CN107614526A - 靶向骨形成蛋白9(bmp9)的抗体及其方法 - Google Patents

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黄大刚
M·库格勒
李倩
C·X·吕
罗霄
单永强
K·U·蒂索-达格特
吴静
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Abstract

本发明涉及分离的结合人BMP9的抗体及其抗原结合片段，以及其组合物及使用方法。

Description

靶向骨形成蛋白9(BMP9)的抗体及其方法
相关申请案
本申请主张2015年6月5日申请的PCT申请第PCT/CN2015/080887号的优先权。该申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，在此其全部内容以引用的方式并入本文中。所述ASCII拷贝于2016年5月4日生成，命名为PAT056928-WO-PCT02_SL.txt，大小为168,487字节。
技术领域
本发明涉及结合人BMP9的抗体及其抗原结合片段，以及其组合物及使用方法。
背景技术
纤维化为一种涉及器官或组织中通过细胞异常形成或发展过量纤维结缔组织的病理性过程。虽然与纤维化相关的过程可作为正常组织形成或修复的一部分存在，但此等过程的失调可引起细胞组成改变且过量结缔组织沉积，逐渐损害组织或器官功能。
纤维化肝病，包括肝硬化，影响全世界超过一亿人口，且每年引起超过一百万例死亡。门静脉高血压为纤维化肝病及肝硬化的主要后果之一，造成该疾病的许多并发症。肝病，包括纤维化肝病(包括肝硬化)的现存疗法可能具有低功效及不良的副作用。此外，当前对于包括纤维化肝病(包括肝硬化)的肝病，无法完全有效治疗或治愈。因此，极大地需要可抑制、预防或逆转肝病，包括纤维化肝病及肝硬化，包括其后果(诸如门静脉高血压)，且因此可用于治疗或预防个体的肝病(例如肝纤维化、肝硬化或门静脉高血压)的部分，以及诊断此类令人虚弱的疾病的诊断方法。
发明内容
本发明提供分离的BMP9结合分子(例如BMP9结合抗体或其抗原结合片段)、包含此类分子的药物组合物、制备此类分子及组合物的方法及其用于治疗疾病，例如肝病(例如肝纤维化、肝硬化及门静脉高血压)的方法。
在一个方面，本发明提供一种分离的BMP9抗体或其抗原结合片段，其包含表1中任一抗体的任1、2、3、4、5或6个CDR。
在一个方面，本发明提供一种分离的BMP9抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-1的6个CDR。
在一个方面，本发明提供一种分离的BMP9抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-2的6个CDR。
在一个方面，本发明提供一种分离的BMP9抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-3的6个CDR。
在一个方面，本发明提供一种分离的BMP9抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-4的6个CDR。
在一个方面，本发明提供一种分离的BMP9抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-5的6个CDR。
在一个方面，本发明提供一种分离的BMP9抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-6的6个CDR。
在一个方面，本发明提供一种分离的BMP9抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-7的6个CDR。
在一个方面，本发明提供一种分离的BMP9抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-8的6个CDR。
在一个方面，本发明提供一种分离的BMP9抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-9的6个CDR。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:1、2及3的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:11、12及13的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:4、5及6的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:14、15及16的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:21、22及23的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:31、32及33的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:24、25及26的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:34、35及36的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:41、42及43的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:51、52及53的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:44、45及46的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:54、55及56的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:61、62及63的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:71、72及73的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:64、65及66的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:74、75及76的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:81、82及83的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:91、92及93的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:84、85及86的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:94、95及96的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:101、102及103的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:111、112及113的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:104、105及106的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:114、115及116的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:121、122及123的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:131、132及133的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:124、125及126的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:134、135及136的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:141、142及143的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:151、152及153的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:144、145及146的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:154、155及156的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:161、162及163的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:171、172及173的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段结合人BMP9且包含：
分别为SEQ ID NO:164、165及166的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:174、175及176的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本发明的一个方面，结合人BMP9的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含至少一个与以下中的任一个或多个具有至少90％、95％、97％、98％或至少99％序列相同的互补决定区(CDR)序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1、2及3的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:11、12及13的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(b)分别为SEQ ID NO:4、5及6的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:14、15及16的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(c)分别为SEQ ID NO:21、22及23的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:31、32及33的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(d)分别为SEQ ID NO:24、25及26的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:34、35及36的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(e)分别为SEQ ID NO:41、42及43的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:51、52及53的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(f)分别为SEQ ID NO:44、45及46的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:54、55及56的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(g)分别为SEQ ID NO:61、62及63的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:71、72及73的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(h)分别为SEQ ID NO:64、65及66的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:74、75及76的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(i)分别为SEQ ID NO:81、82及83的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:91、92及93的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(j)分别为SEQ ID NO:84、85及86的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:94、95及96的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(k)分别为SEQ ID NO:101、102及103的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:111、112及113的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(l)分别为SEQ ID NO:104、105及106的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:114、115及116的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(m)分别为SEQ ID NO:121、122及123的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:131、132及133的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(n)分别为SEQ ID NO:124、125及126的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:134、135及136的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(o)分别为SEQ ID NO:141、142及143的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:151、152及153的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(p)分别为SEQ ID NO:144、145及146的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:154、155及156的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(q)分别为SEQ ID NO:161、162及163的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:171、172及173的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或
(r)分别为SEQ ID NO:164、165及166的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:174、175及176的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一个方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-1的VH及VL氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与如表1中所述的BMP9-1的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列，和/或与如表1中所述的BMP9-1的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-2的VH及VL氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与如表1中所述的BMP9-2的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列，和/或与如表1中所述的BMP9-2的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-3的VH及VL氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与如表1中所述的BMP9-3的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列，和/或与如表1中所述的BMP9-3的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-4的VH及VL氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与如表1中所述的BMP9-4的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列，和/或与如表1中所述的BMP9-4的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-5的VH及VL氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与如表1中所述的BMP9-5的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列，和/或与如表1中所述的BMP9-5的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-6的VH及VL氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与如表1中所述的BMP9-6的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列，和/或与如表1中所述的BMP9-6的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-7的VH及VL氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与如表1中所述的BMP9-7的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列，和/或与如表1中所述的BMP9-7的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-8的VH及VL氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与如表1中所述的BMP9-8的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列，和/或与如表1中所述的BMP9-8的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种抗体或其抗原结合片段，其包含如表1中所述的BMP9-9的VH及VL氨基酸序列。在另一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与如表1中所述的BMP9-9的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列，和/或与如表1中所述的BMP9-9的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其描述于表1中。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包括：SEQ ID NO:7的VH序列；SEQ ID NO:27的VH序列；SEQ ID NO:47的VH序列；SEQ ID NO:67的VH序列；SEQID NO:87的VH序列；SEQ ID NO:107的VH序列；SEQ ID NO:127的VH序列；SEQ ID NO:147的VH序列；或SEQ ID NO:167的VH序列。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或抗原结合片段，其包括：SEQ ID NO:17的VL序列；SEQ ID NO:37的VL序列；SEQ ID NO:57的VL序列；SEQ ID NO:77的VL序列；SEQID NO:97的VL序列；SEQ ID NO:117的VL序列；SEQ ID NO:137的VL序列；SEQ ID NO:157的VL序列；或SEQ ID NO:177的VL序列。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或抗原结合片段，其包括：SEQ ID NO:7的VH序列及SEQ ID NO:17的VL序列；SEQ ID NO:27的VH序列及SEQ ID NO:37的VL序列；SEQID NO:47的VH序列及SEQ ID NO:57的VL序列；SEQ ID NO:67的VH序列及SEQ ID NO:77的VL序列；SEQ ID NO:87的VH序列及SEQ ID NO:97的VL序列；SEQ ID NO:107的VH序列及SEQ IDNO:117的VL序列；SEQ ID NO:127的VH序列及SEQ ID NO:137的VL序列；SEQ ID NO:147的VH序列及SEQ ID NO:157的VL序列；或SEQ ID NO:167的VH序列及SEQ ID NO:177的VL序列。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或抗原结合片段，其包括：SEQ ID NO:9的重链序列；SEQ ID NO:29的重链序列；SEQ ID NO:49的重链序列；SEQ ID NO:69的重链序列；SEQ ID NO:89的重链序列；SEQ ID NO:109的重链序列；SEQ ID NO:129的重链序列；SEQID NO:149的重链序列；或SEQ ID NO:169的重链序列。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或抗原结合片段，其包括：SEQ ID NO:19的轻链序列；SEQ ID NO:39的轻链序列；SEQ ID NO:59的轻链序列；SEQ ID NO:79的轻链序列；SEQ ID NO:99的轻链序列；SEQ ID NO:119的轻链序列；SEQ ID NO:139的轻链序列；SEQID NO:159的轻链序列；或SEQ ID NO:179的轻链序列。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或抗原结合片段，其包括：SEQ ID NO:9的重链序列；及SEQ ID NO:19的轻链序列；SEQ ID NO:29的重链序列；及SEQ ID NO:39的轻链序列；SEQ ID NO:49的重链序列；及SEQ ID NO:59的轻链序列；SEQ ID NO:69的重链序列；及SEQ ID NO:79的轻链序列；SEQ ID NO:89的重链序列；及SEQ ID NO:99的轻链序列；SEQ ID NO:109的重链序列；及SEQ ID NO:119的轻链序列；SEQ ID NO:129的重链序列；及SEQ ID NO:139的轻链序列；SEQ ID NO:149的重链序列；及SEQ ID NO:159的轻链序列；或SEQ ID NO:169的重链序列；及SEQ ID NO:179的轻链序列。
本发明亦包括结合BMP9的抗体及其抗原结合片段，其具有与以下具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链：SEQ ID NO:9的重链序列；SEQ ID NO:29的重链序列；SEQ ID NO:49的重链序列；SEQ ID NO:69的重链序列；SEQ ID NO:89的重链序列；SEQ ID NO:109的重链序列；SEQ ID NO:129的重链序列；SEQ IDNO:149的重链序列；或SEQ ID NO:169的重链序列，和/或与以下具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的轻链：SEQ ID NO:19的轻链序列；SEQ ID NO:39的轻链序列；SEQ ID NO:59的轻链序列；SEQ ID NO:79的轻链序列；SEQ IDNO:99的轻链序列；SEQ ID NO:119的轻链序列；SEQ ID NO:139的轻链序列；SEQ ID NO:159的轻链序列；或SEQ ID NO:179的轻链序列。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其以KD≤1nM结合人BMP9。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其以KD≤500pM结合人BMP9。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以KD≤200pM结合人BMP9。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以KD≤100pM结合人BMP9。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以KD≤50pM结合人BMP9。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以KD≤20pM结合人BMP9。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段对人BMP9的亲和力比对人BMP10大至少约100倍。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段对人BMP9的亲和力比对人BMP7大至少约100倍。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段对人BMP9的亲和力比对人BMP2大至少约100倍。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段对人BMP9的亲和力比对人BMP2、对人BMP7及对人BMP10大至少约100倍。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段对人BMP9的亲和力比对人BMP10大至少约1000倍。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段对人BMP9的亲和力比对人BMP7大至少约1000倍。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段对人BMP9的亲和力比对人BMP2大至少约1000倍。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段对人BMP9的亲和力比对人BMP2、人BMP7及人BMP10大至少约1000倍。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以KD≤1nM结合于食蟹猴BMP9、大鼠BMP9和/或小鼠BMP9。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以KD≤0.5nM结合于食蟹猴BMP9、大鼠BMP9和/或小鼠BMP9。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以KD≤0.2nM结合于食蟹猴BMP9、大鼠BMP9和/或小鼠BMP9。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段以KD≤0.05nM结合于食蟹猴BMP9、大鼠BMP9和/或小鼠BMP9。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其(a)对人BMP9的亲和力比对人BMP10、对人BMP7及对人BMP2大至少约1000倍；及(b)以KD≤1nM结合于人BMP9、食蟹猴BMP9、大鼠BMP9及鼠类BMP9。在叙述KD的任一先前方面中，KD可通过MSD-SET分析法量测，例如如本文描述的。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合于人BMP9且在Biacore分析法中与人BMP10的结合不可检测。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或抗原结合片段抑制人BMP9与人BMP I型受体、例如人ALK1、人ALK2或人ALK3的结合。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或抗原结合片段抑制人BMP9与人BMP II型受体、例如人ActRIIB、ActRIIA或BMPRII的结合。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或抗原结合片段抑制人BMP9与人BMP I型受体、例如人ALK1、人ALK2和/或人ALK3的结合，且抑制人BMP9与人BMP II型受体、例如人ActRIIB、ActRIIA或BMPRII的结合。人BMP I型受体及人BMP II型受体两者与人BMP9结合的该抑制无需同时。
在任一前述方面中，人BMP9与BMP I型和/或BMP II型受体的结合的抑制发生在分离的抗体或其抗原结合片段浓度小于1×10-7M或1×10-8M或1×10-9M下。在一个方面，人BMP9与BMP I型和/或BMP II型受体的结合的抑制发生在分离的抗体或其抗原结合片段浓度小于1×10-9M下，如封闭性ELISA分析法中所量测，例如如本文所公开的。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段展现出体外或体内肝细胞系或初级肝细胞中BMP9诱发的ID1表达减少至少约50％，如在本文公开的分析法中。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段降低体外人BMP9的活性，如在本文公开的分析法中。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段降低体外人BMP9的活性，如HEKT-BRE-Luc报导基因分析法中所测量的，如本文所公开的。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段降低体内人BMP9的活性。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其交叉阻断任一先前方面的抗体或分离的其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段例如如本文所述以浓度小于约500nM，小于约200nM，小于约100nM，小于约10nM，或小于约1nM交叉阻断前述方面中任一方面的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，(a)其对人BMP9的亲和力比对人BMP10、人BMP7及人BMP2大至少约至少约1000倍，且(b)以小于1nM的KD结合于人BMP9、食蟹猴BMP9、大鼠BMP9及鼠类BMP9。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是嵌合的，人源化的或完全人的。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，如在如本文所述的HEK293T-BRE-Luc分析法中所测量，其具有小于200pM的IC50。在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，如在如本文所述的HEK293T-BRE-Luc分析法中所测量，其具有小于100pM的IC50。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是嵌合的，人源化的或完全人的。
在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，如在如本文所述的HEK293T-BRE-Luc分析法中所测量，其具有小于约200pM的IC50。在一个方面，包括任一先前方面中，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，如在如本文所述的HEK293T-BRE-Luc分析法中所测量，其具有小于或等于约100pM的IC50。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是嵌合的，人源化的或完全人的。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其在包括SEQ IDNO:215的人BMP9成熟片段氨基酸残基21-25、43-60、86及96的表位结合于人BMP9的成熟片段。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其在SEQ ID NO:215的人BMP9成熟片段氨基酸残基21-25、43-60、86及96内的表位结合于人BMP9的成熟片段。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其在包含SEQ IDNO:215的氨基酸残基21-25、43-60、86及96的表位结合于人BMP9的成熟片段。在一些方面中，结合包括分离的抗体或其抗原结合片段的氨基酸与SEQ ID NO:215的氨基酸残基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96之间的直接相互作用。
一方面，本发明涉及与人BMP9的成熟片段结合的分离的抗体或其抗原结合片段，并且包含a)在轻链可变区的氨基酸残基Y32，D50，S91，D92，T93，S94和L96；和b)在重链可变区中的氨基酸残基W47，I50，L52，H56，H58，I102，W103和S104。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其在由SEQ ID NO:215的氨基酸残基21-25、43-60、86及96组成的表位结合于人BMP9的成熟片段。在一些方面中，结合包括分离的抗体或其抗原结合片段的氨基酸与SEQ ID NO:215的氨基酸残基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96之间的直接相互作用。
在一个方面，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其在由SEQ ID NO:215的氨基酸残基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96组成的表位结合于人BMP9的成熟片段。
在一个方面，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其在包含SEQ IDNO:215的氨基酸残基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96的表位结合于人BMP9的成熟片段。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其在SEQ ID NO:215的人BMP9成熟片段氨基酸残基83-85及95-100内的表位结合于人BMP9的成熟片段。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其在包含SEQ IDNO:215的氨基酸残基S83、L85、L95、Y97、H98及E100的表位结合于人BMP9的成熟片段。在一些方面中，结合包括分离的抗体或其抗原结合片段的氨基酸与SEQ ID NO:215的氨基酸残基S83、L85、L95、Y97、H98及E100之间的直接相互作用。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其在由SEQ ID NO:215的氨基酸残基S83、L85、L95、Y97、H98及E100组成的表位结合于人BMP9之成熟片段。在一些方面中，结合包括分离的抗体或其抗原结合片段的氨基酸与SEQ ID NO:215的氨基酸残基S83、L85、L95、Y97、H98及E100之间的直接相互作用。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含分别为SEQID NO:184、185及186的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:192、193及194的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，例如鼠类或人源化分离的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其为如表3中所述的B211G2。在一些方面中，本发明涉及一种来源于B211G2的人源化抗体。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含分别为SEQID NO:200、201及202的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:208、209及210的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，例如鼠类或人源化分离的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本发明涉及一种分离的抗体或其抗原结合片段，其为如表3中所述的4E10D7。在一些方面中，本发明涉及一种来源于4E10D7的人源化抗体。
在一个方面，特异性结合于BMP9的本发明的抗体及其抗原结合片段为分离的单克隆抗体。在一个方面，特异性结合于BMP9的本发明的抗体及其抗原结合片段为分离的人单克隆抗体。在一个方面，特异性结合于BMP9的本发明的抗体及其抗原结合片段为人源化单克隆抗体。在一个方面，特异性结合于BMP9的本发明的抗体及其抗原结合片段为分离的嵌合抗体。在一个方面，本发明的抗体及其抗原结合片段包含人重链恒定区及人轻链恒定区。
在本发明的一个方面，特异性结合于BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段为单链抗体。
在本发明的一个方面，特异性结合于BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段为Fab片段。
在本发明的一个方面，特异性结合于BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段为scFv。
在一个方面，本发明的抗体及其抗原结合片段为IgG或来源于IgG。在本发明的一个方面，IgG为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段包含这样的框架，其中氨基酸已经被取代为来自相应人VH或VL胚系序列的抗体框架。在一个方面，经取代至抗体框架中的氨基酸来自或来源于B211G2。在一个方面，经取代至抗体框架中的氨基酸来自或来源于4E10D7。在一些方面中，经取代至抗体框架中的氨基酸包含CDR氨基酸。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段为免疫缀合物的组分。在一个方面，免疫缀合物可包含分离的抗体或其抗原结合片段及以下任一者(作为非限制性实例)：酶、毒素、激素、生长因子或药物。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段通过Fc区突变而具有改变的效应子功能。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段抑制肝细胞(例如体外或体内肝细胞系和/或初级肝细胞)中BMP9活性，例如BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化或Id1表达。在此类方面中，初级肝细胞包括肝脏中存在的任何细胞类型，例如肝细胞。在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段抑制肝细胞(例如体外或体内肝细胞系和/或初级肝细胞)中BMP9活性，例如BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化或Id1表达至少约50％。举例而言，分离的抗体或其抗原结合片段抑制肝细胞(例如体外或体内肝细胞系和/或初级肝细胞)中BMP9活性，例如BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化或Id1表达至少约50％、60％、70％、80％、90％或100％。作为非限制性实例，BMP9活性可通过测量smad1/5/8磷酸化的量或Id1mRNA或蛋白质水平的量来测量。
在本发明的一个方面，分离的抗体或其抗原结合片段降低体外人BMP9的活性。在本发明的一个方面，如在例如如本文所述的HEK293T-BRE-Luc报导基因分析法中所测量，分离的抗体或其抗原结合片段降低体外人BMP9的活性。
在一个方面，本发明提供一种任一先前方面，例如如表1中所述的分离的抗体或其抗原结合片段，及其他治疗剂。其他治疗剂可存在于包括分离的抗体或其抗原结合片段的组合物中，或可存在于分开的组合物中。
在本发明的一个方面，其他治疗剂降低BMP9活性。
