TW201716438A - 靶向骨成形性蛋白９（ｂｍｐ９）之抗體及其方法 - Google Patents

靶向骨成形性蛋白９（ｂｍｐ９）之抗體及其方法 Download PDF

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Abstract

本發明係關於經分離之結合人類BMP9之抗體及其抗原結合片段，以及其組合物及使用方法。

Description

靶向骨成形性蛋白9(BMP9)之抗體及其方法 相關申請案
本申請案主張2015年6月5日申請之PCT申請案第PCT/CN2015/080887號之優先權。此申請案之全部內容以引用的方式併入本文中。
本發明係關於結合人類BMP9之抗體及其抗原結合片段，以及其組合物及使用方法。
纖維化為一種涉及器官或組織中藉由細胞異常形成或發展過量纖維結締組織之病理性過程。雖然與纖維化相關之過程可作為正常組織形成或修復之一部分存在，但此等過程之失調可引起細胞組成改變且過量結締組織沈積，逐漸損害組織或器官功能。
纖維化肝病，包括肝硬化，影響全世界超過一億人口，且每年引起超過一百萬例死亡。門靜脈高血壓為纖維化肝病及肝硬化之主要後果之一，造成該等疾病之許多併發症。肝病，包括纖維化肝病，包括肝硬化之現存療法可具有低功效及不良之副作用。此外，當前對於包括纖維化肝病，包括肝硬化之肝病，無法完全有效治療或治癒。因此，極大地需要可抑制、預防或逆轉肝病，包括纖維化肝病及肝硬化，包括其後果，諸如門靜脈高血壓，且因此可用於治療或預防個體 之肝病，例如肝纖維化、肝硬化或門靜脈高血壓之部分，以及該等令人虛弱之疾病之診斷方法。
本發明提供經分離之BMP9結合分子(例如BMP9結合抗體或其抗原結合片段)、包含此類分子之醫藥組合物、製備此類分子及組合物之方法及其用於治療疾病，例如肝病，例如肝纖維化、肝硬化及門靜脈高血壓之方法。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之BMP9抗體或其抗原結合片段，其包含表1中任一抗體之任1、2、3、4、5或6個CDR。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之BMP9抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-1之6個CDR。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之BMP9抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-2之6個CDR。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之BMP9抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-3之6個CDR。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之BMP9抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-4之6個CDR。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之BMP9抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-5之6個CDR。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之BMP9抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-6之6個CDR。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之BMP9抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-7之6個CDR。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之BMP9抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-8之6個CDR。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之BMP9抗體或其抗原結 合片段，其包含如表1中所述之BMP9-9之6個CDR。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：1、2及3之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：11、12及13之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：4、5及6之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：14、15及16之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：21、22及23之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：31、32及33之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：24、25及26之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：34、35及36之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：41、42及43之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：51、52及53之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：44、45及46之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：54、55及56之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合 人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：61、62及63之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：71、72及73之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：64、65及66之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：74、75及76之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：81、82及83之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：91、92及93之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：84、85及86之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：94、95及96之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：101、102及103之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：111、112及113之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：104、105及106之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：114、115及116之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合 人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：121、122及123之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：131、132及133之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：124、125及126之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：134、135及136之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：141、142及143之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：151、152及153之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：144、145及146之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：154、155及156之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含：分別SEQ ID NO：161、162及163之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：171、172及173之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段結合人類BMP9且包含： 分別SEQ ID NO：164、165及166之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：174、175及176之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在本發明之一個態樣中，結合人類BMP9之經分離之單株抗體或其抗原結合片段包含至少一個與以下中之任一或多者至少90%、95%、97%、98%或至少99%序列一致的互補決定(CDR)序列：(a)分別SEQ ID NO：1、2及3之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：11、12及13之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(b)分別SEQ ID NO：4、5及6之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：14、15及16之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(c)分別SEQ ID NO：21、22及23之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：31、32及33之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(d)分別SEQ ID NO：24、25及26之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：34、35及36之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(e)分別SEQ ID NO：41、42及43之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：51、52及53之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(f)分別SEQ ID NO：44、45及46之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：54、55及56之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(g)分別SEQ ID NO：61、62及63之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：71、72及73之LCDR1、LCDR2及LCDR3序 列；(h)分別SEQ ID NO：64、65及66之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：74、75及76之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(i)分別SEQ ID NO：81、82及83之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：91、92及93之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(j)分別SEQ ID NO：84、85及86之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：94、95及96之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(k)分別SEQ ID NO：101、102及103之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：111、112及113之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(l)分別SEQ ID NO：104、105及106之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：114、115及116之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(m)分別SEQ ID NO：121、122及123之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：131、132及133之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(n)分別SEQ ID NO：124、125及126之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：134、135及136之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(o)分別SEQ ID NO：141、142及143之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：151、152及153之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(p)分別SEQ ID NO：144、145及146之HCDR1、HCDR2及 HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：154、155及156之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(q)分別SEQ ID NO：161、162及163之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：171、172及173之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或(r)分別SEQ ID NO：164、165及166之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：174、175及176之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-1之VH及VL胺基酸序列。在另一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含與如表1中所述之BMP9-1之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VH胺基酸序列，及/或與如表1中所述之BMP9-1之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VL胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-2之VH及VL胺基酸序列。在另一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含與如表1中所述之BMP9-2之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VH胺基酸序列，及/或與如表1中所述之BMP9-2之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VL胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-3之VH及VL胺基酸序列。在另一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含與如表1中所述之BMP9-3之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VH胺基酸序列，及/或與如表1中所述之BMP9-3之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VL胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-4之VH及VL胺基酸序列。在另一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含與如表1中所述之BMP9-4之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VH胺基酸序列，及/或與如表1中所述之BMP9-4之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VL胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-5之VH及VL胺基酸序列。在另一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含與如表1中所述之BMP9-5之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VH胺基酸序列，及/或與如表1中所述之BMP9-5之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VL胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-6之VH及VL胺基酸序列。在另一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含與如表1中所述之BMP9-6之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VH胺基酸序列，及/或與如表1中所述之BMP9-6之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VL胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-7之VH及VL胺基酸序列。在另一個態樣 中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含與如表1中所述之BMP9-7之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VH胺基酸序列，及/或與如表1中所述之BMP9-7之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VL胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-8之VH及VL胺基酸序列。在另一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含與如表1中所述之BMP9-8之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VH胺基酸序列，及/或與如表1中所述之BMP9-8之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VL胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種抗體或其抗原結合片段，其包含如表1中所述之BMP9-9之VH及VL胺基酸序列。在另一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含與如表1中所述之BMP9-9之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VH胺基酸序列，及/或與如表1中所述之BMP9-9之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致之VL胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其描述於表1中。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：7之VH序列；SEQ ID NO：27之VH序列；SEQ ID NO：47之VH序列；SEQ ID NO：67之VH序列；SEQ ID NO：87之VH序列；SEQ ID NO：107之VH序列；SEQ ID NO：127之VH序列；SEQ ID NO：147之VH序列；或SEQ ID NO：167之VH序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：17之VL序列；SEQ ID NO：37之VL序列；SEQ ID NO：57之VL序列；SEQ ID NO：77之VL序列；SEQ ID NO：97之VL序列；SEQ ID NO：117之VL序列；SEQ ID NO：137之VL序列；SEQ ID NO：157之VL序列；或SEQ ID NO：177之VL序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：7之VH序列及SEQ ID NO：17之VL序列；SEQ ID NO：27之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列；SEQ ID NO：47之VH序列及SEQ ID NO：57之VL序列；SEQ ID NO：67之VH序列及SEQ ID NO：77之VL序列；SEQ ID NO：87之VH序列及SEQ ID NO：97之VL序列；SEQ ID NO：107之VH序列及SEQ ID NO：117之VL序列；SEQ ID NO：127之VH序列及SEQ ID NO：137之VL序列；SEQ ID NO：147之VH序列及SEQ ID NO：157之VL序列；或SEQ ID NO：167之VH序列及SEQ ID NO：177之VL序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：9之重鏈序列；SEQ ID NO：29之重鏈序列；SEQ ID NO：49之重鏈序列；SEQ ID NO：69之重鏈序列；SEQ ID NO：89之重鏈序列；SEQ ID NO：109之重鏈序列；SEQ ID NO：129之重鏈序列；SEQ ID NO：149之重鏈序列；或SEQ ID NO：169之重鏈序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：19之輕鏈序列；SEQ ID NO：39之輕鏈序列；SEQ ID NO：59之輕鏈序列；SEQ ID NO：79之輕鏈序列；SEQ ID NO：99之輕鏈序列；SEQ ID NO：119之輕鏈序列；SEQ ID NO：139之輕鏈序列；SEQ ID NO：159之輕鏈序列；或SEQ ID NO：179之輕鏈序列。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或抗原結合片段，其包括：SEQ ID NO：9之重鏈序列；及SEQ ID NO：19之輕鏈序列；SEQ ID NO：29之重鏈序列；及SEQ ID NO：39之輕鏈序列；SEQ ID NO：49之重鏈序列；及SEQ ID NO：59之輕鏈序列；SEQ ID NO：69之重鏈序列；及SEQ ID NO：79之輕鏈序列；SEQ ID NO：89之重鏈序列；及SEQ ID NO：99之輕鏈序列；SEQ ID NO：109之重鏈序列；及SEQ ID NO：119之輕鏈序列；SEQ ID NO：129之重鏈序列；及SEQ ID NO：139之輕鏈序列；SEQ ID NO：149之重鏈序列；及SEQ ID NO：159之輕鏈序列；或SEQ ID NO：169之重鏈序列；及SEQ ID NO：179之輕鏈序列。
本發明亦包括結合BMP9之抗體及其抗原結合片段，其具有與以下至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的重鏈：SEQ ID NO：9之重鏈序列；SEQ ID NO：29之重鏈序列；SEQ ID NO：49之重鏈序列；SEQ ID NO：69之重鏈序列；SEQ ID NO：89之重鏈序列；SEQ ID NO：109之重鏈序列；SEQ ID NO：129之重鏈序列；SEQ ID NO：149之重鏈序列；或SEQ ID NO：169之重鏈序列，及/或與以下至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的輕鏈：SEQ ID NO：19之輕鏈序列；SEQ ID NO：39之輕鏈序列；SEQ ID NO：59之輕鏈序列；SEQ ID NO：79之輕鏈序列；SEQ ID NO：99之輕鏈序列；SEQ ID NO：119之輕鏈序列；SEQ ID NO：139之輕鏈序列；SEQ ID NO：159之輕鏈序列；或SEQ ID NO：179之輕鏈序列。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其以KD1nM結合人類BMP9。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其以KD500pM結合人類BMP9。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以KD200pM結合人類BMP9。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以KD100pM結合人類BMP9。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以KD50pM結合人類BMP9
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以KD20pM結合人類BMP9。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對人類BMP9之親和力比對人類BMP10大至少約100倍。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其對人類BMP9之親和力比對BMP7人類大至少約1000倍。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對人類BMP9之親和力比對人類BMP2大至少約1000倍。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對人類BMP9之親和力比對人類BMP2、對人類BMP7及對人類BMP10大至少約100倍。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分 離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對人類BMP9之親和力比對人類BMP2、人類BMP7及人類BMP10大至少約1000倍。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以KD1nM結合於食蟹獼猴BMP9、大鼠BMP9及/或小鼠BMP9。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以KD0.5nM結合於食蟹獼猴BMP9、大鼠BMP9及/或小鼠BMP9。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以KD0.2nM結合於食蟹獼猴BMP9、大鼠BMP9及/或小鼠BMP9。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以KD0.05nM結合於食蟹獼猴BMP9、大鼠BMP9及/或小鼠BMP9。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其(a)對人類BMP9之親和力比對人類BMP10、對人類BMP7及對人類BMP2大至少約1000倍；及(b)以KD1nM結合於人類BMP9、食蟹獼猴BMP9、大鼠BMP9及鼠類BMP9。在敍述KD之任一先前態樣中，KD可藉由MSD-SET分析法量測。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合於人類BMP9且在Biacore分析法中與人類BMP10之結合不可偵測。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或抗原結合片段抑制人類BMP9與人類BMP I型受體、例如人類ALK1、人類ALK2或人 類ALK3之結合。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或抗原結合片段抑制人類BMP9與人類BMP II型受體、例如人類ActRIIB、ActRIIA或BMPRII之結合。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或抗原結合片段抑制人類BMP9與人類BMP I型受體、例如人類ALK1、人類ALK2或人類ALK3之結合，且抑制人類BMP9與人類BMP II型受體、例如人類ActRIIB、ActRIIA或BMPRII之結合。人類BMP I型受體及人類BMP II型受體兩者與人類BMP9結合之該抑制無需同時。
