomb3X-TT5C4Fab转入XL-blue中，构建重组工程菌。30℃下经IPTG诱导，收集诱导后重组工程菌破菌上清。间接ELISA检测重组工程菌超声破菌上清，出现阳性结果；SDS-PAGE检测显示（图8）：在Mr约为23KDa处出现1条新的蛋白表达带，与TT5C4Fab的κ链和Fd链理论预测的分子量相近，结果说明在IPTG的诱导下，成功实现了抗破伤风外毒素毒性活性中心的Fab抗体的原核可溶表达，ELISA结果表明：表达的Fab抗体具有与天然破伤风外毒素特异结合的能力，为其在诊断和治疗破伤风梭状芽孢杆菌感染及其并发症中的进一步应用奠定了基础。

实施例5 TT5C4Fab抗体的生物学特性鉴定

采用亲和层析纯化表达蛋白后以SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果，Western blot检测TT5C4Fab特异性；通过TT5C4Fab抗体在Balb/c小鼠体内中和破伤风外毒素毒性的实验鉴定TT5C4Fab抗体对破伤风外毒素的中作用。具体操作如下：

1.TT5C4Fab抗体蛋白的纯化

1.1大量制备TT5C4Fab抗体表达菌超声上清

按1%的浓度接种150ml SB-A⁺培养液中（含100μg/ml氨苄青霉素），37℃过夜培养后，按2%的浓度转种5 000ml SB-A⁺培养液中，37℃振荡培养至A₆₀₀＝0.8，加入1mmol/L IPTG，置30℃振荡培养过夜或14h，4℃8 000g离心20min收集细菌，称重后备用。取100g表达菌，1/10体积PBS（PH7.4）重悬细菌沉淀，冰浴下超声破碎，功率300W，超声10s，间歇10s，50次，每个油镜视野下未破菌少于2个为裂菌完全。

1.2 TT5C4Fab抗体的纯化

1.2.1用10倍于柱床体积的Binding buffer A平衡Protein L Resin层析柱；以1ml/min的速度上样于Protein L Resin柱，用Binding buffer A洗柱子直至所有的未结合的蛋白都被洗脱，采用A₂₈₀监测；10倍柱床体积的Elution buffer B连续洗脱结合蛋白，洗脱下的蛋白直接接入装有中和缓冲液的管中，调节纯化蛋白的PH至7.4；BCA法测定洗脱下的抗体蛋白质浓度。

2.TT5C4Fab抗体的生物学特性检测

2.1Western blot检测TT5C4Fab特异性

破伤风外毒素经SDS-PAGE后转印硝酸纤维素膜，以纯化后的抗破伤风外毒素基因工程抗体TT5C4Fab为一抗，分别以HRP标记的羊抗小鼠Fab IgG为二抗，进行Western blot，具体操作步骤参见实施例1。

2.2TT5C4Fab抗体在Balb/c小鼠体内中和破伤风外毒素毒性的实验

实验参照《中华人民共和国药典》2005年版三部(生物制品)中附录Ⅺ F中描述的方法进行，具体方法如下：实验动物选用体重17～20g昆明小鼠，每组10只，雌雄各半，共9组。将纯化的TT5C4单抗按以下浓度稀释：、0.64mg/ml、0.32mg/ml、0.16mg/ml、0.08mg/ml、0.04mg/ml、分别与等体积的天然破伤风外毒素0.0008mg/ml混合，阴性对照组为硼酸盐缓冲液与等体积天然破伤风外毒素（0.0008mg/ml）的混合，阳性对照为1.6mg/kg的TT5C4MAb，阴性对照为3.2mg/kg2A8单抗，同时设硼酸盐缓冲液空白对照组。混合后置37℃1h后，每只小鼠注射的0.4ml。TT5C4Fab单抗注射剂量按小鼠mg/kg计算分别为6.4mg/kg、3.2mg/kg、1.6mg/kg、0.8mg/kg、0.4mg/kg、0.2mg/kg，TT5C4Mab为1.6mg/kg，天然破伤风外毒素为0.008mg/kg（LD₁₀₀）。观察各组小鼠的死亡情况，在10d观察期后计算小鼠的存活率。实验数据采用PEMS统计软件经χ²检验进行统计学分析，P<0.05具有统计学意义，P<0.01差异极显著。

结果：大量制备TT5C4Fab抗体表达菌超声上清（图7），采用Protein L Resin亲和层析纯化TT5C4Fab抗体，纯化后样品经SDS-PAGE后，采用凝胶成像分析系统扫描分析蛋白纯度为95%（图8），Western blot结果（图9）表明，纯化后的TT5C4Fab抗体能与相应转移至硝酸纤维素膜上的破伤风外毒素形成单一的蛋白质染色带。TT5C4Fab抗体动物体内中和活性试验结果（表2）表明，阴性对照组小鼠小鼠的存活率为0，阳性对照和空白对照组小鼠的存活率为100%，TT5C4Fab抗体各实验组均呈现不同的中和保护效率，且呈现出明显的剂量依赖性，其中TT5C4Fab抗体浓度达6.4mg/kg时，小鼠的存活率为100%，说明TT5C4Fab抗体对破伤风外毒素有很显著的中和保护作用。

表2动物体内TT5C4Fab抗体中和保护试验结果

^**.P<0.01vs 阴性对照组;^**.P<0.05vs 阴性对照组;^*.P>0.05vs 阴性对照组

综上所述，本发明的Fab抗具有与亲本鼠源性单抗TT5C4相当的破伤风外毒素毒性中和作用，且Fab抗体分子量小，仅为全抗体分子量的1/3，大大降低了该中和性抗体的免疫原性，与亲本TT5C4Mab相比更具临床应用价值，为人源化破伤风外毒素中和性抗体的研究奠定了基础。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (11)

1. 一种分泌破伤风梭菌外毒素单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC NO. C201257。

2.一种破伤风梭菌外毒素单克隆抗体，其特征在于，由保藏号为CCTCC NO. C201257的鼠源杂交瘤细胞株产生。

3. 一种由权利要求2所述的单克隆抗体制得的Fab抗体，其特征在于，其包括κ链和Fd链，所述κ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的Fd链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4. 根据权利要求3所述的Fab抗体，其特征在于，所述κ链的互补决定区的核苷酸序列如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示；Fd链的互补决定区的核苷酸序列如SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示。

5. 根据权利要求3所述的Fab抗体，其特征在于，所述κ链的互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31所示；Fd链的互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示。

6. 一种表达载体，其特征在于，含有权利要求3所述的Fab抗体的κ链和Fd链的核苷酸编码序列，其中，所述κ链的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的Fd链的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

7. 根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，该表达载体包括裸DNA或质粒DNA中的至少一种。

8. 一种表达宿主菌，其特征在于，转入了权利要求6所述的表达载体。

9. 权利要求2所述的单克隆抗体或权利要求3所述的Fab抗体在制备预防或治疗破伤风的药物中的应用。

10. 权利要求2所述的单克隆抗体或权利要求3所述的Fab抗体在制备ScFv抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体融合蛋白或蛋白单域抗体中的应用。

11.一种预防或治疗破伤风的药物，其特征在于包含权利要求2所述的单克隆抗体和/或权利要求3所述的Fab抗体，及药学上可接受的载体。

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