在本发明的一个方面，其他治疗剂为siRNA、抗体或其抗原结合片段、可溶性BMP9受体、蛋白质或小分子。
在一个方面，其他治疗剂系选自由以下各者组成的群：抗病毒剂、消炎剂、抗纤维化剂、抗脂肪变性剂、抗细胞凋亡剂、保肝剂及其组合。
在一个方面，其他治疗剂系选自由以下各者组成的群：替诺福韦(tenofovir)、恩替卡韦(entecavir)、拉米夫定(lamivudine)、特布维定(telbuvudine)、阿德福韦(adefovir)、聚乙二醇化干扰素、索非布韦(sofusbuvir)、替拉瑞韦(telaprevir)、达拉斯韦(daclatsivir)、西咪匹韦(simeprevir)、莱达普韦(ledasprevir)、皮质类固醇、GFT-505、赛瑞维克(cenicriviroc)、维生素E、吡格列酮(pioglitazone)、二甲双胍(metformin)、奥贝胆酸(obeticholic acid)、GR-MD-02及其组合。
在另一个方面，本发明提供了包括包含在先方面任一个的分离的抗体或其抗原结合片段(例如如本文所述的，例如在表1中所公开的抗体或其抗原结合片段)及可药用的载体的组合物。组合物可视情况进一步包括例如如本文所述的其他治疗剂。
在一个方面，例如如表1中所述的本发明的分离的抗体或其抗原结合片段可结合诸如本文中描述或本领域中已知的治疗方法或程序施用于有需要的患者。分离的抗体或其抗原结合片段可在方法或程序之前、之后或同时施用。分离的抗体或其抗原结合片段可辅助另一治疗方法或程序施用。
在一个方面，本发明提供一种降低细胞中BMP9活性的方法。该方法可包括使细胞与例如如表1中所述的本发明的分离的抗体或其抗原结合片段接触的步骤。
在一个方面，本发明提供一种抑制有需要的患者中BMP9的方法。该方法可包括向该患者施用治疗有效量的例如如表1中所述的本发明的分离的抗体或其抗原结合片段的步骤。在一些方面中，患者患有肝病。在一些方面中，肝病经本发明的分离的抗体或其抗原结合片段治疗。在一些方面中，肝病与诸如以下的一或多种因素相关联：丙型肝炎病毒(“HCV”)感染；乙型肝炎病毒(“HBV”)感染；自体免疫性肝炎；酒精暴露；毒素暴露；药物暴露；肝脏外伤；胆道阻塞；原发性胆汁性肝硬化；阿拉吉欧症候群(alagille syndrome)；慢性肝淤血；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；原发性硬化性胆管炎；血色沉着病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；以及威尔逊氏病(Wilson disease)。在一些方面中，肝病为肝纤维化、门静脉高血压、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪肝病及肝硬化或其组合。在一些方面中，肝病为肝纤维化。在一些方面中，肝病为门静脉高血压。在一些方面中，肝病为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在一些方面中，肝病为脂肪肝病。在一些方面中，肝病为肝硬化。
在一些方面中，本发明涉及一种治疗有需要的患者的方法，或一种降低患者中BMP9活性的方法，其包括施用本发明的抗体或其抗原结合片段以及其他治疗剂。在一些方面中，其他治疗剂降低BMP9的活性。在一些方面中，其他治疗剂为siRNA、抗体或其抗原结合片段、可溶性受体、蛋白质或小分子。在一些方面中，其他治疗剂选自由以下各者组成的群：抗病毒剂、消炎剂、抗纤维化剂、抗脂肪变性剂、抗细胞凋亡剂、保肝剂及其组合。在一些方面中，其他治疗剂选自由以下各者组成的群：替诺福韦、恩替卡韦、拉米夫定、特布维定、阿德福韦、聚乙二醇化干扰素、索非布韦、替拉瑞韦、达拉斯韦、西咪匹韦、莱达普韦、皮质类固醇、GFT-505、赛瑞维克、维生素E、吡格列酮、二甲双胍、奥贝胆酸、GR-MD-02及其组合。在一些方面中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段及其他治疗剂同时或依序施用。在一些方面中，分离的抗体或其抗原结合片段辅助其他治疗剂的施用来施用。
在一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，例如一或多种核酸分子，其包括编码本发明的抗体或其抗原结合片段，包括任一先前方面的抗体或其抗原结合片段的序列。
在一个方面，本发明包括核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码本文中描述的任一抗体或其抗原结合片段。在一个方面，本发明提供核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码结合人BMP9的抗体或其抗原结合片段的VH或VL序列，其中该抗体或其抗原结合片段包括：
(a)分别为SEQ ID NO:1、2及3的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:11、12及13的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(b)分别为SEQ ID NO:4、5及6的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:14、15及16的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(c)分别为SEQ ID NO:21、22及23的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:31、32及33的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(d)分别为SEQ ID NO:24、25及26的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:34、35及36的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(e)分别为SEQ ID NO:41、42及43的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:51、52及53的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(f)分别为SEQ ID NO:44、45及46的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:54、55及56的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(g)分别为SEQ ID NO:61、62及63的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:71、72及73的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(h)分别为SEQ ID NO:64、65及66的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:74、75及76的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(i)分别为SEQ ID NO:81、82及83的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:91、92及93的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(j)分别为SEQ ID NO:84、85及86的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:94、95及96的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(k)分别为SEQ ID NO:101、102及103的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:111、112及113的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(l)分别为SEQ ID NO:104、105及106的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:114、115及116的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(m)分别为SEQ ID NO:121、122及123的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:131、132及133的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(n)分别为SEQ ID NO:124、125及126的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:134、135及136的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(o)分别为SEQ ID NO:141、142及143的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:151、152及153的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(p)分别为SEQ ID NO:144、145及146的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:154、155及156的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(q)分别为SEQ ID NO:161、162及163的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:171、172及173的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或
(r)分别为SEQ ID NO:164、165及166的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQID NO:174、175及176的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一个方面，本发明提供核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码分离的抗体或其抗原结合片段，例如表1中描述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段包括以下任一者：SEQ ID NO:7的VH序列；SEQ ID NO:27的VH序列；SEQ ID NO:47的VH序列；SEQ ID NO:67的VH序列；SEQ ID NO:87的VH序列；SEQ ID NO:107的VH序列；SEQID NO:127的VH序列；SEQ ID NO:147的VH序列；或SEQ ID NO:167的VH序列。
在一些方面中，本发明提供核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码分离的抗体或其抗原结合片段，例如表1中描述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段包括以下任一者：SEQ ID NO:17的VL序列；SEQ ID NO:37的VL序列；SEQ ID NO:57的VL序列；SEQ ID NO:77的VL序列；SEQ ID NO:97的VL序列；SEQ ID NO:117的VL序列；SEQ ID NO:137的VL序列；SEQ ID NO:157的VL序列；或SEQ ID NO:177的VL序列。
在一些方面中，本发明提供核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码分离的抗体或其抗原结合片段，例如表1中描述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段包括以下任一者：SEQ ID NO:7的VH序列及SEQ ID NO:17的VL序列；SEQ ID NO:27的VH序列及SEQ ID NO:37的VL序列；SEQ ID NO:47的VH序列及SEQ ID NO:57的VL序列；SEQ ID NO:67的VH序列及SEQ ID NO:77的VL序列；SEQ ID NO:87的VH序列及SEQ ID NO:97的VL序列；SEQ ID NO:107的VH序列及SEQ ID NO:117的VL序列；SEQ ID NO:127的VH序列及SEQ ID NO:137的VL序列；SEQ ID NO:147的VH序列及SEQ ID NO:157的VL序列；或SEQ IDNO:167的VH序列及SEQ ID NO:177的VL序列。
在一些方面中，本发明提供核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码分离的抗体或其抗原结合片段，例如表1中描述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段包括以下任一者：SEQ ID NO:9的重链序列；SEQ ID NO:29的重链序列；SEQ IDNO:49的重链序列；SEQ ID NO:69的重链序列；SEQ ID NO:89的重链序列；SEQ ID NO:109的重链序列；SEQ ID NO:129的重链序列；SEQ ID NO:149的重链序列；或SEQ ID NO:169的重链序列。
在一些方面中，本发明提供核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码分离的抗体或其抗原结合片段，例如表1中描述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段包括以下任一者：SEQ ID NO:19的轻链序列；SEQ ID NO:39的轻链序列；SEQ IDNO:59的轻链序列；SEQ ID NO:79的轻链序列；SEQ ID NO:99的轻链序列；SEQ ID NO:119的轻链序列；SEQ ID NO:139的轻链序列；SEQ ID NO:159的轻链序列；或SEQ ID NO:179的轻链序列。
在一些方面中，本发明提供核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码分离的抗体或其抗原结合片段，例如表1中描述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段包括以下任一者：SEQ ID NO:9的重链序列；及SEQ ID NO:19的轻链序列；SEQID NO:29的重链序列；及SEQ ID NO:39的轻链序列；SEQ ID NO:49的重链序列；及SEQ IDNO:59的轻链序列；SEQ ID NO:69的重链序列；及SEQ ID NO:79的轻链序列；SEQ ID NO:89的重链序列；及SEQ ID NO:99的轻链序列；SEQ ID NO:109的重链序列；及SEQ ID NO:119的轻链序列；SEQ ID NO:129的重链序列；及SEQ ID NO:139的轻链序列；SEQ ID NO:149的重链序列；及SEQ ID NO:159的轻链序列；或SEQ ID NO:169的重链序列；及SEQ ID NO:179的轻链序列。
在一些方面中，本发明提供核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码分离的抗体或其抗原结合片段，例如表1中描述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该核酸包含以下任一者：SEQ ID NO:10的重链序列；SEQ ID NO:8的VH序列；SEQ ID NO:20的轻链序列；SEQ IDNO:18的VL序列；SEQ ID NO:30的重链序列；SEQ ID NO:28的VH序列；SEQ ID NO:40的轻链序列；SEQ ID NO:38的VL序列；SEQ ID NO:50的重链序列；SEQ ID NO:48的VH序列；SEQ IDNO:60的轻链序列；SEQ ID NO:58的VL序列；SEQ ID NO:70的重链序列；SEQ ID NO:68的VH序列；SEQ ID NO:80的轻链序列；SEQ ID NO:78的VL序列；SEQ ID NO:90的重链序列；SEQID NO:88的VH序列；SEQ ID NO:100的轻链序列；SEQ ID NO:98的VL序列；SEQ ID NO:110的重链序列；SEQ ID NO:108的VH序列；SEQ ID NO:120的轻链序列；SEQ ID NO:118的VL序列；SEQ ID NO:130的重链序列；SEQ ID NO:128的VH序列；SEQ ID NO:140的轻链序列；SEQ IDNO:138的VL序列；SEQ ID NO:150的重链序列；SEQ ID NO:148的VH序列；SEQ ID NO:160的轻链序列；SEQ ID NO:158的VL序列；SEQ ID NO:170的重链序列；SEQ ID NO:168的VH序列；SEQ ID NO:180的轻链序列；或SEQ ID NO:178的VL序列。
在一些方面中，本发明提供核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码分离的抗体或其抗原结合片段，例如表1中描述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该核酸包含以下任一者：SEQ ID NO:8的VH序列及SEQ ID NO:18的VL序列；SEQ ID NO:28的VH序列及SEQ ID NO:38的VL序列；SEQ ID NO:48的VH序列及SEQ ID NO:58的VL序列；SEQ ID NO:68的VH序列及SEQ ID NO:78的VL序列；SEQ ID NO:88的VH序列及SEQ ID NO:98的VL序列；SEQ ID NO:108的VH序列及SEQ ID NO:118的VL序列；SEQ ID NO:128的VH序列及SEQ ID NO:138的VL序列；SEQ ID NO:148的VH序列及SEQ ID NO:158的VL序列；或SEQ ID NO:168的VH序列及SEQ IDNO:178的VL序列。
在一些方面中，本发明提供核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码分离的抗体或其抗原结合片段，其中所编码的分离的抗体或其抗原结合片段包括与表1中阐述的VL序列、VH序列、轻链序列或重链序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供核酸，例如一或多种多核苷酸，其编码表1中描述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该核酸包括选自由以下各者组成的群的序列：
SEQ ID NO:10的重链序列；
SEQ ID NO:30的重链序列；
SEQ ID NO:50的重链序列；
SEQ ID NO:70的重链序列；
SEQ ID NO:90的重链序列；
SEQ ID NO:110的重链序列；
SEQ ID NO:130的重链序列；
SEQ ID NO:150的重链序列；
SEQ ID NO:170的重链序列；
SEQ ID NO:20的轻链序列；
SEQ ID NO:40的轻链序列；
SEQ ID NO:60的轻链序列；
SEQ ID NO:80的轻链序列；
SEQ ID NO:100的轻链序列；
SEQ ID NO:120的轻链序列；
SEQ ID NO:140的轻链序列；
SEQ ID NO:160的轻链序列；
SEQ ID NO:180的轻链序列；
SEQ ID NO:8的VH序列；
SEQ ID NO:28的VH序列；
SEQ ID NO:48的VH序列；
SEQ ID NO:68的VH序列；
SEQ ID NO:88的VH序列；
SEQ ID NO:108的VH序列；
SEQ ID NO:128的VH序列；
SEQ ID NO:148的VH序列；
SEQ ID NO:168的VH序列；
SEQ ID NO:18的VL序列；
SEQ ID NO:38的VL序列；
SEQ ID NO:58的VL序列；
SEQ ID NO:78的VL序列；
SEQ ID NO:98的VL序列；
SEQ ID NO:118的VL序列；
SEQ ID NO:138的VL序列；
SEQ ID NO:158的VL序列；及
SEQ ID NO:178的VL序列。
与核酸相关的本发明的方面涵盖如下实施例，其中该核酸安置于单一连续多核苷酸上，例如编码1)本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链或VL及2)本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或VH的单一连续多核苷酸。本发明亦涵盖如下实施例，其中该核酸安置于两个或两个以上连续多核苷酸上，例如编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链或VL的一个多核苷酸，及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或VH的另一多核苷酸。
本发明亦提供一种载体，其包括核酸或多核苷酸，例如本文中描述的核酸或多核苷酸。本发明亦提供一种细胞，例如宿主细胞，其包括此类核酸或多核苷酸。在本发明的一个方面，分离的宿主细胞包括包含此类核酸或多核苷酸的载体。
在一个方面，本发明提供一种分离的宿主细胞，其包含(1)编码本发明抗体的重链的重组核酸区段，及(2)编码本发明抗体的轻链的第二重组核酸区段；其中所述DNA区段分别可操作地连接于第一及第二启动子，且能够在该宿主细胞中表达。在本发明的另一个方面，分离的宿主细胞包含分别编码本发明抗体的重链及轻链的重组DNA区段，其中该DNA区段可操作地连接于启动子，且能够在此类宿主细胞中表达。在一个方面，宿主细胞为非人哺乳动物细胞系。在一个方面，宿主细胞为人细胞系。在一个方面，抗体或其抗原结合片段为人单克隆抗体或其抗原结合片段。在一个方面，抗体或其抗原结合片段为一种人源化单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明提供一种如本文所述的BMP9抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体或宿主细胞在制备药物中的用途。本发明提供一种如本文所述的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，例如在制备用于治疗的药物中的用途，例如在制备用于治疗患有肝病的受试者的药物中的用途。本发明提供一种如本文所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于降低有需要的患者中BMP9活性的药物中的用途。本发明提供一种如本文所述的BMP9抗体或其抗原结合片段，其用作药物。本发明提供一种如本文所述的BMP9抗体或其抗原结合片段，其用于治疗。本发明提供一种如本文所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗纤维化病状。本发明提供一种如本文所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗肝病，包括与选自由以下各者组成的群组的一或多种因素相关的肝病：丙型肝炎病毒(“HCV”)感染；乙型肝炎病毒(“HBV”)感染；自体免疫性肝炎；酒精暴露；毒素暴露；药物暴露；肝脏外伤；胆道阻塞；原发性胆汁性肝硬化；阿拉吉欧症候群；慢性肝淤血；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；原发性硬化性胆管炎；血色沉着病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；或威尔逊氏病。本发明提供一种如本文所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗肝纤维化、门静脉高血压、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪肝病或肝硬化。
在一个方面，本发明提供一种例如如本文所述的结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其用于降低有需要的患者中BMP9的活性。
在一个方面，本发明提供一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括表1中列出的CDR，例如一或多个CDR。举例而言，该结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段可包括表1中列出的2、3、4、5或6个CDR，例如表1中列出的抗体的6个CDR(例如，HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3)。
在一个方面，本发明提供一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其列于表1中。
在一个方面，本发明提供一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括与表1中描述的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括与表1中描述的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括与表1中描述的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列，及与表1中描述的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含与表1中描述的轻链氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的轻链氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括与表1中描述的重链氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括与表1中描述的轻链氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的轻链氨基酸序列，及与表1中描述的重链氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码任一前述方面的抗体或其抗原结合片段。
在一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码结合人BMP9的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包括表1中列出的CDR。结合人BMP9的该抗体或其抗原结合片段可包括表1中列出的2、3、4、5或6个CDR，例如表1中列出的抗体的6个CDR(例如，HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3)。
定义
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术及科学术语皆具有与一般熟习本发明所属技术者所通常理解相同的含义。
如本文所用，“BMP9”意指本领域已知的TGFβ/BMP超家族成员，已知其为间质干细胞的骨母细胞分化的有效诱导子(参见Tang等人(2008)J Cell Mol Med.[PMID:19175684])，蛋白质骨形成蛋白9(BMP9)(本文中亦可互换地称为“BMP9”、“BMP-9”、“生长分化因子2”、“GDF-2”、“GDF2”及“生长/分化因子2前体”)或编码BMP9的基因或核酸。亦展示BMP9与葡萄糖代谢调节有关，能够降低糖尿病小鼠中的糖血，中枢神经系统中胆碱能神经元的分化因子，且诱导在铁稳态中起作用的激素(铁调素)的表达(David等人2008.CircRes.4月25日；102(8)：914-22)。
代表性BMP9序列包括(但不限于)以下阐述的序列。
BMP9/生长分化因子2[智人](NP_057288)(SEQ ID NO：213)。
MCPGALWVALPLLSLLAGSLQGKPLQSWGRGSAGGNAHSPLGVPGGGLPEHTFNLKMFLENVKVDFLRSLNLSGVPSQDKTRVEPPQYMIDLYNRYTSDKSTTPASNIVRSFSMEDAISITATEDFPFQKHILLFNISIPRHEQITRAELRLYVSCQNHVDPSHDLKGSVVIYDVLDGTDAWDSATETKTFLVSQDIQDEGWETLEVSSAVKRWVRSDSTKSKNKLEVTVESHRKGCDTLDISVPPGSRNLPFFVVFSNDHSSGTKETRLELREMISHEQESVLKKLSKDGSTEAGESSHEEDTDGHVAAGSTLARRKRSAGAGSHCQKTSLRVNFEDIGWDSWIIAPKEYEAYECKGGCFFPLADDVTPTKHAIVQTLVHLKFPTKVGKACCVPTKLSPISVLYKDDMGVPTLKYHYEGMSVAECGCR
BMP9/生长分化因子2[智人](AF188285)(SEQ ID NO：214)
cggtccagcc cggcagcggg tgagagtagg tgctggccaa gacggttcct tcagagcaaa
cagcagggag atgccggccc gctccttccc agctcctccc cgtgcccgct aacacagcac
ggccgcctgc agtctcctct ctgggtgatt gcgcgggcct aagatgtgtc ctggggcact
gtgggtggcc ctgcccctgc tgtccctgct ggctggctcc ctacagggga agccactgca
gagctgggga cgagggtctg ctgggggaaa cgcccacagc ccactggggg tgcctggagg
tgggctgcct gagcacacct tcaacctgaa gatgtttctg gagaacgtga aggtggattt
cctgcgcagc cttaacctga gtggggtccc ttcgcaggac aaaaccaggg tggagccgcc
gcagtacatg attgacctgt acaacaggta cacgtccgat aagtcgacta cgccagcgtc
caacattgtg cggagcttca gcatggaaga tgccatctcc ataactgcca cagaggactt
ccccttccag aagcacatct tgctcttcaa catctccatt cctaggcatg agcagatcac
cagagctgag ctccgactct atgtctcctg tcaaaatcac gtggacccct ctcatgacct
gaaaggaagc gtggtcattt atgatgttct ggatggaaca gatgcctggg atagtgctac
agagaccaaa accttcctgg tgtcccagga cattcaggat gagggctggg agaccttgga
agtgtccagc gccgtgaagc gctgggtccg gtccgactcc accaagagca aaaataagct
ggaagtgact gtggagagcc acaggaaggg ctgcgacacg ctggacatca gtgtcccccc
aggttccaga aacctgccct tctttgttgt cttctccaat gaccacagca gtggaaccaa
ggagaccagg ctggagctga gggagatgat cagccatgaa caagagagcg tgctcaagaa
gctgtccaag gacggctcca cagaggcagg tgagagcagt cacgaggagg acacggatgg
ccacgtggct gcggggtcga ctttagccag gcggaaaagg agcgccgggg ctggcagcca
ctgtcaaaag acctccctgc gggtaaactt cgaggacatc ggctgggaca gctggatcat
tgcacccaag gagtatgaag cctacgagtg taagggcggc tgcttcttcc ccttggctga
cgatgtgacg ccgacgaaac acgctatcgt gcagaccctg gtgcatctca agttccccac
aaaggtgggc aaggcctgct gtgtgcccac caaactgagc cccatctccg tcctctacaa
ggatgacatg gaggtgccca ccctcaagta ccattacgag ggcatgagcg tggcagagtg
tgggtgcagg tagtatctgc ctgcggggct ggggaggeag gccaaagggg ctecacatga
gaggtcctgc atgcccctgg gcacaacaag gactgattca atctgcatgc cagcctggag
gaggaaaggg agcctgctct ccctccccac accccaccca aagcatacac cgctgagctc
aactgccagg gaaggctaag gaaatgggga tttgagcaca acaggaaagc ctgggagggt
tgttgggatg caaggaggtg atgaaaagga gacaggggga aaaataatcc atagtcagca
gaaaacaaca gcagtgagcc agaggagcac aggcgggcag gtcactgcag agactgatgg
aagttagaga ggtggaggag gccagctcac tccaaaaccc ttggggagta gagggaagga
gcaggccgcg tgtcacaccc atcattgtat gttatttccc acaacccagt tggaggggca
tggcttccaa tttagagacc cg
BMP9的成熟片段/生长分化因子2[智人](来自NP_057288的氨基酸)(SEQ ID NO：215)：
SAGAGSHCQKTSLRVNFEDIGWDSWIIAPKEYEAYECKGGCFFPLADDVTPTKHAIVQTLVHLKFPTKVGKACCVPTKLSPISVLYKDDMGVPTLKYHYEGMSVAECGCR
鼠类及其他动物BMP9分子为本领域中已知(参见例如鼠类BMP9的NP_062379及大鼠BMP9的NP_001099566)。
如本文所述，结合于BMP9的抗体、其抗原结合片段结合于BMP9蛋白质。如本文所用，“huBMP9”系指人BMP9或其片段。
如本文所用，“BMP2”意谓蛋白质骨形成蛋白2(BMP2)或编码BMP2的基因或核酸。BMP2亦称为：BDA2；以及BMP2A；External ID OMIM：112261MGI：88177HomoloGene：926GeneCards：BMP2基因。物种：人；Entrez：650；Ensembl：ENSG00000125845；UniProt：P12643；RefSeq(mRNA)：NM_001200；RefSeq(蛋白质)：NP_001191；位置(UCSC)：Chr 20：6.75-6.76Mb。物种：小鼠；Entrez：12156；Ensembl：ENSMUSG00000027358；UniProt：P21274；RefSeq(mRNA)：NM_007553；RefSeq(蛋白质)：NP_031579；位置(UCSC)：Chr 2：133.55-133.56Mb。如本文所述，结合于BMP2的抗体、其抗原结合片段结合于BMP2蛋白质。
如本文所用，“BMP7”意谓蛋白质骨形成蛋白7(BMP7)或编码BMP7的基因或核酸。BMP7亦称为：成骨蛋白质-1；OP-1；External ID OMIM：112267MGI：103302HomoloGene：20410GeneCards：BMP7基因。物种：人；Entrez：655；Ensembl：ENSG00000101144；UniProt：P18075；RefSeq(mRNA)：NM_001719；RefSeq(蛋白质)：NP_001710；位置(UCSC)：Chr 20：55.74-55.84Mb。物种：小鼠；Entrez：12162；Ensembl：ENSMUSG00000008999；UniProt：P23359；RefSeq(mRNA)：NM_007557；RefSeq(蛋白质)：NP_031583；位置(UCSC)：Chr 2：172.87-172.94Mb。如本文所述，结合于BMP7的抗体、其抗原结合片段结合于BMP7蛋白质。
如本文所用，“BMP10”意谓本领域已知的TGFβ/BMP超家族成员骨形成蛋白10(BMP10)(本文中亦可互换地称为“BMP10”、“BMP-10”、“MGC126783”及“骨形成蛋白10前体”)或编码BMP10的基因或核酸。已提出BMP10为在心室发育期间调节心肌细胞增殖及成熟的主要组分。(Chen等人,(2004)Development.131(9):2219-31及Neubaus等人,(1999)MechDev.,80(2):181-4)。代表性BMP10序列包括(但不限于)以下阐述的序列。
骨形成蛋白10前蛋白原[智人](NP_055297)(SEQ ID NO：216)
MGSLVLTLCALFCLAAYLVSGSPIMNLEQSPLEEDMSLFGDVFSEQDGVDFNTLLQSMKDEFLKTLNLSDIPTQDSAKVDPPEYMLELYNKFATDRTSMPSANIIRSFKNEDLFSQPVSFNVSIPHHEEVIMAELRLYTLVQRDRMIYDGVDRKITTFEVLESKGDNEGERNMLVLVSGEIYGTNSEWETFDVTDAIRRWQKSGSSTHQLEVHIESKHDEAEDASSGRLEIDTSAQNKHNPLLIVFSDDQSSDKERKEELNEMISHEQLPELDNLGLDSFSSGPGEEALLQMRSNIIYDSTARIRRNAKGNYCKRTPLYIDFKEIGWDSWIIAPPGYEAYECRGVCNYPLAEHLTPTKHAIIQALVHLKNSQKASKACCVPTKLEPISILYLDKGVVTYKFKYEGMAVSECGCR
骨形成蛋白10前蛋白原[智人](NM_014482)(SEQ ID NO：217)
ggggagagga agagtggtag ggggagggag agagagagga agagtttcca aacttgtctc
cagtgacagg agacatttac gttccacaag ataaaactgc cacttagagc ccagggaagc
taaaccttcc tggcttggcc taggagctcg agcggagtca tgggctctct ggtcctgaca
ctgtgcgctc ttttctgcct ggcagcttac ttggtttctg gcagccccat catgaaccta
gagcagtctc ctctggaaga agatatgtcc ctctttggtg atgttttctc agagcaagac
ggtgtcgact ttaacacact gctccagagc atgaaggatg agtttcttaa gacactaaac
ctctctgaca tccccacgca ggattcagcc aaggtggacc caccagagta catgttggaa
ctctacaaca aatttgcaac agatcggacc tccatgccct ctgccaacat cattaggagt
ttcaagaatg aagatctgtt ttcccagccg gtcagtttta atgggctccg aaaatacccc
ctcctcttca atgtgtccat tcctcaccat gaagaggtca tcatggctga acttaggcta
tacacactgg tgcaaaggga tcgtatgata tacgatggag tagaccggaa aattaccatt
tttgaagtgc tggagagcaa aggggataac gagggagaaa gaaacatgct ggtcctggtg
tctggggaga tatatggaac caacagtgag tgggagactt ttgatgtcac agatgccatc
agacgttggc aaaagtcagg ctcatccacc caccagctgg aggcccacat tgagagcaaa
cacgatgaag ctgaggatgc cagcagtgga cggctagaaa tagataccag tgcccagaat
aagcataacc ctttgctcat cgtgttttct gatgaccaaa gcagtgacaa ggagaggaag
gaggaactga atgaaatgat ttcccatgag caacctccag agctggacaa cttgggcctg
gatagctttt ccagtggacc tggggaagag gctttgttgc agatgagatc aaacatcatc
tatgactcca ctgcccgaat cagaaggaac gccaaaggaa actactgtaa gaggaccccg
ctctacatcg acttcaagga gattgggtgg gactcctgga tcatcgctcc gcctggatac
gaagcctatg aatgccgtgg tgtttgtaac taccccctgg cagagcatct cacacccaca
aagcatgcaa ttatccaggc cttggtccac ctcaagaatt cccagaaagc ttccaaagcc