在任一前述態樣中，人類BMP9與BMP I型及/或BMP II型受體之結合的抑制發生在經分離之抗體或其抗原結合片段濃度小於1×10-7M或1×10-8M或1×10-9M下。在一個態樣中，人類BMP9與BMP I型及/或BMP II型受體之結合的抑制發生在經分離之抗體或其抗原結合片段濃度小於1×10-9M下，如阻斷性ELISA分析法中所量測。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段展現活體外或活體內肝細胞株或初級肝細胞中BMP9誘發之ID1表現減少至少約50%。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段降低活體外人類BMP9之活性。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段降低活體外人類BMP9之活性，如HEKT-BRE-Luc報導基因分析法中 所量測。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段降低活體內人類BMP9之活性。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其交叉阻斷任一先前態樣之抗體或經分離之其抗原結合片段。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，(a)其對人類BMP9之親和力比對人類BMP10、人類BMP7及人類BMP2大至少約至少約1000倍，且(b)以小於1nM之KD結合於人類BMP9、食蟹獼猴BMP9、大鼠BMP9及鼠類BMP9。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，如在如本文所述之HEK293T-BRE-Luc分析法中所量測，其具有小於200pM之IC50。在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，如在如本文所述之HEK293T-BRE-Luc分析法中所量測，其具有小於100pM之IC50。
在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，如在如本文所述之HEK293T-BRE-Luc分析法中所量測，其具有小於約200pM之IC50。在一個態樣中，包括任一先前態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，如在如本文所述之HEK293T-BRE-Luc分析法中所量測，其具有小於或等於約100pM之IC50。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其在包括SEQ ID NO：215之人類BMP9成熟片段胺基酸殘基21- 25、43-60、86及96之抗原決定基結合於人類BMP9之成熟片段。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其在SEQ ID NO：215之人類BMP9成熟片段胺基酸殘基21-25、43-60、86及96內的抗原決定基結合於人類BMP9之成熟片段。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其在包含SEQ ID NO：215之胺基酸殘基21-25、43-60、86及96的抗原決定基結合於人類BMP9之成熟片段。在一些態樣中，結合包括經分離之抗體或其抗原結合片段之胺基酸與SEQ ID NO：215之胺基酸殘基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96之間的直接相互作用。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其在由SEQ ID NO：215之胺基酸殘基21-25、43-60、86及96組成的抗原決定基結合於人類BMP9之成熟片段。在一些態樣中，結合包括經分離之抗體或其抗原結合片段之胺基酸與SEQ ID NO：215之胺基酸殘基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96之間的直接相互作用。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其在由SEQ ID NO：215之胺基酸殘基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96組成的抗原決定基結合於人類BMP9之成熟片段。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其在包含SEQ ID NO：215之胺基酸殘基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96的抗原決定基結合於人類BMP9之成熟片段。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其在SEQ ID NO：215之人類BMP9成熟片段胺基酸殘基83-85及 95-100內的抗原決定基結合於人類BMP9之成熟片段。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其在包含SEQ ID NO：215之胺基酸殘基S83、L85、L95、Y97、H98及E100的抗原決定基結合於人類BMP9之成熟片段。在一些態樣中，結合包括經分離之抗體或其抗原結合片段之胺基酸與SEQ ID NO：215之胺基酸殘基S83、L85、L95、Y97、H98及E100之間的直接相互作用。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其在由SEQ ID NO：215之胺基酸殘基S83、L85、L95、Y97、H98及E100組成的抗原決定基結合於人類BMP9之成熟片段。在一些態樣中，結合包括經分離之抗體或其抗原結合片段之胺基酸與SEQ ID NO：215之胺基酸殘基S83、L85、L95、Y97、H98及E100之間的直接相互作用。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含分別SEQ ID NO：184、185及186之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：192、193及194之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，例如鼠類或人類化經分離之抗體或其抗原結合片段。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其為如表3中所述之B211G2。在一些態樣中，本發明係關於一種來源於B211G2之人類化抗體。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含分別SEQ ID NO：200、201及202之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：208、209及210之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，例如鼠類或人類化經分離之抗體或其抗原結合片段。
在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其為如表3中所述之4E10D7。在一些態樣中，本發明係關於一 種來源於4E10D7之人類化抗體。
在一個態樣中，特異性結合於BMP9之本發明之抗體及其抗原結合片段為經分離之單株抗體。在一個態樣中，特異性結合於BMP9之本發明之抗體及其抗原結合片段為經分離之人類單株抗體。在一個態樣中，特異性結合於BMP9之本發明之抗體及其抗原結合片段為人類化單株抗體。在一個態樣中，特異性結合於BMP9之本發明之抗體及其抗原結合片段為經分離之嵌合抗體。在一個態樣中，本發明之抗體及其抗原結合片段包含人類重鏈恆定區及人類輕鏈恆定區。
在本發明之一個態樣中，特異性結合於BMP9之經分離之抗體或其抗原結合片段為單鏈抗體。
在本發明之一個態樣中，特異性結合於BMP9之經分離之抗體或其抗原結合片段為Fab片段。
在本發明之一個態樣中，特異性結合於BMP9之經分離之抗體或其抗原結合片段為scFv。
在一個態樣中，本發明之抗體及其抗原結合片段為IgG或來源於IgG。在本發明之一個態樣中，IgG為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段包含其中胺基酸經取代至來自相應人類VH或VL生殖系序列之抗體構架中的構架。在一個態樣中，經取代至抗體構架中之胺基酸來自或來源於B211G2。在一個態樣中，經取代至抗體構架中之胺基酸來自或來源於4F10D7。在一些態樣中，經取代至抗體構架中之胺基酸包含CDR胺基酸。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段為免疫結合物之組分。在一個態樣中，免疫結合物可包含經分離之抗體或其抗原結合片段及以下任一者(作為非限制性實例)：酶、毒素、激素、生長因子或藥物。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段經由Fc區突變而具有改變之效應功能。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段抑制肝細胞(例如活體外或活體內肝細胞株及/或初級肝細胞)中BMP9活性，例如BMP9誘發之Smad1/5/8磷酸化或Id1表現。在此類態樣中，初級肝細胞包括肝臟中存在之任何細胞類型，例如肝細胞。在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段抑制肝細胞(例如活體外或活體內肝細胞株及/或初級肝細胞)中BMP9活性，例如BMP9誘發之Smad1/5/8磷酸化或Id1表現至少約50%。舉例而言，經分離之抗體或其抗原結合片段抑制肝細胞(例如活體外或活體內肝細胞株及/或初級肝細胞)中BMP9活性，例如BMP9誘發之Smad1/5/8磷酸化或Id1表現至少約50%、60%、70%、80%、90%或100%。作為非限制性實例，BMP9活性可藉由量測smad1/5/8磷酸化之量或Id1 mRNA或蛋白質含量之量來量測。
在本發明之一個態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段降低活體外人類BMP9之活性。在本發明之一個態樣中，如在例如如本文所述之HEK293T-BRE-Luc報導基因分析法中所量測，經分離之抗體或其抗原結合片段降低活體外人類BMP9之活性。
在一個態樣中，本發明提供一種任一先前態樣，例如如表1中所述之經分離之抗體或其抗原結合片段，及其他治療劑。其他治療劑可存在於包括經分離之抗體或其抗原結合片段之組合物中，或可存在於分開之組合物中。
在本發明之一個態樣中，其他治療劑降低BMP9活性。
在本發明之一個態樣中，其他治療劑為siRNA、抗體或其抗原結合片段、可溶性BMP9受體、蛋白質或小分子。
在一個態樣中，其他治療劑係選自由以下各者組成之群：抗病 毒劑、消炎劑、抗纖維化劑、抗脂肪變性劑、抗細胞凋亡劑、保肝劑及其組合。
在一個態樣中，其他治療劑係選自由以下各者組成之群：替諾福韋(tenofovir)、恩替卡韋(entecavir)、拉米夫定(lamivudine)、特布維定(telbuvudine)、阿德福韋(adefovir)、聚乙二醇化干擾素、索非布韋(sofusbuvir)、特拉匹韋(telaprevir)、達拉斯韋(daclatsivir)、西咪匹韋(simeprevir)、萊達普韋(ledasprevir)、皮質類固醇、GFT-505、賽瑞維克(cenicriviroc)、維生素E、吡格列酮(pioglitazone)、二甲雙胍(metformin)、奧貝膽酸(obeticholic acid)、GR-MD-02及其組合。
本發明亦包括包含一或多個本發明之BMP9結合分子(例如經分離之BMP9結合抗體或其抗原結合片段)及醫藥學上可接受之載劑的組合物。組合物可視情況進一步包括例如如本文所述之其他治療劑。
在一個態樣中，例如如表1中所述之本發明之經分離之抗體或其抗原結合片段可結合諸如本文中描述或此項技術中已知之治療方法或程序投與有需要之患者。經分離之抗體或其抗原結合片段可在方法或程序之前、之後或同時投與。經分離之抗體或其抗原結合片段可輔助另一治療方法或程序投與。
在一個態樣中，本發明提供一種降低細胞中BMP9活性之方法。該方法可包括使細胞與例如如表1中所述的本發明之經分離之抗體或其抗原結合片段接觸的步驟。
在一個態樣中，本發明提供一種抑制有需要之患者中BMP9之方法。該方法可包括向該患者投與治療有效量的例如如表1中所述的本發明之經分離之抗體或其抗原結合片段的步驟。在一些態樣中，患者患有肝病。在一些態樣中，肝病經本發明之經分離之抗體或其抗原結合片段治療。在一些態樣中，肝病與諸如以下之一或多種因素相關聯：C型肝炎病毒(「HCV」)感染；B型肝炎病毒(「HBV」)感染；自 體免疫性肝炎；酒精暴露；毒素暴露；藥物暴露；肝臟外傷；膽道阻塞；原發性膽汁性肝硬化；阿拉吉歐症候群(alagille syndrome)；慢性肝淤血；非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)；原發性硬化性膽管炎；血色沉著病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；以及威爾遜氏病(Wilson disease)。在一些態樣中，肝病為肝纖維化、門靜脈高血壓、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、脂肪肝病及肝硬化或其組合。在一些態樣中，肝病為肝纖維化。在一些態樣中，肝病為門靜脈高血壓。在一些態樣中，肝病為非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。在一些態樣中，肝病為脂肪肝病。在一些態樣中，肝病為肝硬化。
在一些態樣中，本發明係關於一種治療有需要之患者的方法，或一種降低患者中BMP9活性之方法，其包括投與本發明之抗體或其抗原結合片段以及其他治療劑。在一些態樣中，其他治療劑降低BMP9之活性。在一些態樣中，其他治療劑為siRNA、抗體或其抗原結合片段、可溶性受體、蛋白質或小分子。在一些態樣中，其他治療劑係選自由以下各者組成之群：抗病毒劑、消炎劑、抗纖維化劑、抗脂肪變性劑、抗細胞凋亡劑、保肝劑及其組合。在一些態樣中，其他治療劑選自由以下各者組成之群：替諾福韋、恩替卡韋、拉米夫定、特布維定、阿德福韋、聚乙二醇化干擾素、索非布韋、特拉匹韋、達拉斯韋、西咪匹韋、萊達普韋、皮質類固醇、GFT-505、賽瑞維克、維生素E、吡格列酮、二甲雙胍、奧貝膽酸、GR-MD-02及其組合。在一些態樣中，本發明之經分離之抗體或其抗原結合片段及其他治療劑同時或依序投與。在一些態樣中，經分離之抗體或其抗原結合片段輔助其他治療劑之投與來投與。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之聚核苷酸，例如一或多種核酸分子，其包括編碼本發明之抗體或其抗原結合片段，包括任一先前態樣之抗體或其抗原結合片段的序列。
在一個態樣中，本發明包括核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼本文中描述之任一抗體或其抗原結合片段。在一個態樣中，本發明提供核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼結合人類BMP9之抗體或其抗原結合片段的VH或VL序列，其中該抗體或其抗原結合片段包括：(a)分別SEQ ID NO：1、2及3之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：11、12及13之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(b)分別SEQ ID NO：4、5及6之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：14、15及16之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(c)分別SEQ ID NO：21、22及23之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：31、32及33之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(d)分別SEQ ID NO：24、25及26之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：34、35及36之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(e)分別SEQ ID NO：41、42及43之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：51、52及53之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(f)分別SEQ ID NO：44、45及46之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：54、55及56之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(g)分別SEQ ID NO：61、62及63之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：71、72及73之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列； (h)分別SEQ ID NO：64、65及66之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：74、75及76之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(i)分別SEQ ID NO：81、82及83之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：91、92及93之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(j)分別SEQ ID NO：84、85及86之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：94、95及96之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(k)分別SEQ ID NO：101、102及103之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：111、112及113之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(l)分別SEQ ID NO：104、105及106之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：114、115及116之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(m)分別SEQ ID NO：121、122及123之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：131、132及133之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(n)分別SEQ ID NO：124、125及126之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：134、135及136之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(o)分別SEQ ID NO：141、142及143之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：151、152及153之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(p)分別SEQ ID NO：144、145及146之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：154、155及156之LCDR1、LCDR2 及LCDR3序列；(q)分別SEQ ID NO：161、162及163之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：171、172及173之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或(r)分別SEQ ID NO：164、165及166之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：174、175及176之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在一個態樣中，本發明提供核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼經分離之抗體或其抗原結合片段，例如表1中描述之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段包括以下任一者：SEQ ID NO：7之VH序列；SEQ ID NO：27之VH序列；SEQ ID NO：47之VH序列；SEQ ID NO：67之VH序列；SEQ ID NO：87之VH序列；SEQ ID NO：107之VH序列；SEQ ID NO：127之VH序列；SEQ ID NO：147之VH序列；或SEQ ID NO：167之VH序列。
在一些態樣中，本發明提供核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼經分離之抗體或其抗原結合片段，例如表1中描述之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段包括以下任一者：SEQ ID NO：17之VL序列；SEQ ID NO：37之VL序列；SEQ ID NO：57之VL序列；SEQ ID NO：77之VL序列；SEQ ID NO：97之VL序列；SEQ ID NO：117之VL序列；SEQ ID NO：137之VL序列；SEQ ID NO：157之VL序列；或SEQ ID NO：177之VL序列。
在一些態樣中，本發明提供核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼經分離之抗體或其抗原結合片段，例如表1中描述之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段包括以下任一者：SEQ ID NO：7之VH序列及SEQ ID NO：17之VL序列；SEQ ID NO：27之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列；SEQ ID NO：47之 VH序列及SEQ ID NO：57之VL序列；SEQ ID NO：67之VH序列及SEQ ID NO：77之VL序列；SEQ ID NO：87之VH序列及SEQ ID NO：97之VL序列；SEQ ID NO：107之VH序列及SEQ ID NO：117之VL序列；SEQ ID NO：127之VH序列及SEQ ID NO：137之VL序列；SEQ ID NO：147之VH序列及SEQ ID NO：157之VL序列；或SEQ ID NO：167之VH序列及SEQ ID NO：177之VL序列。
在一些態樣中，本發明提供核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼經分離之抗體或其抗原結合片段，例如表1中描述之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段包括以下任一者：SEQ ID NO：9之重鏈序列；SEQ ID NO：29之重鏈序列；SEQ ID NO：49之重鏈序列；SEQ ID NO：69之重鏈序列；SEQ ID NO：89之重鏈序列；SEQ ID NO：109之重鏈序列；SEQ ID NO：129之重鏈序列；SEQ ID NO：149之重鏈序列；或SEQ ID NO：169之重鏈序列。
在一些態樣中，本發明提供核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼經分離之抗體或其抗原結合片段，例如表1中描述之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段包括以下任一者：SEQ ID NO：19之輕鏈序列；SEQ ID NO：39之輕鏈序列；SEQ ID NO：59之輕鏈序列；SEQ ID NO：79之輕鏈序列；SEQ ID NO：99之輕鏈序列；SEQ ID NO：119之輕鏈序列；SEQ ID NO：139之輕鏈序列；SEQ ID NO：159之輕鏈序列；或SEQ ID NO：179之輕鏈序列。
在一些態樣中，本發明提供核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼經分離之抗體或其抗原結合片段，例如表1中描述之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段包括以下任一者：SEQ ID NO：9之重鏈序列；及SEQ ID NO：19之輕鏈序列；SEQ ID NO：29之重鏈序列；及SEQ ID NO：39之輕鏈序列；SEQ ID NO：49之重鏈序列；及SEQ ID NO：59之輕鏈序列；SEQ ID NO： 69之重鏈序列；及SEQ ID NO：79之輕鏈序列；SEQ ID NO：89之重鏈序列；及SEQ ID NO：99之輕鏈序列；SEQ ID NO：109之重鏈序列；及SEQ ID NO：119之輕鏈序列；SEQ ID NO：129之重鏈序列；及SEQ ID NO：139之輕鏈序列；SEQ ID NO：149之重鏈序列；及SEQ ID NO：159之輕鏈序列；或SEQ ID NO：169之重鏈序列；及SEQ ID NO：179之輕鏈序列。
在一些態樣中，本發明提供核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼經分離之抗體或其抗原結合片段，例如表1中描述之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該核酸包含以下任一者：SEQ ID NO：10之重鏈序列；SEQ ID NO：8之VH序列；SEQ ID NO：20之輕鏈序列；SEQ ID NO：18之VL序列；SEQ ID NO：30之重鏈序列；SEQ ID NO：28之VH序列；SEQ ID NO：40之輕鏈序列；SEQ ID NO：38之VL序列；SEQ ID NO：50之重鏈序列；SEQ ID NO：48之VH序列；SEQ ID NO：60之輕鏈序列；SEQ ID NO：58之VL序列；SEQ ID NO：70之重鏈序列；SEQ ID NO：68之VH序列；SEQ ID NO：80之輕鏈序列；SEQ ID NO：78之VL序列；SEQ ID NO：90之重鏈序列；SEQ ID NO：88之VH序列；SEQ ID NO：100之輕鏈序列；SEQ ID NO：98之VL序列；SEQ ID NO：110之重鏈序列；SEQ ID NO：108之VH序列；SEQ ID NO：120之輕鏈序列；SEQ ID NO：118之VL序列；SEQ ID NO：130之重鏈序列；SEQ ID NO：128之VH序列；SEQ ID NO：140之輕鏈序列；SEQ ID NO：138之VL序列；SEQ ID NO：150之重鏈序列；SEQ ID NO：148之VH序列；SEQ ID NO：160之輕鏈序列；SEQ ID NO：158之VL序列；SEQ ID NO：170之重鏈序列；SEQ ID NO：168之VH序列；SEQ ID NO：180之輕鏈序列；或SEQ ID NO：178之VL序列。
在一些態樣中，本發明提供核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼經分離之抗體或其抗原結合片段，例如表1中描述之經分離之抗 體或其抗原結合片段，其中該核酸包含以下任一者：SEQ ID NO：8之VH序列及SEQ ID NO：18之VL序列；SEQ ID NO：28之VH序列及SEQ ID NO：38之VL序列；SEQ ID NO：48之VH序列及SEQ ID NO：58之VL序列；SEQ ID NO：68之VH序列及SEQ ID NO：78之VL序列；SEQ ID NO：88之VH序列及SEQ ID NO：98之VL序列；SEQ ID NO：108之VH序列及SEQ ID NO：118之VL序列；SEQ ID NO：128之VH序列及SEQ ID NO：138之VL序列；SEQ ID NO：148之VH序列及SEQ ID NO：158之VL序列；或SEQ ID NO：168之VH序列及SEQ ID NO：178之VL序列。