tgctgtgtgc ccacaaagct agagcccatc tccatcctct atttagacaa aggcgtcgtc
acctacaagt ttaaatacga aggcatggcc gtctccgaat gtggctgtag atagaagaag
agtcctatgg cttatttaat aactgtaaat gtgtatattt ggtgttccta tttaatgaga
ttatttaata agggtgtaca gtaatagagg cttgctgcct tcaggaaatg gacaggtcag
tttgttgtag gaaatgcata tttt
鼠类及其他动物BMP10分子为本领域中已知(参见例如鼠类BMP10的NP_033886)。如本文所述，结合于BMP10的抗体、其抗原结合片段结合于BMP10蛋白质。
“Smad”指将细胞外信号自转化生长因子β配体转导至细胞核的细胞内蛋白质家族，在细胞核其活化下游基因转录(参见例如Heldin CH(1997)，Nature 390(6659)：465-71；Attisano L(1998)Curr.Opin.Cell Biol.10(2):188-94；MassaguéJ(1998),Annu.Rev.Biochem.67:753-91；Attisano L(2002)Science 296(5573):1646-7；Whitman M(1998)Genes Dev.12(16):2445-62；Wrana JL(2000)Sci.STKE 2000(23):RE1；Wharton K,(2009),Development 136(22):3691-7)。受体调节的Smad(R-SMAD)包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5及Smad8/9。术语“smad”包括Smad的基因，例如Smad1、Smad5或Smad8的基因，或Smad蛋白质，例如Smad1、Smad5或Smad8。不受理论束缚，据信Smad1、Smad5及Smad8通过配体的BMP子族，包括BMP9优先活化。Smad家族的多个成员通过其编号一起提及。因此，举例而言，“Smad1/5/8”指Smad1、Smad5和/或Smad8。“Smad1/5”指Smad1和/或Smad5。再次，不受理论束缚，据信通过Smad进行信号传导引起Smad蛋白质磷酸化。“pSmad”指磷酸化的Smad蛋白质。
“Id1”意谓基因Id1或蛋白质Id1(参见例如Benezra R,Cell 61(1):49-59；Hara E(1994)J Biol Chem 269(3):2139-45；Ruzinova MB(2003)Trends in Cell Biology 13(8):410-8；Perk J(2005)Nat Rev Cancer 5(8):603-614；Korchynskyi O(2002).J BiolChem.,277(7):4883-91)。DNA结合蛋白抑制剂1(Id1)为可与例如转录因子的碱性HLH家族的成员形成杂二聚体的螺旋-环形-螺旋(HLH)蛋白质。不受理论束缚，Id1为BMP信号传导路径，包括BMP9的熟知标靶基因。
如本文所用，术语“纤维化”是指器官或组织中通过细胞异常形成或发展过量纤维结缔组织。虽然与纤维化相关的过程可作为正常组织形成或修复的一部分存在，但此等过程的失调可引起细胞组成改变且过量结缔组织沉积，逐渐损害组织或器官功能。存在若干类型的纤维化，例如胰脏及肺的囊性纤维化、注射纤维化(其可作为肌肉内注射的并发症发生，尤其在儿童中)、心内膜心肌纤维化、肺的特发性肺部纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化(煤矿工人尘肺症的并发症)及肾源性全身性纤维化。
如本文所用，术语“纤维化病症”、“纤维化病状”及“纤维化疾病”可互换地使用以指特征为纤维化的病症、病状或疾病。纤维化病症的实例包括(但不限于)血管纤维化、肺纤维化(例如特发性肺纤维化)、胰纤维化、肝纤维化(例如“纤维化肝病”，例如肝硬化)、肾纤维化、肌骨胳纤维化、心脏纤维化(例如心内膜心肌纤维化、特发性心肌病)、皮肤纤维化(例如硬皮病、创伤后、手术皮肤结疤、瘢痕瘤及皮肤瘢痕瘤形成)、眼睛纤维化(例如青光眼、眼睛硬化、结膜及角膜结疤及翼状胬肉)、进行性全身性硬化症(PSS)、慢性移植物抗宿主疾病、佩洛尼氏病(Peyronie's disease)、膀胱镜检查后尿道狭窄、特发性及药理学上诱导的腹膜后纤维化、纵隔纤维化、进行性大块纤维化、增生性纤维化及赘生性纤维化。
如本文所用，术语“纤维化肝病”及“肝纤维化”可互换地使用，且是指特征为肝脏中通过细胞异常形成或发展过量纤维结缔组织(例如细胞外基质(“ECM”)蛋白质，包括胶原蛋白)的肝脏疾病。不受任何特定理论束缚，据信活化的肝星形细胞、门管区纤维母细胞及肌纤维母细胞为肝脏中主要纤维发生细胞(亦即产生ECM的细胞)。肝纤维化引起门静脉高血压。晚期肝纤维化引起肝硬化、肝功能衰竭。
可用本发明的抗体或其抗原结合片段治疗的纤维化肝病，包括引起肝硬化和/或门静脉高血压的纤维化肝病，可由例如以下引起：丙型肝炎病毒(“HCV”)感染；乙型肝炎病毒(“HBV”)感染；自体免疫性肝炎；酒精、毒素或药物暴露；肝脏外伤；胆道阻塞；原发性胆汁性肝硬化；阿拉吉欧症候群；慢性肝淤血，包括由心肌疾病或肝流出阻塞引起；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；原发性硬化性胆管炎；血色沉着病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；以及威尔逊氏病。
如本文所用，术语“BMP9抗体”、“抗BMP9抗体”、“BMP9结合抗体”、“BMP9拮抗性抗体”及其类似物(及其抗原结合片段)包括结合于蛋白质BMP9的抗体(及其抗原结合片段)。
如本文所用，术语“细胞”是指易于进行纤维化反应的任何细胞，包括(但不限于)组织及器官内的个别细胞、组织及细胞。如本文所用，术语细胞包括细胞本身，以及细胞周围的细胞外基质(ECM)。举例而言，抑制细胞的纤维化反应包括(但不限于)抑制以下各者的纤维化反应：肺(或肺组织)内一或多个细胞；肝脏(或肝脏组织)内一或多个细胞；肾(或肾组织)内一或多个细胞；肌肉组织内一或多个细胞；心脏(或心肌组织)内一或多个细胞；胰脏内一或多个细胞；皮肤内一或多个细胞；骨胳内一或多个细胞；血管内一或多个细胞；一或多个干细胞；或眼睛内一或多个细胞。
如本文所用，术语“上皮-间质转化”(EMT)是指自上皮表型转换成间质表型，此为胚胎发育的正常过程。EMT亦为其中充当离子及流体转运体的受伤上皮细胞变成基质重塑间质细胞的过程。在癌瘤中，此转型引起细胞形态改变、间质蛋白质表达及侵袭性增加。用于界定体外EMT的准则涉及上皮细胞极性丧失、分成个别细胞且随后在获得细胞活动性之后分散(Vincent-Salomon等人,Breast Cancer Res.2003；5(2):101-106)。在EMT期间表达、分布和/或功能改变且因果相连的分子类别包括生长因子(例如转化生长因子(TGF)-β、wnts)、转录因子(例如snail、SMAD、LEF及核β-连环蛋白)、细胞间粘着轴的分子(钙粘素、联蛋白)、细胞骨架调节剂(ρ家族)及细胞外蛋白酶(基质金属蛋白酶、纤维蛋白溶酶原活化因子)(参见Thompson等人,Cancer Research 65,5991-5995,7月15日,2005)。
如本文所用，术语“抗体”及其类似物包括全抗体及其任何抗原结合片段(亦即“抗原结合部分”)或单一链。天然存在的“抗体”为包含经二硫键相互连接的至少两条重(H)链及两条轻(L)链的糖蛋白。各重链由重链可变区(本文中缩写为VH)及重链恒定区组成。重链恒定区由三个域(CH1、CH2及CH3)构成。各轻链由轻链可变区(本文中简化为VL)及轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域CL构成。VH及VL区可进一步再分成高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插称为框架区(FR)的更保守区。各VH及VL由自氨基端至羧基端依以下顺序排列的三个CDR及四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重链及轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)及经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。
如本文所用，术语“抗原结合片段”、“其抗原结合片段”、抗体的“抗原结合部分”及其类似物是指保留特异性结合于既定抗原(例如BMP9)的能力的完整抗体的一或多个片段。抗体的抗原结合功能可由完整抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括Fab片段，一种由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，一种包含在铰链区通过二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH及CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,1989Nature 341:544-546)；及分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL及VH)通过独立基因编码，然而其可使用重组方法通过人工肽连接子接合，该连接子能够使其制造成VL及VH区成对以形成单价分子的单蛋白链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等人,1988Science 242:423-426；及Huston等人,1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。此类单链抗体包括抗体的一或多个“抗原结合部分”。此等抗体片段是使用本领域技术人员的已知技术获得的，且以与完整抗体相同的方式来筛选片段供使用。
抗原结合片段亦可并入单结构域抗体、最大抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、胞内抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体(tetrabodies)、v-NAR及双-scFv中(参见例如Hollinger及Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136)。抗体的抗原结合部分可移植至基于诸如纤维结合蛋白III型(Fn3)的多肽(参见美国专利第6,703,199号，其描述纤维结合蛋白多肽单功能抗体)的骨架中。
抗原结合部分可并入包含一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，此类Fv片段连同互补轻链多肽形成一对抗原结合区(Zapata等人,1995Protein Eng.8(10):1057-1062；及美国专利第5,641,870号)。
如本文所用，术语“亲和力”是指位于单抗原位点处抗体与抗原之间的相互作用的强度。在各抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在多个位点处相互作用；相互作用愈大，亲和力愈强。
如本文所用，术语“亲合力”是指抗体-抗原复合物的整体稳定性或强度的资讯性量度。其由三个主要因素控制：抗体表位亲和力；抗原与抗体两者的效价；以及相互作用部分的结构配置。最终，此等因素界定抗体的特异性，亦即特定抗体结合于精确的抗原表位的可能性。
术语“氨基酸”是指天然存在及合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物及氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由遗传密码编码的氨基酸，以及后期经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指基础化学结构与天然存在的氨基酸相同(亦即α碳与氢、羧基、氨基及R基团结合)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保持与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。
如本文所用，术语“结合特异性”是指个别抗体组合位点与一种抗原决定簇反应且不与不同抗原决定簇反应的能力。抗体的组合位点位于分子的Fab部分中，且自重链及轻链的高变区构筑。抗体的结合亲和力为单个抗原决定簇与抗体上单个组合位点之间的反应强度。其为抗原决定簇与抗体组合位点之间作用的引力与斥力总和。
两个实体之间的特异性结合意谓以至少1×107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1、1013M-1或1014M-1的平衡常数(KA或KA)结合。短语“特异性(或选择性)结合”于抗体(例如BMP9结合抗体)是指决定蛋白质的异质群体及其他生物制剂中同源抗原(例如人BMP9蛋白质)存在的结合反应。除上文提及的平衡常数(KA)之外，本发明的BMP9结合抗体通常亦具有约1×10-2s-1、1×10-3s-1或更低的解离速率常数(Kd或Koff)，且以比对结合于非特异性抗原(例如BMP2、BMP10或BMP7)的亲和力大至少两倍的亲和力结合于BMP9。短语“识别抗原的抗体”及“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合于抗原的抗体”互换使用。
术语“嵌合抗体”(或其抗原结合片段)为如下抗体分子(或其抗原结合片段)，其中(a)恒定区或其部分经改变、置换或更换，使得抗原结合位点(可变区)连接于不同或改变类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新特性的完全不同分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分经具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、置换或更换。举例而言，小鼠抗体可通过用来自人免疫球蛋白的恒定区置换其恒定区来修饰。由于经人恒定区置换，因此嵌合抗体可保持其识别抗原的特异性，同时相较于初始小鼠抗体，其在人中的抗原性降低。
术语“经保守修饰的变体”适用于氨基酸及核酸序列。关于特定核酸序列，经保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，指序列基本上相同的核酸。由于遗传密码的简并，因此许多在功能上相同的核酸编码任何既定蛋白质。举例而言，密码子GCA、GCC、GCG及GCU皆编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸通过密码子说明的每一位置上，密码子可在不改变所编码的多肽的情况下改变成任何所对应密码子。此类核酸变化为“沉默变异”，其为一种经保守修饰的变异。本文中编码多肽的每一核酸序列亦描述核酸的每一可能的沉默变异。本领域技术人员应认识到核酸中的各密码子(除通常为甲硫氨酸的唯一密码子的AUG及通常为色氨酸的唯一密码子的TGG外)可经修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变异隐含于各所述序列中。
就多肽序列而言，“经保守修饰的变体”包括针对多肽序列的个别取代、缺失或添加，这导致氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表为本领域所熟知。此类经保守修饰的变体另外为且不排除本发明的多态变体、种间同源物及等位基因。以下八组含有彼此为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins(1984))。在一个实施例中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
如本文所用，术语“阻断”是指中止或预防相互作用或过程，例如中止配体依赖性或非配体依赖性信号传导。
如本文所用，术语“识别”是指抗体、其抗原结合片段发现其构象表位且与其相互作用(例如结合)。
术语“交叉阻断(cross-block)”、“交叉阻断(cross-blocked)”、“交叉阻断(cross-blocking)”、“竞争”、“交叉竞争”及相关术语在本文中可互换地使用以意谓在标准竞争结合分析法中抗体或其他结合剂干扰其他抗体或结合剂与BMP9的结合的能力。
抗体或其他结合剂能够干扰另一抗体或结合分子与BMP9结合的能力或程度及因此其是否可根据本发明称为交叉阻断可使用标准竞争结合分析法来确定。一种适合分析法涉及使用Biacore技术(例如通过使用BIAcore 3000仪器(Biacore,Uppsala,Sweden))，其可使用表面等离子共振技术测量相互作用的程度。用于测量交叉阻断的另一分析法使用基于ELISA的方法。虽然预期此类技术产生实质上类似结果，但认为Biacore技术的测量为决定性的。
术语“中和”意谓抗体在结合于其标靶时，降低标靶活性、含量或稳定性；例如BMP9抗体在结合于BMP9时通过至少部分降低BMP9的活性、含量或稳定性，诸如信号传导或其在Smad1/5/8磷酸化和/或纤维化(例如肝纤维化)中的作用来中和BMP9。
术语“表位”意谓能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面基团组成，且通常具有特定三维结构特征，以及荷质比特征。构象表位与非构象表位区别在于，在变性溶剂存在下，与前者的结合消失，但与后者的结合未消失。
术语“表位”包括能够特异性结合于免疫球蛋白或者以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇一般由诸如氨基酸或碳水化合物或糖侧链的分子的化学活性表面基团组成，且通常具有特定三维结构特征，以及荷质比特征。表位可为“线性”的或“构象”的表位。
术语“线性表位”是指蛋白质与相互作用分子(诸如抗体)之间的所有相互作用点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性(连续)存在的表位。
如本文所用，术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对例如BMP9的标靶抗原具有10- 8M或更低，10-9M或更低或10-10M或10-11M或更低的KD。然而，“高亲和力”结合对于其他抗体同种型可变化。举例而言，对于IgM同种型，“高亲和力”结合是指抗体具有10-7M或更低，或10- 8M或更低的KD。
如本文所用，术语“人抗体”(或其抗原结合片段)意欲包括具有其中框架区及CDR区均来源于人来源序列的可变区的抗体(及其抗原结合片段)。此外，若抗体含有恒定区，则该恒定区亦来源于此类人序列，例如人胚系序列或人胚系序列的突变型式。本发明的人抗体及其抗原结合片段可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性突变诱导或通过体内体细胞突变引入的突变)。
如本文所用，短语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”(或其抗原结合片段)是指具有实质上相同的氨基酸序列或来源于相同基因来源的多肽，包括抗体、抗体片段、双特异性抗体等。此术语亦包括单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示针对特定表位的单一结合特异性及亲和力。
术语“人单克隆抗体”(或其抗原结合片段)是指展示单一结合特异性的抗体(及其抗原结合片段)，其具有其中框架区及CDR区均来源于人序列的可变区。在一个实施例中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与永生化细胞融合的获得自转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，其具有包含人重链转基因及人轻链转基因的基因组。
如本文所用，短语“重组人抗体”(或其抗原结合片段)包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体(及其抗原结合片段)，诸如自针对人免疫球蛋白基因进行转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或自其制备的杂交瘤分离的抗体、自经转化以表达人抗体的宿主细胞、例如自转染瘤分离的抗体、自重组、组合人抗体文库分离的抗体及通过涉及所有或一部分人免疫球蛋白基因、序列与其他DNA序列的剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有其中框架及CDR区来源于人胚系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施例中，此类重组人抗体可经受体外诱突(或当使用针对人Ig序列转基因的动物时，为体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的VH及VL区的氨基酸序列为虽然来源于人胚系VH及VL序列且与其相关，但可不天然存在于人体内抗体胚系谱系内的序列。
如本文所用，“人源化”抗体(或其抗原结合片段)为保留非人抗体的反应性，同时在人中免疫原性较低的抗体(或其抗原结合片段)。举例而言，此可通过保持非人CDR区且用其人对应物替换抗体的剩余部分(即，恒定区以及可变区的框架部分)来达成。参见例如Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984；Morrison及Oi,Adv.Immunol.,44:65-92,1988；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498,1991；及Padlan,Molec.Immun.,31:169-217,1994。人工程改造技术的其他实例包括(但不限于)美国专利第5,766,886号中所揭示的Xoma技术。
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或两个以上序列或子序列相同。当在比较窗或指定区域上根据最大对应性比较及比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过人工比对及目视检查所测量，若两个序列具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(亦即在特定区域上，或未说明时在整个序列上，60％相同、视情况65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同)，则两个序列为“实质上相同”。视情况，同一性存在于至少50个核苷酸(或10个氨基酸)长度的区域上，或更优选100至500个或1000个或更多个核苷酸(或20、50、200个或更多个氨基酸)长度的区域上。视情况，同一性存在于以长度计至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更多较佳在以长度计100个至500个或1000个或更多个核苷酸(或20个、50个、200个或更多个氨基酸)的区域上。
就序列比较而言，通常一个序列充当参考序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试序列及参考序列输入电脑中，必要时指定子序列座标，且指定序列算法程序参数。可使用预设程序参数，或可指定替代参数。接着序列比较算法基于程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用，“比较窗”包括提及在两个序列最佳比对之后，一个序列可与具有相同邻接位置数目的参考序列比较的区段，该区段具有任一个选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的群的邻接位置数目。用于比较的序列比对方法为本领域所熟知。可例如通过以下进行序列的最佳比对以进行比较：Smith及Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法；Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比对算法；Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的类似性搜索法；此等算法的电脑化实施(Wisconsin Genetics套装软件(Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,Wis.)中GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)；或手动比对及目视检查(参见例如Brent等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(ringbou版,2003))。
适用于测定序列同一性及序列相似性百分比的算法的两个实例为BLAST及BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977及Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。此算法包括通过鉴别查询序列中的长度W的短字来首先鉴别高评分序列对(HSP)，此类短字在与资料库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某些正值临限值分数T。T称为邻域字分数临限值(Altschul等人，前述)。此等初始邻域字命中充当用于起始搜索的种子以寻找含有其的较长HSP。字命中沿各序列在两个方向上延伸，只要累积比对分数增加即可。就核苷酸序列而言，累积评分使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；始终>0)及N(错配残基的罚分；始终<0)计算。就氨基酸序列而言，评分矩阵用于计算累积分数。当以下情况时，字命中在各方向中的延伸中断：累积比对分数自其达成的最大值降低量X；累积分数因一或多种负评分残基比对的累积而变成0或0以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T及X决定比对的灵敏度及速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(N)11、期望值(E)或10、M＝5、N＝-4及双链比较作为预设参数。就氨基酸序列而言，BLASTP程序使用以下预设：字长为3，及期望值(E)为10，且BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff及Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)，比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，及双链的对比。
BLAST算法亦对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787,1993)。通过BLAST算法得到的一种相似性量度为最小总和机率(P(N))，其指示两个核苷酸或氨基酸序列之间随机出现匹配的机率。举例而言，若测试核酸与参考核酸比较时的最小总机率小于约0.2，更优选小于约0.01，且最佳小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988)算法(其已并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120权重残基表，空隙长度罚分为12且空隙罚分为4测定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453,1970)算法(其已并入GCG套装软件(可在www.gcg.com获得)中的GAP程序中)，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，及间隙权重16、14、12、10、8、6或4及长度权重1、2、3、4、5或6来测定。
如下文所述，除以上提到的序列同一性的百分比之外，两个核酸序列或多肽实质上相同的另一指示为，通过第一核酸编码的多肽与针对通过第二核酸编码的多肽所产生的抗体免疫交叉反应。因此，例如在两个肽不同之处仅为保守性取代的情况下，多肽通常与第二多肽实质上相同。如下所述，两个核酸序列实质上相同的另一指示为两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交。两个核酸序列实质上相同的另一指示为可使用相同引物扩增序列。
如本文所用，术语“分离的抗体”(或其抗原结合片段)是指实质上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(或其抗原结合片段)(例如特异性结合BMP9的分离的抗体实质上不含特异性结合除BMP9外的抗原的抗体)。另外，分离的抗体可实质上不含其他细胞物质和/或化学物质。
术语“同种型”是指通过重链恒定区基因提供的抗体类别(例如IgM、IgE、IgG，诸如IgG1或IgG4)。同种型亦包括这类类别之一的经修饰的型式，其中进行修饰以改变Fc功能，例如增强或减弱效应子功能或与Fc受体的结合。
如本文所用，术语“Kassoc”、“Ka”或“Kon”意欲指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用，术语“Kdis”、“Kd”或“Koff”意欲指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。在一个实施例中，如本文所用，术语“KD”意欲指解离常数，其获自Kd与Ka的比率(亦即Kd/Ka)且以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可使用本领域中充分确立的方法测定。一种测定抗体KD的方法是通过使用表面等离子共振或使用生物传感器系统(诸如系统)。在解离常数小于约10-9M的情况下，溶液平衡动力学排除KD测量(MSD-SET)为一种测定抗体KD的较佳方法(参见例如Friquet,B.,Chaffotte,A.F.,Djavadi-Ohaniance,L.,及Goldberg,M.E.(1985).Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay.J Immnunol Meth 77,305-319；以引用的方式并入本文中)。
如本文所用，术语“IC50”是指在体外或体内分析法中，抗体或其抗原结合片段诱导最大反应50％(亦即最大反应与基线之间的一半)的抑制反应的浓度。
术语“效应子功能”是指通过借助除抗原结合域外的抗体结构域结合介导，通常通过效应物分子的结合介导的抗体分子的活性。效应子功能包括补体介导的效应子功能，其通过例如补体的C1组分与抗体的结合介导。补体活化在细胞病原体的调理及溶胞中具有重要作用。补体活化亦刺激发炎反应且亦可涉及自体免疫超敏性。效应子功能亦包括Fc受体(FcR)介导的效应子功能，其可在抗体恒定域结合于Fc受体(FcR)时触发。抗体结合于细胞表面上的Fc受体触发多种重要且不同的生物反应，包括包被抗体的颗粒的吞食及摧毁、免疫复合体的清除、杀伤细胞对包被抗体的标靶细胞的溶解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、发炎性介体的释放、免疫球蛋白产生的胎盘转移及控制。抗体的效应子功能可通过改变，例如增强或降低抗体对效应分子(诸如Fc受体或补体组分)的亲和力而改变。结合亲和力一般将通过修饰效应分子结合位点来改变，且在此情况下，适于定位相关位点且以适合方式修饰位点至少一部分。亦设想抗体上对效应分子的结合位点的改变无需显著改变整体结合亲和力，而可改变相互作用的几何形状，使得效应物机制如在非有效性结合中般无效。进一步设想效应子功能亦可通过修饰不直接参与效应分子结合，而另外与效应子功能的效能有关的位点而改变。
术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”可互换使用，且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键的核酸，此类核酸为合成的、天然存在的及非天然存在的，具有与参考核酸类似的结合特性，且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括(但不限于)硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手型膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另外指示，否则特定核酸序列亦隐含地涵盖其经保守修饰的变体(例如简并密码子取代)及互补序列，以及明确指示的序列。具体而言，如下详述，简并密码子取代可通过产生其中一或多个所选择的(或所有)密码子的第三位置经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来达成(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；及Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。
术语“有效连接”是指两个或两个以上多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。通常，其是指转录调节序列相对于所转录序列的功能关系。举例而言，启动子或增强子序列若其在适当宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则有效连接于编码序列。一般而言，有效连接于转录序列的启动子转录调节序列在实体上邻接于所转录序列，亦即其为顺式作用。然而，诸如增强子的一些转录调节序列无需在实体上邻接于或紧邻于其增强转录的编码序列。
如本文所用的术语“最佳化”意谓使用在生产细胞或生物体，一般真核细胞，例如毕赤酵母(Pichia)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞中优选的密码子改变核苷酸序列以编码氨基酸序列。对最佳化的核苷酸序列进行工程改造以完全或尽可能地保留通过起始核苷酸序列最初编码的氨基酸序列，亦称为“亲本”序列。本文中的最佳化序列已经工程改造以具有哺乳动物细胞中的优选密码子。然而，本文中亦预想在其他真核细胞或原核细胞中此等序列的最佳化表达。由最佳化的核苷酸序列编码的氨基酸序列亦称为最佳化。
术语“多肽”及“蛋白质”可在本文中互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。此类术语适用于其中一或多个氨基酸残基为对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物及非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外指示，否则特定多肽序列亦隐含地涵盖其保守修饰的变体。
如本文所用，术语“重组人抗体”(或其抗原结合片段)包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体(及其抗原结合片段)，诸如自针对人免疫球蛋白基因进行转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或自其制备的杂交瘤分离的抗体、自经转化以表达人抗体的宿主细胞、例如自转染瘤分离的抗体、自重组、组合人抗体文库分离的抗体及通过涉及所有或一部分人免疫球蛋白基因、序列与其他DNA序列的剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有其中框架及CDR区来源于人胚系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在一个实施方案中，此类重组人抗体可经受体外突变诱导(或当使用人Ig序列的动物转基因时，为体内体细胞突变诱导)，且因此重组抗体的VH及VL区的氨基酸序列为虽然来源于人胚系VH及VL序列且与其相关，但在体内可不天然存在于人抗体胚系抗体库内的序列。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)是指已引入重组表达载体的细胞。应了解，此类术语不仅意指特定个体细胞，而且亦指此类细胞的后代。由于某些修饰可能因突变或环境影响而存在于后代中，所以此类子代可能实际上不与亲本细胞相同，但仍包括于如本文中所用的术语“宿主细胞”的范畴内。
术语“个体”包括人及非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物及爬行动物。除非指出，否则术语“患者”或“个体”在本文中互换使用。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”、“治疗(treating)”及“治疗(treatment)”包括施用组合物或抗体以预防或延迟疾病(例如肝纤维化)的症状、并发症或生物化学标记发作、缓解症状或阻止或抑制疾病、病状或病症进一步发展。治疗可为防治性(以预防或延迟疾病发作，或预防其临床或亚临床症状显现)或治疗性遏制或缓解疾病显现后的症状。治疗可通过本文所述的治疗量度测量。本发明的“治疗”方法包括向个体施用BMP9抗体或其抗原结合片段以治愈纤维化疾病或病状、降低其严重程度或改善其一或多个症状，以延长个体的健康或存活期超出在缺乏此类治疗下预期的健康或存活期。举例而言，“治疗”包括缓解个体中纤维化疾病症状(例如呼吸短促、疲劳、咳嗽、重量减轻、与肺纤维化或厌食相关的食欲不振、与肝纤维化相关的疲劳、重量减轻、门静脉高血压及腹水)达至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。
术语“载体”意欲指一种多核苷酸分子，其能够输送其已连接的另一多核苷酸。载体的一种类型为“质粒”，其是指可接合其他DNA片段的环形双链DNA环。另一类型载体为病毒载体，其中其他DNA片段可接合至病毒基因组。某些载体能够在引入其的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中时可整合至宿主细胞的基因组中，且进而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引起其以有效方式连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体常常呈质粒形式。由于质粒为载体的最常用形式，因而在本说明书中，“质粒”与“载体”可互换使用。然而，本发明意欲包括发挥相等功能的此类其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒以及腺相关病毒)。
附图说明
图1：在RGA分析法中由杂交瘤法产生的抗BMP9抗体的体外活性测试。a.杂交瘤产生的BMP9抗体对人BMP2、BMP7及BMP9诱导的RGA活性的降低曲线及IC50；b.杂交瘤产生的BMP9抗体对大鼠BMP9诱导的RGA活性的降低曲线及IC50。
图2：在RGA分析法中由噬菌体展示法产生的抗BMP9抗体的体外活性测试。a.噬菌体展示产生的BMP9抗体对人BMP2、BMP7及BMP9诱导的RGA活性的降低曲线及IC50；b.噬菌体展示产生的BMP9抗体对大鼠BMP9诱导的RGA活性的降低曲线及IC50。
图3：通过smad 1/5磷酸化分析法进行的体外活性测试。a.杂交瘤产生的BMP9抗体对CFSC细胞中人BMP9诱导的smad 1/5/8磷酸化染色的降低曲线及IC50。b.噬菌体展示产生的BMP9抗体对CFSC细胞中人BMP9诱导的smad 1/5/8磷酸化染色的降低曲线及IC50。c.在抗BMP9抗体缺乏或存在下HUVEC细胞中BMP9诱导的磷酸化smad 1/5及ID1表达的蛋白质印迹法。
图4.BMP9HDI小鼠模型中使用杂交瘤产生的抗BMP9抗体的体内功效研究。与未经处理及阴性对照比较，展示不同处理组的代表性肝(a)、肝重及体重(b)、肝功能(c)。d.通过定量PCR检测ID1的mRNA表达。BMP9cDNA指示pcDNA3.1-小鼠BMP9，其编码小鼠BMP9。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图5.BMP9HDI小鼠模型中噬菌体展示产生的抗BMP9抗体的体内功效研究。与未经处理及阴性对照比较，展示不同处理组的代表性肝(a)、肝重及体重(b)、肝功能(c)。d.通过定量PCR检测ID1的mRNA表达。BMP9 cDNA指示质粒pcDNA3.1-小鼠BMP9，其编码小鼠BMP9。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图6.CCl4小鼠模型中的体内功效研究。展示对照IgG加油或CCl4处理的组(a)、对照IgG或杂交瘤产生的BMP9Ab加CCl4处理的组(b)的蛋白质印迹结果。右图通过GAPDH表达校正。显著差异如下指示：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。c、d.展示不同组的p-Smad 1/5/8组织学结果。c.C57BL/6小鼠的资料。d.BALB/c小鼠的资料。
图7.CCl4小鼠模型中的体内功效研究。展示对照IgG加油或CCl4处理的组(a)、对照IgG或噬菌体展示产生的Ab加CCl4处理的组(b)的蛋白质印迹结果。右图通过GAPDH表达校正。显著差异如下指示：*P<0.05，**P<0.01。c.展示不同组的p-Smad 1/5/8组织学结果。
图8.2周CCl4肝纤维化小鼠模型中使用小鼠抗BMP9抗体(2B11G2及4E10D7)的体内功效研究。与未经处理及阴性对照比较，展示不同处理组的天狼星红染色(a)、肝脏羟脯氨酸含量(b)、肝功能(c)、肝重(d)的定量。e.通过定量PCR检测ID1的mRNA表达。*P<0.05。
图9.正常小鼠(a)及ANIT大鼠模型(b)中的PK分析法。
图10.在食蟹猴中单剂量施用抗体BMP9-2之后总抗BMP6浓度(各线展示来自单个猴的资料)。
图11在食蟹猴中在多剂量抗体BMP9-2(MOR022962)研究期间总抗BMP6浓度。
发明详述
本发明提供特异性结合于BMP9蛋白的抗体及其抗原结合片段以及药物组合物、产生方法及此类抗体及组合物的使用方法。
BMP9抗体及其抗原结合片段
本发明提供特异性结合于人BMP9的抗体及其抗原结合片段。
BMP9信号传导在肝纤维化/肝硬化及门静脉高血压的发病机制中起作用。在纤维化病状中，例如在肝硬化肝脏组织中BMP9表达、血清含量及信号传导增加。不受任何特定理论束缚，本发明提出一种BMP9拮抗性抗体，因为预期抗纤维化疗法有益于患有慢性肝病和/或门静脉高血压，例如患有肝纤维化，例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病毒感染(例如HBV或HCV)、酒精、毒素或免疫诱导的肝纤维化或肝硬化的患者。
此类抗人BMP9抗体的实例为序列在表1中列出的抗体BMP9-1、BMP9-2、BMP9-3、BMP9-4、BMP9-5、BMP9-6、BMP9-7、BMP9-8及BMP9-9。
抗体BMP9-1、BMP9-2、BMP9-3、BMP9-4、BMP9-5、BMP9-6、BMP9-7、BMP9-8及BMP9-9均以高亲和力、相对于人BMP7、人BMP10及人BMP2的高选择性结合于人BMP9。这些抗体亦抑制Smad1/5/8磷酸化及Id1诱导，且在体内小鼠模型中保护肝避免BMP9诱导的破坏。
本文所揭示的BMP9拮抗性抗体代表一种可靠地改善肝病、例如肝纤维化、肝硬化或门静脉高血压或防止其进展的新颖治疗方法。不受任何特定理论束缚，本发明提出此可通过抑制BMP9信号传导进行。
在一个实施例中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其对人BMP9蛋白的亲和力比对以下任一者高100、500或1000倍：人BMP2、BMP10或人BMP7蛋白。特异性结合于BMP9而不结合于BMP7为重要的：BMP7基因敲除小鼠在出生之后死亡，具有肾、眼睛及骨胳缺陷。此外，BMP7在预防与纤维化相关的慢性心脏病进展中为重要的。因此，抗BMP9抗体与BMP7的交叉反应性为不合乎需要的。本文所提供的抗体对BMP9而非BMP7具有特异性；参见例如表5及表7。图1a及图2a亦展示特异性结合于人BMP9而非人BMP2及BMP7蛋白的证据。
本发明的抗体包括(但不限于)如本文，包括实例中所述的分离的人及人源化单克隆抗体。
此类抗人BMP9抗体的实例为序列在表1中列出的抗体BMP9-1、BMP9-2、BMP9-3、BMP9-4、BMP9-5、BMP9-6、BMP9-7、BMP9-8及BMP9-9。
在ELISA结合分析中，抗体BMP9-2以高亲和力结合人BMP9，且不结合人BMP2、人BMP7或人BMP10(亦即选择性结合于人BMP9，例如超过1000倍，例如超过10,000倍)，亦即对人BMP2、BMP7或BMP10的活性不可检测。抗体BMP9-2亦在体外抑制BMP9与ALKI及ActRIIB受体两者的结合。如通过竞争ELISA所测量，BMP9与ALKI的结合最大抑制59％，且与ActRIIB的结合最大抑制85％。此外，小鼠中单次10mg/kg处理遏制CCl4诱导的pSmad1/5/8(如通过IHC及蛋白质印迹法所测量)。此外，抗体BMP9-2的单次10mg/kg注射降低BMP9诱导的Id1产生且拯救BMP9诱导的肝重降低。
与人BMP2、BMP10或BMP7蛋白质相比，抗体BMP9-1、BMP9-3及BMP9-4均展示对人BMP9蛋白质的高特异性。关于本文中描述的抗体的产生及表征的其他细节提供于实施例中。
本发明提供特异性结合BMP9(例如人BMP9蛋白)的抗体，此类抗体包含表1中列出的VH结构域。本发明亦提供特异性结合于BMP9蛋白的抗体，此类抗体包含具有表1中列出的任一VH CDR的氨基酸序列的VHCDR。详言之，本发明提供特异性结合于BMP9蛋白的抗体，此类抗体包含一个、两个、三个、四个、五个或五个以上具有表1中列出的任一VH CDR的氨基酸序列的VH CDR(或者由其组成)。
本发明亦提供特异性结合于BMP9的抗体及其抗原结合片段，此类抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的VH氨基酸序列(或者由其组成)，其中框架序列(例如不为CDR的序列)中不超过约10个氨基酸已突变(其中各种非限制性的突变实例为添加、取代或缺失)。本发明亦提供特异性结合于BMP9的抗体及其抗原结合片段，此类抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的VH氨基酸序列(或者由其组成)，其中框架序列(例如不为CDR的序列)中不超过10个氨基酸已突变(其中各种非限制性的突变实例为添加、取代或缺失)。
本发明亦提供特异性结合于BMP9的抗体及其抗原结合片段，此类抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的VH氨基酸序列(或者由其组成)，其中框架序列(例如不为CDR的序列)中不超过约20个氨基酸已突变(其中各种非限制性的突变实例为添加、取代或缺失)。本发明亦提供特异性结合于BMP9的抗体及其抗原结合片段，此类抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的VH氨基酸序列(或者由其组成)，其中框架序列(例如不为CDR的序列)中不超过20个氨基酸已突变(其中各种非限制性的突变实例为添加、取代或缺失)。
本发明亦提供特异性结合于BMP9的抗体及其抗原结合片段，此类抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的VL氨基酸序列(或者由其组成)，其中框架序列(例如不为CDR的序列)中不超过约10个氨基酸已突变(其中各种非限制性的突变实例为添加、取代或缺失)。本发明亦提供特异性结合于BMP9的抗体及其抗原结合片段，此类抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的VL氨基酸序列(或者由其组成)，其中框架序列(例如不为CDR的序列)中不超过10个氨基酸已突变(其中各种非限制性的突变实例为添加、取代或缺失)。
本发明亦提供特异性结合于BMP9的抗体及其抗原结合片段，此类抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的VL氨基酸序列(或者由其组成)，其中框架序列(例如不为CDR的序列)中不超过约20个氨基酸已突变(其中各种非限制性的突变实例为添加、取代或缺失)。本发明亦提供特异性结合于BMP9的抗体及其抗原结合片段，此类抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的VL氨基酸序列(或者由其组成)，其中框架序列(例如不为CDR的序列)中不超过20个氨基酸已突变(其中各种非限制性的突变实例为添加、取代或缺失)。
本发明提供特异性结合于BMP9蛋白的抗体及其抗原结合片段，此类抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的VL域。本发明亦提供特异性结合于BMP9蛋白的抗体及其抗原结合片段，此类抗体或其抗原结合片段包含具有表1中列出的任一VL CDR的氨基酸序列的VLCDR。详言之，本发明提供特异性结合于BMP9蛋白的抗体及其抗原结合片段，此类抗体或其抗原结合片段包含一个、两个、三个或更多个具有表1中列出的任一VL CDR的氨基酸序列的VL CDR(或者由其组成)。
本发明的其他抗体及其抗原结合片段包括已突变的氨基酸，然而CDR区与表1中描述的序列中描绘的CDR区具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一个方面，本发明的其他抗体及其抗原结合片段包括突变氨基酸序列，其中当与表1中描述的序列中描绘的CDR区比较时，CDR区不超过1、2、3、4或5个氨基酸已突变。
本发明亦提供编码特异性结合于BMP9蛋白的抗体及其抗原结合片段的VH、VL、全长重链及全长轻链的核酸序列。此类核酸序列可针对在哺乳动物细胞中的表达最佳化(例如表1展示抗体BMP9-1、BMP9-2、BMP9-3、BMP9-5、BMP9-6、BMP9-7、BMP9-8及BMP9-9的重链及轻链的示例核酸序列)。
表1.本发明的BMP9抗体的实例
本发明的其他抗体及其抗原结合片段包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已突变，然而与表1中描述的序列具有至少60％、70％、80％、90％或95％同一性的抗体及其抗原结合片段。在一个实施方案中，其包括其中当与表1中描述的序列中描绘的可变区比较时可变区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已突变，而保留了实质上相同治疗活性的突变氨基酸序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:1、2及3的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQ ID NO:11、12及13的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:4、5及6的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQ ID NO:14、15及16的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:21、22及23的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQ IDNO:31、32及33的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:24、25及26的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQ IDNO:34、35及36的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:41、42及43的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQ IDNO:51、52及53的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:44、45及46的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQ IDNO:54、55及56的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:61、62及63的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQ IDNO:71、72及73的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:64、65及66的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQ IDNO:74、75及76的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:81、82及83的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQ IDNO:91、92及93的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:84、85及86的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQ IDNO:94、95及96的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:101、102及103的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQID NO:111、112及113的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:104、105及106的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQID NO:114、115及116的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:121、122及123的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQID NO:131、132及133的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:124、125及126的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQID NO:134、135及136的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:141、142及143的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQID NO:151、152及153的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:144、145及146的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQID NO:154、155及156的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:161、162及163的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQID NO:171、172及173的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定实施方案中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含分别为SEQ ID NO:164、165及166的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分别为SEQID NO:174、175及176的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
因为这些抗体中的每一者可结合于BMP9，所以VH、VL、全长轻链及全长重链序列(氨基酸序列及编码氨基酸序列的核苷酸序列)可“经混合及匹配”以产生本发明的其他BMP9结合抗体及其抗原结合片段。此类“经混合及匹配”的BMP9结合抗体可使用本领域中已知的结合分析法(例如ELISA及描述于实施例部分中的其他分析法)来测试。当这些链混合及匹配时，来自特定VH/VL对的VH序列应经结构上类似的VH序列置换。同样，来自特定全长重链/全长轻链对的全长重链序列应经结构上类似的全长重链序列置换。同样，来自特定VH/VL对的VL序列应经结构上类似的VL序列置换。同样，来自特定全长重链/全长轻链对的全长轻链序列应经结构上类似的全长轻链序列置换。
在另一方面，本发明提供BMP9结合抗体，其包含如表1中所述的重链及轻链CDR1、CDR2及CDR3或其组合。CDR区使用Kabat系统(Kabat等人1991Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开案第91-3242号)或使用Chothia系统(Chothia等人1987J.Mol.Biol.196:901-917；及Al-Lazikani等人1997J.Mol.Biol.273:927-948)划定界限。或者可使用其他用于将CDR区划定界限的方法。举例而言，Kabat与Chothia的CDR定义可组合，使得CDR由人VH中氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)以及人VL中氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)组成。
鉴于这些抗体中的每一者可结合于BMP9且抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2及CDR3区提供，因此VH CDR1、CDR2及CDR3序列与VL CDR1、CDR2及CDR3序列可“混合及匹配”(亦即来自不同抗体的CDR可混合及匹配，不过各抗体必须含有VH CDR1、CDR2及CDR3以及VLCDR1、CDR2及CDR3以产生本发明的其他结合BMP9的结合分子。此类“经混合及匹配”的BMP9结合抗体可使用本领域中已知的结合分析法及实施例中所述的分析法(例如ELISA)来测试。当VH CDR序列混合及匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应经结构上类似的CDR序列置换。同样，当VL CDR序列混合及匹配时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应经结构上类似的CDR序列置换。本领域技术人员将显而易知，新颖的VH及VL序列可通过用来自本文中针对本发明的单克隆抗体所展示的CDR序列的结构上类似的序列使一或多个VH和/或VL CDR区序列突变来产生。
因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合区，该分离的单克隆抗体或其抗原结合区包含：包含选自SEQ ID NO:1、21、41、61、81、101、121、141、161、4、24、44、64、84、104、124、144及164任一者的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NO:2、22、42、62、82、102、122、142、162、5、25、45、65、85、105、125、145及165任一者的氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含选自SEQ ID NO:3、23、43、63、83、103、123、143、163、6、26、46、66、86、106、126、146及166任一者的氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含选自SEQ ID NO:11、31、51、71、91、111、131、151、171、14、34、54、74、94、114、134、154及174任一者的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NO:12、32、52、72、92、112、132、152、172、15、35、55、75、95、115、135、155及175任一者的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及包含选自SEQ IDNO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、16、36、56、76、96、116、136、156及176任一者的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中该抗体特异性结合BMP9。
在一个实施方案中，特异性结合于BMP9的抗体为表1中描述的抗体。在一个实施方案中，特异性结合于BMP9的抗体为BMP9-1。在一个实施方案中，特异性结合于BMP9的抗体为BMP9-2。在一个实施方案中，特异性结合于BMP9的抗体为BMP9-3。在一个实施方案中，特异性结合于BMP9的抗体为BMP9-4。在一个实施方案中，特异性结合于BMP9的抗体为BMP9-5。在一个实施方案中，特异性结合于BMP9的抗体为BMP9-6。在一个实施方案中，特异性结合于BMP9的抗体为BMP9-7。在一个实施方案中，特异性结合于BMP9的抗体为BMP9-8。在一个实施方案中，特异性结合于BMP9的抗体为BMP9-9。
如本文所用，若抗体的可变区或全长链获自使用人胚系免疫球蛋白基因的系统，人抗体包含作为特定胚系序列的“产物”或“来源于”特定胚系序列的重链或轻链可变区或全长重链或轻链。此类系统包括用目的抗原将携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫接种或用相关抗原筛选展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。作为人胚系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”人胚系免疫球蛋白序列的人抗体可通过将人抗体的氨基酸序列与人胚系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较且选择序列最接近(亦即最大％同一性)人抗体序列的人胚系免疫球蛋白序列来如此鉴别。如与胚系序列比较，作为特定人胚系免疫球蛋白序列的“产物”或“来源于”特定人胚系免疫球蛋白序列的人抗体可含有例如由天然存在的体细胞突变或定点突变的有意引入所引起的氨基酸差异。然而，在VH或VL框架区中，所选人抗体通常在氨基酸序列上与由人胚系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90％的同一性，且含有当与其他物种的胚系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠类胚系序列)相比时鉴别人抗体为人的氨基酸残基。在某些情况中，人抗体在氨基酸序列上与通过胚系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可至少60％、70％、80％、90％或至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，重组人抗体在VH或VL框架区中将展示与通过人胚系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个的氨基酸差异。在某些情况中，人抗体可展示与通过胚系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个的氨基酸差异。
BMP家族成员及肝纤维化
在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合于BMP9的抗体或其结合片段。在一个实施方案中，抗体或其结合片段描述于表1中。
在一个实施方案中，抗体或其结合片段特异性结合于BMP9，但不结合于其他BMP蛋白(诸如BMP2、BMP10或BMP7)。
在人及小鼠中，BMP9在肝脏中表达，且据信BMP9信号传导在肝病，例如肝纤维化、肝硬化或门静脉高血压的发病机制中起作用。不束缚于任何理论，据信BMP9信号传导引起Smad1/5/8磷酸化，Smad1/5/8磷酸化又引起Id1活化。Id1活化引起肝细胞的细胞凋亡、HSC活化及HSC-EC串扰，引起肝纤维化。已展示肝脏中BMP9表达的活化造成肝细胞细胞死亡及肝星形细胞活化、肝纤维化及诱导纤维化标记基因(例如αSMA、波形蛋白及Col1a1)及严重肝脏破坏。如本文，包括实施例中所述，已意外且出乎意料地展示本发明的BMP9抗体对BMP9具有高度特异性(与BMP2、BMP10和/或BMP7相比)且体外及体内抑制BMP9，包括抑制BMP9诱导的肝病，包括BMP9诱导的肝纤维化。
下文描述各种类型的BMP9抗体及其抗原结合片段。
同源抗体
在另一实施方案中，本发明提供一种包含与表1中描述的序列同源的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段，且该抗体结合于BMP9且保留表1中描述的那些抗体的所需功能特性。
举例而言，本发明提供一种分离的包含重链可变区及轻链可变区的单克隆抗体(或其功能性抗原结合片段)，其中该重链可变区包含与选自由SEQ ID NO:7、27、47、67、87、107、127、147及167组成的群的氨基酸序列至少80％、具有至少90％或至少95％相同的氨基酸序列；该轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO:17、37、57、77、97、107、117、137、157及177组成的群的氨基酸序列至少80％、具有至少90％或至少95％相同的氨基酸序列；该抗体特异性结合于BMP9蛋白，且该抗体抑制BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化、BMP9诱导的Id1诱导、纤维化标记物的BMP9诱导和/或BMP9诱导的肝脏破坏，其中任一分析法为本领域中已知。在一特定实例中，在BRE-Luc报导基因分析法(如本文所述)中，此类抗体具有小于500pM的IC50值。在一特定实例中，在CCl4小鼠模型，例如如本文所述的CCl4小鼠模型中，在单次注射10mg/kg剂量时此类抗体显著抑制Smad1/5/8磷酸化。在一特定实例中，在小鼠HDI模型，例如如本文所述的小鼠HDI模型中，在单次注射10mg/kg剂量时此类抗体显著抑制Id1的BMP9诱导。在一特定实例中，此类抗体显著保护肝脏组织避免BMP9诱导的破坏，例如纤维化。
在一个实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可与表1中阐述的序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一个实施方案中，除不超过1、2、3、4或5个氨基酸位置中氨基酸取代外，VH和/或VL氨基酸序列可相同。具有与表1中描述的抗体的VH及VL区高度(亦即80％或更大)相同的VH及VL区的抗体可通过对分别编码SEQ ID NO:7、27、47、67、87、107、127、147或167及17、37、57、77、97、107、117、137、157或177的核酸分子进行诱变(例如定点或PCR介导的诱变)，接着使用本文中描述的功能分析法针对保留的功能测试所编码的改变抗体来获得。
在一个实施方案中，全长重链和/或全长轻链氨基酸序列可与表1中阐述的序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。具有分别与SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149或169任一者的全长重链及SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159或179任一者的全长轻链高度(亦即80％或更大)相同的全长重链及全长轻链的抗体可通过对分别编码此类多肽的核酸分子进行诱变(例如定点或PCR介导的诱变)，接着使用本文中描述的功能分析法针对保留的功能测试所编码的改变抗体来获得。
在一个实施方案中，全长重链和/或全长轻链核苷酸序列可与表1中阐述的序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在一个实施方案中，重链和/或轻链核苷酸序列的可变区可与表1中阐述的序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
如本文所用，两个序列之间的同一性百分比为在为使两个序列最佳比对，需要将间隙引入下，考虑到间隙数及各间隙的长度，序列共享的相同位置的数目的函数(亦即，％同一性等于相同位置数/总位置数×100)。如下文非限制性实施例中所述，序列比较及两个序列之间的同一性百分比的测定可使用数学算法实现。
或者或另外，本发明的蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以针对公共资料库进行搜索以例如鉴别相关序列。举例而言，此类搜索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLAST程序(2.0版)进行。具有保守性修饰的抗体
在一个实施方案中，本发明的抗体具有包含CDR1、CDR2及CDR3序列的重链可变区及包含CDR1、CDR2及CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中之一或多者具有基于本文所述的抗体或其保守性修饰的指定氨基酸序列，且其中抗体保留本发明的BMP9结合抗体及其抗原结合片段的所需功能特性。因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其功能性抗原结合片段，其由包含CDR1、CDR2及CDR3序列的重链可变区及包含CDR1、CDR2及CDR3序列的轻链可变区组成，其中：重链可变区CDR1包含选自SEQ ID NO:1、4、21、24、41、44、61、64、81、84、101、104、121、124、141、144、161及164任一者的氨基酸序列或其保守变体；重链可变区CDR2包含选自SEQ ID NO:2、5、22、25、42、45、62、65、82、85、102、105、122、125、142、145、162及165任一者的氨基酸序列或其保守变体；重链可变区CDR3包含选自SEQ ID NO:3、6、23、26、43、46、63、66、83、86、103、106、123、126、143、146、163及166任一者的氨基酸序列或其保守变体；轻链可变区CDR1包含选自SEQ ID NO:11、14、31、34、51、54、71、74、91、94、111、114、131、134、151、154、171及174任一者的氨基酸序列或其保守变体；轻链可变区CDR2包含选自SEQ ID NO:12、15、32、35、52、55、72、75、92、95、112、115、132、135、152、155、172及175的氨基酸序列或其保守变体；以及轻链可变区CDR3包含选自SEQ ID NO:13、16、33、36、53、56、73、76、93、96、113、116、133、136、153、156、173及176的氨基酸序列或其保守变体；该抗体或其抗原结合片段特异性结合于BMP9，且该抗体抑制BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化、BMP9诱导的Id1诱导、纤维化标记物的BMP9诱导和/或BMP9诱导的肝脏破坏，其中任一分析法为本领域中已知。在一特定实施例中，该抗体特异性结合于BMP9蛋白，且该抗体抑制BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化、BMP9诱导的Id1诱导、纤维化标记物的BMP9诱导和/或BMP9诱导的肝脏破坏，其中任一分析法为本领域中已知。在一特定实施例中，在BRE-Luc报导基因分析法(如本文所述)中此类抗体具有小于500pM的IC50值。在一特定实施例中，在CCl4小鼠模型，例如如本文所述的CCl4小鼠模型中，在单次注射10mg/kg剂量时此类抗体显著抑制Smad1/5/8磷酸化。在一特定实施例中，在小鼠HDI模型，例如如本文所述的小鼠HDI模型中，在单次注射10mg/kg剂量时此类抗体显著抑制Id1的BMP9诱导。在一特定实施例中，此类抗体显著保护肝脏组织避免BMP9诱导的破坏，例如纤维化。
在一个实施方案中，针对在哺乳动物细胞中表达最佳化的本发明抗体具有全长重链序列及全长轻链序列，其中这些序列中之一或多者具有基于本文所述的抗体或其保守性修饰的指定氨基酸序列，且其中抗体保留本发明的BMP9结合抗体及其抗原结合片段的所需功能特性。因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体，其针对在哺乳动物细胞中表达最佳化，由全长重链及全长轻链组成，其中：全长重链具有选自SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169的群的氨基酸序列及其保守性修饰；且全长轻链具有选自SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159、179的群的氨基酸序列及其保守性修饰；该抗体特异性结合于BMP9；且该抗体抑制BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化、BMP9诱导的Id1诱导、纤维化标记物的BMP9诱导和/或BMP9诱导的肝脏破坏，其中任一分析法为本领域中已知。在一特定实施例中，该抗体特异性结合于BMP9蛋白，且该抗体抑制BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化、BMP9诱导的Id1诱导、纤维化标记物的BMP9诱导和/或BMP9诱导的肝脏破坏，其中任一分析法为本领域中已知。在一特定实施例中，在BRE-Luc报导基因分析法(如本文所述)中此类抗体具有小于500pM的IC50值。在一特定实施例中，在CCl4小鼠模型，例如如本文所述的CCl4小鼠模型中，在单次注射10mg/kg剂量时此类抗体显著抑制Smad1/5/8磷酸化。在一特定实施例中，在小鼠HDI模型，例如如本文所述的小鼠HDI模型中，在单次注射10mg/kg剂量时此类抗体显著抑制Id1的BMP9诱导。在一特定实施例中，此类抗体显著保护肝脏组织避免BMP9诱导的破坏，例如纤维化。
结合于相同表位的抗体
本发明提供结合于与表1中列出的BMP9结合抗体结合相同表位的抗体。因此，其他抗体可在BMP9结合分析法中基于其与本发明的其他抗体及其抗原结合片段交叉竞争(例如以统计学上显著的方式竞争性抑制其结合)的能力鉴别。测试抗体抑制本发明的抗体及其抗原结合片段结合BMP9蛋白的能力表明测试抗体可与该抗体竞争结合于BMP9；根据非限制性理论，此类抗体可与其所竞争的抗体结合于BMP9上相同或相关(例如结构上相似或空间上邻近)的表位。在某一实施方案中，与本发明的抗体及其抗原结合片段结合于BMP9上相同表位的抗体为人单克隆抗体。此类人单克隆抗体可如本文所述制备及分离。在某一实施方案中，与本发明的抗体及其抗原结合片段结合于BMP9上相同表位的抗体为小鼠单克隆抗体。此类小鼠单克隆抗体列于表3中。在某些实施方案中，与本发明的抗体及其抗原结合片段结合于BMP9上相同表位的抗体为来源于表3中列出的小鼠单克隆抗体的人源化单克隆抗体。在某一实施方案中，与本发明的抗体及其抗原结合片段结合于BMP9上相同表位的抗体为人源化单克隆抗体。此类人源化单克隆抗体可如本文所述制备及分离。
一旦确定抗原上的所要表位，则可例如使用本发明中所述的技术产生抗该表位的抗体。或者，在探索过程期间，抗体的产生及表证可阐明关于所要表位的资讯。根据此资讯，随后可针对结合于相同表位竞争性筛检抗体。一种实现此的方法为进行交叉竞争研究，以寻找彼此竞争性结合的抗体，例如抗体竞争结合于抗原。用于基于交叉竞争对抗体“分箱(binning)”的一种高通量方法描述于国际专利申请案第WO 2003/48731号中。如熟习本领域者所了解，实际上抗体可特异性结合的任何东西均可为表位。表位可包含抗体结合的那些残基。
一般而言，在蛋白质和/或巨分子的复合混合物中对特定标靶抗原具有特异性的抗体将优先识别标靶抗原上的表位。
包括表位的既定多肽区可使用本领域中熟知的多种表位定位技术鉴别。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(GlennE.Morris编,1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。举例而言，线性表位可通过例如如下测定：在固体支撑物上并行合成大量肽，此类肽对应于蛋白质分子的部分，且使肽与抗体反应，而肽仍附接于支撑物。此类技术为本领域中已知且描述于例如美国专利第4,708,871号；Geysen等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:3998-4002；Geysen等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:78-182；Geysen等人(1986)Mol.Immunol.23:709-715。类似地，构象表位容易通过诸如通过例如氢/氘交换、X射线结晶学及二维核磁共振测定氨基酸BMP9的空间构象来鉴别。参见例如Epitope Mapping Protocols,上文。蛋白质的抗原区亦可使用标准抗原性及亲水性曲线图，诸如使用例如获自Oxford Molecular Group的Omiga1.0版软件程序计算的曲线图鉴别。为测定抗原性型态，此电脑程序采用Hopp/Woods法，Hopp等人,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78:3824-3828；且对于亲水性曲线图，采用Kyte-Doolittle技术，Kyte等人,(1982)J.MoI.Biol.157:105-132。
经工程改造及经修饰的抗体
本发明的抗体进一步可使用具有本文中展示的VH和/或VL序列中的一或多者的抗体作为工程改造修饰抗体的起始材料制备，该修饰抗体可具有自起始抗体改变的特性。抗体可通过修饰一或两个可变区(亦即VH和/或VL)内，例如一或多个CDR区内和/或一或多个框架区内的一或多个残基而进行工程改造。或者或另外，抗体可通过修饰恒定区内的残基以例如改变抗体的效应子功能而进行工程改造。
可进行的可变区工程化的一种类型为CDR移植。抗体主要通过位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与标靶抗原相互作用。出于此原因，个别抗体之间的CDR内的氨基酸序列与CDR外的序列相比更多样化。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以可通过构筑包括来自特定天然存在的抗体的CDR序列移植至来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上的表达载体，表达模拟特定天然存在的抗体的特性的重组抗体。(参见例如Riechmann,L.等人,1998Nature 332:323-327；Jones,P.等人,1986Nature 321:522-525；Queen,C.等人,1989 Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86:10029-10033；颁予Winter的美国专利第5,225,539号以及颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及第6,180,370。)
此类框架序列可自包括胚系抗体基因序列或重排抗体序列的公共DNA资料库或公开参考文献获得。举例而言，人重链及轻链可变区基因的胚系DNA序列可见于“VBase”人胚系序列资料库(可在网际网路上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)以及Kabat,E.A.等人,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH公开案第91-3242号；Tomlinson,I.M.等人,1992J.fol.Biol.227:776-798；以及Cox,J.P.L.等人,1994Eur.J Immunol.24:827-836；每一者的内容以引用的方式明确并入本文中。举例而言，人重链及轻链可变区基因及重排抗体序列的胚系DNA序列可见于“IMGT”资料库(可在网际网路上www.imgt.org获得；参见Lefranc,M.P.等人,1999Nucleic Acids Res.27:209-212；每一者的内容以引用的方式明确并入本文中。)
用于本发明的抗体及其抗原结合片段的框架序列的一实例为结构上类似于本发明的所选抗体及其抗原结合片段使用的框架序列，例如本发明的单克隆抗体使用的共同序列和/或框架序列的框架序列。VH CDR1、CDR2及CDR3序列及VL CDR1、CDR2及CDR3序列可移植至序列与在框架序列所来源的胚系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的框架区上，或CDR序列可移植至与胚系序列相比含有一或多个突变的框架区上。举例而言，已发现在某些情况下使框架区内的残基突变为有益的，以维持或增强抗体的抗原结合能力(参见例如颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及第6,180,370号)。
可变区修饰的另一类型为使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内氨基酸残基突变，进而提高相关抗体之一或多种结合特性(例如亲和力)，称为“亲和力成熟”。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变且对抗体结合或相关其他功能特性的影响可在如本文所述及实施例所提供的体外或体内分析法中进行评价。可引入保守性修饰(如上文所论述)。突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，通常在CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个经改变。
移植抗原结合结构域至替代框架或骨架中
可采用各种抗体/免疫球蛋白框架或骨架，只要所得多肽包括特异性结合于BMP9的至少一个结合区即可。此类框架或骨架包括人免疫球蛋白的5种主要个体基因型、其抗原结合片段，且包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选具有人源化方面。就此而言，单重链抗体(诸如在骆驼中鉴别的单重链抗体)备受关注。熟习本领域者不断地发现及研发新颖框架、骨架及片段。