在一些態樣中，本發明提供核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼經分離之抗體或其抗原結合片段，其中所編碼之經分離之抗體或其抗原結合片段包括與表1中闡述之VL序列、VH序列、輕鏈序列或重鏈序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致的胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供核酸，例如一或多種聚核苷酸，其編碼表1中描述之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該核酸包括選自由以下各者組成之群的序列：SEQ ID NO：10之重鏈序列；SEQ ID NO：30之重鏈序列；SEQ ID NO：50之重鏈序列；SEQ ID NO：70之重鏈序列；SEQ ID NO：90之重鏈序列；SEQ ID NO：110之重鏈序列；SEQ ID NO：130之重鏈序列；SEQ ID NO：150之重鏈序列；SEQ ID NO：170之重鏈序列； SEQ ID NO：20之輕鏈序列；SEQ ID NO：40之輕鏈序列；SEQ ID NO：60之輕鏈序列；SEQ ID NO：80之輕鏈序列；SEQ ID NO：100之輕鏈序列；SEQ ID NO：120之輕鏈序列；SEQ ID NO：140之輕鏈序列；SEQ ID NO：160之輕鏈序列；SEQ ID NO：180之輕鏈序列；SEQ ID NO：8之VH序列；SEQ ID NO：28之VH序列；SEQ ID NO：48之VH序列；SEQ ID NO：68之VH序列；SEQ ID NO：88之VH序列；SEQ ID NO：108之VH序列；SEQ ID NO：128之VH序列；SEQ ID NO：148之VH序列；SEQ ID NO：168之VH序列；SEQ ID NO：18之VL序列；SEQ ID NO：38之VL序列；SEQ ID NO：58之VL序列；SEQ ID NO：78之VL序列；SEQ ID NO：98之VL序列；SEQ ID NO：118之VL序列；SEQ ID NO：138之VL序列；SEQ ID NO：158之VL序列；及 SEQ ID NO：178之VL序列。
與核酸相關的本發明之態樣涵蓋如下實施例，其中該核酸安置於單一連續聚核苷酸上，例如編碼1)本發明之抗體或其抗原結合片段之輕鏈或VL及2)本發明之抗體或其抗原結合片段之重鏈或VH的單一連續聚核苷酸。本發明亦涵蓋如下實施例，其中該核酸安置於兩個或兩個以上連續聚核苷酸上，例如編碼本發明之抗體或其抗原結合片段之輕鏈或VL的一個聚核苷酸，及編碼本發明之抗體或其抗原結合片段之重鏈或VH的另一聚核苷酸。
本發明亦提供一種載體，其包括核酸或聚核苷酸，例如本文中描述之核酸或聚核苷酸。本發明亦提供一種細胞，例如宿主細胞，其包括此類核酸或聚核苷酸。在本發明之一個態樣中，經分離之宿主細胞包括包含此類核酸或聚核苷酸之載體。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之宿主細胞，其包含(1)編碼本發明抗體之重鏈的重組核酸區段，及(2)編碼本發明抗體之輕鏈的第二重組核酸區段；其中該等DNA區段分別可操作地連接於第一及第二啟動子，且能夠在該宿主細胞中表現。在本發明之另一個態樣中，經分離之宿主細胞包含分別編碼本發明抗體之重鏈及輕鏈的重組DNA區段，其中該DNA區段可操作地連接於啟動子，且能夠在該等宿主細胞中表現。在一個態樣中，宿主細胞為非人類哺乳動物細胞株。在一個態樣中，宿主細胞為人類細胞株。在一個態樣中，抗體或其抗原結合片段為人類單株抗體或其抗原結合片段。在一個態樣中，抗體或其抗原結合片段為一種人類化單株抗體或其抗原結合片段。
本發明提供一種如本文所述之BMP9抗體或其抗原結合片段、聚核苷酸、載體或宿主細胞的用途，其係用於製造藥劑。本發明提供一種如本文所述之BMP9抗體或其抗原結合片段，其係用作藥劑。本發明提供一種如本文所述之BMP9抗體或其抗原結合片段，其係用於療 法。本發明提供一種如本文所述之抗體或其抗原結合片段，其係用於治療纖維化病狀。本發明提供一種如本文所述之抗體或其抗原結合片段，其係用於治療肝病，包括與選自由以下各者組成之群組的一或多種因素相關之肝病：C型肝炎病毒(「HCV」)感染；B型肝炎病毒(「HBV」)感染；自體免疫性肝炎；酒精暴露；毒素暴露；藥物暴露；肝臟外傷；膽道阻塞；原發性膽汁性肝硬化；阿拉吉歐症候群；慢性肝淤血；非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)；原發性硬化性膽管炎；血色沉著病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；或威爾遜氏病。本發明提供一種如本文所述之抗體或其抗原結合片段，其用於治療肝纖維化、門靜脈高血壓、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、脂肪肝病或肝硬化。
在一個態樣中，本發明提供一種例如如本文所述之結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其用於降低有需要之患者中BMP9之活性。
在一個態樣中，本發明提供一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包括表1中列出之CDR，例如一或多個CDR。舉例而言，該結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段可包括表1中列出之2、3、4、5或6個CDR。
在一個態樣中，本發明提供一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其列於表1中。
在一個態樣中，本發明提供一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包括與表1中描述之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的VH胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包括與表1中描述之VL胺基酸序列至少90%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的VL胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包括與表1中描述之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的VH胺基酸序列，及與表1中描述之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的VL胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含與表1中描述之輕鏈胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的輕鏈胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包括與表1中描述之重鏈胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的重鏈胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包括與表1中描述之輕鏈胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的輕鏈胺基酸序列，及與表1中描述之重鏈胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的重鏈胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之聚核苷酸，其編碼任一前述態樣之抗體或其抗原結合片段。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之聚核苷酸，其編碼結合人類BMP9之抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包 括表1中列出之CDR。結合人類BMP9之該抗體或其抗原結合片段可包括超過一個表1中列出之CDR，例如2、3、4、5或6個表1中列出之CDR。
定義
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習本發明所屬技術者所通常理解相同之含義。
如本文所用，「BMP9」意指此項技術已知之TGFβ/BMP超家族成員，已知其為間質幹細胞之骨母細胞分化的有效誘導子(參見Tang等人(2008)J Cell Mol Med.[PMID：19175684])，蛋白質骨成形性蛋白9(BMP9)(本文中亦可互換地稱為「BMP9」、「BMP-9」、「生長分化因子2」、「GDF-2」、「GDF2」及「生長/分化因子2前驅物」)或編碼BMP9之基因或核酸。亦展示BMP9與葡萄糖代謝調節有關，能夠降低糖尿病小鼠中之血糖(中樞神經系統中膽鹼能神經元之分化因子)，且誘導在鐵穩態中起作用之激素(鐵調素)的表現(David等人2008.Circ Res.4月25日；102(8)：914-22)。
代表性BMP9序列包括(但不限於)以下闡述之序列。
BMP9/生長分化因子2[智人](NP_057288)(SEQ ID NO：213)。
BMP9/生長分化因子2[智人](AF188285)(SEQ ID NO：214)
BMP9之成熟片段/生長分化因子2[智人](來自NP_057288之胺基酸)(SEQ ID NO：215)：
鼠類及其他動物BMP9分子為此項技術中已知(參見例如鼠類BMP9之NP_062379及大鼠BMP9之NP_001099566)。
如本文所述，結合於BMP9之抗體、其抗原結合片段結合於BMP9蛋白質。如本文所用，「huBMP9」係指人類BMP9或其片段。
如本文所用，「BMP2」意謂蛋白質骨成形性蛋白2(BMP2)或編碼BMP2之基因或核酸。BMP2亦稱為：BDA2；以及BMP2A；External ID OMIM：112261 MGI：88177 HomoloGene：926 GeneCards：BMP2基因。物種：人類；Entrez：650；Ensembl：ENSG00000125845；UniProt：P12643；RefSeq(mRNA)：NM_001200；RefSeq(蛋白質)：NP_001191；位置(UCSC)：Chr 20：6.75-6.76Mb。物種：小鼠；Entrez：12156；Ensembl：ENSMUSG00000027358；UniProt：P21274；RefSeq(mRNA)：NM_007553；RefSeq(蛋白質)：NP_031579；位置(UCSC)：Chr 2：133.55-133.56Mb。如本文所述，結合於BMP2之抗體、其抗原結合片段結合於BMP2蛋白質。
如本文所用，「BMP7」意謂蛋白質骨成形性蛋白7(BMP7)或編碼BMP7之基因或核酸。BMP7亦稱為：成骨蛋白質-1；OP-1；External ID OMIM：112267 MGI：103302 HomoloGene：20410 GeneCards：BMP7基因。物種：人類；Entrez：655；Ensembl：ENSG00000101144；UniProt：P18075；RefSeq(mRNA)：NM_001719；RefSeq(蛋白質)：NP_001710；位置(UCSC)：Chr 20：55.74-55.84Mb。物種：小鼠；Entrez：12162；Ensembl：ENSMUSG00000008999；UniProt：P23359；RefSeq(mRNA)：NM_007557；RefSeq(蛋白質)：NP_031583；位置(UCSC)：Chr 2：172.87-172.94Mb。如本文所述，結合於BMP7之抗體、其抗原結合片段結合於BMP7蛋白質。
如本文所用，「BMP10」意謂此項技術已知之TGFβ/BMP超家族成員骨成形性蛋白10(BMP10)(本文中亦可互換地稱為「BMP10」、「BMP-10」、「MGC126783」及「骨成形性蛋白10前驅物」)或編碼BMP10之基因或核酸。已提出BMP10為在心室發育期間調節心肌細胞增殖及成熟之主要組分。(Chen等人，(2004)Development.131(9)：2219-31及Neubaus等人，(1999)Mech Dev.,80(2)：181-4)。代表性BMP10序列包括(但不限於)以下闡述之序列。
骨成形性蛋白10前原蛋白[智人](NP_055297)(SEQ ID NO：216)
骨成形性蛋白10[智人](NM_014482)(SEQ ID NO：217)
鼠類及其他動物BMP10分子為此項技術中已知(參見例如鼠類BMP10之NP_033886)。如本文所述，結合於BMP10之抗體、其抗原結合片段結合於BMP10蛋白質。
「Smad」係指將細胞外信號自轉型生長因子β配位體轉導至細胞核之細胞內蛋白質家族，其中其活化下游基因轉錄(參見例如Heldin CH(1997),Nature 390(6659)：465-71；Attisano L(1998)Curr.Opin.Cell Biol.10(2)：188-94；Massagué J(1998),Annu.Rev.Biochem.67：753-91；Attisano L(2002)Science 296(5573)：1646-7；Whitman M(1998)Genes Dev.12(16)：2445-62；Wrana JL(2000)Sci.STKE 2000(23)：RE1；Wharton K,(2009),Development 136(22)：3691-7)。受體調節之Smad(R-SMAD)包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5及Smad8/9。術語「smad」包括Smad之基因，例如Smad1、Smad5或Smad8之基因，或Smad蛋白質，例如Smad1、Smad5或Smad8。不受理論束縛，咸信Smad1、Smad5及Smad8藉由配位體之BMP子族，包括BMP9優先活化。Smad家族之多個成員藉由其編號一起提及。因此，舉例而言，「Smad1/5/8」係指Smad1、Smad5及/或Smad8。「Smad1/5」係指Smad1及/或Smad5。再次，不受理論束縛，咸信經由Smad進行信號傳導引起Smad蛋白質磷酸化。「pSmad」係指磷酸化之Smad蛋白質。
「Id1」意謂基因Id1或蛋白質Id1(參見例如Benezra R,Cell 61(1)：49-59；Hara E(1994)J Biol Chem 269(3)：2139-45；Ruzinova MB(2003)Trends in Cell Biology 13(8)：410-8；Perk J(2005)Nat Rev Cancer 5(8)：603-614；Korchynskyi O(2002).J Biol Chem.,277(7)：4883-91)。DNA結合蛋白抑制劑1(Id1)為可與例如轉錄因子之基本HLH家族之成員形成雜二聚體的螺旋-環形-螺旋(HLH)蛋白質。不受理論束縛，Id1為BMP信號傳導路徑，包括BMP9之熟知標靶基因。
如本文所用，術語「纖維化」係指器官或組織中藉由細胞異常形成或發展過量纖維結締組織。雖然與纖維化相關之過程可作為正常組織形成或修復之一部分存在，但此等過程之失調可引起細胞組成改 變且過量結締組織沈積，逐漸損害組織或器官功能。存在若干類型之纖維化，例如胰臟及肺之囊腫性纖維化、注射纖維化(其可作為肌肉內注射之併發症發生，尤其在兒童中)、心內膜心肌纖維化、肺之特發性肺部纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維化、腹膜後纖維化、進行性大塊纖維化(煤礦工人塵肺症之併發症)及腎源性全身性纖維化。
如本文所用，術語「纖維化病症」、「纖維化病狀」及「纖維化疾病」可互換地使用以指特徵為纖維化之病症、病狀或疾病。纖維化病症之實例包括(但不限於)血管纖維化、肺纖維化(例如特發性肺纖維化)、胰纖維化、肝纖維化(例如「纖維化肝病」，例如肝硬化)、腎纖維化、肌骨胳纖維化、心臟纖維化(例如心內膜心肌纖維化、特發性心肌病)、皮膚纖維化(例如硬皮病、創傷後、手術皮膚結疤、瘢痕瘤及皮膚瘢痕瘤形成)、眼睛纖維化(例如青光眼、眼睛硬化、結膜及角膜結疤及翼狀胬肉)、進行性全身性硬化症(PSS)、慢性移植物抗宿主疾病、佩洛尼氏病(Peyronie's disease)、膀胱鏡檢查後尿道狹窄、特發性及藥理學上誘發之腹膜後纖維化、縱隔纖維化、進行性大塊纖維化、增生性纖維化及贅生性纖維化。
如本文所用，術語「纖維化肝病」及「肝纖維化」可互換地使用，且係指特徵為肝臟中藉由細胞異常形成或發展過量纖維結締組織(例如細胞外基質(「ECM」)蛋白質，包括膠原蛋白)之肝臟疾病。不受任何特定理論束縛，咸信活化之肝星形細胞、門管區纖維母細胞及肌纖維母細胞為肝臟中主要纖維母細胞(亦即產生ECM之細胞)。肝纖維化引起門靜脈高血壓。晚期肝纖維化引起肝硬化、肝功能衰竭。
可用本發明之抗體或其抗原結合片段治療之纖維化肝病，包括引起肝硬化及/或門靜脈高血壓之纖維化肝病，可由例如以下引起：C型肝炎病毒(「HCV」)感染；B型肝炎病毒(「HBV」)感染；自體免疫性肝炎；酒精、毒素或藥物暴露；肝臟外傷；膽道阻塞；原發性膽 汁性肝硬化；阿拉吉歐症候群；慢性肝淤血，包括由心肌疾病或肝流出阻塞引起；非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)；原發性硬化性膽管炎；血色沉著病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；以及威爾遜氏病。
如本文所用，術語「BMP9抗體」、「抗BMP9抗體」、「BMP9結合抗體」、「BMP9拮抗性抗體」及其類似物(及其抗原結合片段)包括結合於蛋白質BMP9之抗體(及其抗原結合片段)。
如本文所用，術語「細胞」係指易於進行纖維化反應之任何細胞，包括(但不限於)組織及器官內之個別細胞、組織及細胞。如本文所用，術語細胞包括細胞本身，以及細胞周圍之細胞外基質(ECM)。舉例而言，抑制細胞之纖維化反應包括(但不限於)抑制以下各者之纖維化反應：肺(或肺組織)內一或多個細胞；肝臟(或肝臟組織)內一或多個細胞；腎(或腎組織)內一或多個細胞；肌肉組織內一或多個細胞；心臟(或心肌組織)內一或多個細胞；胰臟內一或多個細胞；皮膚內一或多個細胞；骨骼內一或多個細胞；血管內一或多個細胞；一或多個幹細胞；或眼睛內一或多個細胞。
如本文所用，術語「上皮-間質轉化」(EMT)係指自上皮表現型轉換成間質表現型，此為胚胎發育之正常過程。EMT亦為其中充當離子及流體轉運體之受傷上皮細胞變成基質重塑間質細胞的過程。在癌瘤中，此轉型引起細胞形態改變、間質蛋白質表現及侵襲性增加。用於界定活體外EMT之準則涉及上皮細胞極性喪失、分成個別細胞且隨後在獲得細胞活動性之後分散(Vincent-Salomon等人，Breast Cancer Res.2003；5(2)：101-106)。在EMT期間表現、分佈及/或功能改變且因果相連之分子類別包括生長因子(例如轉型生長因子(TGF)-β、wnts)、轉錄因子(例如snail、SMAD、LEF及核β-連環蛋白)、細胞間黏著軸之分子(鈣黏素、聯蛋白)、細胞骨架調節劑(ρ家族)及細胞外蛋白酶(基質金屬蛋白酶、纖維蛋白溶酶原活化因子)(參見Thompson等人， Cancer Research 65,5991-5995,7月15日，2005)。
如本文所用，術語「抗體」及其類似物包括全抗體及其任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或單一鏈。天然存在之「抗體」為包含經二硫鍵相互連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的醣蛋白。各重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個域(CH1、CH2及CH3)構成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中簡化為VL)及輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個域CL構成。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL由自胺基端至羧基端依以下順序排列之三個CDR及四個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q))的結合。
如本文所用，術語「抗原結合片段」、「其抗原結合片段」、抗體之「抗原結合部分」及其類似物係指保留特異性結合於既定抗原(例如BMP9)之能力的完整抗體之一或多個片段。抗體之抗原結合功能可由完整抗體之片段執行。術語抗體之「抗原結合部分」內涵蓋的結合片段之實例包括Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；F(ab)2片段，一種包含在鉸鏈區藉由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；由VH及CH1域組成之Fd片段；由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；由VH域組成之單域抗體(dAb)片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)；及經分離之互補決定區(CDR)。
此外，儘管Fv片段之兩個域(VL及VH)藉由獨立基因編碼，然而其可使用重組方法藉由人工肽連接子接合，該連接子能夠使其製造成VL及VH區成對以形成單價分子之單蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如Bird等人，1988 Science 242：423-426；及Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此類單鏈抗體包括抗體之一或多個「抗原結合部分」。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式來篩選片段供使用。
抗原結合片段亦可併入單域抗體、最大抗體、微型抗體、胞內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv中(參見例如Hollinger及Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136)。抗體之抗原結合部分可移植至基於諸如纖維結合蛋白III型(Fn3)之多肽(參見美國專利第6,703,199號，其描述纖維結合蛋白多肽單功能抗體)之骨架中。
抗原結合部分可併入包含一對串聯Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)之單鏈分子中，該等Fv片段連同互補輕鏈多肽形成一對抗原結合區(Zapata等人，1995 Protein Eng.8(10)：1057-1062；及美國專利第5,641,870號)。
如本文所用，術語「親和力」係指位於單抗原位點處抗體與抗原之間的相互作用的強度。在各抗原位點內，抗體「臂」之可變區經由弱非共價力與抗原在多個位點處相互作用；相互作用愈大，親和力愈強。
如本文所用，術語「親合力」係指抗體-抗原複合物之整體穩定性或強度的資訊性量度。其由三個主要因素控制：抗體抗原決定基親和力；抗原與抗體兩者之價數；以及相互作用部分之結構配置。最終，此等因素界定抗體之特異性，亦即特定抗體結合於精確的抗原之抗原決定基的可能性。
術語「胺基酸」係指天然存在及合成之胺基酸，以及以類似於天然存在之胺基酸的方式起作用之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸為由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及後期經修飾之彼等胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷絲胺酸。胺基酸類似物 係指基礎化學結構與天然存在之胺基酸相同(亦即α碳與氫、羧基、胺基及R基團結合)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有經修飾之R基(例如正白胺酸)或經修飾之肽主鏈，但保持與天然存在之胺基酸相同之基礎化學結構。胺基酸模擬物係指具有與胺基酸之一般化學結構不同之結構，但以與天然存在之胺基酸類似之方式起作用的化合物。
如本文所用，術語「結合特異性」係指個別抗體組合位點與一種抗原決定子反應且不與不同抗原決定子反應的能力。抗體之組合位點位於分子之Fab部分中，且自重鏈及輕鏈之高變區構築。抗體之結合親和力為單個抗原決定子與抗體上單個組合位點之間的反應強度。其為抗原決定子與抗體組合位點之間作用的引力與斥力總和。
兩個實體之間的特異性結合意謂以至少1×107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1、1013M-1或1014M-1之平衡常數(KA或KA)結合。短語「特異性(或選擇性)結合」於抗體(例如BMP9結合抗體)係指決定蛋白質之異質群體及其他生物製劑中同源抗原(例如人類BMP9蛋白質)存在之結合反應。除上文提及之平衡常數(KA)之外，本發明之BMP9結合抗體通常亦具有約1×10-2s-1、1×10-3s-1或更低之解離速率常數(Kd或Koff)，且以比對結合於非特異性抗原(例如BMP2、BMP10或BMP7)之親和力大至少兩倍的親和力結合於BMP9。短語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性結合於抗原之抗體」互換使用。
術語「嵌合抗體」(或其抗原結合片段)為如下抗體分子(或其抗原結合片段)，其中(a)恆定區或其部分經改變、置換或更換，使得抗原結合位點(可變區)連接於不同或改變類別、效應功能及/或物種之恆定區或賦予嵌合抗體新特性之完全不同分子，例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區或其部分經具有不同或改變抗原特 異性之可變區改變、置換或更換。舉例而言，小鼠抗體可藉由用來自人類免疫球蛋白之恆定區置換其恆定區來修飾。由於經人類恆定區置換，因此嵌合抗體可保持其識別抗原之特異性，同時相較於初始小鼠抗體，其在人類中之抗原性降低。
術語「經保守修飾之變異體」適用於胺基酸及核酸序列。關於特定核酸序列，經保守修飾之變異體係指編碼一致或基本上一致胺基酸序列之彼等核酸，或其中該核酸不依照基本上一致序列來編碼胺基酸序列。由於遺傳密碼之簡併，因此許多在功能上相同之核酸編碼任何既定蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸藉由密碼子說明之每一位置上，密碼子可在不改變所編碼之多肽的情況下改變成任何所對應密碼子。此類核酸變化為「沉默變異」，其為一種經保守修飾之變異。本文中編碼多肽之每一核酸序列亦描述核酸之每一可能的沉默變異。熟習此項技術者應認識到核酸中之各密碼子(除通常為甲硫胺酸之唯一密碼子之AUG及通常為色胺酸之唯一密碼子之TGG外)可經修飾以產生功能上一致之分子。因此，編碼多肽之核酸的各沉默變異隱含於各所述序列中。
就多肽序列而言，「經保守修飾之變異體」包括使得胺基酸經化學上類似之胺基酸取代的針對多肽序列之個別取代、缺失或添加。提供功能上類似之胺基酸的保守取代表為此項技術中熟知。此類經保守修飾之變異體另外為且不排除本發明之多晶型變異體、種間同源物及對偶基因。以下八組含有彼此為保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；以及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如 Creighton,Proteins(1984))。在一個實施例中，術語「保守序列修飾」係用於指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體之結合特徵的胺基酸修飾。
如本文所用，術語「阻斷」係指中止或預防相互作用或過程，例如中止配位體依賴性或非配位體依賴性信號傳導。
如本文所用，術語「識別」係指抗體、其抗原結合片段發現其構形抗原決定基且與其相互作用(例如結合)。
術語「交叉阻斷(cross-block)」、「交叉阻斷(cross-blocked)」、「交叉阻斷(cross-blocking)」、「競爭」、「交叉競爭」及相關術語在本文中可互換地使用以意謂在標準競爭結合分析法中抗體或其他結合劑干擾其他抗體或結合劑與BMP9之結合的能力。
抗體或其他結合劑能夠干擾另一抗體或結合分子與BMP9結合之能力或程度及因此其是否可根據本發明稱為交叉阻斷可使用標準競爭結合分析法來確定。一種適合分析法涉及使用Biacore技術(例如藉由使用BIAcore 3000儀器(Biacore,Uppsala,Sweden))，其可使用表面電漿子共振技術量測相互作用之程度。用於量測交叉阻斷之另一分析法使用基於ELISA之方法。雖然預期該等技術產生實質上類似結果，但認為Biacore技術之量測為決定性的。
術語「中和」意謂抗體在結合於其標靶時，降低標靶活性、含量或穩定性；例如BMP9抗體在結合於BMP9時藉由至少部分降低BMP9之活性、含量或穩定性，諸如信號傳導或其在Smad1/5/8磷酸化及/或纖維化(例如肝纖維化)中之作用來中和BMP9。
術語「抗原決定基」意謂能夠與抗體特異性結合之蛋白質決定子。抗原決定基通常由諸如胺基酸或糖側鏈之分子之化學活性表面基團組成，且通常具有特定三維結構特徵，以及荷質比特徵。構形抗原決定基與非構形抗原決定基區別在於，在變性溶劑存在下，與前者之 結合消失，但與後者之結合未消失。