在一个方面，本发明涉及一种使用上面可移植本发明的CDR的非免疫球蛋白骨架产生基于非免疫球蛋白的抗体的方法。可采用已知或未来非免疫球蛋白框架及骨架，只要其包含对标靶BMP9蛋白具有特异性的结合区即可。已知的非免疫球蛋白框架或骨架包括(但不限于)纤维结合蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,Mass.)、锚蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、结构域抗体(Domantis,Ltd.,Cambridge,Mass.及Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂质运载蛋白(Pieris ProteolabAG,Freising,Germany)、小模组化免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,Wash.)、高亲合性多聚体(Avidia,Inc.,Mountain View,Calif.)、蛋白A(Affibody AG,Sweden)及阿菲林(affilin)(γ-晶状体球蛋白或泛素)(SciI Proteins GmbH,Halle,Germany)。
纤维结合蛋白骨架系基于纤维结合蛋白III型结构域(例如纤维结合蛋白III型的第十模组(10Fn3域))。纤维结合蛋白III型结构域具有分布在两个β片之间的7或8个β链，其彼此抵靠填充而形成蛋白质的核心，且进一步含有使β链彼此间连接且暴露于溶剂的环(与CDR类似)。在β片夹层的各边缘处存在至少三个此类环，其中边缘为蛋白质垂直于β链方向的边界(参见美国专利第6,818,418号)。这些基于纤维结合蛋白的骨架不为免疫球蛋白，不过总折叠与包含骆驼(camel)及骆马(llama)IgG中的整个抗原识别单位的最小功能抗体片段(重链的可变区)的总折叠紧密相关。因为此结构，所以非免疫球蛋白抗体模拟针对抗体的抗原结合特性在性质上及亲和力上类似的抗原结合特性。类似于体内抗体亲和力成熟过程的体外环随机化及改组策略中可使用这些骨架。这些基于纤维结合蛋白的分子可用作骨架，其中分子的环区可使用标准克隆技术用本发明的CDR替换。
锚蛋白技术系基于使用具有锚蛋白衍生的重复模组的蛋白质，该重复模组作为用于承载可用于与不同标靶结合的可变区的骨架。锚蛋白重复模组为一种由两个逆平行α螺旋及β转角组成的33个氨基酸多肽。可变区的结合主要通过使用核糖体展示来最佳化。
高亲和性多聚体(avimer)来源于含有天然A结构域的蛋白质，诸如LRP-1。这些结构域本性上用于蛋白质-蛋白质相互作用，且在人中超过250种蛋白质在结构上系基于A结构域。高亲和性多聚体系由多个不同“A结构域”单体(2至10个)通过氨基酸连接子连接而组成。可与标靶抗原结合的高亲合性多聚体可使用描述在例如美国专利申请公开案第20040175756号、第20050053973号、第20050048512号及第20060008844号中的方法产生。
亲和抗体亲和性配体为由三螺旋束组成的简单小蛋白质，该三螺旋束是基于蛋白质A的IgG结合结构域之一的骨架。蛋白质A为来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的表面蛋白质。此骨架结构域由58个氨基酸组成，使其中13个随机化以产生具有大量配体变体的亲和抗体文库(参见例如美国专利第5,831,012号)。亲和抗体分子模拟抗体，与分子量为150kDa的抗体相比，其分子量为6kDa。尽管亲和抗体分子的尺寸小，但亲和抗体分子的结合位点类似于抗体的结合位点。
抗运载蛋白(Anticalins)为Pieris ProteoLab AG公司研发的产品。其来源于脂质运载蛋白，一组广泛的小型稳定蛋白质，通常涉及化学敏感或不溶化合物的生理学运输或储存。若干种天然脂质运载蛋白存在于人组织或体液中。蛋白质架构与免疫球蛋白类似，其中高变环位于刚性框架的顶部。然而，与抗体或其重组片段相比，脂质运载蛋白由具有160至180个氨基酸残基的单多肽链组成，其仅略大于单免疫球蛋白结构域。该组构成结合袋的四个环显示明显的结构可塑性且包容多个侧链。结合位点因此可以专有方法再成形以利用高亲和性及特异性识别不同形状的指定标靶分子。脂质运载蛋白家族中的一种蛋白质，大菜粉蝶(Pieris Brassicae)的后胆色素结合蛋白(bilin-binding protein；BBP)，已用于通过对该组四个环进行诱变来研发抗运载蛋白。描述抗运载蛋白的专利申请案的一个实例在PCT公开案第WO 1999/16873号中。
阿菲林(affilin)分子为小型非免疫球蛋白蛋白质，其经设计而对蛋白质及小分子具特异性亲和力。新阿菲林分子可极快速地选自两个文库，各文库均基于不同的人来源骨架蛋白。阿菲林分子未显示与免疫球蛋白蛋白质的任何结构同源性。目前使用两种阿菲林骨架，其中一者为γ结晶体(一种人结构性眼晶状体蛋白质)，且另一者为“泛素”超家族蛋白质。两种人骨架均极小，展示高温稳定性且几乎对pH值变化及变性剂具抗性。此高稳定性主要归因于蛋白质的β片结构扩大。γ结晶体来源蛋白质的实例描述于WO200104144中且“泛素样”蛋白质的实例描述于WO2004106368中。
蛋白质表位模拟物(PEM)为模拟蛋白质的β发夹二级结构(涉及蛋白质-蛋白质相互作用的主要二级结构)的中等大小、环状、肽样分子(MW1-2kDa)。
人BMP9结合抗体可使用本领域中已知的方法产生。举例而言，人工程改造技术用于将非人抗体转变成经工程改造的人抗体。美国专利公开案第20050008625号描述一种用人可变区置换抗体中的非人抗体可变区同时相对于非人抗体维持相同或提供优选结合特征的体内方法。该方法依赖于表位引导的用全人抗体对非人参考抗体的可变区的置换。所得人抗体一般在结构上与参考非人抗体不相关，但与参考抗体结合同一抗原上的同一表位。简言之，连续表位引导的互补替换方法通过如下进行：在细胞中，在对测试抗体与抗原的结合起反应的报导系统存在下，在“竞争者”与参考抗体的不同混合物的文库(“测试抗体”)之间建立结合于有限量的抗原的竞争。竞争者可为参考抗体或其衍生物，诸如单链Fv片段。竞争者亦可为抗原的天然或人工配体，其与参考抗体结合于相同表位。竞争者的唯一要求为其与参考抗体结合于相同的表位，且其与参考抗体竞争结合抗原。测试抗体具有一个来自非人参考抗体的共同抗原结合V区，且另一V区自诸如人抗体谱系文库的不同来源随机选择。来自参考抗体的共同V区充当向导，将测试抗体定位于抗原上的相同表位上，且呈相同取向，使得选择偏向与参考抗体的最高抗原结合保真度。
许多类型报导系统可用于检测测试抗体与抗原之间的所需相互作用。举例而言，补充报导片段可分别连接于抗原及测试抗体，使得仅仅当测试抗体结合于抗原时发生通过片段互补的报导子活化。当测试抗体及抗原-报导子片段融合物与竞争者共表达时，报导子活化变成视测试抗体与竞争者竞争的能力而定，该能力与测试抗体对抗原的亲和力成比例。可使用的其他报导子系统包括如美国专利申请案序列号10/208,730(公开案第20030198971号)中所揭示的自体抑制报导子再活化系统(RAIR)的再活化子，或美国专利申请案序列号10/076,845(公开案第20030157579号)中所揭示的竞争活化系统。
使用连续表位引导的互补替换系统，进行选择以鉴别表达单一测试抗体以及竞争者、抗原及报导子组分的细胞。在这些细胞中，各测试抗体与竞争者一对一竞争结合于有限量的抗原。报导子的活性与结合于测试抗体的抗原的量成比例，该量又与测试抗体对抗原的亲和力及测试抗体的稳定性成比例。测试抗体最初基于当表达为测试抗体时其相对于参考抗体的活性选择。第一轮选择的结果为一组“杂交”抗体，各由来自参考抗体的相同非人V区及来自文库的人V区构成，且各与参考抗体结合于抗原上相同表位。第一轮中选择的更多杂交抗体之一对抗原的亲和力将与参考抗体相当或高于其。
在第二V区替换步骤中，在第一步骤中选择的人V区用作向导，用于选择同源人V区的不同文库对剩余非人参考抗体V区的人替换。第一轮中选择的杂交抗体亦可用作第二轮选择的竞争者。第二轮选择的结果为一组完全人抗体，其结构上不同于参考抗体，但与参考抗体竞争结合于相同抗原。一些所选人抗体与参考抗体结合于相同抗原上相同表位。在这些所选人抗体中，一或多个以与参考抗体相当或高于其的亲和力结合于相同表位。
使用上述小鼠或嵌合BMP9结合抗体之一作为参考抗体，此方法可容易用于产生以相同结合特异性及相同或更优选结合亲和力结合于人BMP9的人抗体。另外，此类人BMP9结合抗体亦可自通常产生人抗体的公司，例如KaloBios,Inc.(Mountain View,Calif.)购得。
骆驼科抗体
自骆驼及单峰驼(双峰骆驼(Camelus bactrianus)及单峰骆驼(Calelusdromaderius))家族成员(包括新世界成员，诸如骆马物种(羊驼(Lama pacos)、大羊驼(Lama glama)及瘦驼(Lama vicugna)))获得的抗体蛋白已在尺寸、结构复杂性及对人个体的抗原性方面加以表征。如在自然界中发现的来自此哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，且因此在结构上不同于其他动物抗体的具有两条重链及两条轻链的典型四链四级结构。参见PCT/EP93/02214(WO 94/04678 1994年3月3日公开)。
作为鉴别为VHH的小单可变结构域的骆驼科抗体区可通过基因工程改造获得，以产生对标靶具有高亲和力的小蛋白质，产生称作“骆驼科纳米抗体”的衍生自抗体的低分子量蛋白质。参见美国专利第5,759,808号,1998年6月2日颁予；亦参见Stijlemans,B.等人,2004J Biol Chem 279:1256-1261；Dumoulin,M.等人,2003Nature 424:783-788；Pleschberger,M.等人2003Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo,V.等人2002Int J Cancer 89:456-62；及Lauwereys,M.等人1998EMBO J 17:3512-3520。骆驼科抗体及抗体片段的工程改造文库可例如购自Ablynx,Ghent,Belgium。如同非人来源的其他抗体及其抗原结合片段，骆驼抗体的氨基酸序列可以重组方式改变，以获得更紧密类似人序列的序列，亦即纳米抗体可“人源化”。因此可进一步减小骆驼科抗体对人的天然低抗原性。
骆驼科纳米抗体的分子量为人IgG分子的约十分之一，且蛋白质的实体直径仅为几纳米。小尺寸之一种结果为骆驼科纳米抗体能够结合于较大抗体蛋白质功能上不可见的抗原位点，亦即骆驼科纳米抗体适用作检测否则使用经典免疫技术为隐藏的抗原的试剂，且适用作可能治疗剂。因此，小尺寸的又一结果为骆驼科纳米抗体由于结合于标靶蛋白的凹槽或窄隙中的特定位点而可具抑制作用，且因此相较于经典抗体的功能，可以更紧密类似于经典低分子量药物的功能的能力来发挥作用。
低分子量及紧凑尺寸进一步使骆驼科纳米抗体极其热稳定，对极端pH值及蛋白水解消化稳定，且抗原性弱。另一结果为骆驼科纳米抗体容易自循环系统移至组织中，且甚至跨过血脑屏障且可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步促进药物跨过血脑屏障输送。参见2004年8月19日公开的美国专利申请案20040161738。与对人的低抗原性组合的这些特征显示巨大治疗潜力。此外，这些分子可在诸如大肠杆菌的原核细胞中完全表达，且用噬菌体表达为融合蛋白且具功能性。
因此，本发明的一特性为一种对BMP9具高亲和力的骆驼科抗体或纳米抗体。在本文中一个实施方案中，骆驼科抗体或纳米抗体在骆驼科动物中天然产生，亦即，使用本文关于其他抗体描述的技术由骆驼科在用BMP9或其肽片段进行免疫接种后产生。或者，对BMP9结合骆驼科纳米抗体进行工程改造，亦即通过例如如本文中的实施例中所述，使用淘选程序，以BMP9作为标靶，自展示适当诱变的骆驼科纳米抗体蛋白质的噬菌体文库选择来产生。经工程改造的纳米抗体可进一步通过基因工程改造定制以使其在接受个体中的半衰期为45分钟至2周。在一个特定实施方案中，骆驼科抗体或纳米抗体系通过将本发明的人抗体的重链或轻链的CDR序列移植至纳米抗体或单域抗体框架序列中来获得，如例如PCT/EP93/02214中的实施例所述。
双特异性分子及多价抗体
在另一方面中，本发明的特征在于包含本发明的BMP9结合抗体或其片段的双特异性或多特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合区可衍生化或连接于另一功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如受体的另一抗体或配体)，以产生结合于至少两个不同结合位点或标靶分子的双特异性分子。本发明的抗体可实际上衍生化或连接于一个以上其他功能分子以产生与两个以上不同结合位点和/或标靶分子结合的多特异性分子；此类多特异性分子亦意欲涵盖于如本文所用的术语“双特异性分子”内。为产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可在功能上与一或多个其他结合分子(诸如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟剂)连接(例如通过化学偶合、基因融合、非共价缔合或以其他方式连接)，从而产生双特异性分子。
因此，本发明包括包含对BMP9的至少一个第一结合特异性及对第二标靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。举例而言，第二标靶表位为BMP9的不同于第一标靶表位的另一表位。
另外，就本发明中双特异性分子是多特异性而言，除第一及第二标靶表位之外，分子可进一步包括第三结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv作为结合特异物。抗体亦可为轻链或重链二聚体或其任何最小片段，诸如Fv或单链构筑体，如Ladner等人的美国专利第4,946,778号中所述。
双功能抗体为二价双特异性分子，其中VH及VL结合结构域在单多肽链上表达，其由过短而不容许同一链上的两个结合结构域之间配对的连接子连接。VH及VL域与另一链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger等人,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poijak等人,1994Structure 2:1121-1123)。双功能抗体可通过在同一细胞内表达具有结构VHA-VLB及VHB-VLA(VH-VL构型)或VLA-VHB及VLB-VHA(VL-VH构型)的两个多肽链来产生。其中大多数可在细菌中以可溶形式表达。单链双功能抗体(scDb)系通过约15个氨基酸残基的连接子连接两个形成双功能抗体的多肽链来产生(参见Holliger及Winter,1997Cancer Immunol.Immunother.,45(3-4):128-30；Wu等人,1996Immunotechnology,2(1):21-36)。scDb可以可溶性、活性单体形式表达于细菌中(参见Holliger及Winter,1997Cancer Immunol.Immunother.,45(34):128-30；Wu等人,1996Immunotechnology,2(1):21-36；Pluckthun及Pack,1997Immunotechnology,3(2):83-105；Ridgway等人,1996Protein Eng.,9(7):617-21)。双功能抗体可与Fc融合以产生“二-双功能抗体”(参见Lu等人,2004J.Biol.Chem.,279(4):2856-65)。
可用于本发明的双特异性分子中的其他抗体为鼠类、嵌合及人源化单克隆抗体。
本发明的双特异性分子可通过使用本领域中已知的方法将组成性结合特异物结合来制备。举例而言，双特异性分子的各结合特异物可分别产生，且随后彼此结合。当结合特异物为蛋白质或肽时，多种偶合剂或交联剂可用于共价结合。交联剂的实施例包括蛋白A、碳化二亚胺、N-丁二酰亚胺基-5-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻伸苯基二顺丁烯二酰亚胺(oPDM)、N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及磺基丁二酰亚胺基4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等人,1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,M A等人,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括以下文献中描述的方法：Paulus,1985Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等人,1985Science 229:81-83及Glennie等人,1987J.Immunol.139:2367-2375。结合剂为SATA及磺酸基-SMCC，均获自PierceChemical Co.(Rockford,Ill.)。
当结合特异物为抗体时，其可通过两条重链的C端铰链区的硫氢基键结来缀合。在一特定实施方案中，在缀合之前，铰链区经修饰以含有奇数个硫氢基残基，例如一个。
或者，两种结合特异物可在同一载体中编码，且在同一宿主细胞中表达及组装。此方法特别适用于双特异性分子为mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配体×Fab融合蛋白。本发明的双特异性分子可为包含一个单链抗体及一个结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法例如描述于美国专利第5,260,203号；美国专利第5,455,030号；美国专利第4,881,175号；美国专利第5,132,405号；美国专利第5,091,513号；美国专利第5,476,786号；美国专利第5,013,653号；美国专利第5,258,498号；及美国专利第5,482,858号中。
双特异性分子与其特异性标靶的结合可通过例如酶联结免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(REA)、FACS分析、生物分析法(例如生长抑制)或蛋白质印迹分析法来确认。这些各分析一般是分别采用对相关复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)检测尤其受关注的蛋白质-抗体复合体的存在。
在另一方面中，本发明提供多价化合物，其包含结合于BMP9的本发明的抗体及其抗原结合片段的至少两个相同或不同抗原结合部分。抗原结合部分可通过蛋白质融合或共价或非共价连接而连接在一起。或者，已描述双特异性分子的连接方法。四价化合物可例如通过使本发明的抗体及其抗原结合片段与结合于本发明的抗体及其抗原结合片段的恒定区，例如Fc或铰链区的抗体或抗原结合片段交联来获得。
三聚结构域描述于例如Borean专利EP 1 012 280B1中。五聚模组描述于例如PCT/EP97/05897中。
半衰期延长的抗体
本发明提供体内半衰期延长的特异性结合于BMP9的抗体。
许多因素可影响蛋白质的体内半衰期。例如，肾过滤、肝脏中的代谢、蛋白水解酶(蛋白酶)降解及免疫原性反应(例如抗体对蛋白质的中和及被巨噬细胞及树突细胞吸收)。多种策略可用于延长本发明的抗体及其抗原结合片段的半衰期。例如，通过化学连接于聚乙二醇(PEG)、reCODEPEG、抗体骨架、聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、结合白蛋白的配体及碳水化合物遮蔽物；通过与结合于血清蛋白质的蛋白质(诸如白蛋白、IgG、FcRn)基因融合且转移；通过与结合于血清蛋白质的其他结合部分(诸如纳米抗体、Fab、DARPin、高亲和性多聚体、亲和抗体及抗运载蛋白)偶合(基因方式或化学方式)；通过与rPEG、白蛋白、白蛋白结构域、白蛋白结合蛋白及Fc进行基因融合；或通过并入纳米载体、缓释调配物或医学装置中。
为延长体内抗体的血清循环，诸如高分子量PEG的惰性聚合物分子可通过PEG与抗体的N端或C端的位点特异性缀合或通过存在于赖氨酸残基上的ε-胺基，使用或不使用多官能性连接子连接于抗体或其片段。为使抗体发生聚乙二醇化，通常使抗体、其抗原结合片段与聚乙二醇(PEG)(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)在其中使一或多个PEG基团连接于抗体或抗体片段的条件下反应。聚乙二醇化可通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶聚合物)进行酰化反应或烷化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”意欲涵盖已用于衍生其他蛋白质的任一种PEG形式，诸如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。在一个实施方案中，待聚乙二醇化的抗体为去糖基化抗体。将使用使生物活性损失最小的线性或分支聚合物衍生作用。结合度可通过SDS-PAGE及质谱分析密切监测以确保PEG分子与抗体的适当结合。未反应的PEG可通过尺寸排阻或通过离子交换层析而自抗体-PEG结合物分离。PEG衍生抗体可针对结合活性以及针对体内功效，使用本领域技术人员熟知的方法(例如通过本文所述的免疫分析)来测试。用于蛋白质聚乙二醇化的方法为本领域中已知且可应用于本发明的抗体及其抗原结合片段。参见例如，Nishimura等人的EP 0154 316及Ishikawa等人的EP 0401 384。
其他经修饰的聚乙二醇化技术包括重构化学正交定向工程改造技术(ReCODEPEG)，其通过包括tRNA合成酶及tRNA的重构系统将化学上特定的侧链并入生物合成蛋白质中。此技术实现将超过30个新氨基酸并入大肠杆菌、酵母及哺乳动物细胞中的生物合成蛋白质中。tRNA将规范氨基酸并入安置有琥珀密码子的任何位置，将琥珀自终止密码子转换成信号指导化学指定的氨基酸的并入的密码子。
重组聚乙二醇化技术(rPEG)亦可用于延长血清半衰期。该技术包括以遗传方式将300至600个氨基酸非结构化蛋白质尾与现有医药蛋白质融合。由于此类非结构化蛋白质链的表观分子量比其实际分子量大约15倍，因此蛋白质的血清半衰期大大延长。与需要化学结合及再纯化的传统聚乙二醇化相比，此制造方法大大简化且产物为均质的。
另一技术为聚唾液酸化(polysialytion)，其使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长治疗性肽及蛋白质的有效寿命且提高治疗性肽及蛋白质的稳定性。PSA为唾液酸聚合物(一种糖)。当用于蛋白质及治疗性肽药物传递时，聚唾液酸在缀合时提供保护性微环境。此提高治疗性蛋白质在循环中的有效寿命且防止其被免疫系统识别。PSA聚合物于人体中天然发现。进化超过数百万年的某些细菌采用PSA聚合物来覆盖其壁。这些天然聚唾液酸化细菌接着能够藉助于分子拟态来阻挡人体防御系统。此类细菌中可容易产生大量且具有预定物理特征的PSA(天然的终极隐匿技术)。由于细菌PSA与人体中的PSA在化学上相同，因此细菌PSA完全不具免疫原性，即使与蛋白质偶合。
另一技术包括使用连接于抗体的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物。HES为来源于蜡质玉米淀粉的经修饰的天然聚合物，且可通过人体酶代谢。通常施用HES溶液以取代血容量不足及改良血液的流变特性。抗体的羟乙基淀粉化通过提高分子的稳定性以及通过降低肾脏清除率实现循环半衰期的延长，使得生物活性提高。根据改变不同参数，诸如HES的分子量，可定制广泛范围的HES抗体缀合物。
亦可通过将一或多个氨基酸修饰(亦即取代、插入或缺失)引入IgG恒定域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链Fc结构域片段)中来产生体内半衰期延长的抗体。参见例如国际公开案第WO 98/23289号；国际公开案第WO 97/34631号；及美国专利第6,277,375号。
此外，抗体可结合于白蛋白，以制备在体内更稳定或具有更长体内半衰期的抗体或抗体片段。此类技术为本领域中所熟知，参见例如国际公开案第WO 93/15199号、第WO93/15200号及第WO 01/77137号；以及欧洲专利第EP 413,622号。
延长半衰期的策略尤其适用于纳米抗体、基于纤维结合蛋白的结合剂及需要延长体内半衰期的其他抗体或蛋白质。
抗体缀合物
本发明提供特异性结合于BMP9的抗体或其抗原结合片段，其与异源蛋白质或多肽(或其抗原结合片段，优选至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)以重组方式融合或以化学方式缀合(包括共价与非共价缀合)而产生融合蛋白。详言之，本发明提供融合蛋白，其包含本文所述的抗体的抗原结合片段(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)及异源蛋白质、多肽或肽。使蛋白质、多肽或肽与抗体或抗体片段融合或结合的方法为本领域中已知。参见例如美国专利第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号及第5,112,946号；欧洲专利第EP 307,434号及第EP367,166号；国际公开案第WO 96/04388号及第WO 91/06570号；Ashkenazi等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539；Zheng等人,1995,J.Immunol.154:5590-5600；及Vil等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341。
其他融合蛋白可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术产生。可采用DNA改组改变本发明的抗体及其抗原结合片段(例如具有较高亲和力及较低解离速率的抗体及其抗原结合片段)的活性。一般参见美国专利第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号及第5,837,458号；Patten等人,1997,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2):76-82；Hansson等人,1999,J.Mol.Biol.287:265-76；及Lorenzo及Blasco,1998,Biotechniques 24(2):308-313(这些专利及公开案各以全文引用的方式并入本文中)。抗体及其抗原结合片段或经编码的抗体及其抗原结合片段可通过在重组前利用易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机突变诱导而改变。编码特异性结合于BMP9的抗体、其抗原结合片段的多核苷酸可与一或多种异源分子之一或多种组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
此外，抗体及其抗原结合片段可与诸如肽的标记物序列融合以促进纯化。在一个实施方案中，标记物氨基酸序列为六组氨酸肽(SEQ ID NO:218)，尤其诸如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)中提供的标签，其中许多可购得。如Gentz等人,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824中所述，例如六组氨酸(SEQ ID NO:218)便于纯化融合蛋白。适用于纯化的其他肽标签包括(但不限于)红血球凝集素(“HA”)标签，其对应于来源于流感红血球凝集素蛋白质的表位(Wilson等人,1984,Cell 37:767)，及“flag”标签。
在一个实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段缀合于诊断或可检测剂。此类抗体可用于监测或预后疾病或病症的发作、发展、进展和/或严重程度，作为临床测试程序之一部分，诸如测定特定疗法的功效。此类诊断及检测可通过使抗体与可检测物质偶合来实现，此类可检测物质包括(但不限于)各种酶，诸如(但不限于)辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，诸如(但不限于)链霉抗生物素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；萤光物质，诸如(但不限于)伞酮、萤光素、异硫氰酸萤光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺萤光素、丹磺酰氯或藻红素；发光物质，诸如(但不限于)鲁米诺(luminol)；生物发光物质，诸如(但不限于)萤光素酶、萤光素及水母素；放射性物质，诸如(但不限于)碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In及111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin；及使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发光金属，及非放射性顺磁金属离子。
本发明进一步涵盖与治疗部分结合的抗体及其抗原结合片段的用途。抗体、其抗原结合片段可与治疗部分(诸如细胞毒素，例如细胞生长抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子(例如α-发射体)缀合。细胞毒素或细胞毒性剂包括损害细胞的任何药剂。
此外，抗体、其抗原结合片段可与改变给定生物反应的治疗部分或药物部分缀合。治疗部分或药物部分不应解释为限于经典化学治疗剂。举例而言，药物部分可为具有所需生物活性的蛋白质、肽或多肽。此类蛋白质可包括例如毒素，诸如相思子毒素、蓖麻毒素A、绿脓杆菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白溶酶原活化因子；细胞凋亡剂；抗血管生成剂；或生物反应调节剂，诸如淋巴激素。
另外，抗体可与治疗部分结合，诸如放射性金属离子(诸如213Bi的α发射器)或可用于使放射金属离子(包括(但不限于)131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)与多肽缀合的巨环螯合剂。在一个实施方案中，巨环螯合剂为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)，其可通过连接子分子连接于抗体。此类连接子分子在本领域中通常已知且描述于Denardo等人,1998,Clin Cancer Res.4(10):2483-90；Peterson等人,1999,Bioconjug.Chem.10(4):553-7；及Zimmerman等人,1999,Nucl.Med.Biol.26(8):943-50，各以全文引用的方式并入本文中。
熟知使治疗部分与抗体缀合的技术，参见例如Amon等人,“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(编辑),第243-56页(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery”,Controlled DrugDelivery(第2版),Robinson等人(编辑),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,MonoclonalAntibodies 84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(编辑),第475-506页(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic UseOf Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy,Baldwin等人(编辑),第303-16页(Academic Press 1985)及Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.62:119-58。
抗体亦可附接于固体支撑物，其尤其适用于标靶抗原的免疫分析或纯化。此类固体支撑物包括(但不限于)玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
产生本发明抗体的方法
编码抗体的核酸
本发明提供经实质上纯化的核酸分子，其编码包含上文所述的BMP9结合抗体链的区段或结构域的多肽。一些本发明的核酸包含编码SEQ ID NO:7、27、47、67、87、107、127、147或167任一者中所示的重链可变区的核苷酸序列，和/或编码SEQ ID NO:17、37、57、77、97、117、137、157或177任一者中所示的轻链可变区的核苷酸序列。在一特定实施方案中，核酸分子为表1中鉴别的那些核酸分子。本发明的一些其他核酸分子包含与表1中鉴别的核酸分子的核苷酸序列实质上相同(例如至少65％、80％、95％或99％)的核苷酸序列。当自适当表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够展现BMP9抗原结合能力。
本发明中亦提供编码来自表1中阐述的BMP9结合抗体的重链或轻链的至少一个CDR区且通常所有三个CDR区的多核苷酸。一些其他多核苷酸编码表1中阐述的BMP9结合抗体的重链和/或轻链的所有或实质上所有可变区序列。因为密码简并，所以多种核酸序列将编码免疫球蛋白氨基酸序列中的各者。
本发明的核酸分子可编码抗体的可变区与恒定区。一些本发明的核酸序列包含编码实质上与SEQ ID NO:7、27、47、67、87、107、127、147或167任一者中阐述的成熟重链可变区序列相同(例如至少80％、90％或99％)的成熟重链可变区序列的核苷酸。一些本发明的核酸序列包含编码实质上与SEQ ID NO:17、37、57、77、97、117、137、157及177任一者中阐述的成熟轻链可变区序列相同(例如至少80％、90％或99％)的成熟轻链可变区序列的核苷酸。
多核苷酸序列可通过从头固相DNA合成或通过编码BMP9结合抗体或其结合片段的现有序列(例如如以下实施例中所述的序列)的PCR诱变来产生。核酸的直接化学合成可通过本领域中已知的方法实现，诸如Narang等人,1979,Meth.Enzymol.68:90的磷酸三酯法；Brown等人,Meth.Enzymol.68:109,1979的磷酸二酯法；Beaucage等人,Tetra.Lett.,22:1859,1981的胺基磷酸二乙酯法；及美国专利第4,458,066号的固体支撑物法。通过PCR将突变引入多核苷酸序列中可如以下文献中所述进行：例如PCR Technology:Principles andApplications for DNA Amplification,H.A.Erlich(编辑),Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等人(编辑),Academic Press,San Diego,Calif.,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.19:967,1991；及Eckert等人,PCR Methods and Applications 1:17,1991。
本发明中还提供用于产生上文所述的BMP9结合抗体的表达载体及宿主细胞。各种表达载体可用于表达编码BMP9结合抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体与非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体及系统包括质粒、游离型载体(通常具有表达蛋白质或RNA的表达盒)及人人工染色体(参见例如Harrington等人,Nat Genet.15:345,1997)。举例而言，适用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达BMP9结合多核苷酸及多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B及C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B及C(Invitrogen,San Diego,Calif.)、MPSV载体及本领域中已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。适用病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体；基于SV40、乳头状瘤病毒、HBP埃-巴二氏病毒(HBP Epstein Barr virus)、牛痘病毒载体及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus；SFV)的载体。参见Brent等人,上文；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995；及Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
表达载体的选择视欲表达载体的预定宿主细胞而定。通常，表达载体含有有效连接于编码BMP9结合抗体链抗原结合片段的多核苷酸的启动子及其他调控序列(例如增强子)。在一个实施方案中，诱导性启动子用于防止插入序列在除诱导条件外的条件下表达。诱导性启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。经转化的生物体培养物可在非诱导条件下扩增，而使群体不偏向表达产物为宿主细胞更良好耐受的编码序列。除启动子的外，其他调节元件亦可为BMP9结合抗体链抗原结合片段的有效表达所需的或所要的。这些元件通常包括ATG起始密码子及相邻的核糖体结合位点或其他序列。另外，表达效率可通过包括适于所用细胞系统的增强子来增强(参见例如Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994；及Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。举例而言，SV40增强子或CMV增强子可用于增强哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可提供分泌信号序列位置以与通过插入的BMP9结合抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。更常常，在包涵于载体中的前，插入的BMP9结合抗体序列与信号序列连接。待用于接收编码BMP9结合抗体轻链及重链可变结构域的序列的载体有时还编码恒定区或其部分。此类载体允许可变区与恒定区表达为融合蛋白，从而产生完整抗体及其抗原结合片段。通常，此类恒定区为人恒定区。
含有及表达BMP9结合抗体链的宿主细胞可为原核或真核细胞。大肠杆菌为一种适用于克隆及表达本发明多核苷酸的原核宿主。适用的其他微生物宿主包括杆菌(诸如枯草芽孢杆菌)，及其他肠内菌科(诸如沙门氏菌、沙雷氏菌)，及各种假单胞菌种。在这些原核宿主中，还可产生通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)的表达载体。此外，将存在任何数目的多种熟知启动子，诸如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达，视情况与操纵序列一起，且具有用于起始且完成转录及翻译的核糖体结合位点序列及其类似序列。诸如酵母的其他微生物还可用于表达本发明的BMP9结合多肽。还可使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。
在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞用于表达及产生本发明的BMP9结合多肽。举例而言，其可为表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如如实施例中所述的1D6.C9骨髓瘤杂交瘤纯系)或具有外源性表达载体的哺乳动物细胞系(例如以下例示的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些细胞包括任何正常死亡或正常或异常永生动物或人细胞。举例而言，已研发出能够分泌完整免疫球蛋白的多种适合宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、海拉细胞(HeLa cell)、骨髓瘤细胞系、经转化的B细胞及杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物用于表达多肽的用途一般论述于例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCHPublishers,N.Y.,N.Y.,1987中。哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子及增强子(参见例如Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，及必需的加工信息位点(诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点)，及转录终止子序列。这些表达载体通常含有来源于哺乳动物基因或来源于哺乳动物病毒的启动子。适合启动子可为组成性、细胞类型特异性、阶段特异性和/或可调节或可调控的。适用启动子包括(但不限于)金属硫蛋白启动子、组成性腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导性MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成性MPSV启动子、四环素诱导性CMV启动子(诸如人即刻早期CMV启动子)、组成性CMV启动子及本领域中已知的启动子-增强子组合。
引入含有相关多核苷酸序列的表达载体的方法视细胞宿主的类型而变化。举例而言，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(一般参见Sambrook等人,上文)。其他方法包括例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质粒介导转化、注射及显微注射、冲击法、病毒颗粒(virosome)、免疫脂质体、聚阳离子:核酸结合物、裸DNA、人工病毒粒子、与疱疹病毒结构蛋白VP22融合(Elliot及O'Hare,Cell 88:223,1997)、DNA的药剂增强性吸收及离体转导。就长期高产量生产重组蛋白质而言，通常需要稳定的表达。举例而言，稳定表达BMP9结合抗体链或结合片段的细胞系可使用本发明的表达载体制备，其含有病毒复制起点或内源性表达元件及可选标记物基因。在引入载体之后，可使细胞在交换至选择性培养基之前，于丰富培养基中生长1-2天。可选标记物的目的为赋予用于选择的抗性，且其存在允许成功表达所引入序列的细胞在选择性培养基中生长。抗性、稳定转染的细胞可使用适合于该细胞类型的组织培养技术增殖。
本发明的单克隆抗体的产生
单克隆抗体(mAb)可通过多种技术产生，包括熟知单克隆抗体方法，例如Kohler及Milstein,1975Nature 256:495的标准体细胞杂交技术。产生单克隆抗体的许多技术可采用例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化型。
用于制备杂交瘤的动物系统为鼠类系统。小鼠中的杂交瘤产生为沿用已久的程序。免疫接种方案及分离经免疫接种的脾细胞用于融合的技术为本领域中已知。融合配偶体(例如鼠类骨髓瘤细胞)及融合程序亦为已知。
在某一实施方案中，本发明的抗体为人源化单克隆抗体。本发明的嵌合或人源化抗体及其抗原结合片段可基于如上所述制备的鼠类单克隆抗体的序列制备。编码重链及轻链免疫球蛋白的DNA可自相关鼠类杂交瘤获得且使用标准分子生物学技术进行工程改造以含有非鼠类(例如人)免疫球蛋白序列。举例而言，为产生嵌合抗体，可使用本领域中已知的方法使鼠类可变区与人恒定区连接(参见例如Cabilly等人的美国专利第4,816,567号)。为产生人源化抗体，可使用本领域中已知的方法使鼠类CDR区插入人框架中。参见例如Winter的美国专利第5,225,539号及Queen等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及第6180370号。
在某一实施方案中，本发明的抗体为人单克隆抗体。此类针对BMP9的人单克隆抗体可使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因及转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb小鼠及KM小鼠且在本文中统称为“人Ig小鼠”的小鼠。
HuMAb(Medarex,Inc.)含有编码未重排人重链(μ及γ)及κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座，以及使内源性μ及κ链基因座不活化的靶向突变(参见例如Lonberg等人,1994Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠展现降低的小鼠IgM或K表达，且回应于免疫接种，所引入的人重链及轻链转基因进行类别转换及体细胞突变，以产生高亲和力人IgG-κ单克隆抗体(Lonberg,N.等人,1994上文；Lonberg,N.,1994Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101中评述；Lonberg,N.及Huszar,D.,1995Intern.Rev.Immunol.13:65-93,以及Harding,F.及Lonberg,N.,1995Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMAb小鼠的制备及使用以及此类小鼠所携带的基因组修饰进一步描述于Taylor,L.等人,1992Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人,1993International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3720-3724；Choi等人,1993Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人,1993EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人,1994J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等人,1994International Immunology 579-591；及Fishwild,D.等人,1996Nature Biotechnology 14:845-851，所有文献的内容均以全文引用的方式特定并入本文中。进一步参见美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,789,650号、第5,877,397号、第5,661,016号、第5,814,318号、第5,874,299号及第5,770,429号，均颁予Lonberg及Kay；Surani等人的美国专利第5,545,807号；PCT公开案第WO 92103918号、第WO 93/12227号、第WO 94/25585号、第WO 97113852号、第WO 98/24884号及第WO 99/45962号，均颁予Lonberg及Kay；及Korman等人的PCT公开案第WO 01/14424号。
在另一实施方案中，本发明的人抗体可使用在转基因及转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(诸如携带人重链转基因及人轻链转染色体的小鼠)来产生。此类小鼠(在本文中称为“KM小鼠”)详细描述于Ishida等人的PCT公开案WO 02/43478中。
再此外，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域中可获得且可用于培育本发明的BMP9结合抗体及其抗原结合片段。举例而言，可使用称作Xenomouse(Abgenix,Inc.)的替代转基因系统。此类小鼠描述于例如Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598号、第6,075,181号、第6,114,598号、第6,150,584号及第6,162,963号。
另外，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统可在本领域中获得，且可用于培育本发明的BMP9结合抗体。举例而言，可使用称作“TC小鼠”的携带人重链转染色体与人轻链转染色体的小鼠；此类小鼠描述于Tomizuka等人,2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中。此外，本领域中已描述携带人重链及轻链转染色体的牛(Kuroiwa等人,2002Nature Biotechnology 20:889-894)，且可用于培育本发明的BMP9结合抗体。
本发明的人单克隆抗体还可使用筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。分离人抗体的此类噬菌体展示方法在本领域中已确立或描述于下文实施例中。参见例如Ladner等人的美国专利第5,223,409号、第5,403,484号及第5,571,698号；Dower等人的美国专利第5,427,908号及第5,580,717号；McCafferty等人的美国专利第5,969,108号及第6,172,197号；及Griffiths等人的美国专利第5,885,793号、第6,521,404号、第6,544,731号、第6,555,313号、第6,582,915号及第6,593,081号。
本发明的人单克隆抗体还可使用其中人免疫细胞已重组以使得可在免疫接种时产生人抗体反应的SCID小鼠来制备。此类小鼠描述于例如Wilson等人的美国专利第5,476,996号及第5,698,767号中。
框架或Fc工程改造
本发明的经工程改造的抗体及其抗原结合片段包括其中已对VH和/或VL内的框架残基进行修饰，例如以改善抗体特性的抗体及其抗原结合片段。通常进行此类框架修饰以降低抗体的免疫原性。举例而言，一种方法为使一或多个框架残基“回复突变(backmutate)”成相应胚系序列。更具体而言，已经历体细胞突变的抗体可含有不同于抗体所来源的胚系序列的框架残基。此类残基可通过比较抗体框架序列与抗体所来源于的胚系序列来鉴别。为使框架区序列返回其胚系构型，体细胞突变可通过例如定点诱变“回复突变”成胚系序列。此类“回复突变”抗体还意欲涵盖于本发明内。
框架修饰的另一类型包括使框架区内，或甚至一或多个CDR区内的一或多个残基突变，以移除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。此方法还称为“去免疫”，且进一步详细描述于Carr等人的美国专利公开案第20030153043号中。
除框架区或CDR区内所进行的修饰以外，或取而代之，本发明的抗体可经工程改造以包括在Fc区内的修饰，通常改变抗体之一或多种功能特性，诸如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可经化学修饰(例如可将一或多个化学部分附接于抗体上)，或经修饰以改变其糖基化而再改变该抗体之一或多种功能特性。这些实施方案各进一步详细描述于下文中。Fc区中的残基编号为Kabat EU索引编号。
在一个实施方案中，CH1的铰链区经修饰以使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。此方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利第5,677,425号中。CH1铰链区中的半胱氨酸残基数经改变以例如促进轻链与重链组装或提高或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，抗体的Fc铰链区经突变以减少抗体的生物半衰期。更特定言之，将一或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3域界面区以使得抗体对葡萄球菌蛋白A(Staphylococcyl protein A，SpA)的结合相对于天然Fc铰链结构域SpA结合减弱。此方法进一步详细描述于Ward等人的美国专利第6,165,745号中。
在另一实施方案中，抗体经修饰以延长其生物半衰期。可进行多种方法。举例而言，可引入以下突变中之一或多者：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利第6,277,375号中所述。或者，为延长生物半衰期，抗体可在CH1或CL区内改变以含有获自IgG的Fc区的CH2域的两个环的救助受体结合表位，如Presta等人的美国专利第5,869,046号及第6,121,022号中所述。
在一个实施方案中，Fc区通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变，以改变抗体的效应子功能。举例而言，一或多个氨基酸可经不同氨基酸残基置换以使得该抗体具有改变的针对效应子配体的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应子配体可为例如Fc受体或补体的C1组分。此方法进一步详细描述于例如Winter等人的美国专利第5,624,821号与第5,648,260号中。
在另一实施方案中，选自氨基酸残基的一或多个氨基酸可经不同氨基酸残基置换，以使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法进一步详细描述于Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中。
在另一实施方案中，一或多个氨基酸残基经改变，从而改变抗体固定补体的能力。此方法进一步描述于Bodmer等人的PCT公开案WO 94/29351中。
在另一实施方案中，通过修饰一或多个氨基酸对Fc区进行修饰以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力。此方法进一步描述于Presta的PCT公开案WO 00/42072中。此外，已定位人IgG1上Fc-γRI、Fc-γRII、Fc-γRIII及FcRn的结合位点且已描述结合改善的变体(参见例如Shields,R.L.等人,2001J.Biol.Chen.276:6591-6604)。
在再一实施方案中，抗体的糖基化进行修饰。举例而言，可制得无糖基化抗体(亦即，抗体缺乏糖基化)。糖基化可经改变以例如提高抗体对“抗原”的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一或多个糖基化位点来完成。举例而言，可进行一或多个氨基酸取代，消除一或多个可变区框架糖基化位点，进而消除该位点的糖基化。此类无糖基化可提高抗体对抗原的亲和力。此类方法进一步详细描述于Co等人的美国专利第5,714,350号及第6,350,861号中。
或者或另外，可产生糖基化类型改变的抗体，诸如岩藻糖基残基量减少的低岩藻糖基化抗体或二分GlcNac结构增加的抗体。此类经改变的糖基化模式已证明会提高抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞在本领域中已有描述且可用作表达本发明的重组抗体，从而产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。举例而言，Hang等人的EP 1,176,195描述一种细胞系，其中编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因在功能上破坏，使得此类细胞系中所表达的抗体展现低岩藻糖基化。Presta的PCT公开案WO 03/035835描述一种变异CHO细胞系，LecI3细胞，其将岩藻糖附接于Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，亦使得该宿主细胞中表达的抗体低岩藻糖基化(还参见Shields,R.L.等人,2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开案WO 99/54342描述经工程改造以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰胺基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在经工程改造的细胞系中表达的抗体展现增加的二等分GlcNac结构，引起抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人,1999Nat.Biotech.17:176-180)。
将改变的抗体工程改造的方法
如上文所论述，本文中展示的具有VH及VL序列或全长重链和轻链序列的BMP9结合抗体可用于通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或附接于其的恒定区来产生新BMP9结合抗体。因此，在本发明的另一方面中，本发明的BMP9结合抗体的结构特征用于产生结构上相关的BMP9结合抗体，其保留本发明的抗体及其抗原结合片段的至少一种功能特性，诸如结合于人BMP9且还抑制BMP9的一或多种功能特性(例如抑制BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化、BMP9诱导的Id1诱导、纤维化标记物的BMP9诱导和/或BMP9诱导的肝脏破坏，其中任一分析为本领域中已知，例如抑制Smad1/5/8磷酸化如先后通过HUVEC分析法及蛋白质印迹法(如本文所述)所测量，或先后通过CFSC分析法及cellomics扫描(如本文所述)测量；例如抑制在小鼠HDI模型中，例如如本文所述的小鼠HDI模型中单次注射10mg/kg剂量时Id1的BMP9诱导)。
举例而言，如上文所论述，本发明的抗体及其抗原结合片段的一或多个CDR区或其突变可以重组方式与已知的框架区和/或其他CDR组合，以产生其他以重组方式进行工程改造的本发明的BMP9结合抗体及其抗原结合片段。其他修饰类型包括先前章节中所述的修饰。工程改造方法的起始物质为本文中所提供的VH和/或VL序列中的一或多者，或其一或多个CDR区。为产生经工程改造的抗体，不必实际上制备(亦即表达为蛋白质)具有本文所提供的VH和/或VL序列中的一或多者或其一或多个CDR区的抗体。相反地，序列中所含有的信息用作起始材料以产生来源于原始序列的“第二代”序列，且随后“第二代”序列经制备且表达为蛋白质。
经改变的抗体序列还可通过筛选抗体文库来制备，该抗体文库具有如US20050255552中所述的固定CDR3序列或最小基本结合决定簇以及在CDR1及CDR2序列上的变异。筛选可根据适于自抗体文库筛选抗体的任何筛选技术(诸如噬菌体展示技术)进行。
标准分子生物学技术可用于制备及表达所改变的抗体序列。由改变的抗体序列编码的抗体为保留本文中描述的BMP9结合抗体的一种、一些或全部功能特性的抗体，此类功能特性包括(但不限于)特异性结合于人BMP9蛋白质和/或抑制BMP9的一或多种功能特性(例如抑制BMP9诱导的Smad1/5/8磷酸化、BMP9诱导的Id1诱导、纤维化标记物的BMP9诱导和/或BMP9诱导的肝脏破坏，其中任一分析为本领域中已知，例如抑制Smad1/5/8磷酸化如先后通过HUVEC分析法及蛋白质印迹法(如本文所述)所测量，或先后通过CFSC分析法及cellomics扫描(如本文所述)测量；例如抑制在小鼠HDI模型中，例如如本文所述的小鼠HDI模型中单次注射10mg/kg剂量时Id1的BMP9诱导)。
经改变的抗体的功能特性可使用在本领域中可获得和/或本文所述的标准分析法(诸如阐述于实施例中的分析法(例如ELISA))评估。
在工程改造本发明的抗体及其抗原结合片段的方法的一个实施方案中，突变可随机或选择性地沿着BMP9结合抗体编码序列的全部或部分引入，且可针对如本文所述的结合活性和/或其他功能特性筛选所得经修饰的BMP9结合抗体。突变方法已描述于本领域中。举例而言，Short的PCT公开案WO 02/092780描述使用饱和诱变、合成连接组装或其组合来产生及筛选抗体突变的方法。或者，Lazar等人的PCT公开案WO 03/074679描述使用计算筛选方法使抗体的生理化学特性最佳化的方法。本发明的抗体的表征
本发明的抗体及其抗原结合片段可通过各种功能分析法表征。举例而言，其可通过其抑制BMP9的能力表征。
抗体结合于BMP9的能力可通过直接标记相关抗体来检测，或抗体可未标记且使用本领域中已知的各种夹心分析格式间接检测结合。
在一个实施方案中，本发明的BMP9结合抗体及其抗原结合片段阻断参考BMP9结合抗体与BMP9多肽的结合或与参考BMP9结合抗体竞争结合于BMP9多肽。这些可为上述完全人或人源化BMP9结合抗体。其亦可为与参考抗体结合于相同表位的其他人、小鼠、嵌合或人源化BMP9结合抗体。阻断参考抗体结合或与参考抗体竞争结合的能力表明所测试的BMP9结合抗体结合于与参考抗体所界定的表位相同或类似的表位，或结合于足够靠近参考BMP9结合抗体所结合的表位的表位。此类抗体尤其可共享针对参考抗体所鉴别的有利特性。阻断参考抗体或与参考抗体竞争的能力可通过例如竞争结合分析法测定。使用竞争结合分析法，检验测试抗体抑制参考抗体与诸如BMP9多肽的共同抗原特异性结合的能力。若过量测试抗体实质上抑制参考抗体结合，则测试抗体与参考抗体竞争特异性结合于抗原。实质上抑制意谓测试抗体降低参考抗体的特异性结合通常达至少10％、25％、50％、75％或90％。
存在许多已知的竞争结合分析法可用于评估抗体与参考抗体竞争结合于特定蛋白质，在此情况下，为BMP9。这些分析法包括例如固相直接或间接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析法(EIA)、夹心竞争分析法(参见Stahli等人,Methods inEnzymology 9:242-253,1983)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人,J.Immunol.137:3614-3619,1986)；固相直接标记分析法、固相直接标记夹心分析法(参见Harlow和Lane,上文)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人,Molec.Immunol.25:7-15,1988)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人,Virology 176:546-552,1990)；以及直接标记RIA(Moldenhauer等人,Scand.J.Immunol.32:77-82,1990)。通常，此类分析法涉及使用经纯化的抗原，该抗原结合于带有未经标记的测试BMP9结合抗体及经标记的参考抗体中任一者的固体表面或细胞。竞争性抑制是通过在测试抗体存在下测定结合于固体表面或细胞的标记的量来测量。通常测试抗体过量存在。通过竞争分析法鉴别的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体结合于相同表位的抗体及结合于足够靠近参考抗体所结合的表位的相邻表位以发生空间位阻的抗体。
为确定所选BMP9结合单克隆抗体是否结合于独特表位，可使用市售试剂((例如来自Pierce,Rockford,IL的试剂)对各抗体进行生物素标记。使用未标记单克隆抗体及生物素标记单克隆抗体的竞争研究可使用BMP9多肽包被的ELISA盘进行。生物素标记MAb结合可用链霉素-抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针检测。为确定经纯化的BMP9结合抗体的同种型，可进行同种型ELISA。举例而言，在4℃下可将微量滴定盘的孔包被1μg/ml抗人IgG过夜。在用1％BSA封闭之后，盘与1μg/ml或更少单克隆BMP9结合抗体或经纯化之同种型对照在室温下反应一至两小时。接着可使孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合的探针反应。接着盘显影且分析，从而可确定经纯化的抗体的同种型。
为证实单克隆BMP9结合抗体与表达BMP9多肽的活细胞的结合，可使用流式细胞测量术。简言之，表达BMP9的细胞系(在标准生长条件下生长)可与各种浓度BMP9结合抗体在含有0.1％BSA及10％胎牛血清的PBS中混合，且在37℃下孵育1小时。在洗涤之后，使细胞与萤光素标记的抗人IgG抗体在与初级抗体染色相同的条件下反应。样品可通过FACScan仪器，使用光及侧散射特性在单细胞上闸控来分析。除流式细胞测量术分析法之外或代替流式细胞测量术分析，可利用使用萤光显微法的替代分析法。细胞可如上所述准确染色且通过萤光显微法检验。此方法允许目测个别细胞，但灵敏度可能降低，视抗原密度而定。
本发明的BMP9结合抗体及其抗原结合片段可通过蛋白质印迹法进一步测试与BMP9多肽或抗原片段的反应性。简言之，可制备经纯化的BMP9多肽或融合蛋白或来自表达BMP9的细胞的细胞提取物且进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳之后，分离的抗原转移至硝化纤维膜，用10％胎牛血清封闭，且用待测试的单克隆抗体探测。可使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合且通过BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.)显影。
功能分析法的实施例还描述以下实施例部分中。
预防及治疗用途
本发明提供治疗与BMP9活性增加相关的疾病或病症的方法，其是通过向有需要的个体施用有效量的本发明的任何抗体或其抗原结合片段。在一特定实施方案中，本发明提供一种治疗肝纤维化的方法，其通过向有需要的个体施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。在一特定实施方案中，本发明提供一种治疗肝硬化的方法，其通过向有需要的个体施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。在一特定实施方案中，本发明提供一种治疗门静脉高血压的方法，其通过向有需要的个体施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。
本发明的抗体或其抗原结合片段可尤其用于治疗，例如预防、延迟或逆转例如肝纤维化的肝病的进展。本发明的抗体或其抗原结合片段可尤其用于治疗，例如预防、延迟或逆转肝硬化的进展。本发明的抗体或其抗原结合片段可尤其用于治疗，例如预防、延迟或逆转门静脉高血压的进展。抗体或其抗原结合片段还可与其他疗法组合用于治疗患者的肝纤维化、肝硬化和/或门静脉高血压。本发明的抗体或其抗原结合片段可尤其用于治疗，例如预防、延迟或逆转晚期肝病，例如静脉曲张、黄疸、腹水、肝性脑病、肝肾症候群、自发性细菌性腹膜炎及肝肺部症候群的进展。
在一个实施方案中，本发明提供治疗BMP9相关的疾病或病症的方法，其是通过向有需要的个体施用有效量的本发明的抗体及其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段适用的已知的BMP9相关疾病或病症的实施例包括：血管生成，包括抑制肿瘤血管生成；贫血，包括肾贫血及癌症诱导的贫血；异位骨化疾病；血管疾病，包括动脉粥样硬化、高血压及心脏病。另外，抗体或其抗原结合片段适用的已知的BMP9相关疾病或病症的实施例包括纤维化肝病，包括引起肝硬化和/或门静脉高血压的纤维化肝病，包括由例如以下引起的纤维化肝病：丙型肝炎病毒(“HCV”)感染；乙型肝炎病毒(“HBV”)感染；自体免疫性肝炎；酒精、毒素或药物暴露；肝脏外伤；胆道阻塞；原发性胆汁性肝硬化；阿拉吉欧症候群；慢性肝淤血，包括由心肌疾病或肝流出阻塞引起；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；原发性硬化性胆管炎；血色沉着病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；以及威尔逊氏病。
在一特定实施方案中，本发明提供治疗BMP9相关疾病或病症的方法，其系通过向有需要的个体施用有效量的本发明的抗体及其抗原结合片段，其中该疾病或病症为肝病，例如肝纤维化、肝硬化或门静脉高血压。
在一特定实施方案中，本发明提供治疗肝病，例如肝纤维化、肝硬化或门静脉高血压的方法，其是通过向有需要的个体施用有效量的包含本发明抗体的组合物。在一特定实施方案中，本发明提供治疗肝病，例如肝纤维化或肝硬化的方法，其是通过向有需要的个体施用有效量的包含本发明抗体的组合物。
在一特定实施方案中，本发明提供治疗门静脉高血压的方法。
在一个实施方案中，表1中描述的分离的抗体或其抗原结合片段可结合诸如本文中描述或本领域中已知的治疗方法或程序施用给有需要的患者。此类方法或程序包括以下作为非限制性实施例：与用于乙型或丙型肝炎的抗病毒疗法、消炎剂、抗脂肪变性剂、抗细胞凋亡剂或保肝剂或其他抗纤维化剂共同施用。
举例而言，本发明的抗体或其抗原结合片段，包括表1中描述的那些抗体或其抗原结合片段，可与“标准”抗纤维化剂组合使用。举例而言，抗体或其抗原结合片段可与细胞毒素、免疫抑制剂、放射性毒性剂和/或治疗抗体(亦即连同或联合(亦即免疫结合物))组合施用。本发明涵盖的特定共同治疗剂包括(但不限于)类固醇(例如皮质类固醇，诸如泼尼松(Prednisone)、免疫抑制和/或消炎剂(例如γ干扰素、环磷酰胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲胺喋呤(methotrexate)、青霉胺(penicillamine)、环孢灵、秋水仙碱、抗胸腺细胞球蛋白、麦考酚酸酯(mycophenolate mofetil)及羟基氯奎(hydroxychloroquine))、细胞毒性药物、钙离子通道阻断剂(例如硝苯地平(nifedipine))、血管紧张素转化酶抑制剂(ACE)抑制剂、对胺基苯甲酸(PABA)、二甲亚砜、转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂、白介素-5(IL-5)抑制剂及泛胱天蛋白酶抑制剂。
可与本发明的分离的抗体或其抗原结合片段，包括表1中的抗体或其抗原结合片段组合使用的其他抗纤维化剂包括(但不限于)凝集素(如例如美国专利第7,026,283号中所述，其整个内容以引用的方式并入本文中)以及Wynn等人描述的抗纤维化剂(JournalClin.Invest.第117卷第3期,2007年3月,第524页，其整个内容以引用的方式并入本文中)。举例而言，其他抗纤维化剂及疗法包括(但不限于)各种消炎/免疫抑制/细胞毒性药物(包括秋水仙碱、硫唑嘌呤、环磷酰胺、泼尼松、沙立度胺(thalidomide)、配妥西菲林(pentoxifylline)及茶碱)。TGF-β信号传导改质剂(包括松弛素、SMAD7、HGF及BMP7以及TGF-β1、TGFβRI、TGFβRII、EGR-1及CTGF抑制剂)(例如吡非尼酮(perfenidone)、F-351、F-200及F-573)、细胞因子及细胞因子受体拮抗剂(IL-1β、IL-5、IL-6、IL-13、IL-21、IL-4R、IL-13Rβ1、GM-CSF、TNF-α、抑瘤素M、WISP-1及PDGF的抑制剂)、细胞因子及趋化因子(IFN-γ、IFN-α/β、IL-12、IL-10、HGF、CXCL10及CXCL11)、趋化因子拮抗剂(CXCL1、CXCL2、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL6、CCL17及CCL18的抑制剂)、趋化因子受体拮抗剂(CCR2、CCR3、CCR5、CCR7、CXCR2及CXCR4的抑制剂)、TLR拮抗剂(TLR3、TLR4及TLR9的抑制剂)、血管生成拮抗剂(VEGF特异性抗体及腺苷脱胺酶替换疗法)、抗高血压药(β阻断剂及ANG II、ACE及醛固酮的抑制剂)、血管活性物质(ET-1受体拮抗剂及bosetan)、合成及加工胶原蛋白的酶的抑制剂(脯胺酰基羟化酶的抑制剂)、B细胞拮抗剂(利妥昔单抗)、整合素/粘附分子拮抗剂(阻断α1β1及αvβ6整合素的分子以及整合素连接激酶的抑制剂及对ICAM-1及VCAM-1具有特异性的抗体)、靶向肌纤维母细胞的促细胞凋亡药物、MMP抑制剂(MMP2、MMP9及MMP12的抑制剂)及TIMP抑制剂(对TIMP-1具有特异性的抗体)。
本发明的抗体或其抗原结合片段，包括表1中描述的抗体或其抗原结合片段，可与“标准”抗糖尿病剂，例如二甲双胍(metformin)组合使用，以治疗与糖尿病相关的NASH纤维化。可与本发明的抗体或其抗原结合片段，包括表1中描述的抗体或其抗原结合片段组合使用的其他抗糖尿病剂为本领域中已知，且包括磺酰脲(例如格列本脲(glyburide)、格列吡嗪(glipizide)及格列美脲(glimepiride)、格列奈类(meglitinide)(例如瑞格列奈(repaglinide)及那格列奈(nateglinide))、噻唑啶二酮(例如罗格列酮(rosiglitazone)及吡格列酮(pioglitazone))、DPP-4抑制剂(例如西他列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)及利格列汀(linagliptin))、GLP-1受体促效剂(例如艾塞那肽(exenatide)及利拉鲁肽(liraglutide))、SGLT2抑制剂(例如卡格列净(canagliflozin)及达格列净(dapagliflozin))及胰岛素。
本发明的抗体或其抗原结合片段，包括表1中描述的抗体或其抗原结合片段，可与“标准”抗病毒剂，例如HBV及HCV抗病毒剂组合使用，以治疗HBV和/或HCV相关的纤维化。可与本发明的抗体或其抗原结合片段，包括表1中描述的抗体或其抗原结合片段组合使用的其他抗病毒剂为本领域中已知，且包括干扰素(例如IFNα-2b、IFNα-2a、PEG-内含子及IFNalfacon-1)、与利巴韦林组合的干扰素、蛋白酶抑制剂(例如利帕斯韦(ledipasvir)、索非布韦(sofosbuvir)、博赛普韦(boceprivir)或替拉瑞韦、替诺福韦、达拉斯韦(daclatsivir)、西咪匹韦(simeprevir)、莱达普韦(ledasprevir))及其他抗病毒剂(例如拉米夫定(lamivudine)、阿德福韦(adefovir)、替比夫定(telbivudine)及恩替卡韦(entecavir))。
本发明的抗体或其抗原结合片段，包括表1中描述的抗体或其抗原结合片段，可与“标准”消炎剂，例如皮质类固醇、GFT-505及赛你维可(cenicriviroc)以及其组合进行组合使用。
本发明的抗体或其抗原结合片段，包括表1中描述的抗体或其抗原结合片段，可与“标准”抗脂肪变性剂，例如维生素E、吡格列酮、二甲双胍、奥贝胆酸以及其组合进行组合使用。
本发明的抗体或其抗原结合片段，包括表1中描述的抗体或其抗原结合片段，可与“标准”抗细胞凋亡或保肝剂，例如奥贝胆酸、GFT-505、GR-MD-02以及其组合进行组合使用。
如熟练技术人员所了解，涉及本发明的抗体或其抗原结合片段，包括表1中描述的抗体或其抗原结合片段的组合疗法可包括涉及多类上述药剂的组合疗法，例如可涉及一或多种抗病毒剂及一或多种其他抗纤维化剂。
当本发明的治疗剂连同另一药剂或其他药剂施用时，两种(或更多种)可按任何次序依序或同时施用。在一些方面中，向还接受使用第二药剂或方法的疗法的个体施用本发明的抗体。在其他方面中，结合分子与手术治疗结合施用。
用于与BMP9结合抗体组合治疗的适合药剂包括本领域中已知的抑制或降低BMP9的表达、水平、稳定性和/或活性的药剂。此类药剂包括针对BMP9的抗体、siRNA、可溶性BMP9受体、蛋白质及小分子。
本领域中已知针对BMP9的各种抗体，尤其包括文献中描述或可购得的那些抗体，例如单克隆小鼠IgG2b纯系360107(R&D systems MAB3209)及例如US2014/0056902中描述的那些抗体。
针对BMP9的各种siRNA为本领域中已知。
已知其他BMP9抑制剂，包括(例如)可溶性BMP受体，诸如ALKI的可溶性片段及ActRIIb。这些任一者可与本文所揭示的任何抗体或其抗原结合片段组合使用。
组合疗法方案可为累加的，或其可产生协同结果(例如BMP9活性的降低超过对两种药剂组合使用所预期的)。在一个实施方案中，本发明提供一种用本发明的BMP9结合抗体及如上所述的抗纤维化剂或方法预防和/或治疗肝病，例如纤维化、门静脉高血压或肝硬化，或如上所述的另一BMP9相关疾病的组合疗法。
诊断用途
在一个方面，本发明涵盖用于在生物样品(例如血液、血清、细胞、组织)或个体罹患疾病或病症或处于出现与肝病相关的病症，例如肝纤维化、肝硬化或门静脉高血压风险下的情况下测定BMP9和/或核酸表达以及BMP9功能的诊断分析法。
诸如竞争分析法的诊断分析法依赖于标记类似物(“示踪剂”)与测试样品分析物竞争共同结合配偶体上有限数目结合位点的能力。结合配偶体一般在竞争之前或在竞争之后不溶解，且接着结合于结合配偶体的示踪剂及分析物与未结合的示踪剂及分析物分离。此分离通过倾析(其中结合配偶体预先不溶)或通过离心(其中结合配偶体在竞争反应之后沉淀)实现。测试样品分析物的量与如通过标记物质的量所测量的结合示踪剂的量成反比。制备使用已知量的分析物的剂量反应曲线且与测试结果比较以定量确定存在于测试样品中的分析物的量。当酶用作可检测标记物时，这些分析法称为ELISA系统。在此形式的分析法中，抗体与BMP9结合抗体之间的竞争结合使得结合BMP9、优选本发明的BMP9表位为血清样品中抗体，最尤其是血清样品中的中和抗体的量度。
所述分析法之一重要优点为直接测量中和抗体(亦即干扰BMP9、特别表位结合的抗体)。此类分析法，尤其呈ELISA测试形式的分析法在临床环境及常规血液筛选中具有大量应用。
在临床诊断或监测患有与肝病相关的病症(例如肝纤维化、肝硬化或门静脉高血压)的患者时，检测到与来自正常个体的对应生物样品中含量相比，例如肝脏中BMP9蛋白质或mRNA的含量升高表明患者患有与肝病(例如肝纤维化、肝硬化或门静脉高血压)相关的病症。
体内诊断或成像描述于US2006/0067935中。简言之，这些方法一般包含向患者施用或引入诊断有效量的有效附接于非侵袭性方法可检测的标记物或标记的BMP9结合分子。允许抗体-标记物缀合物足够时间定位及结合于BMP9。接着患者暴露于检测装置，以鉴别可检测标记物，因此形成患者组织中BMP9结合分子位置的影像。BMP9结合抗体或其抗原结合片段的存在通过测定抗体标记物是否结合于组织组分而检测。检测到与无肝病(例如肝纤维化、肝硬化或门静脉高血压)的正常个体相比，BMP9蛋白质或蛋白质组合的含量增加表明易患和/或患上与肝病(例如肝纤维化、肝硬化或门静脉高血压)相关的病症。本发明的这些方面还用于组织成像法及组合诊断与治疗方法。
本发明还涉及预测医药领域，其中诊断分析法、预后分析法、药物基因组学及监测临床试验用于达成预后(预测)目的，以藉此预防性治疗个体。
本发明还提供预后(或预测)分析法用于确定个体是否处于发展与BMP9路径活性失调相关的病症的风险下。举例而言，BMP9基因的突变可在生物样品中分析。此类分析可用于达成预后或预测目的，以藉此在发作特征为BMP9、核酸表达或活性或与其相关的病症前预防性治疗个体。
本发明的另一方面提供用于测定个体中BMP9核酸表达或BMP9活性的方法，以藉此为该个体选择适当治疗或预防剂(在本文中称作“药物基因组学”)。药物基因组学允许基于个体的基因型(例如进行检验以确定个体对特定药剂起反应的能力的个体基因型)选择药剂(例如药物)用于治疗性或预防性治疗个体。
本发明的另一方面提供一种在临床试验中监测药剂(例如药物)对BMP9的表达或活性的影响的方法。
药物组合物
本发明提供包含BMP9结合抗体或其结合片段与可药用的载体一起调配的药物组合物。组合物可另外含有一或多种适合于治疗或预防BMP9相关疾病(例如肝病，例如肝纤维化、肝硬化或门静脉高血压)的其他治疗剂。医药载体增强组合物或使其稳定，或可促进组合物的制备。可药用的载体包括生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂及其类似物。
本发明的药物组合物可通过本领域中已知的多种方法施用。投药途径和/或模式视所要结果而变化。施用可为静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下，或靠近目标部位施用。可药用的载体应适合于静脉内、肌肉内、皮下、非经肠、脊髓或表皮投药(例如通过注射或输液)。视投药途径而定，活性化合物(亦即抗体、双特异性及多特异性分子)可用保护化合物不受酸作用及可使化合物失活的其他天然条件影响的物质涂布。
组合物应为无菌及流体。举例而言，可通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过在分散液的情况下维持必要粒度及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，组合物中优选包括等张剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇或山梨糖醇)及氯化钠。通过使组合物中包括延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝或明胶)，可实现可注射组合物的长期吸收。
本发明的药物组合物可根据本领域中熟知且常规实施的方法制备。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,第20版,2000；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。药物组合物优选在GMP条件下制造。通常，在本发明的药物组合物中采用治疗上有效剂量或有作用剂量的BMP9结合抗体。BMP9结合抗体通过本领域技术人员已知的熟知方法调配成可药用剂型。调节剂量方案以得到最佳所需反应(例如治疗反应)。举例而言，可施用单一药团，可随时间施用若干个分次剂量，或可依治疗情况的紧急性所指示按比例减少或增加剂量。就易投药性及剂量的均一性而言，将非经肠组合物调配成单位剂型尤其有利。如本文所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗的个体的实体离散单元；各单元含有经计算以产生所需治疗效应的预定量活性化合物，与所需医药载体结合。
可改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量，以便获得在对患者无不当毒性的情况下有效实现特定患者、组合物及施用模式的所需治疗反应的活性成分的量。所选剂量视多种药物动力学因素而定，此类因素包括所采用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、整体健康情况及之前病史及其类似因素。
医师或兽医可以低于达成所需治疗作用所需的水准的水平开始药物组合物中所用的本发明的抗体或抗体片段的剂量，且逐渐增加剂量直至达成所需作用为止。一般而言，本发明的组合物有效治疗本文中描述的超敏性发炎性病症的剂量视许多不同因素而变化，此类因素包括施用方式、目标部位、患者的生理状态、患者为人还是动物、施用的其他药物治疗及治疗为预防还是治疗。需要滴定治疗剂量以使安全性及功效达最佳。对于全身性施用抗体，剂量范围为每公斤宿主体重约0.0001mg至100mg，且更通常为每公斤宿主体重0.01mg至15mg。例示性治疗方案需要每两周全身施用一次或一月一次或每3至6个月一次。对于玻璃体内施用抗体，剂量在约0.0001mg至约10mg范围内。例示性治疗方案需要每两周全身施用一次或一月一次或每3至6个月一次。
抗体通常多次施用。单次剂量之间的间隔可为数周、数月或数年。如测量患者中BMP9结合抗体的血液含量所指示，间隔还可为不规则的。在全身性投药的一些方法中，调整剂量以达成1至1000μg/ml的血浆抗体浓度且在一些方法中为25μg/ml至500μg/ml。或者，抗体可以持续释放制剂的形式施用，在此情况下，施用频率较低。剂量及频率视患者中抗体的半衰期变化。一般而言，人源化抗体显示的半衰期比嵌合抗体及非人抗体的半衰期长。施用的剂量及频率可视治疗为预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，在长时间段内，以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高的剂量，直至疾病的进展降低或终止，且优选直至患者展示疾病的症状部分或完全改善。此后，可向患者施用预防性方案。
实施例
提供以下实施例以进一步说明本发明，但不限制其范畴。本发明的其他变体对于本领域普通技术人员而言显而易见且涵盖于随附权利要求中。