術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合於免疫球蛋白或者以其他方式與分子相互作用之任何蛋白質決定子。抗原決定基決定子一般由諸如胺基酸或碳水化合物或糖側鏈之分子之化學活性表面基團組成，且通常具有特定三維結構特徵，以及荷質比特徵。抗原決定基可為「線性」或「構形」。
術語「線性抗原決定基」係指蛋白質與相互作用分子(諸如抗體)之間的所有相互作用點沿蛋白質之一級胺基酸序列線性(連續)存在的抗原決定基。
如本文所用，術語IgG抗體之「高親和力」係指抗體對例如BMP9之標靶抗原具有10-8M或更低，更佳10-9M或更低或10-10M或10-11M或更低之KD。然而，「高親和力」結合對於其他抗體同種型可變化。舉例而言，對於IgM同型，「高親和力」結合係指抗體具有10-7M或更低，或10-8M或更低之KD。
如本文所用，術語「人類抗體」(或其抗原結合片段)意欲包括具有其中構架區及CDR區均來源於人類來源序列之可變區的抗體(及其抗原結合片段)。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦來源於此類人類序列，例如人類生殖系序列或人類生殖系序列之突變型式。本發明之人類抗體及其抗原結合片段可包括不由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入的突變)。
如本文所用，短語「單株抗體」或「單株抗體組合物」(或其抗原結合片段)係指具有實質上一致之胺基酸序列或來源於相同基因來源之多肽，包括抗體、抗體片段、雙特異性抗體等。此術語亦包括單一分子組成之抗體分子之製劑。單株抗體組合物顯示針對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。
術語「人類單株抗體」(或其抗原結合片段)係指展示單一結合特異性之抗體(及其抗原結合片段)，其具有其中構架區及CDR區均來源於人類序列之可變區。在一個實施例中，人類單株抗體由融合瘤產生，該融合瘤包括與永生化細胞融合的自轉殖基因非人類動物(例如轉殖基因小鼠)獲得的B細胞，其具有包含人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉殖基因之基因組。
如本文所用，短語「重組人類抗體」(或其抗原結合片段)包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體(及其抗原結合片段)，諸如自針對人類免疫球蛋白基因進行轉殖基因或轉殖染色體的動物(例如小鼠)或自其製備之融合瘤分離之抗體、自經轉型以表現人類抗體之宿主細胞、例如自轉染瘤分離之抗體、自重組、組合人類抗體文庫分離之抗體及藉由涉及所有或一部分人類免疫球蛋白基因、序列與其他DNA序列之剪接的任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體。此類重組人類抗體具有其中構架及CDR區來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。在一個實施例中，此類重組人類抗體可經受活體外突變誘發(或當使用針對人類Ig序列轉殖基因之動物時，為活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為雖然來源於人類生殖系VH及VL序列且與其相關，但可不活體內天然存在於人類抗體生殖系譜系內之序列。
如本文所用，「人類化」抗體(或其抗原結合片段)為保留非人類抗體之反應性，同時在人類中免疫原性較低之抗體(或其抗原結合片段)。舉例而言，此可藉由保持非人類CDR區且用其人類對應物替換抗體之剩餘部分(亦即，恆定區以及可變區之構架部分)來達成。參見例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855,1984；Morrison及Oi,Adv.Immunol.,44：65-92,1988；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28：489-498, 1991；及Padlan,Molec.Immun.,31：169-217,1994。人類工程改造技術之其他實例包括(但不限於)美國專利第5,766,886號中所揭示之Xoma技術。
在兩個或兩個以上核酸或多肽序列之情況下，術語「一致」或「一致性」百分比係指兩個或兩個以上序列或子序列相同。當在比較窗或指定區域上根據最大對應性比較及比對時，如使用以下序列比較演算法之一或藉由人工比對及目視檢查所量測，若兩個序列具有特定百分比的相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即在特定區域上，或未說明時在整個序列上，60%一致、視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致)，則兩個序列為「實質上一致」。視情況，一致性存在於至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)長度之區域上，或更佳100至500個或1000個或更多個核苷酸(或20、50、200個或更多個胺基酸)長度之區域上。視情況，一致性存在於以長度計至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區域上，或更多較佳在以長度計100個至500個或1000個或更多個核苷酸(或20個、50個、200個或更多個胺基酸)之區域上。
就序列比較而言，通常一個序列充當參考序列，測試序列與其比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。接著序列比較演算法基於程式參數來計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
如本文所用，「比較窗」包括提及在兩個序列最佳比對之後，一個序列可與具有相同鄰接位置數目之參考序列比較的區段，該區段具有任一個選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成之群的鄰接位置數目。用於比較之序列比對方法為此項技術中所熟知。可例如藉由以下進行序列之最佳比對以進行比較：Smith及 Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源性演算法；Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443,1970之同源性比對演算法；Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444,1988之類似性搜索法；此等演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics套裝軟體(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.)中GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)；或手動比對及目視檢查(參見例如Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(ringbou版，2003))。
適用於測定序列一致性及序列相似性百分比之演算法之兩個實例為BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別描述於Altschul等人，Nuc.Acids Res.25：3389-3402,1977及Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410,1990中。進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。此演算法包括藉由鑑別查詢序列中之長度W之短字來首先鑑別高評分序列對(HSP)，該等短字在與資料庫序列中相同長度之字比對時匹配或滿足某些正值臨限值分數T。T稱為鄰域字分數臨限值(Altschul等人，前述)。此等初始鄰域字命中充當用於起始搜索之種子以尋找含有其之較長HSP。字命中沿各序列在兩個方向上延伸，只要累積比對分數增加即可。就核苷酸序列而言，累積評分使用參數M(一對匹配殘基之獎勵分數；始終>0)及N(錯配殘基之罰分；始終<0)計算。就胺基酸序列而言，評分矩陣用於計算累積分數。當以下情況時，字命中在各方向中之延伸中斷：累積比對分數自其達成之最大值降低量X；累積分數因一或多種負評分殘基比對之累積而變成0或0以下；或達到任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X決定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(用於核苷酸序列)係使用字長(N)11、期望值(E)或10、M=5、N=-4及雙股比較作為預設參數。就胺基酸序列而言， BLASTP程式使用以下預設：字長為3，及期望值(E)為10，且BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915,1989)，比對(B)為50，期望值(E)為10，M=5，N=-4，及雙股線之對比。
BLAST演算法亦對兩個序列之間的相似性進行統計分析(參見例如Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787,1993)。藉由BLAST演算法得到之一種相似性量度為最小總和機率(P(N))，其指示兩個核苷酸或胺基酸序列之間隨機出現匹配之機率。舉例而言，若測試核酸與參考核酸比較時的最小總機率小於約0.2，更佳小於約0.01，且最佳小於約0.001，則認為核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列之間的一致性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17,1988)演算法(其已併入ALIGN程式(版本2.0)中)，使用PAM120權重殘基表(空隙長度罰分為12且空隙罰分為4)測定。此外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453,1970)演算法(其已併入GCG套裝軟體(可在www.gcg.com獲得)中之GAP程式中)，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及間隙權重16、14、12、10、8、6或4及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。
如下文所述，除以上提到之序列一致性之百分比之外，兩個核酸序列或多肽實質上一致之另一指示為，藉由第一核酸編碼之多肽與針對藉由第二核酸編碼之多肽所產生之抗體免疫交叉反應。因此，例如在兩個肽不同之處僅為保守性取代的情況下，多肽通常與第二多肽實質上一致。如下所述，兩個核酸序列實質上一致之另一指示為兩個分子或其補體在嚴格條件下彼此雜交。兩個核酸序列實質上一致之另一指示為可使用相同引子擴增序列。
如本文所用，術語「經分離之抗體」(或其抗原結合片段)係指實 質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(或其抗原結合片段)(例如特異性結合BMP9之經分離之抗體實質上不含特異性結合除BMP9外之抗原的抗體)。另外，經分離之抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
術語「同型」係指藉由重鏈恆定區基因提供之抗體類別(例如IgM、IgE、IgG，諸如IgG1或IgG4)。同型亦包括此等類別之一的經修飾之型式，其中進行修飾以改變Fc功能，例如增強或減弱效應功能或與Fc受體之結合。
如本文所用，術語「Kassoc」、「Ka」或「Kon」意欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而如本文所用，術語「Kdis」、「Kd」或「Koff」意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。在一個實施例中，如本文所用，術語「KD」意欲指解離常數，其獲自Kd與Ka之比率(亦即Kd/Ka)且以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可使用此項技術中充分確立之方法測定。一種測定抗體KD之方法係藉由使用表面電漿子共振或使用生物感測器系統(諸如Biacore®系統)。在解離常數小於約10-9M之情況下，溶液平衡動力學排除KD量測(MSD-SET)為一種測定抗體KD之較佳方法(參見例如Friquet,B.,Chaffotte,A.F.,Djavadi-Ohaniance,L.，及Goldberg,M.E.(1985).Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay.J Immnunol Meth 77,305-319；以引用的方式併入本文中)。
如本文所用，術語「IC50」係指在活體外或活體內分析法中，抗體或其抗原結合片段誘發最大反應50%(亦即最大反應與基線之間的一半)之抑制反應的濃度。
如本文所用，術語「單株抗體」(或其抗原結合片段)或「單株抗體(或其抗原結合片段)組合物」係指單一分子組合物之抗體分子(或其 抗原結合片段)之製劑。單株抗體組合物顯示針對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和性。
術語「效應功能」係指藉由經由除抗原結合域外之抗體結構域結合介導，通常藉由效應分子之結合介導的抗體分子活性。效應功能包括補體介導之效應功能，其藉由例如補體之C1組分與抗體之結合介導。補體活化在細胞病原體之調理及溶胞中具有重要作用。補體活化亦刺激發炎反應且亦可涉及自體免疫過敏性。效應功能亦包括Fc受體(FcR)介導之效應功能，其可在抗體恆定域結合於Fc受體(FcR)時觸發。抗體結合於細胞表面上之Fc受體觸發多種重要且不同之生物反應，包括塗佈抗體之顆粒之吞噬及摧毀、免疫複合體之清除、殺手細胞對塗佈抗體之標靶細胞之溶解(稱為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性，或ADCC)、發炎性介體之釋放、免疫球蛋白產生之胎盤轉移及控制。抗體之效應功能可藉由改變，例如增強或降低抗體對效應分子(諸如Fc受體或補體組分)之親和力而改變。結合親和力一般將藉由修飾效應分子結合位點來改變，且在此情況下，適於定位相關位點且以適合方式修飾位點至少一部分。亦設想抗體上對效應分子之結合位點的改變無需顯著改變整體結合親和力，而可改變相互作用之幾何形狀，使得效應機制如非生產性結合中般無效。進一步設想效應功能亦可藉由修飾不與效應分子結合直接有關，而另外與效應功能之效能有關之位點改變。
術語「核酸」在本文中與術語「聚核苷酸」可互換使用，且係指呈單股或雙股形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾之主鏈殘基或鍵的核酸，該等核酸為合成的、天然存在的及非天然存在的，具有與參考核酸類似之結合特性，且以類似於參考核苷酸之方式代謝。此類類似物之實例包括(但不限於)硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲 酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)及互補序列，以及明確指示之序列。特定言之，如下詳述，簡併密碼子取代可藉由產生一或多個所選擇之(或所有)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081,1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608,1985；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98,1994)。
術語「可操作地連接」係指兩個或兩個以上聚核苷酸(例如DNA)區段之間的功能關係。通常，其係指轉錄調節序列相對於所轉錄序列之功能關係。舉例而言，啟動子或強化子序列若其在適當宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列之轉錄，則可操作地連接於編碼序列。一般而言，可操作地連接於轉錄序列之啟動子轉錄調節序列在實體上鄰接於所轉錄序列，亦即其為順式作用。然而，諸如強化子之一些轉錄調節序列無需在實體上鄰接於或緊鄰於其增強轉錄之編碼序列。
如本文所用之術語「最佳化」意謂使用在生產細胞或生物體，一般真核細胞，例如畢赤酵母(Pichia)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞中較佳的密碼子改變核苷酸序列以編碼胺基酸序列。對最佳化之核苷酸序列進行工程改造以完全或儘可能地保留藉由起始核苷酸序列最初編碼之胺基酸序列，亦稱為「親本」序列。本文中之最佳化序列已經工程改造以具有哺乳動物細胞中之較佳密碼子。然而，本文中亦預想在其他真核細胞或原核細胞中此等序列之最佳化表現。由最佳化之核苷酸序列編碼之胺基酸序列亦稱為最佳化。
術語「多肽」及「蛋白質」可在本文中互換使用，以指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為對應天然 存在之胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合物，以及適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。除非另外指示，否則特定多肽序列亦隱含地涵蓋其保守修飾之變異體。
如本文所用，術語「重組人類抗體」(或其抗原結合片段)包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體(及其抗原結合片段)，諸如自針對人類免疫球蛋白基因進行轉殖基因或轉殖染色體的動物(例如小鼠)或自其製備之融合瘤分離之抗體、自經轉型以表現人類抗體之宿主細胞、例如自轉染瘤分離之抗體、自重組、組合人類抗體文庫分離之抗體及藉由涉及所有或一部分人類免疫球蛋白基因、序列與其他DNA序列之剪接的任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體。此類重組人類抗體具有其中構架及CDR區來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在一個實施例中，此類重組人類抗體可經受活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之動物轉殖基因時，為活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為雖然來源於人類生殖系VH及VL序列且與其相關，但在活體內可不天然存在於人類抗體生殖系抗體庫內之序列。
術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)係指已引入重組表現載體之細胞。應瞭解，此類術語不僅意指特定個體細胞，而且亦指此類細胞之後代。由於某些修飾可能因突變或環境影響而存在於後代中，所以此類子代可能實際上不與親本細胞一致，但仍包括於如本文中所用之術語「宿主細胞」之範疇內。
術語「個體」包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物及爬行動物。除非指出，否則術語「患者」或「個體」在本文中互換使用。
術語「治療(treat)」、「治療(treated)」、「治療(treating)」及「治療 (treatment)」包括投與組合物或抗體以預防或延遲疾病(例如肝纖維化)之症狀、併發症或生物化學標記發作、緩解症狀或阻止或抑制疾病、病狀或病症進一步發展。治療可為防治性(以預防或延遲疾病發作，或預防其臨床或亞臨床症狀顯現)或治療性遏制或緩解疾病顯現後之症狀。治療可藉由本文所述之治療量度量測。本發明之「治療」方法包括向個體投與BMP9抗體或其抗原結合片段以治癒纖維化疾病或病狀、降低其嚴重程度或改善其一或多個症狀，以延長個體之健康或存活期超出在缺乏此類治療下預期之健康或存活期。舉例而言，「治療」包括緩解個體中纖維化疾病症狀(例如呼吸短促、疲勞、咳嗽、重量減輕、與肺纖維化或厭食相關之食慾不振、與肝纖維化相關之疲勞、重量減輕、門靜脈高血壓及腹水)達至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。
術語「載體」意欲指一種聚核苷酸分子，其能夠輸送其已連接之另一聚核苷酸。載體之一種類型為「質體」，其係指可接合其他DNA片段之環形雙股DNA環。另一類型載體為病毒載體，其中其他DNA片段可接合至病毒基因組。某些載體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因組中，且進而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引起其以可操作方式連接的基因之表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常常呈質體形式。由於質體為載體之最常用形式，因而在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括發揮相等功能之此類其他形式之表現載體，諸如病毒 載體(例如複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒以及腺相關病毒)。
圖1：在RGA分析法中由融合瘤法產生之抗BMP9抗體的活體外活性測試。a.融合瘤產生之BMP9抗體對人類BMP2、BMP7及BMP9誘發之RGA活性的降低曲線及IC50；b.融合瘤產生之BMP9抗體對大鼠BMP9誘發之RGA活性的降低曲線及IC50。
圖2：在RGA分析法中由噬菌體呈現法產生之抗BMP9抗體的活體外活性測試。a.噬菌體呈現產生之BMP9抗體對人類BMP2、BMP7及BMP9誘發之RGA活性的降低曲線及IC50；b.噬菌體呈現產生之BMP9抗體對大鼠BMP9誘發之RGA活性的降低曲線及IC50。
圖3：藉由smad 1/5磷酸化分析法進行之活體外活性測試。a.融合瘤產生之BMP9抗體對CFSC細胞中人類BMP9誘發之smad 1/5/8磷酸化染色的降低曲線及IC50。b.噬菌體呈現產生之BMP9抗體對CFSC細胞中人類BMP9誘發之smad 1/5/8磷酸化染色的降低曲線及IC50。c.在抗BMP9抗體缺乏或存在下HUVEC細胞中BMP9誘發之磷酸化smad 1/5及ID1表現的西方墨點法。
圖4. BMP9 HDI小鼠模型中使用融合瘤產生之抗BMP9抗體的活體內功效研究。與未經處理及陰性對照比較，展示不同處理組之代表性肝(a)、肝重及體重(b)、肝功能(c)。d.藉由定量PCR偵測ID1之mRNA表現。BMP9 cDNA指示pcDNA3.1-小鼠BMP9，其編碼小鼠BMP9。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
圖5. BMP9 HDI小鼠模型中噬菌體呈現產生之抗BMP9抗體的活體內功效研究。與未經處理及陰性對照比較，展示不同處理組之代表性肝(a)、肝重及體重(b)、肝功能(c)。d.藉由定量PCR偵測ID1之mRNA表現。BMP9 cDNA指示pcDNA3.1-小鼠BMP9，其編碼小鼠BMP9。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
圖6. CCl4小鼠模型中之活體內功效研究。展示對照IgG加油或CCl4處理之組(a)、對照IgG或融合瘤產生之BMP9 Ab加CCl4處理之組(b)的西方墨點結果。右圖藉由GAPDH表現校正。顯著差異如下指示：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。c、d.展示不同組之p-Smad 1/5/8組織學結果。c. C57BL/6小鼠之資料。d. BALB/c小鼠之資料。
圖7. CCl4小鼠模型中之活體內功效研究。展示對照IgG加油或CCl4處理之組(a)、對照IgG或噬菌體呈現產生之Ab加CCl4處理之組(b)的西方墨點結果。右圖藉由GAPDH表現校正。顯著差異如下指示：*P<0.05，**P<0.01。c.展示不同組之p-Smad 1/5/8組織學結果。
圖8. 2週CCl4肝纖維化小鼠模型中使用小鼠抗BMP9抗體(2B11G2及4E10D7)之活體內功效研究。與未經處理及陰性對照比較，展示不同處理組之天狼星紅染色(a)、肝臟羥脯胺酸含量(b)、肝功能(c)、肝重(d)之定量。e.藉由定量PCR偵測ID1之mRNA表現。*P<0.05。
圖9. 正常小鼠(a)及ANIT大鼠模型(b)中之PK分析法。
圖10. 在食蟹獼猴中單劑量投與抗體BMP9-2之後總抗BMP6濃度(各線呈現來自單個猴之資料)。
圖11在食蟹獼猴中在多劑量抗體BMP9-2(MOR022962)研究期間總抗BMP6濃度。
本發明提供特異性結合於BMP9蛋白質之抗體及其抗原結合片段以及醫藥組合物、產生方法及此類抗體及組合物之使用方法。
BMP9抗體及其抗原結合片段
本發明提供特異性結合於人類BMP9之抗體及其抗原結合片段。
BMP9信號傳導在肝纖維化/肝硬化及門靜脈高血壓之發病機制中起作用。在纖維化病狀中，例如在肝硬化肝臟組織中BMP9表現、血清含量及信號傳導增加。不受任何特定理論束縛，本發明提出一種 BMP9拮抗性抗體，因為預期抗纖維化療法有益於患有慢性肝病及/或門靜脈高血壓，例如患有肝纖維化，例如非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、病毒感染(例如HBV或HCV)、酒精、毒素或免疫誘發之肝纖維化或肝硬化之患者。
此類抗人類BMP9抗體之實例為序列在表1中列出之抗體BMP9-1、BMP9-2、BMP9-3、BMP9-4、BMP9-5、BMP9-6、BMP9-7、BMP9-8及BMP9-9。
抗體BMP9-1、BMP9-2、BMP9-3、BMP9-4、BMP9-5、BMP9-6、BMP9-7、BMP9-8及BMP9-9均以高親和力、相對於人類BMP7、人類BMP10及人類BMP2之高選擇性結合於人類BMP9。此等抗體亦抑制Smad1/5/8磷酸化及Id1誘發，且在活體內小鼠模型中保護肝避免BMP9誘發之破壞。
本文所揭示之BMP9拮抗性抗體代表一種可靠地改善肝病、例如肝纖維化、肝硬化或門靜脈高血壓或防止其進展之新穎治療方法。不受任何特定理論束縛，本發明提出此可經由抑制BMP9信號傳導進行。
在一個實施例中，本發明提供經分離之抗體或其抗原結合片段，其對人類BMP9蛋白之親和力比對以下任一者高100、500或1000倍：人類BMP2、BMP10或人類BMP7蛋白。特異性結合於BMP9而不結合於BMP7為重要的：BMP7基因敲除小鼠在出生之後死亡，具有腎、眼睛及骨骼缺陷。此外，BMP7在預防與纖維化相關之慢性心臟病進展中為重要的。因此，抗BMP9抗體與BMP7之交叉反應性為不合乎需要的。本文所提供之抗體對BMP9而非BMP7具有特異性；參見例如表5及表7。圖1a及圖2a亦展示特異性結合於人類BMP9而非人類BMP2及BMP7蛋白質之證據。
本發明之抗體包括(但不限於)如本文，包括實例中所述之經分離 之人類及人類化單株抗體。
此類抗人類BMP9抗體之實例為序列在表1中列出之抗體BMP9-1、BMP9-2、BMP9-3、BMP9-4、BMP9-5、BMP9-6、BMP9-7、BMP9-8及BMP9-9。
在ELISA結合分析中，抗體BMP9-2以高親和力結合人類BMP9，且不結合人類BMP2、人類BMP7或人類BMP10(亦即選擇性結合於人類BMP9，例如超過1000倍，例如超過10,000倍)，亦即對人類BMP2、BMP7或BMP10之活性不可偵測。抗體BMP9-2亦在活體外抑制BMP9與ALKI及ActRIIB受體兩者之結合。如藉由競爭ELISA所量測，BMP9與ALKI之結合最大抑制59%，且與ActRIIB之結合最大抑制85%。此外，小鼠中單次10mg/kg處理遏制CCl4誘發之pSmad1/5/8(如藉由IHC及西方墨點法所量測)。此外，抗體BMP9-2之單次10mg/kg注射降低BMP9誘發之Id1產生且拯救BMP9誘發之肝重降低。
與人類BMP2、BMP10或BMP7蛋白質相比，抗體BMP9-1、BMP9-3及BMP9-4均展示對人類BMP9蛋白質之高特異性。關於本文中描述之抗體之產生及表徵的其他細節提供於實例中。
本發明提供特異性結合BMP9(例如人類BMP9蛋白)之抗體，該等抗體包含表1中列出之VH結構域。本發明亦提供特異性結合於BMP9蛋白之抗體，該等抗體包含具有表1中列出之任一VH CDR之胺基酸序列的VH CDR。詳言之，本發明提供特異性結合於BMP9蛋白之抗體，該等抗體包含一個、兩個、三個、四個、五個或五個以上具有表1中列出之任一VH CDR之胺基酸序列的VH CDR(或者由其組成)。
本發明亦提供特異性結合於BMP9之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含表1中列出之VH胺基酸序列(或者由其組成)，其中構架序列(例如不為CDR之序列)中不超過約10個胺基酸已 突變(其中各種非限制性之突變實例為添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合於BMP9之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含表1中列出之VH胺基酸序列(或者由其組成)，其中構架序列(例如不為CDR之序列)中不超過10個胺基酸已突變(其中各種非限制性之突變實例為添加、取代或缺失)。
本發明亦提供特異性結合於BMP9之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含表1中列出之VH胺基酸序列(或者由其組成)，其中構架序列(例如不為CDR之序列)中不超過約20個胺基酸已突變(其中各種非限制性之突變實例為添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合於BMP9之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含表1中列出之VH胺基酸序列(或者由其組成)，其中構架序列(例如不為CDR之序列)中不超過20個胺基酸已突變(其中各種非限制性之突變實例為添加、取代或缺失)。