实施例1：重组BMP9的产生
将编码全长hBMP9蛋白质的DNA序列克隆至表达载体中且通过DNA测序来证实。将hBMP9构建体瞬时转染至293F细胞系中且将此类细胞针对hBMP9蛋白质产量进一步最佳化。最终产量以10L规模及多轮进行。当细胞存活率>80％时收集最终收获物。最终收获物中的细胞碎片通过离心及过滤制程去除。标靶hBMP9蛋白质通过使用阳离子交换层析及阴离子交换层析来纯化。超过滤用于浓缩hBMP9蛋白质及交换缓冲液。蛋白质的定量通过罗氏法(Lowry method)测定。经纯化的hBMP9蛋白质通过SDS-PAGE、蛋白质印迹法及HPLC分析。
实施例2：通过杂交瘤技术产生抗BMP9抗体
小鼠免疫接种及融合
通过重复程序，对十只BALB/c小鼠进行重组蛋白人BMP9(huBMP9)免疫接种，该程序涉及皮下或腹膜间注射25-50μg huBMP9 4次。收获经免疫接种小鼠的脾脏，且分离的脾细胞与骨髓瘤细胞(P3Ag8.653细胞系)融合，产生杂交瘤克隆。以结合ELISA为初级筛选分析法，测试来自杂交瘤克隆的上清液，以鉴别结合于BMP9的阳性克隆。接着在阻断性ELISA中测试自初级筛选结合分析法鉴别的阳性克隆的上清液，以鉴别可抑制BMP9与其受体之间的相互作用的阳性克隆。使用四种不同重组BMP9受体：人Alk1-Fc(R&D system，370-AL-100)；人BMPRII-Fc(R&D system，811-BR-100)；人ActRIIA-Fc(R&D system，340-R2-100)；人ActRIIB-Fc(R&D system)。
基于如Biacore所检验，以高亲和力结合huBMP9的能力，且针对阻断特异性BMP9受体相互作用的能力，选择两个克隆用于人源化。2B11G2抑制人BMP9及人Alk1的结合，而4E10D7抗体可抑制人BMP9及人BMPRII的结合。因此，2B11G2归类为I型受体相互作用的抑制剂，而4E10D7归类为II型受体相互作用的抑制剂。
小鼠杂交瘤抗体2B11G2及4E10D7的结合特性及序列分别展示在表2及3中。
表2.通过Biacore测定，小鼠杂交瘤抗BMP9单克隆抗体的动力学参数。动力学数据与二价模型拟合且参数Ka1及Kd1用于确定KD。
表3.结合人BMP9的鼠类抗体的实施例
2B11G2人源化抗体的设计
通过CDR移植，设计来源于2B11G2小鼠抗体的人源化抗体。简言之，通过将非人动物抗体(称作“供体”)的VH CDR或VL CDR的氨基酸序列移植至人抗体(称作“接受体”)的VH或VL的框架区中来产生。
选择人胚系序列1-46(VBASE VH1 1-46；IMGT IGHV1-46*01)作为人源化2B11G2VH的接受体框架；将2B11G2VH的CDR移植至接受体框架中，以产生2B11G2VH的第一人源化序列，称为2B11G2_VH1_Hz0。使重链框架中的位置71、73、78、94(Chothia编号协定)突变成对应小鼠供体残基，以产生序列2B11G2_VH1_Hz1。2B11G2_VH1_Hz0及2B11G2_VH1_Hz1的CDR2中的潜在翻译后修饰(PTM)NG位点通过分别在序列2B11G2_VH1_Hz0_N55Q及序列2B11G2_VH1_Hz1_N55Q中将NG取代成QG来移除。
选择人胚系序列A10(VBASE VKVI A10；IMGT IGKV6-21*01)作为人源化2B11G2VL的接受体框架；将2B11G2VL的CDR移植至接受体框架中，以产生2B11G2VL的第一人源化序列，称为2B11G2_VK6_Hz0。由于供体与接受体序列之间框架高度保守，故不引入额外框架突变。
通过密码子最佳化产生每个人源化序列的核苷酸序列。
设计多个人源化VH序列及多个人源化VL序列；且可通过将每个人源化VH序列与每个人源化VL序列组合来产生呈IgG1或Fab的一组人源化抗体。VH序列及VL序列运载在不同质粒中，因此重链质粒与轻链质粒共转染至表达宿主细胞(亦即HEK293-6E细胞)中以产生特异性抗体。在此人源化研究中，嵌合或人源化抗体以IgG1形式产生。
4E10D7人源化抗体的设计
来源于4E10D7小鼠抗体的人源化抗体通过如上所述的CDR移植设计。
选择人胚系序列1-02(VBASE VH1 1-02；IMGT IGHV1-2*02)作为人源化4E10D7VH的接受体框架；将4E10D7VH的CDR移植至接受体框架中，以产生4E10D7VH的第一人源化序列，称为4E10D7_VH1_Hz0。使重链框架中的位置71、73、94(Chothia编号协定)突变成对应小鼠供体残基，以产生序列4E10D7_VH1_Hz1。4E10D7_VH1_Hz1的CDR2中的潜在翻译后修饰(PTM)NG位点通过在序列4E10D7_VH1_Hz1_N55Q中将NG取代成QG来移除。
选择人胚系序列L25(VBASE VKIII L25；IMGT IGKV3/OR2-268*01)作为人源化4E10D7VL的接受体框架；将4E10D7VL的CDR移植至接受体框架中，以产生4E10D7VL的第一人源化序列，称为4E10D7_VK3_Hz0。使轻链框架中的位置4、36、46、83及87(Chothia编号协定)突变成对应小鼠残基，以产生称为4E10D7_VK3_Hz3的人源化序列。
人源化VH及VL序列运载在不同质粒中，且宿主细胞(亦即HEK293-6E细胞)用一种重链质粒及一种轻链质粒共转染，以产生特异性IgG1抗体。
人源化抗体的产生及纯化
将HEK293-6E细胞在补充有0.1％Pluronic F68(Invitrogen，24040-032)及4mML-GlutaMAX(Invitrogen，35050-061)的F17培养基(Invitrogen，0050092DK)中培养。在转染前一天细胞以1×106/ml的密度处理，且自培养基移除抗生素。在转染当天，首先测量细胞密度及存活率以确保密度应在1.5-2.0×106个细胞/毫升内且存活率应超过95％。质粒DNA的用量通过细胞体积计算，总质粒DNA量通常为每1×106个细胞1μg用于抗体表达。将重链(HC)质粒及轻链(LC)质粒(推荐的HC:LC比率为IgG表达1:1.5及Fab表达1.5:1)添加至补充有转染增强子293Expression MAX-1(ACRO Biosystems，Exp-711)的灭菌水(Invitrogen，10977-015)中，其中增强子:DNA的比率＝1-4μL:10μg，因此接着添加1mg/ml转染试剂PEI(聚乙烯亚胺，线性，25Da,Polysciences,24885)，PEI:DNA的比率＝4:1。接着混合物轻缓地添加至细胞中。在转染之后24小时将胰蛋白胨(胰蛋白胨N1，Organotechnie,TekniScience Inc.,19553)添加至细胞中，最终浓度为0.5％。经转染的细胞一般在转染之后5至7天以60％-80％存活率收获。
纯化制程通过AKTAxpress系统(GE Healthcare)进行。简言之，收获的细胞在10000G下离心10分钟，且上清液通过0.22μm膜过滤以移除小细胞碎片。推荐添加相同体积的DPBS(GIBCO，A12586-01)至上清液中以提高捕捉效率。为纯化IgG，MabSelect柱(GEHealthcare)连接至AKTAxpress仪器，且为纯化Fab，使用KappaSelect柱(GE Healthcare)。在负载样品前将柱用10CV(柱体积)操作缓冲液(DPBS)平衡。在负载样品之后，将柱用8CVDPBS洗涤。通过柠檬酸洗脱缓冲液梯度(50mM柠檬酸钠、140mM NaCl，pH 2.5)自柱洗脱抗体样品，且接着收集至具有中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH9.0)的深孔盘(Thermo ScientificNunc Plate，目录号THM#278743)中。自此类孔汇集抗体样品且接着在PBS中透析或通过Amicon离心管过滤来处理。
人源化变体的亲和力成熟
分析基于4E10D7及基于2B11G2的人源化抗体的结合亲和力，且选择来源于各鼠类抗体的单个人源化变体以通过亲和力成熟，通过合理设计与跨越结合“热点”及CDR区的诱变，使用酵母展示库进一步优化。分析变异抗体的结合亲和力。
基于亲本4E10D7衍生的人源化抗体hz45设计总共21个重链变体(称为4E10D7_AM_H_01至4E10D7_AM_H_21)，而在所有进一步变体中使用来自4E10D7-hz45的轻链(称为4E10D7_AM_L_00)。
基于亲本2B11G2衍生的人源化抗体hz42或hz52VH，设计总共50个重链变体(称为2B11G2_AM_H_01至2B11G2_AM_H_50)，且基于亲本2B11G2衍生的人源化抗体hz52VL，设计5个轻链变体(称为2B11G2_AM_L_01至2B11G2_AM_L_05)。
展示亲和力提高的具有突变的链以IgG或Fab格式构筑。所衍生的抗体随后使用来自重链及轻链标识符的字尾重新命名。举例而言，包含4E10D7_AM_H_01重链及4E10D7_AM_L_00轻链的IgG重新命名为AM0100；包含4E10D7_AM_H_19重链及4E10D7_AM_L_00轻链的IgG重新命名为AM1900；包含2B11G2_AM_H_44重链及2B11G2_AM_05轻链的IgG重新命名为AM4405。
使用本文中描述的BRE-Luc分析法，分析构筑抗体与huBMP9的结合，及对BMP9信号传导的抑制。
实施例3：通过噬菌体展示技术产生抗BMP9抗体
与上述通过小鼠杂交瘤及人源化程序鉴别抗BMP9抗体的工作平行，噬菌体展示用于鉴别完全人抗BMP9抗体。简言之，为选择识别人BMP9的抗体，采用多个淘选策略。针对人BMP9蛋白质的治疗抗体通过使用市售噬菌体展示文库MorphoSys HuCAL文库作为抗体变异蛋白质来源，选择具有高结合亲和力的克隆来产生。噬菌粒文库系基于概念(Knappik等人,(2000)J Mol Biol 296:57-86)且采用技术用于在噬菌体表面上展示Fab(Lohning的WO01/05950)。为增加抗体结合亲和力，同时维持文库多样性，将溶液与固相淘选的第二轮输出输入RapMATTM制程，同时进入全细胞及差异全细胞淘选策略的第三轮输出(Prassler等人,(2009)Immunotherapy；1:571-583)。
为表达全长IgG，重链(VH)及轻链(VL)的可变域片段自Fab表达载体亚克隆至包含人恒定域的适当表达载体中。真核HKB11细胞经编码IgG的重链与轻链的表达载体DNA转染。
分析抗体的结合亲和力、特异性及对BMP9与其受体的结合的抑制。抗BMP9抗体分成三组：I型抑制剂(能够抑制ALKI与BMP9的结合)、II型抑制剂(能够抑制ActRIIB和/或BMPRII的结合)或I型+II型抑制剂(能够抑制ALKI与ActRIIB和/或BMPRII的结合)。
展示对huBMP9的最高亲和力的抗体进行进一步工程改造。使用基于PCR的策略进行工程改造过程。在通过重叠延伸PCR合成及组装之后，将再次工程改造的VH及VL片段亚克隆至适当载体主链中，用于随后Fab或IgG表达。工程改造过程涉及以下方面：胚系、移除PTM位点和/或密码子最佳化。
实施例4：BMP受体抑制分析法
阻断性ELISA用于鉴别可抑制BMP9与其受体之间的相互作用的阳性克隆。可使用四种不同重组BMP9受体：人Alk1-Fc(R&D system，370-AL-100)；人BMPRII-Fc(R&D system，811-BR-100)；人ActRIIA-Fc(R&D system，340-R2-100)；人ActRIIB-Fc(R&D system)。
抗体样品对特定配体/受体组合的阻断活性由ELISA测量。简言之，在4℃下将50μl浓度为包被缓冲液(PBS)中1μg/ml的受体添加至96孔ELISA盘中过夜，接着用PBST洗涤一次。ELISA盘用各孔中200μl封闭缓冲液(含有1％BSA的PBST)封闭且接着在室温(RT)下孵育1小时，接着用PBST洗涤3次。将稀释的抗体样品与生物素标记的人BMP9(1μg/ml bio-hBMP9)混合且于室温下孵育45分钟。将抗体与bio-hBMP9的混合物以50微升/孔添加至盘中，且接着于室温下孵育30分钟，接着用PBST洗涤3次。将50μl Poly-HRP链霉抗生物素(Thermofisher，21140)添加至盘各孔中，且于室温下孵育30分钟，接着用PBST洗涤5次。最后，将50μl TMB试剂(Invitrogen 002023)及50μl 1N HCl(Invitrogen SS01100)添加至各孔中，以终止反应。各孔的吸收度在450nm下读取以得到读数OD450。若抗体以IC50<1nM抑制Alk1与BMP9的结合，则其表征为“I型”抑制剂。若抗体以IC50<1nM抑制ActRIIA、ActRIIB和/或BMPRII与BMP9的结合，则其表征为“II型”抑制剂。若抗体以IC50<1nM抑制Alk1与BMP9的结合且以IC50<1nM抑制ActRIIA、ActRIIB和/或BMPRII与BMP9的结合，则其表征为“I型+II型”。在另一分析法中测量各BMP受体与人BMP9的结合的抑制。
实施例5：抗BMP9抗体对BMP9的结合亲和力
溶液平衡滴定(SET)分析法允许测定紧密结合剂的Fab-抗原相互作用亲和力(KD)(参见Friquet,B.,Chaffotte,A.F.,Djavadi-Ohaniance,L.,及Goldberg,M.E.(1985).Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibodycomplexes by enzyme-linked immunosorbent assay.J Immnunol Meth 77,305-319；以引用的方式并入本文中)。此项技术不需要任一相互作用配偶体的固定或标记，且适合于强相互作用(pM至低nM范围)。简言之，恒定浓度的Fab(浓度处于或低于预期K)的混合物与适合浓度范围内的抗原一起共同孵育，直至达到平衡。游离Fab结合位点的量通过将混合物转移在抗原包被的盘上且简单孵育来测定。因此，游离Fab结合于盘且在洗涤步骤以移除Fab-抗原复合物之后用检测抗体检测。所产生的信号相对于抗原浓度绘制；且通过非线性曲线拟合准确测定KD。
在孵育缓冲液(含有0.5％BSA(Sigma Cat#A7906-500G)及0.02％Tween-20(VWRCat#437082Q)的PBS(Teknova Cat#P0195))中制备抗原(人BMP9(GD-43-KS00)；食蟹猴BMP9、大鼠BMP9(R&D Systems 5566-BP)或小鼠BMP9(iPROT101715))的22个连续2n稀释液。添加恒定浓度的Fab。60μl体积的各抗原:Fab混合物一式两份分布至384孔聚丙烯微量滴定盘(PP MTP，Greiner Cat#781280)中。孵育缓冲液充当阴性对照且不含抗原的样品充当阳性对照(Bmax)。将盘密封且在室温(RT)下孵育过夜(O/N)。
将384孔标准MSD阵列盘(Meso Scale Discovery Cat#L21XA)涂上作为捕捉剂的在PBS中稀释的30微升/孔人BMP9且在4℃下孵育过夜。在用70微升/孔洗涤缓冲液(具有0.05％Tween-20的TBS(Teknova Cat#T1680))洗涤3次之后，在室温下将盘用50微升/孔封闭缓冲液(具有5％BSA的PBS)封闭1小时。在洗涤之后，将30微升/孔体积的抗原:Fab混合物自PP MTP转移至经包被的MSD盘中且于室温下孵育20分钟。在额外洗涤步骤之后，将在孵育缓冲液中1:1000稀释的30μl检测抗体(结合MSD SULFO-TAG NHS酯(Meso Scale DiscoveryCat#R91AN-1)的山羊抗人Fab特异性抗体(Jackson Immuno Research Cat#109-005-097))添加至各孔中且于室温下孵育30分钟。洗涤MSD盘且添加35微升/孔读取缓冲液(MSD读取缓冲液T 4x，Meso Scale Discovery Cat#R92TC-1)且接着于室温下孵育5分钟。用MSDSECTOR Imager 6000测量ECL信号。根据Fab的1:1拟合模型(根据Piehler等人,1997)，用XLfit(IDBS)软件评估资料。
实施例6：抗BMP9抗体的结合特异性
证实抗BMP9抗体对BMP9的结合亲和力，且通过SPR，通过Biacore T200仪器(Biacore,GE healthcare)测定对其他抗原的亲和力(及特异性)。使用标准EDC-NHS胺偶合化学将抗原(重组人(rh)BMP9或rhBMP2(R&D Cat#355-BM-010)、rhBMP7(R&D Cat#354-BP-010)或rhBMP10(R&D Cat#2926-BP-025))固定在CM5传感器芯片(Biacore,GE Healthcare)上，以达到特定表面积密度(rhBMP9为50RU，rhBMP2为800RU，rhBMP7为580RU，rhBMP10为390RU)。操作缓冲液为30μl/min的HBS-EP+。使用2倍连续稀释的六个不同Fab浓度(31.25nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM、1000nM)进行动力学测量。用KINJECT以30μl/min的流速测量样品，注射时间为180s且解离时间为1500s。在各循环之后，用10mM甘氨酸pH 1.5(rhBMP9)或50mM NaOH(rhBMP2、rhBMP7或rhBMP10)使传感器芯片再生以移除结合分析物。原始数据使用Biacore T200评估软件(Biacore,GE healthcare)拟合成1:1结合模型以确定kon及koff速率常数且接着计算KD。
本领域普通技术人员将了解其他方法可用于测量抗体对BMP9的亲和力，包括例如ELISA或Octet(Forte-Bio Octet)。虽然预期各项技术产生实质上类似的结果，但认为如通过MSD-SET所测量的结合亲和力及KD对KD小于约10nM的抗体而言为决定性的。
实施例7：抗BMP9抗体的体外活性
使用稳定表达BRE(BMP9反应元件)驱动的萤火虫萤光素酶的HEK293T ID-BRE2-luc细胞，分析抗体抑制BMP9诱导的信号传导的能力。
经稳定转染的HEK293T ID-BRE2-luc细胞在无抗生素的杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM，高葡萄糖；含有GlutaMAXTM-II、4.5g/l葡萄糖，但无丙酮酸钠的DMEM；Gibco，#31965)及10％热失活胎牛血清(FBS，PAN#P30-1502，通过在56℃下孵育30分钟热失活)中生长。细胞在37℃下在5％ CO2氛围中孵育。为继代培养，在用1x DPBS(无CaCl2及MgCl2；Gibco，#14190)洗涤一次之后，细胞用Accutase溶液(PAA，#L11-007)分离。细胞一周两次继代培养。作为选择抗生素，灭瘟素(Blasticidin S HCL)(Invitrogen，#R210-01)以10μg/ml的最终浓度新鲜添加至继代培养的细胞中。
对于报导基因分析法，使用Accutase分离细胞，且于测量培养基(不具有选择抗生素的培养基)中以每孔1×104个细胞的密度接种在384孔平底白色分析盘(BectonDickinson Labware，#35-3988)中且在37℃及5％CO2下孵育过夜。次日，在37℃下纯化的IgG与抗原(最终浓度：300pM)一起预孵育30分钟。对于人BMP9诱导的活性，使用重组人BMP9复合物(200ng/ml，通过AutekBio FTZ Inc.纯化)；对于人BMP2诱导的活性，使用重组人BMP2(100ng/ml，R&D#355-BM-010/CF)；对于人BMP7诱导的活性，使用重组人BMP7(400ng/ml，R&D#354-BP-010/CF)；对于大鼠BMP9诱导的活性，在接种在90mm培养皿中的293T细胞中过表达6μg pcDNA3.1-大鼠BMP9质粒，且48小时后，收集培养基作为大鼠BMP9条件培养基，且使用1/16稀释的大鼠BMP9条件培养基。将预先孵育的抗体-抗原混合物添加至细胞中且刺激后18小时，使细胞裂解且根据制造商方案，通过添加Bright-GloTM(Bright-GloTM萤光素酶分析系统；Promega；#E2620)至细胞中，检测萤光素酶活性。在Tecan读数器(整合时间：250ms；减弱：无；移动与整合之间的时间：3ms)中测量发光。
实施例8：Smad1/5/8磷酸化分析法
对于HUVEC细胞分析法，HUVEC细胞购自Allcells且在HUVEC培养基(Allcells，H-004)中培养。将6孔培养盘以3×105个细胞/孔接种且在培养基中培养。接着细胞在37℃与5％CO2下孵育过夜。向细胞中添加于DMEM加0.5％FBS中的BMP9抗体，有或无BMP9(重组人BMP9复合物，如上所述)。在1小时之后，收获细胞且在95℃下在SDS样品缓冲液中变性10分钟。蛋白质通过SDS-PAGE分离且点印迹至硝化纤维膜(iBlot Gene Transfer Stacks，LifeTech#34095)上。将膜用5％脱脂奶粉封闭1小时，且接着在4℃下与初级抗体、抗磷酸化-Smad 1/5Ab(CST#9516，1:1000)、抗ID1Ab(Santa Cruz#SC-488，1:200)或抗GAPDH Ab(CST#2118，1:2000)一起孵育过夜。在洗涤之后，膜在室温下通过使用适当辣根过氧化酶结合的二级抗体在室温下1小时、抗小鼠IgG-HRP(CST#7076，1:2500)或抗兔IgG-HRP(CST#7074，1:2500)孵育1小时。结果通过BioRed ChemDoc Image机目测。
对于CFSC细胞分析法，CFSC细胞与DMEM加10％FBS一起培养。在第0天，将50微升/孔1.0×105个细胞/毫升悬浮液(5×103个细胞/孔)用培养基接种在黑色96孔PE盘中，在37℃、5％CO2下孵育过夜。在第1天，制备抗体稀释液及人BMP9溶液：重组人BMP9复合物(200ng/ml)及Ab(自12μg/ml稀释，比率为1:3且6次)。混合抗体及BMP9(1:1)，在37℃下孵育30分钟，接着添加50微升/孔BMP/Ab混合物至含有50μl来自前一天的培养基的细胞盘中，在37℃下与5％CO2一起孵育。1.5小时后，在室温下将盘固定在4％三聚甲醛中15分钟，在用PBS洗涤之后，在室温下用PBS中0.1％TritonX-100透化细胞又15分钟。再次洗涤，在室温下用PBS中3％BSA封闭细胞1小时。接着与p-Smad1/5/8抗体(Millipore#AB3848)在4℃下一起孵育过夜，在洗涤之后，与二级抗体(Alexa Fluor 488驴抗兔抗体，Life Tech#A21206)加DAPI染料在室温下再一起孵育2小时。彻底洗涤，接着供应100μl PBS，通过ThermofisherCellomics ArrayScan HCS系统读取。
实施例9：抗BMP9抗体的体外活性
使用肝纤维化的流体动力学注射(HDI)小鼠模型测量抗BMP9抗体的体内功效。
无特定病原体(SPF)及7-8周龄的雄性BALB/c小鼠由Shanghai Slac LaboratoryAnimal Co.,Ltd供应。到达设施后，使小鼠适应环境至少7天。在随机分组之后，小鼠经BMP9Ab或人对照IgG静脉内处理一次，且接着为BMP9质粒或空白载体的流体动力学注射(HDI)。4天后，在称重之后，处死所有小鼠以收集血液及肝脏组织样品。在100mg/kg氯胺酮麻醉下，进行心肌穿刺以得到尽可能多的血液。整个肝用生理食盐水快速冲洗，简单在纸巾上吸干，且接着称重，以测量肝重/体重比率。且在观测肝脏形态之后，将肝切片，接着肝片转移至低温小瓶中且在液氮中速冻以进行分子生物学分析。在分析前所有样品均储存在-80℃下。
包括血清丙氨酸转胺酶(ALT)及天冬氨酸转胺酶(AST)含量的肝功能由HITACHI7020自动生物化学分析器使用Quick Auto Neo ALT及Quick Auto Neo AST试剂盒(SHINO-TEST CORPORATION，Japen)测量。肝脏组织进行基因表达型态分析及组织学分析。对于基因表达型态分析，用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)自组织提取总RNA，使用Superscript III逆转录试剂盒，根据制造商的说明书(Life Technologies)进行纯化RNA的逆转录，接着基因转录物的定量由定量即时PCR，使用Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI)及ABI7500Fast即时PCR系统测量。用于小鼠ID1的引物对为5′-CGAGGCGGCATGTGT TCC-3′(SEQ IDNO：219)及5′-TCTGGGGAACCGAGAGCAC-3′(SEQ ID NO：220)；对于小鼠GAPDH，5′-CGTGCCGCCTG GAGAAACC-3′(SEQ ID NO：221)及5′-TGGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTG-3′(SEQ IDNO：222)。使肝脏组织裂解在T-per缓冲液(Thermo，#78510)中以进行ID1及p-smad1/5蛋白质印迹，使用抗磷酸化Smad 1/5Ab(CST#9516，1∶1000)、抗ID1 Ab(Santa Cruz#SC-488，1∶200)、抗GAPDH Ab(CST#2118，1∶2000)、抗小鼠IgG-HRP(CST#7076，1∶2500)及抗兔IgG-HRP(CST#7074，1∶2500)，蛋白质印迹法与通过smad 1/5磷酸化分析实验的体外活性测试相同。
实施例10：肝脏损伤的体内CCl4小鼠模型
无特定病原体(SPF)及7-8周龄的雄性BALB/c小鼠及C57BL/6小鼠由ShanghaiSlac Laboratory Animal Co.，Ltd供应。
到达设施后，使小鼠适应环境至少7天。在随机分组之后，小鼠经溶解于橄榄油中的4μl/g 25％CCl4腹膜内处理，一周两次，历时2周，以诱导肝纤维化。与第一次CCl4注射同时，还经静脉内注射BMP9Ab(10mg/kg，每周两次)以测试其在肝纤维化期间的功能。一周后处死小鼠，且肝脏组织进行蛋白质表达型态分析及组织学分析。
对于组织学，肝脏样品用10％缓冲福马林固定16-18小时，用石蜡包埋。通过使用Ventana自动化切片染色机(Ventana Medical Systems，Tucson，AZ，USA)进行免疫组织化学。兔多株抗磷酸化Smad1/5/8(Millipore,Billerica,MA)抗体以适当浓度用作初级抗体。对于蛋白质表达，进行蛋白质印迹法。材料及方法与上述Smad 1/5磷酸化分析法的体外活性测试中相同。
实施例11：结合亲和力、特异性及体外抑制分析法的结果
人源化杂交瘤产生的IgG的结合亲和力、特异性及IC50值(如BRE-Luc RGA中测量)概述在表4及表5中。
表4.
*＝基于亲本鼠类抗体对受体亚型的抑制。
+＝在小于约1nM的Ab浓度下抑制相互作用
-＝在小于约1nM的Ab浓度下不抑制相互作用
表5.抗BMP9抗体的动力学参数(至少三个独立分析的平均值)。KD值如通过MSD-SET测量。
n/a＝未分析
nb＝未结合
nsp＝极弱结合，无法评估
噬菌体展示产生的完全人抗体的结合亲和力、特异性及IC50值(如BRE-Luc RGA中测量)概述在表6及表7中。
表6
+＝在小于约1nM的Ab浓度下抑制相互作用
-＝在小于约1nM的Ab浓度下不抑制相互作用
表7.噬菌体展示产生的抗BMP9抗体的动力学特性(至少三个独立分析的平均值)。KD值如通过MSD-SET测量。
n/a＝未分析
nb＝无结合
nsp＝极弱结合，无法评估
综合而言，这些资料展示能够结合于人BMP9的至少三个不同表位的抗BMP9抗体的鉴别。AM4405、MOR022928及MOR023787结合于huMBP9的表位，其中结合能够抑制I型BMP受体(例如AlkI)与BMP9的相互作用。相比之下，AM0100、AM1900、MOR023073、MOR023793、MOR023795、MOR023796、MOR023090及MOR023093结合于huMBP9的表位，其中结合能够抑制II型BMP受体(例如ActIIR、BMPRII)与BMP9的相互作用。MOR022962及MOR022965结合于另一表位，其中结合能够抑制I型及II型BMP受体两者与BMP9的相互作用。本文所揭示的抗体对I型BMP受体或II型BMP受体或I型及II型BMP受体两者的抑制在小于或等于约1nM的IC50下实现。
这些资料还表明已自两个不同淘选来源鉴别能够以高亲和力及特异性结合huBMP9的抗体，包括人及人源化抗体。举例而言，所有鉴别的抗体均以小于1nM、例如小于500pm的KD结合于huBMP9。许多鉴别的抗体以小于200pM的KD结合于huBMP9。本发明的抗体还能够与食蟹猴、大鼠和/或鼠类BMP9交叉反应，此为有益的，因为这些抗体可用于疾病的动物模型中。最后，所有抗体均对BMP9具有高度特异性，对BMP9的特异性超过人BMP10、人BMP7及人BMP2至少1000倍，且在许多情况下，显示不结合于人BMP10、人BMP7或人BMP2。这些抗体还能够在报导基因分析法(“RGA”)中以小于1nM且在许多情况下小于200pM的IC50抑制BMP9信号诱导。综合而言，这些结果证实本发明的抗体为高度特异性及有效的抗BMP9抗体。
实施例12：2B11G2Fab与huBMP9的晶体结构
人BMP9与2B11G2嵌合Fab抗体的复合物的晶体结构在下解析，其在每个不对称单元中含有两个hBMP9成熟结构域与两个Fab分子的一个均二聚体。该结构以寄存编号1dpbd寄存至内部资料库Proasis中(1dpbd在下文称作hBMP9与2B11G2嵌合Fab的此结构)。
通过将1dpbd的结构重叠至BMP9-Alk1-ActRIIb(PDB:4FAO)的结构上，展示2B11G2及Alk1共享BMP9的相同结合表面(成熟结构域)，此与2B11G2可与Alk1竞争BMP9结合的实验观测结果匹配。该结构还表明ActRIIb与BMP9的相互作用在2B11G2Fab结合于BMP9时不受影响。
2B11G2的所有6个CDR均与BMP9的相互作用有关；且在BMP9与HCDR2、HCDR3及LCDR3之间建立主要结合界面。HCDR1通过疏水相互作用结合于BMP9；特定言之，HCDR1的Thr28及Pro30与BMP9的Gly21、Ser24及Trp25相互作用(在针对BMP9成熟结构域的编号中)。HCDR2主要通过疏水相互作用结合于BMP9；特定言之，Val50由来自BMP9的苯基包围，Tyr52与一个BMP9单体的Trp22形成H键且与另一BMP9单体的Leu60及Phe43形成疏水相互作用，Val57及Ser59与BMP9的Phe43及Pro44形成疏水相互作用。HCDR3主要通过疏水相互作用结合于BMP9；特定言之，Phe102与一个BMP9单体的Phe43、Ile56及Leu60且与另一BMP9单体的Trp22及Trp25挤在一起，Tyr103与BMP9的Tyr86及Trp25堆迭。LCDR1中的Asn32为LCDR1中与BMP9相互作用的唯一残基。LCDR2中的Tyr50与BMP9的Asp47形成H键。LCDR3通过混合疏水性及极性相互作用结合于BMP9；具体而言，Ser91及Ser93分别与BMP9的Asp47及Asp48形成H键，His92主链与BMP9中的Asp47及Asp48主链形成H键，Trp94及Tyr96与BMP9的Pro44及Ala46形成疏水相互作用。
受体竞争抑制分析的结果表明2B11G2为BMP9I型受体抑制剂。晶体结构通过展示2B11G2结合于与Alk1(BMP I型受体)结合位点重叠的表位证实此。
2B11G2Fab与huBMP9的成熟片段(SEQ ID NO:215)之间的相互作用展示在表8中。
表8：2B11G2Fab与人BMP9成熟结构域(SEQ ID NO:215)之间的残余接触点。
实施例13：抗BMP9抗体的体外活性评估结果
如以上在图1A及表5中所示，杂交瘤来源的抗体2B11G2-AM4405、4E10D7-AM0100可以相对较低的IC50抑制人BMP9诱导的报导基因活性，而对人BMP2或人BMP7诱导的报导基因活性几乎无作用。还如图1b中所示，亲本抗体可抑制大鼠BMP9诱导的报导基因活性，且符合明显降低曲线，此意谓这些抗体对人及大鼠BMP9信号传导具有类似抑制活性。总之，这些结果证实抗BMP9抗体能够特异性抑制BMP9信号传导，且能够与来自不同物种的BMP9蛋白质交叉反应(例如可与人及大鼠BMP9交叉反应)。
此外，噬菌体展示产生的抗体还展示对BMP9具有特异性，且与来自不同物种的BMP9交叉反应。如以上图2A及表7中所示，完全人抗BMP9抗体可在小于1nM的浓度下抑制BMP9信号传导，但在高达1μM的浓度下不影响BMP2或BMP7的信号传导。详言之，Mor022962可以相对较低的IC50抑制人BMP9诱导的报导基因活性，而对人BMP2或人BMP7诱导的报导基因活性几乎无作用。如图1b中所示，Mor022962抗体可抑制大鼠BMP9诱导的报导基因活性，且符合明显降低曲线。总之，这些结果证实噬菌体展示产生的BMP9抗体能够特异性抑制BMP9信号传导，且能够与来自不同物种的BMP9蛋白质交叉反应(例如可与人及大鼠BMP9交叉反应)。
实施例14：体外Smad 1/5/8磷酸化分析的结果
在两种细胞系中测量抗BMP9抗体抑制BMP9诱导的Smad 1/5磷酸化和/或Id1表达的能力：如下所述的HUVEC及CFSC。
不受理论束缚，据信在BMP9信号传导期间，BMP9配体首先结合其受体，接着藉助于Co-Smad使Smad1/5/8磷酸化。随后，磷酸化的Smad1/5/8进入细胞核以促进BMP9标靶基因，例如ID1的表达。因此，测试磷酸化的Smad1/5/8(“p-Smad 1/5/8”)及ID1表达的水平作为BMP9信号传导的读取结果。如图3a中所示，当用BMP9及杂交瘤产生的抗体处理CFSC细胞时，亲本4E10D7抗体可抑制通过BMP9诱导的p-Smad1/5/8染色水平。如图3b中所示，噬菌体展示产生的抗体MOR022962抗体可抑制CSFC细胞中通过BMP9诱导的p-Smad1/5/8染色水平。此外，如图3c中所示，在HUVEC细胞中，噬菌体展示产生及杂交瘤产生的抗BMP9抗体可降低通过BMP9诱导的磷酸化的smad1/5及ID1表达的水平。所有以上资料均表明抗BMP9抗体抑制BMP9信号传导。
实施例15：抗BMP9抗体的体内活性的结果
使用肝脏形态、肝重及体重、肝脏功能作为肝脏损伤的读取结果，发现BMP9表达质粒的流体动力学注射可诱导小鼠中严重肝脏损伤。如图4及5中所示，BMP9质粒的HDI可引起严重肝脏坏死(图4a/5a)，伴随肝重及体重减少(图4b/5b)及ALT、AST含量增加(图4c/5c)。当小鼠同时用抗BMP9抗体处理时，与仅仅BMP9质粒的HDI相比，肝脏坏死、ALT及AST含量减少，而肝重及体重改善(图4/图5)。综合而言，这些结果表明抗BMP9抗体可有效地封闭体内BMP9诱导的肝脏损伤。此外，抗BMP9抗体还可抑制BMP9诱导的ID1(BMP9信号传导的标靶基因)表达(图4d/5d)。所有以上资料均展示抗BMP9抗体可阻断体内BMP9的信号传导与功能。
实施例16：肝脏损伤的体内CCl4小鼠模型的结果
通过蛋白质印迹法与组织学，与油对照相比，CCl4处理小鼠中smad1/5/8的磷酸化上调(图6a、6b及6c/图7a、7b及7c)，表明BMP9上调及肝脏破坏。当小鼠用抗BMP9抗体处理时，抑制CCl4诱导的smad1/5/8磷酸化，表明BMP9抗体可有效抑制体内BMP9信号传导。
实施例17：肝纤维化的长期体内CCl4小鼠模型
无特定病原体(SPF)及7-8周龄的雌性BALB/c小鼠由Shanghai Slac LaboratoryAnimal Co.,Ltd供应。在随机分组之后，小鼠经静脉内注射(10mg/kg抗BMP9抗体或小鼠对照IgG)以测试其在肝纤维化期间的功能。在注射抗体2小时之后，小鼠经溶解于橄榄油中的4μl/g 25％CCl4腹膜内处理，且此后每周经相同CCl4剂量处理两次，历时两周，以诱导肝纤维化。
在两周之后，处死小鼠以收集血液及肝脏组织样品。在异氟醚麻醉下，收集血液样品。整个肝用生理食盐水快速冲洗，简单在纸巾上吸干，且接着称重。且在观测肝脏形态之后，将肝切片，且转移至低温小瓶中且在液氮中速冻，以进行分子生物学分析。在分析前所有样品均储存在-80℃下。
通过HITACHI 7020自动生物化学分析器，使用Quick Auto Neo ALT及Quick AutoNeo AST试剂盒(SHINO-TEST CORPORATION,Japan)测量血清丙氨酸转胺酶(ALT)含量。肝脏组织进行基因表达及组织学分析。对于基因表达分析，用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)自组织提取总RNA，使用Superscript III逆转录试剂盒，根据制造商的说明书(LifeTechnologies)进行纯化RNA的逆转录，接着基因转录物的定量由定量即时PCR，使用PowerSYBR Green PCR Master Mix(ABI)及ABI 7500Fast即时PCR系统测量。用于小鼠ID1的引物对为5'-CGAGGCGGCATGTGTTCC-3'(SEQ ID NO:219)及5'-TCTGGGGAACCGAGAGCAC-3'(SEQ IDNO:220)；对于小鼠GAPDH，为5'-CGTGCCGCCTG GAGAAACC-3'(SEQ ID NO:221)及5'-TGGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTG-3'(SEQ ID NO:222)。肝脏羟脯氨酸含量用经修改的羟脯氨酸分析试剂盒(Sigma)分析。对于组织学，肝脏样品用10％缓冲福马林固定16-18小时，用石蜡包埋，接着进行天狼星红染色及纤维化区域定量。
肝纤维化的体内CCl4小鼠模型的结果
使用天狼星红染色及肝脏羟脯氨酸含量作为肝纤维化的读取结果，发现注射CCl4可诱导小鼠中肝纤维化。如图8中所示，如通过阳性天狼星红染色及肝脏羟脯氨酸含量增加(图8a及8b)所测定，注射CCl4加对照IgG可诱导肝纤维化。这些伴随ALT含量增加(图8c)及肝重增加(图8d)。CCl4处理还通过上调其标靶基因Id1活化BMP9信号传导(图8e)。当小鼠用抗BMP9抗体处理时，Id1基因诱导显著减少，表明BMP9抗体充分阻断BMP9信号传导。同时，与对照IgG组相比，CCl4诱导的肝纤维化及ALT含量大大减少，而肝重改善(图8)。综合而言，长期体内模型的这些结果表明抗BMP9抗体可在体内有效地阻断BMP9信号传导且改善CCl4诱导的肝纤维化。
实施例18：药物动力学(PK)分析
小鼠PK-抗体4E10D7
无特定病原体(SPF)及7-8周龄的雄性C57BL/6小鼠由Shanghai LaboratoryAnimal Co.,Ltd(SLAC)供应。到达设施后，使小鼠适应环境至少7天。整体上，该研究中使用15只雄性小鼠，且基于不同处理及各种时程随机化成5组。第0天，用10mg/Kg抗BMP9抗体4E10D7注射(经静脉内)组1-4；用10mg/Kg对照IgG注射组5，剂量体积为5ml/kg。在第-1天及给药后2h、6h、24h、48h、72h、96h、168h、336h自某些组收集血液(表9)。不同组在特定时间点处死。对于非终末采血，在麻醉下通过眼眶采血/剪尾收集血液。对于终末采血(T)，通过心肌穿刺收集血液。
表9
通过竞争Elisa分析检测各时间点的IgG浓度。将0.25μg/mL、100微升/孔人BMP9复合物包被在96孔盘上，在4℃下孵育过夜。在用洗涤缓冲液(1×PBS+0.1％Tween20)洗涤3次之后，添加300微升/孔封闭缓冲液(1×PBS+0.1％Tween20+1％BSA)，在室温下在450rpm下震荡1小时。接着制备样品进行测试：对于标准曲线，将120μl Ab(在含有8％未处理小鼠血清的分析缓冲液中自100μg/ml稀释，比率为1:3且7次)与120μl生物素标记的Ab(在分析缓冲液中稀释至0.067μg/ml)混合；对于血清样品，添加9.6μl血清样品至120μl分析缓冲液(稀释12.5倍)中，且与120μl生物素标记的Ab(在分析缓冲液中稀释至0.067μg/ml)混合。分析缓冲液为1×PBS+0.05％ Tween20+1％ BSA。用洗涤缓冲液洗涤盘3次，接着添加100微升/孔制备样品，各点一式两份，在室温下孵育2小时。随后，在另外3次洗涤之后，添加100微升/孔HRP-链霉抗生物素(1:5000，Pierce#21140)至各孔，在黑暗中在450rpm下震荡下孵育1小时。接着，洗涤且添加TMB底物(Life Tech#002023)至分析盘的各孔，密封且在室温下在450rpm下震荡下孵育约5分钟。通过添加100微升/孔1M HCl终止反应，接着在450nM下读取OD。
ANIT大鼠模型中的PK分析-4E10D7
7-8周龄的雄性SD大鼠由Shanghai Slac Laboratory Animal Co.,Ltd供应。到达设施后，使大鼠适应环境至少7天。6只雄性大鼠用于此研究中，基于不同处理随机化成2组。第0天，用10mg/Kg抗BMP9IgG注射(经静脉内)1组；用10mg/Kg对照IgG注射组2，组1及2喂食ANIT饮食(由SLAC供应)。在第-1天及给药后2h、6h、8h、24h、48h、72h、120h、192h、336h、504h自各大鼠收集血液。所有组均在3周后处死。对于非终末采血，在麻醉下通过眼眶采血/剪尾收集血液。对于终末采血，通过心肌穿刺收集血液。各时间点的IgG浓度通过竞争Elisa分析法检测，类似于正常小鼠中的PK分析。
结果
结果展示于图9中。正常小鼠与ANIT大鼠模型中亲本Ab 4E10D7展示类似PK型态。Ab在2小时内达到峰值浓度，且在24小时前开始降低且降达一半，接着在1周内相对稳定在50μg/ml下。
食蟹猴中药物动力学(PK)分析-MOR022962
单剂量研究：
向3至4岁及2.5至4kg的3只雄性食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))经静脉内施用10mg/kg抗BMP9抗体MOR022962(Ab BMP9-2)。在给药前及给药后0.25h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、240h、336h、408h、504h、576h、672h、744h、840h、912h及1008h收集血液。各时间点的总MOR022962Ab浓度通过识别抗体的Fc域的夹心ELISA检测。各个体随时间变化的总MOR022962浓度展示在图10中。在所有个体中，最大浓度在0.25h观测到，此为给药后第一次取样时间。终末消除半衰期(t1/2)为132至145小时(5.5至6.0天)。在研究第32天开始的一只动物中MOR022962明显加速的清除(图10)与同时检测到抗药物抗体相同。
重复剂量研究：
向2至5岁及2.3至3.8kg雄性食蟹猴(食蟹猴)经静脉内施用每周10、30或100mg/kg(n＝2/组)抗BMP9抗体(MOR022962)，历时4周(5剂)。对照动物(n＝2)接收同等剂量体积(1mL/kg)的运载体，历时4周(5剂)。在各剂量施用前、在各剂量之后0.25h及在第一次及倒数第二次剂量之后6h、24h、48h、72h、96h、120h收集血液。各时间点的总MOR022962 Ab浓度通过识别抗体的Fc域的夹心ELISA检测。随时间变化的总MOR022962 Ab浓度展示在图11中。在所有处理动物中，最大浓度(Cmax)在0.25h观测到，此为给药后第一次取样时间。MOR022962暴露(Cmax或AUC0-7d)在10-100mg/kg的剂量范围内按比例增加剂量。在3个剂量组中，药物累积(在第一次及倒数第二次剂量之后AUC0-7d的比率)范围为1.3-2.3。
实施例19：可研发性
使用本领域中已知的分析法，评估对huBMP9(相对于结合于huBMP7、huBMP2及huBMP10)具有良好亲和力及特异性的IgG抗体的可研发性。简言之，由尺寸排阻层析测量抗体聚集；在pH＝7.5下评估熔融温度；在硫酸铵(NH4)2SO4、组氨酸pH＝6中通过疏水相互作用层析(HIC)评估疏水性；且在HEK-293T表达系统中测量生产滴度。结果概述在表11中。这些结果证实本发明的抗BMP9抗体展现预想不到良好的可研发性，因此适合于作为药剂研发。
表11.抗BMP-9抗体的可研发性
实施例20：MOR022962Fv与hBMP9二聚体的晶体结构
人BMP9与MOR022962Fv域的复合物的晶体结构以解析。各不对称单元含有一个hBMP9均二聚体及两个Fv分子。结构以寄存编号1ssod寄存至内部资料库Proasis中(1ssod在下文称作hBMP9与MOR022962Fv的此结构)。
通过将1ssod的结构叠加至BMP9-Alk1-ActRIIb(PDB：4FAO)的结构上，展示MOR022962及ActRIIb共享BMP9(成熟结构域)上的重叠接触表面，此与MOR022962可与ActRIIb竞争结合BMP9的实验观测结果良好相同。结构还展示MOR022962与BMP9的结合表面不直接与Alk1与BMP9的结合表面重叠。
晶体结构展示MOR022962结合于BMP9中包括涉及疏水相互作用的L85、L95、Y97、H98及涉及氢键网路的S83、H98、E100的表位。MOR022962Fv与huBMP9的成熟片段(SEQ IDNO:215)之间的详细相互作用展示在下表12中。
因为生物化学实验展示在生物化学实验中MOR022962意想不到地能够在一定程度上阻断ActRIIb(II型BMP受体)及AlkI(I型BMP受体)结合于BMP9，所以此表明MOR022962所结合的表位代表引起I型与II型BMP9受体类型的阻断的新结合表位，不过机制仍然不明确。
表12：MOR022962Fv与人BMP9成熟结构域(SEQ ID NO:215)之间的残基的接触点
氢键网路相互作用：
疏水相互作用：
HC：重链，LC：轻链
因此，在一个实施方案中，本发明提供了与BMP9结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含a)轻链可变区的以下氨基酸残基：Y32、D50、S91、D92、T93、S94和L96；和b)重链可变区中的以下氨基酸残基：W47、I50、L52、H56、H58、I102、W103和S104。
除非另有定义，否则本文所用的技术及科学术语均具有与熟习本发明所属的技术人员通常所理解相同的意义。
如熟习此项技术的本领域技术人员所清楚的，除非另外指明，否则所有未特定详细描述的方法、步骤、技术及操作可以本身已知的方式进行且已以本身已知的方式进行。例如再次提及标准手册及本文中提及之一般背景技术及其中所引用的其他参考文献。除非另外指明，否则本文中所引用的参考文献各以全文引用的方式并入本文中。
在本申请的文本通篇中，本说明书的文本(例如表1)与序列表之间若存在不相同，则应以本说明书的文本为准。
本发明的权利要求为非限制性的且提供于下文中。
虽然本文已详细揭示特定方面及权利要求，但此已藉助于实施例仅仅出于说明的目的进行，且不意欲对所附权利要求的范畴或任何对应将来申请案的权利要求的主题范畴具有限制性。详言之，本发明人预期在不背离如权利要求所界定的本发明的精神及范畴下可对本发明进行各种取代、改变及修改。据信核酸起始材料、相关克隆或文库类型的选择对于具有本文中描述的方面的知识的普通技术人员而言为惯例。认为其他方面、优点及修改在以下权利要求的范畴内。熟习本领域的技术人员应认识到或能够使用不超过常规实验，即可确定本文中所述的本发明的特定方面的许多同等物。此类同等物意欲涵盖于以下权利要求中。在后来申请的对应申请案中权利要求范畴的改写可能归因于各个国家的专利法律的限制且不应解释为放弃权利要求的主题。

Claims (58)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合人BMP9且包含：
(a)分别为SEQ ID NO:61、62及63的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:71、72及73的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(b)分别为SEQ ID NO:64、65及66的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:74、75及76的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(c)分别为SEQ ID NO:1、2及3的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:11、12及13的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(d)分别为SEQ ID NO:4、5及6的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:14、15及16的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(e)分别为SEQ ID NO:21、22及23的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:31、32及33的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(f)分别为SEQ ID NO:24、25及26的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:34、35及36的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(g)分别为SEQ ID NO:41、42及43的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:51、52及53的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(h)分别为SEQ ID NO:44、45及46的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:54、55及56的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(i)分别为SEQ ID NO:81、82及83的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:91、92及93的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(j)分别为SEQ ID NO:84、85及86的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:94、95及96的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(k)分别为SEQ ID NO:101、102及103的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:111、112及113的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(l)分别为SEQ ID NO:104、105及106的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:114、115及116的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(m)分别为SEQ ID NO:121、122及123的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:131、132及133的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(n)分别为SEQ ID NO:124、125及126的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:134、135及136的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(o)分别为SEQ ID NO:141、142及143的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:151、152及153的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(p)分别为SEQ ID NO:144、145及146的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:154、155及156的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(q)分别为SEQ ID NO:161、162及163的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:171、172及173的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或
(r)分别为SEQ ID NO:164、165及166的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:174、175及176的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
2.如权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)SEQ ID NO:67的VH序列；
(b)SEQ ID NO:7的VH序列；
(c)SEQ ID NO:27的VH序列；
(d)SEQ ID NO:47的VH序列；
(e)SEQ ID NO:87的VH序列；
(f)SEQ ID NO:107的VH序列；
(g)SEQ ID NO:127的VH序列；
(h)SEQ ID NO:147的VH序列；或
(i)SEQ ID NO:167的VH序列。
3.如权利要求1至2中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)SEQ ID NO:77的VL序列；
(b)SEQ ID NO:17的VL序列；
(c)SEQ ID NO:37的VL序列；
(d)SEQ ID NO:57的VL序列；
(e)SEQ ID NO:97的VL序列；
(f)SEQ ID NO:117的VL序列；
(g)SEQ ID NO:137的VL序列；
(h)SEQ ID NO:157的VL序列；或
(i)SEQ ID NO:177的VL序列。
4.如权利要求1至3中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)SEQ ID NO:67的VH序列及SEQ ID NO:77的VL序列；
(b)SEQ ID NO:7的VH序列及SEQ ID NO:17的VL序列；
(c)SEQ ID NO:27的VH序列及SEQ ID NO:37的VL序列；
(d)SEQ ID NO:47的VH序列及SEQ ID NO:57的VL序列；
(e)SEQ ID NO:87的VH序列及SEQ ID NO:97的VL序列；
(f)SEQ ID NO:107的VH序列及SEQ ID NO:117的VL序列；
(g)SEQ ID NO:127的VH序列及SEQ ID NO:137的VL序列；
(h)SEQ ID NO:147的VH序列及SEQ ID NO:157的VL序列；或
(i)SEQ ID NO:167的VH序列及SEQ ID NO:177的VL序列。
5.如权利要求1至4中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)SEQ ID NO:69的重链序列；
(b)SEQ ID NO:9的重链序列；
(c)SEQ ID NO:29的重链序列；
(d)SEQ ID NO:49的重链序列；
(e)SEQ ID NO:89的重链序列；
(f)SEQ ID NO:109的重链序列；
(g)SEQ ID NO:129的重链序列；
(h)SEQ ID NO:149的重链序列；或
(i)SEQ ID NO:169的重链序列。
6.如权利要求1至5中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)SEQ ID NO:79的轻链序列；
(b)SEQ ID NO:19的轻链序列；
(c)SEQ ID NO:39的轻链序列；
(d)SEQ ID NO:59的轻链序列；
(e)SEQ ID NO:99的轻链序列；
(f)SEQ ID NO:119的轻链序列；
(g)SEQ ID NO:139的轻链序列；
(h)SEQ ID NO:159的轻链序列；或
(i)SEQ ID NO:179的轻链序列。
7.如权利要求1至6中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)SEQ ID NO:69的重链序列；及SEQ ID NO:79的轻链序列；
(b)SEQ ID NO:9的重链序列；及SEQ ID NO:19的轻链序列；
(c)SEQ ID NO:29的重链序列；及SEQ ID NO:39的轻链序列；
(d)SEQ ID NO:49的重链序列；及SEQ ID NO:59的轻链序列；
(e)SEQ ID NO:89的重链序列；及SEQ ID NO:99的轻链序列；
(f)SEQ ID NO:109的重链序列；及SEQ ID NO:119的轻链序列；
(g)SEQ ID NO:129的重链序列；及SEQ ID NO:139的轻链序列；
(h)SEQ ID NO:149的重链序列；及SEQ ID NO:159的轻链序列；或
(i)SEQ ID NO:169的重链序列；及SEQ ID NO:179的轻链序列。
8.如在先权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或抗原结合片段为IgG或来源于IgG。
9.如权利要求8的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该IgG系选自由IgG1、IgG2、IgG3及IgG4组成的组。
10.如在先权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或抗原结合片段选自由以下各者组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab及scFv。
11.如在先权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该分离的抗体或其抗原结合片段为免疫缀合物的组分。
12.如在先权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其通过Fc区内的氨基酸突变而具有改变的效应子功能。
13.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其交叉阻断前述权利要求中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段。
14.一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，(a)其对人BMP9的亲和力比对人BMP10、对人BMP7及对人BMP2大至少约1000倍；以及(b)以小于1nM的KD结合于人BMP9、食蟹猴BMP9、大鼠BMP9及鼠类BMP9。
15.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其：
(a)结合于人BMP9且抑制人BMP9与例如ALK1、ALK2或ALK3的BMP I型受体的结合；
(b)结合于人BMP9且抑制人BMP9与例如ActIIRB的BMP II型受体的结合；或
(c)结合于人BMP9且抑制人BMP9与例如ALK1、ALK2或ALK3的BMP I型受体及例如ActIIRB的BMP II型受体两者的结合。
16.如权利要求15的分离的抗体或其抗原结合片段，其中人BMP9与该BMP I型受体、该BMP II型受体、或该BMP I型受体及该BMP II型受体的结合的该抑制是在小于或等于约1nM的IC50下。
17.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其(a)在SEQ ID NO:215的氨基酸残基21-25、43-60、86及96内的表位结合于人BMP9的成熟片段；或(b)在SEQ ID NO:215的氨基酸残基83-85及95-100内的表位结合于人BMP9的成熟片段。
18.如权利要求17的分离的抗体或其抗原结合片段，其如下结合于人BMP9的成熟片段：(a)在包含SEQ ID NO:215的氨基酸残基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96的表位；(b)在包含SEQ ID NO:215的氨基酸残基S83、L85、L95、Y97、H98及E100的表位；(c)在由SEQ ID NO:215的氨基酸残基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96组成的表位；或(d)在由SEQ ID NO:215的氨基酸残基S83、L85、L95、Y97、H98及E100组成的表位。
19.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)分别为SEQ ID NO:184、185及186的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:192、193及194的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(b)分别为SEQ ID NO:181、182及183的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:189、190及191的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(c)分别为SEQ ID NO:197、198及199的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:205、206及207的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或
(d)分别为SEQ ID NO:200、201及202的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:208、209及210的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
20.如权利要求1至19中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段为嵌合、人源化或完全人。
21.一种组合物，其包含如权利要求1至20中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段和可药用载体。
22.一种组合物，其包含如权利要求1至20中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段和其他的治疗剂。
23.一种降低细胞中BMP9活性的方法，包括将该细胞与权利要求1至20中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段或权利要求21-22中任一项的组合物接触。
24.一种抑制有需要的患者中BMP9的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求1至20中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段或权利要求21-22中任一项的组合物。
25.如权利要求24的方法，其中所述患者患有肝病。
26.如权利要求25的方法，其中该肝病为以下的一种或者多种或与以下的一种或者多种相关联：丙型肝炎病毒(“HCV”)感染；乙型肝炎病毒(“HBV”)感染；自体免疫性肝炎；酒精暴露；毒素暴露；药物暴露；肝脏外伤；胆道阻塞；原发性胆汁性肝硬化；阿拉吉欧症候群(alagille syndrome)；慢性肝淤血；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；原发性硬化性胆管炎；血色沉着病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；以及威尔逊氏病(Wilson disease)。
27.如权利要求25的方法，其中该肝病选自由肝纤维化、门静脉高血压、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪肝病或肝硬化组成的组。
28.如权利要求23至27中任一项的方法，还包括施用其他治疗剂。
29.如权利要求28的方法，其中该其他治疗剂降低BMP9的活性。
30.如权利要求28的方法，其中该其他治疗剂为siRNA、抗体或其抗原结合片段、可溶性受体、蛋白质或小分子。
31.如权利要求28的方法，其中该其他治疗剂选自由以下各者组成的组：抗病毒剂、消炎剂、抗纤维化剂、抗脂肪变性剂、抗细胞凋亡剂、保肝剂及其组合。
32.如权利要求31的方法，其中该其他治疗剂选自由以下各者组成的组：替诺福韦(tenofovir)、恩替卡韦(entecavir)、拉米夫定(lamivudine)、特布维定(telbuvudine)、阿德福韦(adefovir)、聚乙二醇化干扰素、索非布韦(sofusbuvir)、替拉瑞韦(telaprevir)、达拉斯韦(daclatsivir)、西咪匹韦(simeprevir)、莱达普韦(ledasprevir)、皮质类固醇、GFT-505、赛瑞维克(cenicriviroc)、维生素E、吡格列酮(pioglitazone)、二甲双胍(metformin)、奥贝胆酸(obeticholic acid)、GR-MD-02及其组合。
33.如权利要求28至32中任一项的方法，其中(a)该分离的抗体或其抗原结合片段及该其他治疗剂同时或依序施用，和/或(b)该分离的抗体或其抗原结合片段辅助该其他治疗剂的施用来施用。
34.一种分离的多核苷酸，其包含编码如权利要求1至20中任一项的抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
35.一种分离的多核苷酸，其包含编码结合人BMP9的抗体或其抗原结合片段的VH或VL序列的核酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)分别为SEQ ID NO:61、62及63的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:71、72及73的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(b)分别为SEQ ID NO:64、65及66的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:74、75及76的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(c)分别为SEQ ID NO:1、2及3的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:11、12及13的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(d)分别为SEQ ID NO:4、5及6的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:14、15及16的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(e)分别为SEQ ID NO:21、22及23的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:31、32及33的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(f)分别为SEQ ID NO:24、25及26的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:34、35及36的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(g)分别为SEQ ID NO:41、42及43的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:51、52及53的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(h)分别为SEQ ID NO:44、45及46的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:54、55及56的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(i)分别为SEQ ID NO:81、82及83的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:91、92及93的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(j)分别为SEQ ID NO:84、85及86的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ ID NO:94、95及96的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(k)分别为SEQ ID NO:101、102及103的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:111、112及113的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(l)分别为SEQ ID NO:104、105及106的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:114、115及116的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(m)分别为SEQ ID NO:121、122及123的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:131、132及133的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(n)分别为SEQ ID NO:124、125及126的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:134、135及136的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(o)分别为SEQ ID NO:141、142及143的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:151、152及153的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(p)分别为SEQ ID NO:144、145及146的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:154、155及156的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；
(q)分别为SEQ ID NO:161、162及163的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:171、172及173的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或
(r)分别为SEQ ID NO:164、165及166的HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分别为SEQ IDNO:174、175及176的LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
36.如权利要求35的分离的多核苷酸，其中该核酸序列编码包含以下的VH序列：
(a)SEQ ID NO:67的VH序列；
(b)SEQ ID NO:7的VH序列；
(c)SEQ ID NO:27的VH序列；
(d)SEQ ID NO:47的VH序列；
(e)SEQ ID NO:87的VH序列；
(f)SEQ ID NO:107的VH序列；
(g)SEQ ID NO:127的VH序列；
(h)SEQ ID NO:147的VH序列；或
(i)SEQ ID NO:167的VH序列。
37.如权利要求35或36的分离的多核苷酸，其中该核酸序列编码包含以下的VL序列：
(a)SEQ ID NO:77的VL序列；
(b)SEQ ID NO:17的VL序列；
(c)SEQ ID NO:37的VL序列；
(d)SEQ ID NO:57的VL序列；
(e)SEQ ID NO:97的VL序列；
(f)SEQ ID NO:117的VL序列；
(g)SEQ ID NO:137的VL序列；
(h)SEQ ID NO:157的VL序列；或
(i)SEQ ID NO:177的VL序列。
38.如权利要求35至37的分离的多核苷酸，其包含编码VH序列的核酸序列及编码VL序列的核酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO:67的VH序列及SEQ ID NO:77的VL序列；
(b)SEQ ID NO:7的VH序列及SEQ ID NO:17的VL序列；
(c)SEQ ID NO:27的VH序列及SEQ ID NO:37的VL序列；
(d)SEQ ID NO:47的VH序列及SEQ ID NO:57的VL序列；
(e)SEQ ID NO:87的VH序列及SEQ ID NO:97的VL序列；
(f)SEQ ID NO:107的VH序列及SEQ ID NO:117的VL序列；
(g)SEQ ID NO:127的VH序列及SEQ ID NO:137的VL序列；
(h)SEQ ID NO:147的VH序列及SEQ ID NO:157的VL序列；或
(i)SEQ ID NO:167的VH序列及SEQ ID NO:177的VL序列。
39.如权利要求35至38的分离的多核苷酸，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO:69的重链序列；
(b)SEQ ID NO:9的重链序列；
(c)SEQ ID NO:29的重链序列；
(d)SEQ ID NO:49的重链序列；
(e)SEQ ID NO:89的重链序列；
(f)SEQ ID NO:109的重链序列；
(g)SEQ ID NO:129的重链序列；
(h)SEQ ID NO:149的重链序列；或
(i)SEQ ID NO:169的重链序列。
40.如权利要求35至39的分离的多核苷酸，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO:79的轻链序列；
(b)SEQ ID NO:19的轻链序列；
(c)SEQ ID NO:39的轻链序列；
(d)SEQ ID NO:59的轻链序列；
(e)SEQ ID NO:99的轻链序列；
(f)SEQ ID NO:119的轻链序列；
(g)SEQ ID NO:139的轻链序列；
(h)SEQ ID NO:159的轻链序列；或
(i)SEQ ID NO:179的轻链序列。
41.如权利要求35至40的分离的多核苷酸，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)SEQ ID NO:69的重链序列；及SEQ ID NO:79的轻链序列；
(b)SEQ ID NO:9的重链序列；及SEQ ID NO:19的轻链序列；
(c)SEQ ID NO:29的重链序列；及SEQ ID NO:39的轻链序列；
(d)SEQ ID NO:49的重链序列；及SEQ ID NO:59的轻链序列；
(e)SEQ ID NO:89的重链序列；及SEQ ID NO:99的轻链序列；
(f)SEQ ID NO:109的重链序列；及SEQ ID NO:119的轻链序列；
(g)SEQ ID NO:129的重链序列；及SEQ ID NO:139的轻链序列；
(h)SEQ ID NO:149的重链序列；及SEQ ID NO:159的轻链序列；或
(i)SEQ ID NO:169的重链序列；及SEQ ID NO:179的轻链序列。
42.一种分离的多核苷酸，其包含编码结合人BMP9的抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的核酸，该多核苷酸包含以下任一者的序列：
(a)SEQ ID NO:70的重链序列；
(b)SEQ ID NO:68的VH序列；
(c)SEQ ID NO:80的轻链序列；
(d)SEQ ID NO:78的VL序列；
(e)SEQ ID NO:10的重链序列；
(f)SEQ ID NO:8的VH序列；
(g)SEQ ID NO:20的轻链序列；
(h)SEQ ID NO:18的VL序列；
(i)SEQ ID NO:30的重链序列；
(j)SEQ ID NO:28的VH序列；
(k)SEQ ID NO:40的轻链序列；
(l)SEQ ID NO:38的VL序列；
(m)SEQ ID NO:50的重链序列；
(n)SEQ ID NO:48的VH序列；
(o)SEQ ID NO:60的轻链序列；
(p)SEQ ID NO:58的VL序列；
(q)SEQ ID NO:90的重链序列；
(r)SEQ ID NO:88的VH序列；
(s)SEQ ID NO:100的轻链序列；
(t)SEQ ID NO:98的VL序列；
(u)SEQ ID NO:110的重链序列；
(v)SEQ ID NO:108的VH序列；
(w)SEQ ID NO:120的轻链序列；
(x)SEQ ID NO:118的VL序列；
(y)SEQ ID NO:130的重链序列；
(z)SEQ ID NO:128的VH序列；
(aa)SEQ ID NO:140的轻链序列；
(bb)SEQ ID NO:138的VL序列；
(cc)SEQ ID NO:150的重链序列；
(dd)SEQ ID NO:148的VH序列；
(ee)SEQ ID NO:160的轻链序列；
(ff)SEQ ID NO:158的VL序列；
(gg)SEQ ID NO:170的重链序列；
(hh)SEQ ID NO:168的VH序列；
(ii)SEQ ID NO:180的轻链序列；或
(jj)SEQ ID NO:178的VL序列。
43.一种分离的多核苷酸，其编码结合人BMP9的抗体或其抗原结合片段的VH及VL，该多核苷酸包含以下任一者的序列：
(a)SEQ ID NO:68的VH序列及SEQ ID NO:78的VL序列；
(b)SEQ ID NO:8的VH序列及SEQ ID NO:18的VL序列；
(c)SEQ ID NO:28的VH序列及SEQ ID NO:38的VL序列；
(d)SEQ ID NO:48的VH序列及SEQ ID NO:58的VL序列；
(e)SEQ ID NO:88的VH序列及SEQ ID NO:98的VL序列；
(f)SEQ ID NO:108的VH序列及SEQ ID NO:118的VL序列；
(g)SEQ ID NO:128的VH序列及SEQ ID NO:138的VL序列；
(h)SEQ ID NO:148的VH序列及SEQ ID NO:158的VL序列；或
(i)SEQ ID NO:168的VH序列及SEQ ID NO:178的VL序列。
44.如权利要求34至43中任一项的分离的多核苷酸，其安置于单一连续多核苷酸上。
45.如权利要求34至43中任一项的分离的多核苷酸，其安置于两个或两个以上连续多核苷酸上。
46.一种载体，其包含如权利要求34至45中任一项的多核苷酸。
47.一种细胞，其包含如权利要求46的载体。
48.如权利要求1至20中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段、如权利要求21至22中任一项的组合物、如权利要求34至45中任一项的分离的多核苷酸、如权利要求46的载体或如权利要求47的细胞在制备药物中的用途。
49.权利要求1至20中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，用作药物。
50.权利要求1至20中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，用于治疗。
51.权利要求1至20中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，用于治疗患有肝病的受试者。
52.如权利要求51的用于使用的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该肝病为以下或与以下相关联：丙型肝炎病毒(“HCV”)感染；乙型肝炎病毒(“HBV”)感染；自体免疫性肝炎；酒精暴露；毒素暴露；药物暴露；肝脏外伤；胆道阻塞；原发性胆汁性肝硬化；阿拉吉欧症候群；慢性肝淤血；非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；原发性硬化性胆管炎；血色沉着病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；和威尔逊氏病。
53.如权利要求51的用于使用的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该肝病选自由肝纤维化、门静脉高血压、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪肝病及肝硬化组成的组。
54.如权利要求1-20中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，用于降低有需要的患者的BMP9活性。
55.一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含表1中列出的抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
56.一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其在表1中列出。
57.一种结合人BMP9的分离的抗体或其抗原结合片段，其
(a)包含与表1中描述的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列；
(b)包含与表1中描述的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列；
(c)包含与表1中描述的VH氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH氨基酸序列，及与表1中描述的VL氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL氨基酸序列；
(d)包含与表1中描述的轻链氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的轻链氨基酸序列；
(e)包含与表1中描述的重链氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链氨基酸序列；或
(f)包含与表1中描述的轻链氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的轻链氨基酸序列，及与表1中描述的重链氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的重链氨基酸序列。
58.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求55至57中任一项的抗体或其抗原结合片段。
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