本發明亦提供特異性結合於BMP9之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含表1中列出之VL胺基酸序列(或者由其組成)，其中構架序列(例如不為CDR之序列)中不超過約10個胺基酸已突變(其中各種非限制性之突變實例為添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合於BMP9之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含表1中列出之VL胺基酸序列(或者由其組成)，其中構架序列(例如不為CDR之序列)中不超過10個胺基酸已突變(其中各種非限制性之突變實例為添加、取代或缺失)。
本發明亦提供特異性結合於BMP9之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含表1中列出之VL胺基酸序列(或者由其組成)，其中構架序列(例如不為CDR之序列)中不超過約20個胺基酸已突變(其中各種非限制性之突變實例為添加、取代或缺失)。本發明亦提供特異性結合於BMP9之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗 原結合片段包含表1中列出之VL胺基酸序列(或者由其組成)，其中構架序列(例如不為CDR之序列)中不超過20個胺基酸已突變(其中各種非限制性之突變實例為添加、取代或缺失)。
本發明提供特異性結合於BMP9蛋白之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含表1中列出之VL域。本發明亦提供特異性結合於BMP9蛋白之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含具有表1中列出之任一VL CDR之胺基酸序列的VL CDR。詳言之，本發明提供特異性結合於BMP9蛋白之抗體及其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含一個、兩個、三個或更多個具有表1中列出之任一VL CDR之胺基酸序列的VL CDR(或者由其組成)。
本發明之其他抗體及其抗原結合片段包括已突變之胺基酸，然而CDR區與表1中描述之序列中描繪之CDR區具有至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一個態樣中，本發明之其他抗體及其抗原結合片段包括突變胺基酸序列，其中當與表1中描述之序列中描繪之CDR區比較時，CDR區不超過1、2、3、4或5個胺基酸已突變。
本發明亦提供編碼特異性結合於BMP9蛋白之抗體及其抗原結合片段的VH、VL、全長重鏈及全長輕鏈之核酸序列。此類核酸序列可針對在哺乳動物細胞中之表現最佳化(例如表1展示抗體BMP9-1、BMP9-2、BMP9-3、BMP9-5、BMP9-6、BMP9-7、BMP9-8及BMP9-9之重鏈及輕鏈的示例核酸序列)。
本發明之其他抗體及其抗原結合片段包括其中胺基酸或編碼胺基酸之核酸已突變，然而與表1中描述之序列具有至少60%、70%、80%、90%或95%一致性的抗體及其抗原結合片段。在一個實施例中，其包括其中當與表1中描述之序列中描繪之可變區比較時可變區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已突變，而截留實質上相同治療活性之突變胺基酸序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：1、2及3之 HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：11、12及13之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：4、5及6之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：14、15及16之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：21、22及23之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：31、32及33之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：24、25及26之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：34、35及36之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：41、42及43之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：51、52及53之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：44、45及46之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：54、55及56之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：61、62及63之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：71、72及73之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：64、65及66之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：74、75及76之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：81、82及83之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：91、92及93之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：84、85及86之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：94、95及96之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：101、102及103之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：111、112及113之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：104、105及106之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：114、115及116之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：121、122及123之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：131、132及133之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：124、125及126 之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：134、135及136之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：141、142及143之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：151、152及153之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：144、145及146之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：154、155及156之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：161、162及163之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：171、172及173之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
在另一特定實施例中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含分別SEQ ID NO：164、165及166之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列及分別SEQ ID NO：174、175及176之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
因為此等抗體中之每一者可結合於BMP9，所以VH、VL、全長輕鏈及全長重鏈序列(胺基酸序列及編碼胺基酸序列之核苷酸序列)可「經混合及匹配」以產生本發明之其他BMP9結合抗體及其抗原結合片段。此類「經混合及匹配」之BMP9結合抗體可使用此項技術中已知之結合分析法(例如ELISA及描述於實例部分中之其他分析法)來測試。當此等鏈混合及匹配時，來自特定VH/VL對之VH序列應經結構上類似之VH序列置換。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長重鏈序列應經結構上類似之全長重鏈序列置換。同樣，來自特定 VH/VL對之VL序列應經結構上類似之VL序列置換。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長輕鏈序列應經結構上類似之全長輕鏈序列置換。
在另一態樣中，本發明提供BMP9結合抗體，其包含如表1中所述之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3或其組合。CDR區使用Kabat系統(Kabat等人1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)或使用Chothia系統(Chothia等人1987 J.Mol.Biol.196：901-917；及Al-Lazikani等人1997 J.Mol.Biol.273：927-948)劃定界限。或者可使用其他用於將CDR區劃定界限之方法。舉例而言，Kabat與Chothia之CDR定義可組合，使得CDR由人類VH中胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)及95-102(HCDR3)以及人類VL中胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)及89-97(LCDR3)組成。
鑒於此等抗體中之每一者可結合於BMP9且抗原結合特異性主要由CDR1、CDR2及CDR3區提供，因此VH CDR1、CDR2及CDR3序列與VL CDR1、CDR2及CDR3序列可「混合及匹配」(亦即來自不同抗體之CDR可混合及匹配，不過各抗體必須含有VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3以產生本發明之其他結合BMP9之結合分子。此類「經混合及匹配」之BMP9結合抗體可使用此項技術中已知之結合分析法及實例中所述之分析法(例如ELISA)來測試。當VH CDR序列混合及匹配時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之CDR序列置換。同樣，當VL CDR序列混合及匹配時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之CDR序列置換。一般技術者將顯而易知，新穎的VH及VL序列可藉由用來自本文中針對本發明之單株抗體所展示之CDR序列的結構上類似之序列使一或多個VH及/或VL CDR區序列突變來產生。
因此，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合區，該經分離之單株抗體或其抗原結合區包含：包含選自SEQ ID NO：1、21、41、61、81、101、121、141、161、4、24、44、64、84、104、124、144及164任一者之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含選自SEQ ID NO：2、22、42、62、82、102、122、142、162、5、25、45、65、85、105、125、145及165任一者之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含選自SEQ ID NO：3、23、43、63、83、103、123、143、163、6、26、46、66、86、106、126、146及166任一者之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含選自SEQ ID NO：11、31、51、71、91、111、131、151、171、14、34、54、74、94、114、134、154及174任一者之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含選自SEQ ID NO：12、32、52、72、92、112、132、152、172、15、35、55、75、95、115、135、155及175任一者之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；以及包含選自SEQ ID NO：13、33、53、73、93、113、133、153、173、16、36、56、76、96、116、136、156及176任一者之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；其中該抗體特異性結合BMP9。
在一個實施例中，特異性結合於BMP9之抗體為表1中描述之抗體。在一個實施例中，特異性結合於BMP9之抗體為BMP9-1。在一個實施例中，特異性結合於BMP9之抗體為BMP9-2。在一個實施例中，特異性結合於BMP9之抗體為BMP9-3。在一個實施例中，特異性結合於BMP9之抗體為BMP9-4。在一個實施例中，特異性結合於BMP9之抗體為BMP9-5。在一個實施例中，特異性結合於BMP9之抗體為BMP9-6。在一個實施例中，特異性結合於BMP9之抗體為BMP9-7。在一個實施例中，特異性結合於BMP9之抗體為BMP9-8。在一個實施例中，特異性結合於BMP9之抗體為BMP9-9。
如本文所用，若抗體之可變區或全長鏈獲自使用人類生殖系免 疫球蛋白基因之系統，人類抗體包含作為特定生殖系序列之「產物」或「來源於」特定生殖系序列的重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈。此類系統包括用相關抗原將攜帶人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫接種或用相關抗原篩選呈現在噬菌體上之人類免疫球蛋白基因文庫。作為人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可藉由將人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列進行比較且選擇序列最接近(亦即最大%一致性)人類抗體序列之人類生殖系免疫球蛋白序列來如此鑑別。如與生殖系序列比較，作為特定人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」特定人生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可含有例如由天然存在之體細胞突變或定點突變之有意引入所引起的胺基酸差異。然而，在VH或VL構架區中，所選人類抗體通常在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類生殖系序列)相比時鑑別人類抗體為人類的胺基酸殘基。在某些情況中，人類抗體在胺基酸序列上與藉由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列可至少60%、70%、80%、90%或至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。通常，重組人類抗體在VH或VL構架區中將呈現與藉由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過10個的胺基酸差異。在某些情況中，人類抗體可呈現與藉由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過5個，或甚至不超過4個、3個、2個或1個的胺基酸差異。
BMP家族成員及肝纖維化
在一個實施例中，本發明提供一種特異性結合於BMP9之抗體或其結合片段。在一個實施例中，抗體或其結合片段描述於表1中。
在一個實施例中，抗體或其結合片段特異性結合於BMP9，但不 結合於其他BMP蛋白(諸如BMP2、BMP10或BMP7)。
在人類及小鼠中，BMP9在肝臟中表現，且咸信BMP9信號傳導在肝病，例如肝纖維化、肝硬化或門靜脈高血壓之發病機制中起作用。不束縛於任何理論，咸信BMP9信號傳導引起Smad1/5/8磷酸化，Smad1/5/8磷酸化又引起Id1活化。Id1活化引起肝細胞細胞凋亡、HSC活化及HSC-EC串擾，引起肝纖維化。已展示肝臟中BMP9表現之活化造成肝細胞細胞死亡及肝星形細胞活化、肝纖維化及誘發纖維化標記基因(例如αSMA、波形蛋白及Col1a1)及嚴重肝臟破壞。如本文，包括實例中所述，已意外且出乎意料地展示本發明之BMP9抗體對BMP9具有高度特異性(與BMP2、BMP10及/或BMP7相比)且活體外及活體內抑制BMP9，包括抑制BMP9誘發之肝病，包括BMP9誘發之肝纖維化。
下文描述各種類型之BMP9抗體及其抗原結合片段。
同源抗體
在另一實施例中，本發明提供一種包含與表1中描述之序列同源之胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段，且該抗體結合於BMP9且保留表1中描述之彼等抗體的所需功能特性。
舉例而言，本發明提供一種經分離之包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體(或其功能性抗原結合片段)，其中該重鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：7、27、47、67、87、107、127、147及167組成之群之胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%一致的胺基酸序列；該輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：17、37、57、77、97、107、117、137、157及177組成之群之胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%一致的胺基酸序列；該抗體特異性結合於BMP9蛋白，且該抗體抑制BMP9誘發之Smad1/5/8磷酸化、BMP9誘發之Id1誘發、纖維化標記物之BMP9誘發及/或BMP9誘發之肝臟破壞，其中任一分析 法為此項技術中已知。在一特定實例中，在BRE-Luc報導基因分析法(如本文所述)中，此類抗體具有小於500pM之IC50值。在一特定實例中，在CCl4小鼠模型，例如如本文所述之CCl4小鼠模型中，在單次注射10mg/kg劑量時此類抗體顯著抑制Smad1/5/8磷酸化。在一特定實例中，在小鼠HDI模型，例如如本文所述之小鼠HDI模型中，在單次注射10mg/kg劑量時此類抗體顯著抑制Id1之BMP9誘發。在一特定實例中，此類抗體顯著保護肝臟組織避免BMP9誘發之破壞，例如纖維化。
在一個實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可與表1中闡述之序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一個實施例中，除不超過1、2、3、4或5個胺基酸位置中胺基酸取代外，VH及/或VL胺基酸序列可一致。具有與表1中描述之抗體之VH及VL區高度(亦即80%或更大)一致的VH及VL區之抗體可藉由對分別編碼SEQ ID NO：7、27、47、67、87、107、127、147或167及17、37、57、77、97、107、117、137、157或177之核酸分子進行突變誘發(例如定點或PCR介導之突變誘發)，接著使用本文中描述之功能分析法針對保留之功能測試所編碼之改變抗體來獲得。
在一個實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈胺基酸序列可與表1中闡述之序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。具有分別與SEQ ID NO：9、29、49、69、89、109、129、149或169任一者之全長重鏈及SEQ ID NO：19、39、59、79、99、119、139、159或179任一者之全長輕鏈高度(亦即80%或更大)一致的全長重鏈及全長輕鏈之抗體可藉由對分別編碼此類多肽之核酸分子進行突變誘發(例如定點或PCR介導之突變誘發)，接著使用本文中描述之功能分析法針對保留之功能測試所編碼之改變抗體來獲得。
在一個實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈核苷酸序列可與表1中 闡述之序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
在一個實施例中，重鏈及/或輕鏈核苷酸序列之可變區可與表1中闡述之序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
如本文所用，兩個序列之間的一致性百分比為在為使兩個序列最佳比對，需要將間隙引入下，考慮到間隙數及各間隙之長度，序列共享之一致位置之數目的函數(亦即，%一致性等於一致位置數/總位置數×100)。如下文非限制性實例中所述，序列比較及兩個序列之間的一致性百分比之測定可使用數學演算法實現。
或者或另外，本發明之蛋白質序列可進一步用作「查詢序列」以針對公共資料庫進行搜索以例如鑑別相關序列。舉例而言，此類搜索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之BLAST程式(2.0版)進行。
具有保守性修飾之抗體
在一個實施例中，本發明之抗體具有包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中此等CDR序列中之一或多者具有基於本文所述之抗體或其保守性修飾的指定胺基酸序列，且其中抗體保留本發明之BMP9結合抗體及其抗原結合片段之所需功能特性。因此，本發明提供一種經分離之單株抗體或其功能性抗原結合片段，其由包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區組成，其中：重鏈可變區CDR1包含選自SEQ ID NO：1、4、21、24、41、44、61、64、81、84、101、104、121、124、141、144、161及164任一者之胺基酸序列或其保守變異體；重鏈可變區CDR2包含選自SEQ ID NO：2、5、22、25、42、45、62、65、82、85、102、105、 122、125、142、145、162及165任一者之胺基酸序列或其保守變異體；重鏈可變區CDR3包含選自SEQ ID NO：3、6、23、26、43、46、63、66、83、86、103、106、123、126、143、146、163及166任一者之胺基酸序列或其保守變異體；輕鏈可變區CDR1包含選自SEQ ID NO：11、14、31、34、51、54、71、74、91、94、111、114、131、134、151、154、171及174任一者之胺基酸序列或其保守變異體；輕鏈可變區CDR2包含選自SEQ ID NO：12、15、32、35、52、55、72、75、92、95、112、115、132、135、152、155、172及175之胺基酸序列或其保守變異體；以及輕鏈可變區CDR3包含選自SEQ ID NO：13、16、33、36、53、56、73、76、93、96、113、116、133、136、153、156、173及176之胺基酸序列或其保守變異體；該抗體或其抗原結合片段特異性結合於BMP9，且該抗體抑制BMP9誘發之Smad1/5/8磷酸化、BMP9誘發之Id1誘發、纖維化標記物之BMP9誘發及/或BMP9誘發之肝臟破壞，其中任一分析法為此項技術中已知。在一特定實例中，該抗體特異性結合於BMP9蛋白，且該抗體抑制BMP9誘發之Smad1/5/8磷酸化、BMP9誘發之Id1誘發、纖維化標記物之BMP9誘發及/或BMP9誘發之肝臟破壞，其中任一分析法為此項技術中已知。在一特定實例中，在BRE-Luc報導基因分析法(如本文所述)中此類抗體具有小於500pM之IC50值。在一特定實例中，在CCl4小鼠模型，例如如本文所述之CCl4小鼠模型中，在單次注射10mg/kg劑量時此類抗體顯著抑制Smad1/5/8磷酸化。在一特定實例中，在小鼠HDI模型，例如如本文所述之小鼠HDI模型中，在單次注射10mg/kg劑量時此類抗體顯著抑制Id1之BMP9誘發。在一特定實例中，此類抗體顯著保護肝臟組織避免BMP9誘發之破壞，例如纖維化。
在一個實施例中，針對在哺乳動物細胞中表現最佳化之本發明抗體具有全長重鏈序列及全長輕鏈序列，其中此等序列中之一或多者 具有基於本文所述之抗體或其保守性修飾的指定胺基酸序列，且其中抗體保留本發明之BMP9結合抗體及其抗原結合片段之所需功能特性。因此，本發明提供一種經分離之單株抗體，其針對在哺乳動物細胞中表現最佳化，由全長重鏈及全長輕鏈組成，其中：全長重鏈具有選自SEQ ID NO：9、29、49、69、89、109、129、149、169之群的胺基酸序列及其保守性修飾；且全長輕鏈具有選自SEQ ID NO：19、39、59、79、99、119、139、159、179之群的胺基酸序列及其保守性修飾；該抗體特異性結合於BMP9；且該抗體抑制BMP9誘發之Smad1/5/8磷酸化、BMP9誘發之Id1誘發、纖維化標記物之BMP9誘發及/或BMP9誘發之肝臟破壞，其中任一分析法為此項技術中已知。在一特定實例中，該抗體特異性結合於BMP9蛋白，且該抗體抑制BMP9誘發之Smad1/5/8磷酸化、BMP9誘發之Id1誘發、纖維化標記物之BMP9誘發及/或BMP9誘發之肝臟破壞，其中任一分析法為此項技術中已知。在一特定實例中，在BRE-Luc報導基因分析法(如本文所述)中此類抗體具有小於500pM之IC50值。在一特定實例中，在CCl4小鼠模型，例如如本文所述之CCl4小鼠模型中，在單次注射10mg/kg劑量時此類抗體顯著抑制Smad1/5/8磷酸化。在一特定實例中，在小鼠HDI模型，例如如本文所述之小鼠HDI模型中，在單次注射10mg/kg劑量時此類抗體顯著抑制Id1之BMP9誘發。在一特定實例中，此類抗體顯著保護肝臟組織避免BMP9誘發之破壞，例如纖維化。
結合於相同抗原決定基之抗體
本發明提供結合於與表1中列出之BMP9結合抗體結合相同抗原決定基之抗體。因此，其他抗體可在BMP9結合分析法中基於其與本發明之其他抗體及其抗原結合片段交叉競爭(例如以統計學上顯著之方式競爭性抑制其結合)之能力鑑別。測試抗體抑制本發明之抗體及其抗原結合片段結合BMP9蛋白的能力表明測試抗體可與該抗體競爭 結合於BMP9；根據非限制性理論，此類抗體可與其所競爭之抗體結合於BMP9上相同或相關(例如結構上相似或空間上鄰近)的抗原決定基。在某一實施例中，與本發明之抗體及其抗原結合片段結合於BMP9上相同抗原決定基之抗體為人類單株抗體。此類人類單株抗體可如本文所述製備及分離。在某一實施例中，與本發明之抗體及其抗原結合片段結合於BMP9上相同抗原決定基之抗體為小鼠單株抗體。此類小鼠單株抗體列於表3中。在某些實施例中，與本發明之抗體及其抗原結合片段結合於BMP9上相同抗原決定基的抗體為來源於表3中列出之小鼠單株抗體的人類化單株抗體。在某一實施例中，與本發明之抗體及其抗原結合片段結合於BMP9上相同抗原決定基的抗體為人類化單株抗體。此類人類化單株抗體可如本文所述製備及分離。
一旦確定抗原上之所要抗原決定基，則可例如使用本發明中所述之技術產生抗彼抗原決定基之抗體。或者，在探索過程期間，抗體之產生及表證可闡明關於所要抗原決定基之資訊。根據此資訊，隨後可針對結合於相同抗原決定基競爭性篩檢抗體。一種實現此之方法為進行交叉競爭研究，以尋找彼此競爭性結合的抗體，例如抗體競爭結合於抗原。用於基於交叉競爭對抗體「分箱(binning)」之一種高通量方法描述於國際專利申請案第WO 2003/48731號中。如熟習此項技術者所瞭解，實際上抗體可特異性結合之任何東西均可為抗原決定基。抗原決定基可包含抗體結合之彼等殘基。
一般而言，在蛋白質及/或巨分子之複合混合物中對特定標靶抗原具有特異性之抗體將優先識別標靶抗原上之抗原決定基。
包括抗原決定基之既定多肽區可使用此項技術中熟知之多種抗原決定基定位技術鑑別。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris編，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。舉例而言，線性抗原決定基可藉 由例如如下測定：在固體支撐物上並行合成大量肽，該等肽對應於蛋白質分子之部分，且使肽與抗體反應，而肽仍附接於支撐物。此類技術為此項技術中已知且描述於例如美國專利第4,708,871號；Geysen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：3998-4002；Geysen等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：78-182；Geysen等人(1986)Mol.Immunol.23：709-715。類似地，構形抗原決定基容易藉由諸如藉由例如氫/氘交換、X射線結晶學及二維核磁共振測定胺基酸BMP9之空間構形來鑑別。參見例如Epitope Mapping Protocols，上文。蛋白質之抗原區亦可使用標準抗原性及親水性曲線圖，諸如使用例如獲自Oxford Molecular Group之Omiga 1.0版軟體程式計算的曲線圖鑑別。為測定抗原性型態，此電腦程式採用Hopp/Woods法，Hopp等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：3824-3828；且對於親水性曲線圖，採用Kyte-Doolittle技術，Kyte等人，(1982)J.MoI.Biol.157：105-132。
經工程改造及經修飾之抗體
本發明之抗體進一步可使用具有本文中展示之VH及/或VL序列中之一或多者的抗體作為工程改造修飾抗體之起始材料製備，該修飾抗體可具有自起始抗體改變之特性。抗體可藉由修飾一或兩個可變區(亦即VH及/或VL)內，例如一或多個CDR區內及/或一或多個構架區內的一或多個殘基而進行工程改造。或者或另外，抗體可藉由修飾恆定區內之殘基以例如改變抗體之效應功能而進行工程改造。
可進行之可變區工程化之一種類型為CDR移植。抗體主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中的胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。出於此原因，個別抗體之間的CDR內之胺基酸序列與CDR外之序列相比更多樣化。因為CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，所以可藉由構築包括來自特定天然存在之抗體之CDR序列移植至來自具有不同特性之不同抗體之構架序列上的表現載體，表現模擬特定天 然存在之抗體之特性的重組抗體。(參見例如Riechmann,L.等人，1998 Nature 332：323-327；Jones,P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen,C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86：10029-10033；頒予Winter之美國專利第5,225,539號以及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370。)
此類構架序列可自包括生殖系抗體基因序列或重排抗體序列之公共DNA資料庫或公開參考文獻獲得。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於「VBase」人類生殖系序列資料庫(可在網際網路上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase獲得)以及Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號；Tomlinson,I.M.等人，1992 J.fol.Biol.227：776-798；以及Cox,J.P.L.等人，1994 Eur.J Immunol.24：827-836；每一者之內容以引用的方式明確併入本文中。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因及重排抗體序列之生殖系DNA序列可見於「IMGT」資料庫(可在網際網路上www.imgt.org獲得；參見Lefranc,M.P.等人，1999 Nucleic Acids Res.27：209-212；每一者之內容以引用的方式明確併入本文中。)
用於本發明之抗體及其抗原結合片段的構架序列之一實例為結構上類似於本發明之所選抗體及其抗原結合片段使用的構架序列，例如本發明之單株抗體使用的共同序列及/或構架序列的構架序列。VH CDR1、CDR2及CDR3序列及VL CDR1、CDR2及CDR3序列可移植至序列與在構架序列所來源之生殖系免疫球蛋白基因中所發現之序列一致的構架區上，或CDR序列可移植至與生殖系序列相比含有一或多個突變之構架區上。舉例而言，已發現在某些情況下使構架區內之殘基突變為有益的，以維持或增強抗體之抗原結合能力(參見例如頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號 及第6,180,370號)。
可變區修飾之另一類型為使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內胺基酸殘基突變，進而提高相關抗體之一或多種結合特性(例如親和力)，稱為「親和力成熟」。可進行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變且對抗體結合或相關其他功能特性之影響可在如本文所述及實例所提供之活體外或活體內分析法中進行評價。可引入保守性修飾(如上文所論述)。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。另外，通常在CDR區內不超過一個、兩個、三個、四個或五個經改變。
移植抗原結合域至替代構架或骨架中
可採用各種抗體/免疫球蛋白構架或骨架，只要所得多肽包括特異性結合於BMP9之至少一個結合區即可。此類構架或骨架包括人類免疫球蛋白之5種主要個體基因型、其抗原結合片段，且包括其他動物物種之免疫球蛋白，較佳具有人類化態樣。就此而言，單重鏈抗體(諸如在駱駝中鑑別之單重鏈抗體)備受關注。熟習此項技術者不斷地發現及研發新穎構架、骨架及片段。
在一個態樣中，本發明係關於一種使用上面可移植本發明之CDR之非免疫球蛋白骨架產生基於非免疫球蛋白之抗體的方法。可採用已知或未來非免疫球蛋白構架及骨架，只要其包含對標靶BMP9蛋白具有特異性之結合區即可。已知之非免疫球蛋白構架或骨架包括(但不限於)纖維結合蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,Mass.)、錨蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、域抗體(Domantis,Ltd.,Cambridge,Mass.及Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂質運載蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模組化免疫藥物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,Wash.)、高親合性多聚體(Avidia,Inc.,Mountain View,Calif.)、蛋白A(Affibody AG, Sweden)及阿菲林(affilin)(γ-晶狀體球蛋白或泛素)(SciI Proteins GmbH,Halle,Germany)。
纖維結合蛋白骨架係基於纖維結合蛋白III型結構域(例如纖維結合蛋白III型之第十模組(10 Fn3域))。纖維結合蛋白III型結構域具有分佈在兩個β片之間的7或8個β股，其彼此抵靠填充而形成蛋白質之核心，且進一步含有使β股彼此間連接且暴露於溶劑的環(與CDR類似)。在β片夾層之各邊緣處存在至少三個此類環，其中邊緣為蛋白質垂直於β股方向之邊界(參見美國專利第6,818,418號)。此等基於纖維結合蛋白之骨架不為免疫球蛋白，不過總摺疊與包含駱駝(camel)及駱馬(llama)IgG中之整個抗原識別單位之最小功能抗體片段(重鏈之可變區)的總摺疊緊密相關。因為此結構，所以非免疫球蛋白抗體模擬針對抗體之抗原結合特性在性質上及親和力上類似之抗原結合特性。類似於活體內抗體親和力成熟過程的活體外環隨機化及改組策略中可使用此等骨架。此等基於纖維結合蛋白之分子可用作骨架，其中分子之環區可使用標準選殖技術用本發明之CDR替換。
錨蛋白技術係基於使用具有錨蛋白衍生之重複模組的蛋白質作為用於承載可用於與不同標靶結合之可變區之骨架。錨蛋白重複模組為一種由兩個逆平行α螺旋及β轉角組成之33個胺基酸多肽。可變區之結合主要藉由使用核糖體呈現來最佳化。
高親和性多聚體來源於含有天然A結構域之蛋白質，諸如LRP-1。此等結構域本性上用於蛋白質-蛋白質相互作用，且在人類中超過250種蛋白質在結構上係基於A結構域。高親和性多聚體係由多個不同「A結構域」單體(2至10個)經由胺基酸連接子連接而組成。可與標靶抗原結合之高親合性多聚體可使用描述在例如美國專利申請公開案第20040175756號、第20050053973號、第20050048512號及第20060008844號中之方法產生。
親和抗體親和性配位體為由三螺旋束組成的簡單小蛋白質，該三螺旋束係基於蛋白質A之IgG結合域之一的骨架。蛋白質A為來自細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之表面蛋白質。此骨架結構域由58個胺基酸組成，使其中13個隨機化以產生具有大量配位體變異體之親和抗體文庫(參見例如美國專利第5,831,012號)。親和抗體分子模擬抗體，與分子量為150kDa之抗體相比，其分子量為6kDa。儘管親和抗體分子之尺寸小，但親和抗體分子之結合位點類似於抗體之結合位點。
抗運載蛋白(Anticalins)為Pieris ProteoLab AG公司研發之產品。其來源於脂質運載蛋白，一組廣泛的小型穩定蛋白質，通常涉及化學敏感或不溶化合物之生理學運輸或儲存。若干種天然脂質運載蛋白存在於人類組織或體液中。蛋白質架構與免疫球蛋白類似，其中高變環位於剛性構架之頂部。然而，與抗體或其重組片段相比，脂質運載蛋白由具有160至180個胺基酸殘基之單多肽鏈組成，其僅略大於單免疫球蛋白結構域。該組構成結合袋之四個環顯示明顯的結構可塑性且包容多個側鏈。結合位點因此可以專有方法再成形以利用高親和性及特異性識別不同形狀之指定標靶分子。脂質運載蛋白家族中之一種蛋白質，大菜粉蝶(Pieris Brassicae)之後膽色素結合蛋白(bilin-binding protein；BBP)，已用於藉由對該組四個環進行突變誘發來研發抗運載蛋白。描述抗運載蛋白之專利申請案之一個實例在PCT公開案第WO 1999/16873號中。
阿菲林分子為小型非免疫球蛋白蛋白質，其經設計而對蛋白質及小分子具特異性親和力。新阿菲林分子可極快速地選自兩個文庫，各文庫均基於不同的人類來源骨架蛋白。阿菲林分子未顯示與免疫球蛋白蛋白質之任何結構同源性。目前使用兩種阿菲林骨架，其中一者為γ結晶體(一種人類結構性眼晶狀體蛋白質)，且另一者為「泛素」 超家族蛋白質。兩種人類骨架均極小，展示高溫穩定性且幾乎對pH值變化及變性劑具抗性。此高穩定性主要歸因於蛋白質之β片結構擴大。γ結晶體來源蛋白質之實例描述於WO200104144中且「泛素樣」蛋白質之實例描述於WO2004106368中。
蛋白質抗原決定基模擬物(PEM)為模擬蛋白質之β髮夾二級結構(涉及蛋白質-蛋白質相互作用的主要二級結構)的中等大小、環狀、肽樣分子(MW 1-2kDa)。
人類BMP9結合抗體可使用此項技術中已知之方法產生。舉例而言，人類工程改造技術用於將非人類抗體轉變成經工程改造之人類抗體。美國專利公開案第20050008625號描述一種用人類可變區置換抗體中之非人類抗體可變區同時相對於非人類抗體維持相同或提供較佳結合特徵的活體內方法。該方法依賴於抗原決定基引導之用全人類抗體對非人類參考抗體之可變區的置換。所得人類抗體一般在結構上與參考非人類抗體不相關，但與參考抗體結合同一抗原上之同一抗原決定基。簡言之，連續抗原決定基引導之互補替換方法藉由如下進行：在細胞中，在對測試抗體與抗原之結合起反應的報導系統存在下，在「競爭者」與參考抗體之不同混合物之文庫(「測試抗體」)之間建立結合於有限量之抗原的競爭。競爭者可為參考抗體或其衍生物，諸如單鏈Fv片段。競爭者亦可為抗原之天然或人工配位體，其與參考抗體結合於相同抗原決定基。競爭者之唯一要求為其與參考抗體結合於相同的抗原決定基，且其與參考抗體競爭結合抗原。測試抗體具有一個來自非人類參考抗體之共同抗原結合V區，且另一V區自諸如人類抗體譜系文庫之不同來源隨機選擇。來自參考抗體之共同V區充當嚮導，將測試抗體定位於抗原上之相同抗原決定基上，且呈相同取向，使得選擇偏向與參考抗體之最高抗原結合保真度。
許多類型報導系統可用於偵測測試抗體與抗原之間的所需相互 作用。舉例而言，補充報導片段可分別連接於抗原及測試抗體，使得僅僅當測試抗體結合於抗原時發生藉由片段互補之報導子活化。當測試抗體及抗原-報導子片段融合物與競爭者共表現時，報導子活化變成視測試抗體與競爭者競爭之能力而定，該能力與測試抗體對抗原之親和力成比例。可使用之其他報導子系統包括如美國專利申請案序列號10/208,730(公開案第20030198971號)中所揭示之自體抑制報導子再活化系統(RAIR)的再活化子，或美國專利申請案序列號10/076,845(公開案第20030157579號)中所揭示之競爭活化系統。
使用連續抗原決定基引導之互補替換系統，進行選擇以鑑別表現單一測試抗體以及競爭者、抗原及報導子組分之細胞。在此等細胞中，各測試抗體與競爭者一對一競爭結合於有限量之抗原。報導子之活性與結合於測試抗體之抗原之量成比例，該量又與測試抗體對抗原之親和力及測試抗體之穩定性成比例。測試抗體最初基於當表現為測試抗體時其相對於參考抗體之活性選擇。第一輪選擇之結果為一組「雜交」抗體，各由來自參考抗體之相同非人類V區及來自文庫之人類V區構成，且各與參考抗體結合於抗原上相同抗原決定基。第一輪中選擇之更多雜交抗體之一對抗原之親和力將與參考抗體相當或高於其。
在第二V區替換步驟中，在第一步驟中選擇之人類V區用作嚮導，用於選擇同源人類V區之不同文庫對剩餘非人類參考抗體V區的人類替換。第一輪中選擇之雜交抗體亦可用作第二輪選擇之競爭者。第二輪選擇之結果為一組完全人類抗體，其結構上不同於參考抗體，但與參考抗體競爭結合於相同抗原。一些所選人類抗體與參考抗體結合於相同抗原上相同抗原決定基。在此等所選人類抗體中，一或多個以與參考抗體相當或高於其之親和力結合於相同抗原決定基。
使用上述小鼠或嵌合BMP9結合抗體之一作為參考抗體，此方法 可容易用於產生以相同結合特異性及相同或更佳結合親和力結合於人類BMP9的人類抗體。另外，此類人類BMP9結合抗體亦可自通常產生人類抗體之公司，例如KaloBios,Inc.(Mountain View,Calif.)購得。
駱駝科抗體
自駱駝及單峰駝(雙峰駱駝(Camelus bactrianus)及單峰駱駝(Calelus dromaderius))家族成員(包括新世界成員，諸如駱馬物種(羊駝(Lama pacos)、大羊駝(Lama glama)及瘦駝(Lama vicugna)))獲得之抗體蛋白已在尺寸、結構複雜性及對人類個體之抗原性方面加以表徵。如在自然界中發現之來自此哺乳動物家族之某些IgG抗體缺少輕鏈，且因此在結構上不同於其他動物抗體之具有兩條重鏈及兩條輕鏈之典型四鏈四級結構。參見PCT/EP93/02214(WO 94/04678 1994年3月3日公開)。
作為鑑別為VHH之小單可變域的駱駝科抗體區可藉由基因工程改造獲得，以產生對標靶具有高親和力之小蛋白質，產生稱作「駱駝科奈米抗體」之衍生自抗體之低分子量蛋白質。參見美國專利第5,759,808號，1998年6月2日頒予；亦參見Stijlemans,B.等人，2004 J Biol Chem 279：1256-1261；Dumoulin,M.等人，2003 Nature 424：783-788；Pleschberger,M.等人2003 Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo,V.等人2002 Int J Cancer 89：456-62；及Lauwereys,M.等人1998 EMBO J 17：3512-3520。駱駝科抗體及抗體片段之工程改造文庫可例如購自Ablynx,Ghent,Belgium。如同非人類來源之其他抗體及其抗原結合片段，駱駝抗體之胺基酸序列可以重組方式改變，以獲得更緊密類似人類序列之序列，亦即奈米抗體可「人類化」。因此可進一步減小駱駝科抗體對人類之天然低抗原性。
駱駝科奈米抗體之分子量為人類IgG分子之約十分之一，且蛋白質之實體直徑僅為幾奈米。小尺寸之一種結果為駱駝科奈米抗體能夠 結合於較大抗體蛋白質功能上不可見之抗原位點，亦即駱駝科奈米抗體適用作偵測另外使用經典免疫技術隱藏之抗原之試劑，且適用作可能治療劑。因此，小尺寸之又一結果為駱駝科奈米抗體由於結合於標靶蛋白之凹槽或窄隙中之特定位點而可具抑制作用，且因此相較於經典抗體之功能，可以更緊密類似於經典低分子量藥物之功能的能力來發揮作用。
低分子量及緊湊尺寸進一步使駱駝科奈米抗體極其熱穩定，對極端pH值及蛋白水解消化穩定，且抗原性弱。另一結果為駱駝科奈米抗體容易自循環系統移至組織中，且甚至跨過血腦障壁且可治療影響神經組織之病症。奈米抗體可進一步促進藥物跨過血腦屏障輸送。參見2004年8月19日公開之美國專利申請案20040161738。與對人類之低抗原性組合之此等特徵顯示巨大治療潛力。此外，此等分子可在諸如大腸桿菌之原核細胞中完全表現，且用噬菌體表現為融合蛋白且具功能性。
因此，本發明之一特性為一種對BMP9具高親和力之駱駝科抗體或奈米抗體。在本文中一個實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體在駱駝科動物中天然產生，亦即，使用本文關於其他抗體描述之技術由駱駝科在用BMP9或其肽片段進行免疫接種後產生。或者，對BMP9結合駱駝科奈米抗體進行工程改造，亦即藉由例如如本文中之實例中所述，使用淘選程序，以BMP9作為標靶，自呈現適當誘變之駱駝科奈米抗體蛋白質之噬菌體文庫選擇來產生。經工程改造之奈米抗體可進一步藉由基因工程改造定製以使其在接受個體中之半衰期為45分鐘至2週。在一個特定實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體係藉由將本發明之人類抗體之重鏈或輕鏈之CDR序列移植至奈米抗體或單域抗體構架序列中來獲得，如例如PCT/EP93/02214中之實例所述。
雙特異性分子及多價抗體
在另一態樣中，本發明之特徵在於包含本發明之BMP9結合抗體或其片段之雙特異性或多特異性分子。本發明之抗體或其抗原結合區可衍生化或連接於另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如受體之另一抗體或配位體)，以產生結合於至少兩個不同結合位點或標靶分子之雙特異性分子。本發明之抗體可實際上衍生化或連接於一個以上其他功能分子以產生與兩個以上不同結合位點及/或標靶分子結合之多特異性分子；此類多特異性分子亦意欲涵蓋於如本文所用之術語「雙特異性分子」內。為產生本發明之雙特異性分子，本發明之抗體可在功能上與一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬劑)連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或以其他方式連接)，從而產生雙特異性分子。
因此，本發明包括包含對BMP9之第一結合特異性及對第二標靶抗原決定基之第二結合特異性的雙特異性分子。舉例而言，第二標靶抗原決定基為BMP9之不同於第一標靶抗原決定基之另一抗原決定基。
另外，就本發明中雙特異性分子具多特異性而言，除第一及第二標靶抗原決定基之外，分子可進一步包括第三結合特異性。
在一個實施例中，本發明之雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv作為結合特異物。抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，諸如Fv或單鏈構築體，如Ladner等人之美國專利第4,946,778號中所述。
雙功能抗體為二價雙特異性分子，其中VH及VL結合域在單多肽鏈上表現，其由過短而不容許同一鏈上之兩個結合域之間配對的連接子連接。VH及VL域與另一鏈之互補結構域配對，從而產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poijak等人，1994 Structure 2：1121-1123)。雙功能抗體 可藉由在同一細胞內表現具有結構VHA-VLB及VHB-VLA(VH-VL組態)或VLA-VHB及VLB-VHA(VL-VH組態)之兩個多肽鏈來產生。其中大多數可在細菌中以可溶形式表現。單鏈雙功能抗體(scDb)係藉由約15個胺基酸殘基之連接子連接兩個形成雙功能抗體之多肽鏈來產生(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(3-4)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology,2(1)：21-36)。scDb可以可溶性、活性單體形式表現於細菌中(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(34)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology,2(1)：21-36；Pluckthun及Pack,1997 Immunotechnology,3(2)：83-105；Ridgway等人，1996 Protein Eng.,9(7)：617-21)。雙功能抗體可與Fc融合以產生「二-雙功能抗體」(參見Lu等人，2004 J.Biol.Chem.,279(4)：2856-65)。
可用於本發明之雙特異性分子中之其他抗體為鼠類、嵌合及人類化單株抗體。
本發明之雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法將組成性結合特異物結合來製備。舉例而言，雙特異性分子之各結合特異物可分別產生，且隨後彼此結合。當結合特異物為蛋白質或肽時，多種偶合劑或交聯劑可用於共價結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-5-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及磺基丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)(參見例如Karpovsky等人，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu,M A等人，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括以下文獻中描述之方法：Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等人，1985 Science 229：81-83及Glennie等人，1987 J.Immunol.139：2367- 2375。結合劑為SATA及磺酸基-SMCC，均獲自Pierce Chemical Co.(Rockford,Ill.)。
當結合特異物為抗體時，其可藉由兩條重鏈之C端鉸鏈區之硫氫基鍵結來結合。在一特定實施例中，在結合之前，鉸鏈區經修飾以含有奇數個硫氫基殘基，例如一個。
或者，兩種結合特異物可在同一載體中編碼，且在同一宿主細胞中表現及組裝。此方法特別適用於雙特異性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配位體×Fab融合蛋白。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子之單鏈分子，或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。用於製備雙特異性分子之方法例如描述於美國專利第5,260,203號；美國專利第5,455,030號；美國專利第4,881,175號；美國專利第5,132,405號；美國專利第5,091,513號；美國專利第5,476,786號；美國專利第5,013,653號；美國專利第5,258,498號；及美國專利第5,482,858號中。
雙特異性分子與其特異性標靶之結合可藉由例如酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(REA)、FACS分析、生物分析法(例如生長抑制)或西方墨點分析法來確認。此等各分析一般係分別採用對相關複合物具有特異性之標記試劑(例如抗體)偵測尤其受關注之蛋白質-抗體複合體的存在。
在另一態樣中，本發明提供多價化合物，其包含結合於BMP9之本發明之抗體及其抗原結合片段的至少兩個相同或不同抗原結合部分。抗原結合部分可經由蛋白質融合或共價或非共價連接而連接在一起。或者，已描述雙特異性分子之連接方法。四價化合物可例如藉由使本發明之抗體及其抗原結合片段與結合於本發明之抗體及其抗原結合片段之恆定區，例如Fc或鉸鏈區的抗體或抗原結合片段交聯來獲 得。
三聚結構域描述於例如Borean專利EP 1 012 280B1中。五聚模組描述於例如PCT/EP97/05897中。
半衰期延長之抗體
本發明提供活體內半衰期延長之特異性結合於BMP9之抗體。
許多因素可影響蛋白質之活體內半衰期。例如，腎過濾、肝臟中之代謝、蛋白水解酶(蛋白酶)降解及免疫原性反應(例如抗體對蛋白質之中和及被巨噬細胞及樹突細胞吸收)。多種策略可用於延長本發明之抗體及其抗原結合片段之半衰期。例如，藉由化學連接於聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗體骨架、聚唾液酸(PSA)、羥乙基澱粉(HES)、結合白蛋白之配位體及碳水化合物遮蔽物；藉由與結合於血清蛋白質之蛋白質(諸如白蛋白、IgG、FcRn)基因融合且轉移；藉由與結合於血清蛋白質之其他結合部分(諸如奈米抗體、Fab、DARPin、高親和性多聚體、親和抗體及抗運載蛋白)偶合(基因方式或化學方式)；藉由與rPEG、白蛋白、白蛋白結構域、白蛋白結合蛋白及Fc進行基因融合；或藉由併入奈米載體、緩釋調配物或醫學裝置中。
為延長活體內抗體之血清循環，諸如高分子量PEG之惰性聚合物分子可經由PEG與抗體之N端或C端之位點特異性結合或經由存在於離胺酸殘基上之ε-胺基，使用或不使用多官能性連接子連接於抗體或其片段。為使抗體發生聚乙二醇化，通常使抗體、其抗原結合片段與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在其中使一或多個PEG基團連接於抗體或抗體片段的條件下反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶聚合物)進行醯化反應或烷化反應來進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之任一種PEG形式，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二 醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在一個實施例中，待聚乙二醇化之抗體為去糖基化抗體。將使用使生物活性損失最小之線性或分支聚合物衍生作用。結合度可藉由SDS-PAGE及質譜分析密切監測以確保PEG分子與抗體之適當結合。未反應之PEG可藉由尺寸排阻或藉由離子交換層析而自抗體-PEG結合物分離。PEG衍生抗體可針對結合活性以及針對活體內功效，使用熟習此項技術者熟知之方法(例如藉由本文所述之免疫分析)來測試。用於蛋白質聚乙二醇化之方法為此項技術中已知且可應用於本發明之抗體及其抗原結合片段。參見例如，Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
其他經修飾之聚乙二醇化技術包括重構化學正交定向工程改造技術(ReCODE PEG)，其經由包括tRNA合成酶及tRNA之重構系統將化學上特定之側鏈併入生物合成蛋白質中。此技術實現將超過30個新胺基酸併入大腸桿菌、酵母及哺乳動物細胞中之生物合成蛋白質中。tRNA將規範胺基酸併入安置有琥珀密碼子之任何位置，將琥珀自終止密碼子轉換成信號傳導化學指定之胺基酸之併入的密碼子。
重組聚乙二醇化技術(rPEG)亦可用於延長血清半衰期。此項技術包括以遺傳方式將300至600個胺基酸非結構化蛋白質尾與現有醫藥蛋白質融合。由於此類非結構化蛋白質鏈之表觀分子量比其實際分子量大約15倍，因此蛋白質之血清半衰期大大延長。與需要化學結合及再純化之傳統聚乙二醇化相比，此製造方法大大簡化且產物為均質的。
另一技術為聚唾液酸化(polysialytion)，其使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)來延長有效壽命且提高治療性肽及蛋白質之穩定性。PSA為唾液酸聚合物(一種糖)。當用於蛋白質及治療性肽藥物傳遞時，聚唾液酸在結合時提供保護性微環境。此提高治療性蛋白質在循環中之有效壽命且防止其被免疫系統識別。PSA聚合物於人體中天然發現。進化超過數百萬年之某些細菌採用PSA聚合物來覆蓋其壁。此等天然 聚唾液酸化細菌接著能夠藉助於分子擬態來阻擋人體防禦系統。此類細菌中可容易產生大量且具有預定物理特徵之PSA(天然之終極隱匿技術)。由於細菌PSA與人體中之PSA在化學上相同，因此細菌PSA完全不具免疫原性，即使與蛋白質偶合。
另一技術包括使用連接於抗體之羥乙基澱粉(「HES」)衍生物。HES為來源於蠟質玉米澱粉之經修飾之天然聚合物，且可藉由人體酶代謝。通常投與HES溶液以取代血容量不足及改良血液之流變特性。抗體之羥乙基澱粉化藉由提高分子之穩定性以及藉由降低腎臟清除率實現循環半衰期之延長，使得生物活性提高。根據改變不同參數，諸如HES之分子量，可定製廣泛範圍之HES抗體結合物。
亦可藉由將一或多個胺基酸修飾(亦即取代、插入或缺失)引入IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈Fc結構域片段)中來產生活體內半衰期延長之抗體。參見例如國際公開案第WO 98/23289號；國際公開案第WO 97/34631號；及美國專利第6,277,375號。
此外，抗體可結合於白蛋白，以製備在活體內更穩定或具有更長活體內半衰期的抗體或抗體片段。該等技術為此項技術中所熟知，參見例如國際公開案第WO 93/15199號、第WO 93/15200號及第WO 01/77137號；以及歐洲專利第EP 413,622號。
延長半衰期之策略尤其適用於奈米抗體、基於纖維結合蛋白之結合劑及需要延長活體內半衰期之其他抗體或蛋白質。
抗體結合物
本發明提供特異性結合於BMP9之抗體或其抗原結合片段，其與異源蛋白質或多肽(或其抗原結合片段，較佳至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸之多肽)以重組方式融合或以化學方式結合(包括共價與非共價結合)而產生融合蛋白。詳言之，本發明提供融 合蛋白，其包含本文所述之抗體之抗原結合片段(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)及異源蛋白質、多肽或肽。使蛋白質、多肽或肽與抗體或抗體片段融合或結合之方法為此項技術中已知。參見例如美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號及第5,112,946號；歐洲專利第EP 307,434號及第EP 367,166號；國際公開案第WO 96/04388號及第WO 91/06570號；Ashkenazi等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539；Zheng等人，1995,J.Immunol.154：5590-5600；及Vil等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341。
其他融合蛋白可經由基因改組、基元改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)之技術產生。可採用DNA改組改變本發明之抗體及其抗原結合片段(例如具有較高親和力及較低解離速率之抗體及其抗原結合片段)的活性。一般參見美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；Patten等人，1997,Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等人，1999,J.Mol.Biol.287：265-76；及Lorenzo及Blasco,1998,Biotechniques 24(2)：308-313(此等專利及公開案各以全文引用的方式併入本文中)。抗體及其抗原結合片段或經編碼之抗體及其抗原結合片段可藉由在重組前利用易錯PCR、隨機核苷酸插入或其他方法進行隨機突變誘發而改變。編碼特異性結合於BMP9之抗體、其抗原結合片段的聚核苷酸可與一或多種異源分子之一或多種組分、基元、區段、部分、結構域、片段等重組。
此外，抗體及其抗原結合片段可與諸如肽之標記物序列融合以促進純化。在一個實施例中，標記物胺基酸序列為六組胺酸肽(SEQ ID NO：218)，尤其諸如pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)中提供之標籤，其中許多可購得。如Gentz等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，例如六組胺酸(SEQ ID NO：218)便於純化融合蛋白。適用於純化之其他肽標籤包括(但不限於)紅血球凝集素(「HA」)標籤，其對應於來源於流感紅血球凝集素蛋白質之抗原決定基(Wilson等人，1984,Cell 37：767)，及「flag」標籤。
在一個實施例中，本發明之抗體及其抗原結合片段結合於診斷或可偵測劑。此類抗體可用於監測或預後疾病或病症之發作、發展、進展及/或嚴重程度，作為臨床測試程序之一部分，諸如測定特定療法之功效。此類診斷及偵測可藉由使抗體與可偵測物質偶合來實現，該等可偵測物質包括(但不限於)各種酶，諸如(但不限於)辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如(但不限於)抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；螢光物質，諸如(但不限於)傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光物質，諸如(但不限於)魯米諾(luminol)；生物發光物質，諸如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母素；放射性物質，諸如(但不限於)碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In及111In)、鎝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin；及使用各種正電子發射斷層攝影術之正電子發光金屬，及非放射性順磁金屬離子。
本發明進一步涵蓋與治療部分結合的抗體及其抗原結合片段的 用途。抗體、其抗原結合片段可與治療部分(諸如細胞毒素，例如細胞生長抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α-發射體)結合。細胞毒素或細胞毒性劑包括損害細胞之任何藥劑。
此外，抗體、其抗原結合片段可與改變給定生物反應之治療部分或藥物部分結合。治療部分或藥物部分不應解釋為限於經典化學治療劑。舉例而言，藥物部分可為具有所需生物活性之蛋白質、肽或多肽。此類蛋白質可包括例如毒素，諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化因子；細胞凋亡劑；抗血管生成劑；或生物反應調節劑，諸如淋巴激素。
另外，抗體可與治療部分結合，諸如放射性金屬離子(諸如213Bi)或可用於使放射金屬離子(包括(但不限於)131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)與多肽結合的巨環螯合劑。在一個實施例中，巨環螯合劑為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸(DOTA)，其可經由連接子分子連接於抗體。此類連接子分子在此項技術中通常已知且描述於Denardo等人，1998,Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等人，1999,Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；及Zimmerman等人，1999,Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，各以全文引用的方式併入本文中。
熟知使治療部分與抗體結合之技術，參見例如Amon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編輯)，第243-56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」,Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(編輯)，第623-53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)； Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編輯)，第475-506頁(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編輯)，第303-16頁(Academic Press 1985)及Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.62：119-58。
抗體亦可附接於固體支撐物，其尤其適用於標靶抗原之免疫分析或純化。此類固體支撐物包括(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
產生本發明抗體之方法 編碼抗體之核酸
本發明提供經實質上純化之核酸分子，其編碼包含上文所述之BMP9結合抗體鏈之區段或結構域之多肽。一些本發明之核酸包含編碼SEQ ID NO：7、27、47、67、87、107、127、147或167任一者中所示之重鏈可變區的核苷酸序列，及/或編碼SEQ ID NO：17、37、57、77、97、117、137、157或177任一者中所示之輕鏈可變區的核苷酸序列。在一特定實施例中，核酸分子為表1中鑑別之彼等核酸分子。本發明之一些其他核酸分子包含與表1中鑑別之核酸分子之核苷酸序列實質上一致(例如至少65%、80%、95%或99%)的核苷酸序列。當自適當表現載體表現時，由此等聚核苷酸編碼之多肽能夠展現BMP9抗原結合能力。
本發明中亦提供編碼來自表1中闡述之BMP9結合抗體之重鏈或輕鏈的至少一個CDR區且通常所有三個CDR區的聚核苷酸。一些其他聚核苷酸編碼表1中闡述之BMP9結合抗體之重鏈及/或輕鏈的所有或實質上所有可變區序列。因為密碼簡併，所以多種核酸序列將編碼免 疫球蛋白胺基酸序列中之各者。
本發明之核酸分子可編碼抗體之可變區與恆定區。一些本發明之核酸序列包含編碼實質上與SEQ ID NO：7、27、47、67、87、107、127、147或167任一者中闡述之成熟重鏈可變區序列一致(例如至少80%、90%或99%)之成熟重鏈可變區序列的核苷酸。一些本發明之核酸序列包含編碼實質上與SEQ ID NO：17、37、57、77、97、117、137、157及177任一者中闡述之成熟輕鏈可變區序列一致(例如至少80%、90%或99%)之成熟輕鏈可變區序列的核苷酸。
聚核苷酸序列可藉由重新固相DNA合成或藉由編碼BMP9結合抗體或其結合片段之現有序列(例如如以下實例中所述之序列)之PCR突變誘發來產生。核酸之直接化學合成可藉由此項技術中已知之方法實現，諸如Narang等人，1979,Meth.Enzymol.68：90之磷酸三酯法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109,1979之磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22：1859,1981之胺基磷酸二乙酯法；及美國專利第4,458,066號之固體支撐物法。藉由PCR將突變引入聚核苷酸序列中可如以下文獻中所述進行：例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編輯)，Freeman Press,NY,N.Y.,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編輯)，Academic Press,San Diego,Calif.,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991。
本發明中亦提供用於產生上文所述之BMP9結合抗體之表現載體及宿主細胞。各種表現載體可用於表現編碼BMP9結合抗體鏈或結合片段之聚核苷酸。基於病毒之表現載體與非病毒表現載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體及系統包括質體、游離型載體(通常具有表現蛋白質或RNA之表現卡匣)及人類人工染色體(參見 例如Harrington等人，Nat Genet.15：345,1997)。舉例而言，適用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現BMP9結合聚核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、B及C、pcDNA3.1/His、pEBVHisA、B及C(Invitrogen,San Diego,Calif.)、MPSV載體及此項技術中已知用於表現其他蛋白質之許多其他載體。適用病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒之載體；基於SV40、乳頭狀瘤病毒、HBP埃-巴二氏病毒(HBP Epstein Barr virus)、牛痘病毒載體及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus；SFV)之載體。參見Brent等人，上文；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49：807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。
表現載體之選擇視欲表現載體之預定宿主細胞而定。通常，表現載體含有可操作地連接於編碼BMP9結合抗體鏈抗原結合片段之聚核苷酸的啟動子及其他調控序列(例如強化子)。在一個實施例中，誘導性啟動子用於防止插入序列在除誘導條件外的條件下表現。誘導性啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱休克啟動子。經轉型之生物體培養物可在非誘導條件下擴增，而使群體不偏向表現產物為宿主細胞更良好耐受的編碼序列。除啟動子之外，其他調節元件亦可為BMP9結合抗體鏈抗原結合片段之有效表現所需的或所要的。此等元件通常包括ATG起始密碼子及相鄰的核糖體結合位點或其他序列。另外，表現效率可藉由包括適於所用細胞系統之強化子來增強(參見例如Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125,1994；及Bittner等人，Meth.Enzymol.,153：516,1987)。舉例而言，SV40強化子或CMV強化子可用於增強哺乳動物宿主細胞中之表現。
表現載體亦可提供分泌信號序列位置以與藉由插入之BMP9結合抗體序列編碼之多肽形成融合蛋白。更常常，在包涵於載體中之前，插入之BMP9結合抗體序列與信號序列連接。待用於接收編碼BMP9結 合抗體輕鏈及重鏈可變域之序列的載體有時亦編碼恆定區或其部分。此類載體允許可變區與恆定區表現為融合蛋白，從而產生完整抗體及其抗原結合片段。通常，此類恆定區為人類恆定區。
含有及表現BMP9結合抗體鏈之宿主細胞可為原核或真核細胞。大腸桿菌為一種適用於選殖及表現本發明聚核苷酸之原核宿主。適用之其他微生物宿主包括桿菌(諸如枯草桿菌)，及其他腸內菌科(諸如沙門氏菌、沙雷氏菌)，及各種假單胞菌種。在此等原核宿主中，亦可產生通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)的表現載體。此外，將存在任何數目之多種熟知啟動子，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子通常控制表現，視情況與操縱序列一起，且具有用於起始且完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及其類似序列。諸如酵母之其他微生物亦可用於表現本發明之BMP9結合多肽。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體之組合。
在一個實施例中，哺乳動物宿主細胞用於表現及產生本發明之BMP9結合多肽。舉例而言，其可為表現內源性免疫球蛋白基因之融合瘤細胞株(例如如實例中所述之1D6.C9骨髓瘤融合瘤純系)或具有外源性表現載體之哺乳動物細胞株(例如以下例示之SP2/0骨髓瘤細胞)。此等細胞包括任何正常死亡或正常或異常永生動物或人類細胞。舉例而言，已研發出能夠分泌完整免疫球蛋白之多種適合宿主細胞株，包括CHO細胞株、各種Cos細胞株、海拉細胞(HeLa cell)、骨髓瘤細胞株、經轉型之B細胞及融合瘤。哺乳動物組織細胞培養物用於表現多肽之用途一般論述於例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子及強化子(參見例如Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68,1986)，及必需的處理資訊位點(諸如核 糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點)，及轉錄終止子序列。此等表現載體通常含有來源於哺乳動物基因或來源於哺乳動物病毒之啟動子。適合啟動子可為組成性、細胞類型特異性、階段特異性及/或可調節或可調控的。適用啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成性腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導性MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成性MPSV啟動子、四環素誘導性CMV啟動子(諸如人類即刻早期CMV啟動子)、組成性CMV啟動子及此項技術中已知之啟動子-強化子組合。
引入含有相關聚核苷酸序列之表現載體的方法視細胞宿主之類型而變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。(一般參見Sambrook等人，上文)。其他方法包括例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導轉型、注射及顯微注射、衝擊法、病毒顆粒(virosome)、免疫脂質體、聚陽離子：核酸結合物、裸DNA、人工病毒粒子、與疱疹病毒結構蛋白VP22融合(Elliot及O'Hare,Cell 88：223,1997)、DNA之藥劑增強性吸收及離體轉導。就長期高產量生產重組蛋白質而言，通常需要穩定的表現。舉例而言，穩定表現BMP9結合抗體鏈或結合片段之細胞株可使用本發明之表現載體製備，其含有病毒複製起點或內源性表現元件及可選標記物基因。在引入載體之後，可使細胞在交換至選擇性培養基之前，於豐富培養基中生長1-2天。可選標記物之目的為賦予抗選擇性，且其存在允許成功表現所引入序列之細胞在選擇性培養基中生長。抗性、穩定轉染之細胞可使用適合於該細胞類型之組織培養技術增殖。
本發明之單株抗體之產生
單株抗體(mAb)可藉由多種技術產生，包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,1975 Nature 256：495之標準體細胞雜交技術。產生單株抗體之許多技術可採用例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉型。
用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統。小鼠中之融合瘤產生為沿用已久之程序。分離經免疫接種之脾細胞用於融合之免疫接種方案及技術為此項技術中已知。融合搭配物(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序亦為已知。
在某一實施例中，本發明之抗體為人類化單株抗體。本發明之嵌合或人類化抗體及其抗原結合片段可基於如上所述製備之鼠類單株抗體之序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可自相關鼠類融合瘤獲得且使用標準分子生物學技術進行工程改造以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。舉例而言，為產生嵌合抗體，可使用此項技術中已知之方法使鼠類可變區與人類恆定區連接(參見例如Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人類化抗體，可使用此項技術中已知之方法使鼠類CDR區插入人類構架中。參見例如Winter之美國專利第5,225,539號及Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6180370號。
在某一實施例中，本發明之抗體為人類單株抗體。此類針對BMP9之人類單株抗體可使用攜帶部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉殖基因或轉染色體小鼠來產生。此等轉殖基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠且在本文中統稱為「人類Ig小鼠」之小鼠。
HuMAb Mouse®(Medarex,Inc.)含有編碼未重排人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微型基因座，以及使內源性μ及κ鏈基因座不活化的靶向突變(參見例如Lonberg等人，1994 Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠展現降低之小鼠IgM或K表現，且回應於免疫接種，所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因進行類別轉換及體細胞突變，以產生高親和力人類IgG-κ單株抗體(Lonberg,N.等人，1994上文；Lonberg,N.,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101中評述；Lonberg,N.及Huszar,D.,1995 Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding,F.及Lonberg,N.,1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠之製備及使用以及此類小鼠所攜帶的基因組修飾進一步描述於Taylor,L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen,J.等人，1993 International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等人，1993 Nature Genetics 4：117-123；Chen,J.等人，1993 EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，1994 J.Immunol.152：2912-2920；Taylor,L.等人，1994 International Immunology 579-591；及Fishwild,D.等人，1996 Nature Biotechnology 14：845-851，所有文獻之內容均以全文引用之方式特定併入本文中。進一步參見美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號，均頒予Lonberg及Kay；Surani等人之美國專利第5,545,807號；PCT公開案第WO 92103918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97113852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號，均頒予Lonberg及Kay；及Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
在另一實施例中，本發明之人類抗體可使用在轉殖基因及轉染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠(諸如攜帶人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠)來產生。此類小鼠(在本文中稱為「KM小鼠」)詳細描述於Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
再此外，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉殖基因動物系統在此項技術中可獲得且可用於培育本發明之BMP9結合抗體及其抗原結合片段。舉例而言，可使用稱作Xenomouse(Abgenix,Inc.)之替代轉殖基因系統。此類小鼠描述於例如Kucherlapati等人之美國專利第 5,939,598號、第6,075,181號、第6,114,598號、第6,150,584號及第6,162,963號。
另外，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉染色體動物系統可在此項技術中獲得，且可用於培育本發明之BMP9結合抗體。舉例而言，可使用稱作「TC小鼠」之攜帶人類重鏈轉染色體與人類輕鏈轉染色體之小鼠；此類小鼠描述於Tomizuka等人，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，此項技術中已描述攜帶人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛(Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20：889-894)，且可用於培育本發明之BMP9結合抗體。
本發明之人類單株抗體亦可使用篩選人類免疫球蛋白基因文庫之噬菌體呈現方法來製備。分離人類抗體之此類噬菌體呈現方法在此項技術中已確立或描述於下文實例中。參見例如Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698號；Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；及Griffiths等人之美國專利第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號及第6,593,081號。
本發明之人類單株抗體亦可使用其中人類免疫細胞已重組以使得可在免疫接種時產生人類抗體反應之SCID小鼠來製備。此類小鼠描述於例如Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
構架或Fc工程改造
本發明之經工程改造之抗體及其抗原結合片段包括其中已對VH及/或VL內之構架殘基進行修飾，例如以改善抗體特性之抗體及其抗原結合片段。通常進行此類構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法為使一或多個構架殘基「回復突變(backmutate)」成相應生殖系序列。更特定言之，已經歷體細胞突變之抗體可含有不同於 抗體所來源之生殖系序列的構架殘基。此類殘基可藉由比較抗體構架序列與抗體所來源於之生殖系序列來鑑別。為使構架區序列返回其生殖系組態，體細胞突變可藉由例如定點突變誘發「回復突變」成生殖系序列。此類「回復突變」抗體亦意欲涵蓋於本發明內。
構架修飾之另一類型包括使構架區內，或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，從而降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
除構架區或CDR區內所進行之修飾以外，或取而代之，本發明之抗體可經工程改造以包括在Fc區內之修飾，通常改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如可將一或多個化學部分附接於抗體上)，或經修飾以改變其糖基化而再改變該抗體之一或多種功能特性。此等實施例各進一步詳細描述於下文中。Fc區中之殘基編號為Kabat EU索引編號。
在一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。CH1鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數經改變以例如促進輕鏈與重鏈組裝或提高或降低抗體之穩定性。
在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以減少抗體之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區以使得抗體對葡萄球菌蛋白A(Staphylococcyl protein A，SpA)之結合相對於天然Fc鉸鏈域SpA結合減弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在另一實施例中，抗體經修飾以延長其生物半衰期。可進行多種方法。舉例而言，可引入以下突變中之一或多者：T252L、 T254S、T256F，如Ward之美國專利第6,277,375號中所述。或者，為延長生物半衰期，抗體可在CH1或CL區內改變以含有獲自IgG之Fc區之CH2域的兩個環的救助受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述。
在一個實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變，以改變抗體之效應功能。舉例而言，一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換以使得該抗體具有改變之針對效應子配體的親和力，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應子配位體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於例如Winter等人之美國專利第5,624,821號與第5,648,260號中。
在另一實施例中，選自胺基酸殘基之一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，以使得抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實施例中，一或多個胺基酸殘基經改變，從而改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在另一實施例中，藉由修飾一或多個胺基酸對Fc區進行修飾以提高抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或提高抗體對Fcγ受體之親和力。此方法進一步描述於Presta之PCT公開案WO 00/42072中。此外，已定位人類IgG1上Fc-γ RI、Fc-γ RII、Fc-γ RIII及FcRn之結合位點且已描述結合改善之變異體(參見例如Shields,R.L.等人，2001 J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
在再一實施例中，抗體之糖基化進行修飾。舉例而言，可製得無糖基化抗體(亦即，抗體缺乏糖基化)。糖基化可經改變以例如提高抗體對「抗原」之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體 序列內之一或多個糖基化位點來完成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，消除一或多個可變區構架糖基化位點，進而消除該位點之糖基化。此類無糖基化可提高抗體對抗原之親和力。此類方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
或者或另外，可產生糖基化類型改變之抗體，諸如岩藻糖基殘基量減少之低岩藻糖基化抗體或二分GlcNac結構增加之抗體。此類經改變之糖基化模式已證明會提高抗體之ADCC能力。此類碳水化合物修飾可藉由例如在糖基化機制改變之宿主細胞中表現抗體來實現。糖基化機制改變之細胞在此項技術中已有描述且可用作表現本發明之重組抗體，從而產生糖基化改變之抗體的宿主細胞。舉例而言，Hang等人之EP 1,176,195描述一種細胞株，其中編碼岩藻糖基轉移酶之FUT8基因在功能上破壞，使得此類細胞株中所表現之抗體展現低岩藻糖基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述一種變異CHO細胞株，LecI3細胞，其將岩藻糖附接於Asn(297)連接之碳水化合物的能力降低，亦使得該宿主細胞中表現之抗體低岩藻糖基化(亦參見Shields,R.L.等人，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現醣蛋白修飾之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III(GnTIII))的細胞株，使得在經工程改造之細胞株中表現的抗體展現增加之二等分GlcNac結構，引起抗體之ADCC活性增加(亦參見Umana等人，1999 Nat.Biotech.17：176-180)。
將改變之抗體工程改造的方法
如上文所論述，本文中展示之具有VH及VL序列或全長重鏈或輕鏈序列之BMP9結合抗體可用於藉由修飾全長重鏈及/或輕鏈序列、VH及/或VL序列或附接於其之恆定區來產生新BMP9結合抗體。因此，在本發明之另一態樣中，本發明之BMP9結合抗體的結構特徵用 於產生結構上相關之BMP9結合抗體，其保留本發明之抗體及其抗原結合片段的至少一種功能特性，諸如結合於人類BMP9且亦抑制BMP9之一或多種功能特性(例如抑制BMP9誘發之Smad1/5/8磷酸化、BMP9誘發之Id1誘發、纖維化標記物之BMP9誘發及/或BMP9誘發之肝臟破壞，其中任一分析為此項技術中已知，例如抑制Smad1/5/8磷酸化如先後藉由HUVEC分析法及西方墨點法(如本文所述)所量測，或先後藉由CFSC分析法及cellomics掃描(如本文所述)量測；例如抑制在小鼠HDI模型中，例如如本文所述之小鼠HDI模型中單次注射10mg/kg劑量時Id1之BMP9誘發)。
舉例而言，如上文所論述，本發明之抗體及其抗原結合片段的一或多個CDR區或其突變可以重組方式與已知之構架區及/或其他CDR組合，以產生其他以重組方式進行工程改造的本發明之BMP9結合抗體及其抗原結合片段。其他修飾類型包括先前章節中所述之修飾。工程改造方法之起始物質為本文中所提供之VH及/或VL序列中之一或多者，或其一或多個CDR區。為產生經工程改造之抗體，不必實際上製備(亦即表現為蛋白質)具有本文所提供之VH及/或VL序列中之一或多者或其一或多個CDR區的抗體。相反地，序列中所含有之信息用作起始物質以產生來源於原始序列之「第二代」序列，且隨後「第二代」序列經製備且表現為蛋白質。
經改變之抗體序列亦可藉由篩選抗體文庫來製備，該抗體文庫具有如US20050255552中所述之固定CDR3序列或最小基本結合決定子以及在CDR1及CDR2序列上之變異。篩選可根據適於自抗體文庫篩選抗體之任何篩選技術(諸如噬菌體呈現技術)進行。
標準分子生物學技術可用於製備及表現所改變之抗體序列。由改變之抗體序列編碼的抗體為保留本文中描述之BMP9結合抗體之一種、一些或全部功能特性的抗體，該等功能特性包括(但不限於)特異 性結合於人類BMP9蛋白質及/或抑制BMP9之一或多種功能特性(例如抑制BMP9誘發之Smad1/5/8磷酸化、BMP9誘發之Id1誘發、纖維化標記物之BMP9誘發及/或BMP9誘發之肝臟破壞，其中任一分析為此項技術中已知，例如抑制Smad1/5/8磷酸化如先後藉由HUVEC分析法及西方墨點法(如本文所述)所量測，或先後藉由CFSC分析法及cellomics掃描(如本文所述)量測；例如抑制在小鼠HDI模型中，例如如本文所述之小鼠HDI模型中單次注射10mg/kg劑量時Id1之BMP9誘發)。
經改變之抗體之功能特性可使用在此項技術中可獲得及/或本文所述之標準分析法(諸如闡述於實例中之分析法(例如ELISA))評估。
在工程改造本發明之抗體及其抗原結合片段之方法的一個實施例中，突變可隨機或選擇性地沿著BMP9結合抗體編碼序列之全部或部分引入，且可針對如本文所述之結合活性及/或其他功能特性篩選所得經修飾之BMP9結合抗體。突變方法已描述於此項技術中。舉例而言，Short之PCT公開案WO 02/092780描述使用飽和突變誘發、合成連接組裝或其組合來產生及篩選抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679描述使用計算篩選方法使抗體之生理化學特性最佳化的方法。
本發明之抗體之表徵
本發明之抗體及其抗原結合片段可藉由各種功能分析法表徵。舉例而言，其可藉由其抑制BMP9之能力表徵。
抗體結合於BMP9之能力可藉由直接標記相關抗體來偵測，或抗體可未標記且使用此項技術中已知之各種夾心分析格式間接偵測結合。
在一個實施例中，本發明之BMP9結合抗體及其抗原結合片段阻斷參考BMP9結合抗體與BMP9多肽之結合或與參考BMP9結合抗體競爭結合於BMP9多肽。此等可為上述完全人類或人類化BMP9結合抗 體。其亦可為與參考抗體結合於相同抗原決定基之其他人類、小鼠、嵌合或人類化BMP9結合抗體。阻斷參考抗體結合或與參考抗體競爭結合之能力表明所測試之BMP9結合抗體結合於與參考抗體所界定之抗原決定基相同或類似之抗原決定基，或結合於足夠靠近參考BMP9結合抗體所結合之抗原決定基的抗原決定基。此類抗體尤其可共享針對參考抗體所鑑別之有利特性。阻斷參考抗體或與參考抗體競爭之能力可藉由例如競爭結合分析法測定。使用競爭結合分析法，檢驗測試抗體抑制參考抗體與諸如BMP9多肽之共同抗原特異性結合之能力。若過量測試抗體實質上抑制參考抗體結合，則測試抗體與參考抗體競爭特異性結合於抗原。實質上抑制意謂測試抗體降低參考抗體之特異性結合通常達至少10%、25%、50%、75%或90%。
存在許多已知之競爭結合分析法可用於評估抗體與參考抗體競爭結合於特定蛋白質，在此情況下，為BMP9。此等分析法包括例如固相直接或間接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析法(EIA)、夾心競爭分析法(參見Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242-253,1983)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland 等人，J.Immunol.137：3614-3619,1986)；固相直接標記分析法、固相直接標記夾心分析法(參見Harlow和Lane，上文)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見Morel等人，Molec.Immunol.25：7-15,1988)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176：546-552,1990)；以及直接標記RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77-82,1990)。通常，此類分析法涉及使用經純化之抗原，該抗原結合於帶有未經標記之測試BMP9結合抗體及經標記之參考抗體中任一者的固體表面或細胞。競爭性抑制係藉由在測試抗體存在下測定結合於固體表面或細胞之標記的量來量測。通常測試抗體過量存在。藉由競爭分析法鑑別之抗體(競爭抗體)包括與參考抗體結合於相同抗原 決定基之抗體及結合於足夠靠近參考抗體所結合之抗原決定基之相鄰抗原決定基以發生位阻的抗體。
為確定所選BMP9結合單株抗體是否結合於獨特抗原決定基，可使用市售試劑((例如來自Pierce,Rockford,IL之試劑)對各抗體進行生物素標記。使用未標記單株抗體及生物素標記單株抗體之競爭研究可使用BMP9多肽塗佈之ELISA盤進行。生物素標記MAb結合可用鏈黴素-抗生物素蛋白-鹼性磷酸酶探針偵測。為確定經純化之BMP9結合抗體的同型，可進行同型ELISA。舉例而言，在4℃下可將微量滴定盤之孔塗佈1μg/ml抗人類IgG隔夜。在用1% BSA阻斷之後，盤與1μg/ml或更少單株BMP9結合抗體或經純化之同型對照在周圍溫度下反應一至兩小時。接著可使孔與人類IgG1或人類IgM特異性鹼性磷酸酶結合之探針反應。接著盤顯影且分析，從而可確定經純化之抗體的同型。
為證實單株BMP9結合抗體與表現BMP9多肽之活細胞的結合，可使用流動式細胞量測術。簡言之，表現BMP9之細胞株(在標準生長條件下生長)可與各種濃度BMP9結合抗體在含有0.1% BSA及10%胎牛血清之PBS中混合，且在37℃下培育1小時。在洗滌之後，使細胞與螢光素標記之抗人類IgG抗體在與初級抗體染色相同之條件下反應。樣品可藉由FACScan儀器，使用光及側散射特性在單細胞上閘控來分析。除流動式細胞量測術分析法之外或代替流動式細胞量測術分析，可利用使用螢光顯微法之替代分析法。細胞可如上所述準確染色且藉由螢光顯微法檢驗。此方法允許目測個別細胞，但靈敏度可能降低，視抗原密度而定。
本發明之BMP9結合抗體及其抗原結合片段可藉由西方墨點法進一步測試與BMP9多肽或抗原片段之反應性。簡言之，可製備經純化之BMP9多肽或融合蛋白或來自表現BMP9之細胞之細胞提取物且進行 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。在電泳之後，分離之抗原轉移至硝化纖維膜，用10%胎牛血清阻斷，且用待測試之單株抗體探測。可使用抗人類IgG鹼性磷酸酶偵測人類IgG結合且藉由BCIP/NBT受質錠劑(Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.)顯影。
功能分析法之實例亦描述以下實例部分中。
預防及治療用途
本發明提供治療與BMP9活性增加相關之疾病或病症的方法，其係藉由向有需要之個體投與有效量之本發明之任何抗體或其抗原結合片段。在一特定實施例中，本發明提供一種治療肝纖維化之方法，其藉由向有需要之個體投與有效量之本發明之抗體或其抗原結合片段。在一特定實施例中，本發明提供一種治療肝硬化之方法，其藉由向有需要之個體投與有效量之本發明之抗體或其抗原結合片段。在一特定實施例中，本發明提供一種治療門靜脈高血壓之方法，其藉由向有需要之個體投與有效量之本發明之抗體或其抗原結合片段。
本發明之抗體或其抗原結合片段可尤其用於治療，例如預防、延遲或逆轉例如肝纖維化之肝病的進展。本發明之抗體或其抗原結合片段可尤其用於治療，例如預防、延遲或逆轉肝硬化之進展。本發明之抗體或其抗原結合片段可尤其用於治療，例如預防、延遲或逆轉門靜脈高血壓之進展。抗體或其抗原結合片段亦可與其他療法組合用於治療患者之肝纖維化、肝硬化及/或門靜脈高血壓。本發明之抗體或其抗原結合片段可尤其用於治療，例如預防、延遲或逆轉晚期肝病，例如靜脈曲張、黃疸、腹水、肝性腦病、肝腎症候群、自發性細菌性腹膜炎及肝肺部症候群之進展。
在一個實施例中，本發明提供治療BMP9相關之疾病或病症的方法，其係藉由向有需要之個體投與有效量之本發明之抗體及其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段適用的已知之BMP9相關疾病或病症 的實例包括：血管生成，包括抑制腫瘤血管生成；貧血，包括腎貧血及癌症誘發之貧血；異位骨化疾病；血管疾病，包括動脈粥樣硬化、高血壓及心臟病。另外，抗體或其抗原結合片段適用的已知之BMP9相關疾病或病症的實例包括纖維化肝病，包括引起肝硬化及/或門靜脈高血壓之纖維化肝病，包括由例如以下引起之纖維化肝病：C型肝炎病毒(「HCV」)感染；B型肝炎病毒(「HBV」)感染；自體免疫性肝炎；酒精、毒素或藥物暴露；肝臟外傷；膽道阻塞；原發性膽汁性肝硬化；阿拉吉歐症候群；慢性肝淤血，包括由心肌疾病或肝流出阻塞引起；非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)；原發性硬化性膽管炎；血色沉著病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；以及威爾遜氏病。
在一特定實施例中，本發明提供治療BMP9相關疾病或病症之方法，其係藉由向有需要之個體投與有效量之本發明之抗體及其抗原結合片段，其中該疾病或病症為肝病，例如肝纖維化、肝硬化或門靜脈高血壓。
在一特定實施例中，本發明提供治療肝病，例如肝纖維化、肝硬化或門靜脈高血壓之方法，其係藉由向有需要之個體投與有效量之包含本發明抗體之組合物。在一特定實施例中，本發明提供治療肝病，例如肝纖維化或肝硬化之方法，其係藉由向有需要之個體投與有效量之包含本發明抗體之組合物。
在一特定實施例中，本發明提供治療門靜脈高血壓之方法。
在一個實施例中，表1中描述之經分離之抗體或其抗原結合片段可結合諸如本文中描述或此項技術中已知之治療方法或程序投與有需要之患者。此類方法或程序包括以下作為非限制性實例：與用於B型或C型肝炎之抗病毒療法、消炎劑、抗脂肪變性劑、抗細胞凋亡劑或保肝劑或其他抗纖維化劑共同投與。
舉例而言，本發明之抗體或其抗原結合片段，包括表1中描述之 彼等抗體或其抗原結合片段，可與「標準」抗纖維化劑組合使用。舉例而言，抗體或其抗原結合片段可與細胞毒素、免疫抑制劑、放射性毒性劑及/或治療抗體(亦即連同或聯合(亦即免疫結合物))組合投與。本發明涵蓋之特定共同治療劑包括(但不限於)類固醇(例如皮質類固醇，諸如潑尼松(Prednisone)、免疫遏制及/或消炎劑(例如γ干擾素、環磷醯胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲胺喋呤(methotrexate)、青黴胺(penicillamine)、環孢靈、秋水仙鹼、抗胸腺細胞球蛋白、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)及羥基氯奎(hydroxychloroquine))、細胞毒性藥物、鈣離子通道阻斷劑(例如硝苯地平(nifedipine))、血管收縮素轉化酶抑制劑(ACE)抑制劑、對胺基苯甲酸(PABA)、二甲亞碸、轉型生長因子-β(TGF-β)抑制劑、介白素-5(IL-5)抑制劑及泛卡斯蛋白酶抑制劑。
可與本發明之經分離之抗體或其抗原結合片段，包括表1中之抗體或其抗原結合片段組合使用的其他抗纖維化劑包括(但不限於)凝集素(如例如美國專利第7,026,283號中所述，其整個內容以引用的方式併入本文中)以及Wynn等人描述之抗纖維化劑(Journal Clin.Invest.第117卷第3期，2007年3月，第524頁，其整個內容以引用的方式併入本文中)。舉例而言，其他抗纖維化劑及療法包括(但不限於)各種消炎/免疫遏制/細胞毒性藥物(包括秋水仙鹼、硫唑嘌呤、環磷醯胺、潑尼松、沙立度胺(thalidomide)、配妥西菲林(pentoxifylline)及茶鹼)。TGF-β信號傳導改質劑(包括鬆弛素、SMAD7、HGF及BMP7以及TGF-β1、TGFβRI、TGFβRII、EGR-1及CTGF抑制劑)(例如吡非尼酮(perfenidone)、F-351、F-200及F-573)、細胞因子及細胞因子受體拮抗劑(IL-1β、IL-5、IL-6、IL-13、IL-21、IL-4R、IL-13Rβ1、GM-CSF、TNF-α、抑瘤素M、WISP-1及PDGF之抑制劑)、細胞因子及趨化因子(IFN-γ、IFN-α/β、IL-12、IL-10、HGF、CXCL10及CXCL11)、 趨化因子拮抗劑(CXCL1、CXCL2、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL6、CCL17及CCL18之抑制劑)、趨化因子受體拮抗劑(CCR2、CCR3、CCR5、CCR7、CXCR2及CXCR4之抑制劑)、TLR拮抗劑(TLR3、TLR4及TLR9之抑制劑)、血管生成拮抗劑(VEGF特異性抗體及腺苷脫胺酶替換療法)、抗高血壓藥(β阻斷劑及ANG II、ACE及醛固酮之抑制劑)、血管活性物質(ET-1受體拮抗劑及bosetan)、合成及加工膠原蛋白之酶之抑制劑(脯胺醯基羥化酶之抑制劑)、B細胞拮抗劑(利妥昔單抗)、整合素/黏附分子拮抗劑(阻斷α1β1及αvβ6整合素之分子以及整合素連接激酶之抑制劑及對ICAM-1及VCAM-1具有特異性之抗體)、靶向肌纖維母細胞之促細胞凋亡藥物、MMP抑制劑(MMP2、MMP9及MMP12之抑制劑)及TIMP抑制劑(對TIMP-1具有特異性之抗體)。
本發明之抗體或其抗原結合片段，包括表1中描述之抗體或其抗原結合片段，可與「標準」抗糖尿病劑，例如二甲雙胍(metformin)組合使用，以治療與糖尿病相關之NASH纖維化。可與本發明之抗體或其抗原結合片段，包括表1中描述之抗體或其抗原結合片段組合使用的其他抗糖尿病劑為此項技術中已知，且包括磺醯脲(例如格列本脲(glyburide)、格列吡嗪(glipizide)及格列美脲(glimepiride)、格列奈類(meglitinide)(例如瑞格列奈(repaglinide)及那格列奈(nateglinide))、噻唑啶二酮(例如羅格列酮(rosiglitazone)及吡格列酮(pioglitazone))、DPP-4抑制劑(例如西他列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)及利格列汀(linagliptin))、GLP-1受體促效劑(例如艾塞那肽(exenatide)及利拉魯肽(liraglutide))、SGLT2抑制劑(例如卡格列淨(canagliflozin)及達格列淨(dapagliflozin))及胰島素。
本發明之抗體或其抗原結合片段，包括表1中描述之抗體或其抗原結合片段，可與「標準」抗病毒劑，例如HBV及HCV抗病毒劑組合 使用，以治療HBV及/或HCV相關之纖維化。可與本發明之抗體或其抗原結合片段，包括表1中描述之抗體或其抗原結合片段組合使用的其他抗病毒劑為此項技術中已知，且包括干擾素(例如IFNα-2b、IFNα-2a、PEG-內含子及IFN alfacon-1)、與利巴韋林組合之干擾素、蛋白酶抑制劑(例如利帕斯韋、索非布韋、博賽普韋(boceprivir)或特拉匹韋、替諾福韋、達拉斯韋、西咪匹韋、萊達普韋)及其他抗病毒劑(例如拉米夫定、阿德福韋、替比夫定及恩替卡韋)。
本發明之抗體或其抗原結合片段，包括表1中描述之抗體或其抗原結合片段，可與「標準」消炎劑，例如皮質類固醇、GFT-505及賽你維可以及其組合進行組合使用。
本發明之抗體或其抗原結合片段，包括表1中描述之抗體或其抗原結合片段，可與「標準」抗脂肪變性劑，例如維生素E、吡格列酮、二甲雙胍、奧貝膽酸以及其組合進行組合使用。
本發明之抗體或其抗原結合片段，包括表1中描述之抗體或其抗原結合片段，可與「標準」抗細胞凋亡或保肝劑，例如奧貝膽酸、GFT-505、GR-MD-02以及其組合進行組合使用。
如熟練技術人員所瞭解，涉及本發明之抗體或其抗原結合片段，包括表1中描述之抗體或其抗原結合片段的組合療法可包括涉及多類上述藥劑之組合療法，例如可涉及一或多種抗病毒劑及一或多種其他抗纖維化劑。
當本發明之治療劑連同另一藥劑或其他藥劑投與時，兩種(或更多種)可按任何次序依序或同時投與。在一些態樣中，向亦接受使用第二藥劑或方法之療法的個體投與本發明之抗體。在其他態樣中，結合分子與手術治療結合投與。
用於與BMP9結合抗體組合治療之適合藥劑包括此項技術中已知之抑制或降低BMP9之表現、含量、穩定性及/或活性的藥劑。此類藥 劑包括針對BMP9之抗體、siRNA、可溶性BMP9受體、蛋白質及小分子。
此項技術中已知針對BMP9之各種抗體，尤其包括文獻中描述或可購得之彼等抗體，例如單株小鼠IgG2b純系360107(R&D systems MAB3209)及例如US2014/0056902中描述之彼等抗體。
針對BMP9之各種siRNA為此項技術中已知。
已知其他BMP9抑制劑，包括(例如)可溶性BMP受體，諸如ALKI之可溶性片段及ActRIIb。此等任一者可與本文所揭示之任何抗體或其抗原結合片段組合使用。
組合療法方案可為累加的，或其可產生協同結果(例如BMP9活性之降低超過對兩種藥劑組合使用所預期)。在一個實施例中，本發明提供一種用本發明之BMP9結合抗體及如上所述之抗纖維化劑或方法預防及/或治療肝病，例如纖維化、門靜脈高血壓或肝硬化，或如上所述之另一BMP9相關疾病的組合療法。
診斷用途
在一個態樣中，本發明涵蓋用於在生物樣品(例如血液、血清、細胞、組織)或個體罹患疾病或病症或處於出現與肝病相關之病症，例如肝纖維化、肝硬化或門靜脈高血壓風險下之情況下測定BMP9及/或核酸表現以及BMP9功能之診斷分析法。
諸如競爭分析法之診斷分析法依賴於標記類似物(「示蹤劑」)與測試樣品分析物競爭共同結合搭配物上有限數目結合位點的能力。結合搭配物一般在競爭之前或在競爭之後不溶解，且接著結合於結合搭配物之示蹤劑及分析物與未結合之示蹤劑及分析物分離。此分離藉由傾析(其中結合搭配物預先不溶)或藉由離心(其中結合搭配物在競爭反應之後沈澱)實現。測試樣品分析物之量與如藉由標記物質之量所量測的結合示蹤劑之量成反比。製備使用已知量之分析物的劑量反應曲 線且與測試結果比較以定量確定存在於測試樣品中之分析物之量。當酶用作可偵測標記物時，此等分析法稱為ELISA系統。在此形式之分析法中，抗體與BMP9結合抗體之間的競爭結合使得結合BMP9、優選本發明之BMP9抗原決定基為血清樣品中抗體，最尤其血清樣品中之中和抗體的量度。
所述分析法之一重要優點為直接量測中和抗體(亦即干擾BMP9、特別抗原決定基結合之抗體)。此類分析法，尤其呈ELISA測試形式之分析法在臨床環境及常規血液篩選中具有大量應用。
在臨床診斷或監測患有與肝病相關之病症(例如肝纖維化、肝硬化或門靜脈高血壓)的患者時，偵測到與來自正常個體之對應生物樣品中含量相比，例如肝臟中BMP9蛋白質或mRNA之含量升高表明患者患有與肝病(例如肝纖維化、肝硬化或門靜脈高血壓)相關之病症。
活體內診斷或成像描述於US2006/0067935中。簡言之，此等方法一般包含向患者投與或引入診斷有效量的可操作地附接於非侵襲性方法可偵測之標記物或標記的BMP9結合分子。允許抗體-標記物結合物足夠時間定位及結合於BMP9。接著患者暴露於偵測裝置，以鑑別可偵測標記物，因此形成患者組織中BMP9結合分子位置之影像。BMP9結合抗體或其抗原結合片段的存在藉由測定抗體標記物是否結合於組織組分而偵測。偵測到與無肝病，例如肝纖維化、肝硬化或門靜脈高血壓之正常個體相比，BMP9蛋白質或蛋白質組合之含量增加表明易患及/或患上與肝病(例如肝纖維化、肝硬化或門靜脈高血壓)相關之病症。本發明之此等態樣亦用於組織成像法及組合診斷與治療方法。
本發明亦係關於預測醫藥領域，其中診斷分析法、預後分析法、藥物基因組學及監測臨床試驗用於達成預後(預測)目的，以藉此預防性治療個體。
本發明亦提供預後(或預測)分析法用於確定個體是否處於發展與BMP9路徑活性失調相關之病症的風險下。舉例而言，BMP9基因之突變可在生物樣品中分析。此類分析可用於達成預後或預測目的，以藉此在發作特徵為BMP9、核酸表現或活性或與其相關之病症前預防性治療個體。
本發明之另一態樣提供用於測定個體中BMP9核酸表現或BMP9活性的方法，以藉此為該個體選擇適當治療或預防劑(在本文中稱作「藥物基因組學」)。藥物基因組學允許基於個體之基因型(例如進行檢驗以確定個體對特定藥劑起反應之能力的個體基因型)選擇藥劑(例如藥物)用於治療性或預防性治療個體。
本發明之另一態樣提供一種在臨床試驗中監測藥劑(例如藥物)對BMP9之表現或活性之影響的方法。
醫藥組合物
本發明提供包含BMP9結合抗體或其結合片段與醫藥學上可接受之載劑一起調配的醫藥組合物。組合物可另外含有一或多種適合於治療或預防BMP9相關疾病(例如肝病，例如肝纖維化、肝硬化或門靜脈高血壓)的其他治療劑。醫藥載劑增強組合物或使其穩定，或可促進組合物之製備。醫藥學上可接受之載劑包括生理學上相容之溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。
本發明之醫藥組合物可藉由此項技術中已知之多種方法投與。投藥途徑及/或模式視所要結果而變化。投與可為靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下，或靠近目標部位投與。醫藥學上可接受之載劑應適合於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊髓或表皮投藥(例如藉由注射或輸液)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦即抗體、雙特異性及多特異性分子)可用保護化合物不受酸作用及可使化合物不活化之其他天 然條件影響的物質塗佈。
組合物應為無菌及流體。舉例而言，可藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液之情況下維持必要粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)及氯化鈉。藉由使組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)，可實現可注射組合物之長期吸收。
本發明之醫藥組合物可根據此項技術中熟知且常規實施之方法製備。參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.，第20版，2000；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。醫藥組合物較佳在GMP條件下製造。通常，在本發明之醫藥組合物中採用治療上有效劑量或有作用劑量之BMP9結合抗體。BMP9結合抗體藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配成醫藥學上可接受劑型。調節劑量方案以得到最佳所需反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單一藥團，可隨時間投與若干個分次劑量，或可依治療情況之緊急性所指示按比例減少或增加劑量。就易投藥性及劑量之均一性而言，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的實體離散單元；各單元含有經計算以產生所需治療效應之預定量活性化合物，與所需醫藥載劑結合。
可改變本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量，以便獲得在對患者無不當毒性之情況下有效實現特定患者、組合物及投與模式之所需治療反應的活性成分之量。所選劑量視多種藥物動力學因素而定，該等因素包括所採用之本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所採用之特定化合物之排泄速率、治療持 續時間、與所採用之特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、整體健康情況及之前病史及其類似因素。
醫師或獸醫可以低於達成所需治療作用所需之水準的水準開始醫藥組合物中所用之本發明之抗體或抗體片段的劑量，且逐漸增加劑量直至達成所需作用為止。一般而言，本發明之組合物有效治療本文中描述之過敏性發炎性病症之劑量視許多不同因素而變化，該等因素包括投與方式、目標部位、患者之生理狀態、患者為人類還是動物、投與之其他藥物治療及治療為預防還是治療。需要滴定治療劑量以使安全性及功效達最佳。對於全身性投與抗體，劑量範圍為每公斤宿主體重約0.0001mg至100mg，且更通常為每公斤宿主體重0.01mg至15mg。例示性治療方案需要每兩週全身投與一次或一月一次或每3至6個月一次。對於玻璃體內投與抗體，劑量在約0.0001mg至約10mg範圍內。例示性治療方案需要每兩週全身投與一次或一月一次或每3至6個月一次。
抗體通常多次投與。單次劑量之間的間隔可為數週、數月或數年。如量測患者中BMP9結合抗體之血液含量所指示，間隔亦可為不規則的。在全身性投藥之一些方法中，調整劑量以達成1至1000μg/ml之血漿抗體濃度且在一些方法中為25μg/ml至500μg/ml。或者，抗體可以持續釋放調配物之形式投與，在此情況下，投與頻率較低。劑量及頻率視患者中抗體之半衰期變化。一般而言，人類化抗體顯示的半衰期比嵌合抗體及非人類抗體之半衰期長。投與之劑量及頻率可視治療為預防性還是治療性而變化。在預防性應用中，在長時間段內，以相對不頻繁之間隔投與相對較低之劑量。一些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短之間隔投與相對較高之劑量，直至疾病之進展降低或終止，且較佳直至患者展示 疾病之症狀部分或完全改善。此後，可向患者投與預防性方案。
實例
提供以下實例以進一步說明本發明，但不限制其範疇。本發明之其他變體對於一般技術者而言顯而易見且涵蓋於隨附申請專利範圍中。
實例1：重組BMP9之產生
將編碼全長hBMP9蛋白質之DNA序列選殖至表現載體中且藉由DNA定序來證實。將hBMP9構築體瞬時轉染至293F細胞株中且將該等細胞針對hBMP9蛋白質產生進一步最佳化。最終產生以10L規模及多輪進行。當細胞存活率>80%時收集最終收穫物。最終收穫物中之細胞碎片藉由離心及過濾製程去除。標靶hBMP9蛋白質藉由使用陽離子交換層析及陰離子交換層析來純化。超過濾用於濃縮hBMP9蛋白質及交換緩衝液。蛋白質之定量藉由羅氏法(Lowry method)測定。經純化之hBMP9蛋白質藉由SDS-PAGE、西方墨點法及HPLC分析。
實例2：藉由融合瘤技術產生抗BMP9抗體 小鼠免疫接種及融合
藉由重複程序，對十隻BALB/c小鼠進行重組蛋白人類BMP9(huBMP9)免疫接種，該程序涉及皮下或腹膜間注射25-50μg huBMP94次。收穫經免疫接種小鼠之脾臟，且經分離之脾細胞與骨髓瘤細胞(P3Ag8.653細胞株)融合，產生融合瘤純系。以結合ELISA為主要篩選分析法，測試來自融合瘤純系之上清液，以鑑別結合於BMP9之陽性純系。接著在阻斷性ELISA中測試自主要篩選結合分析法鑑別之陽性純系的上清液，以鑑別可抑制BMP9與其受體之間的相互作用之陽性純系。使用四種不同重組BMP9受體：人類Alk1-Fc(R&D system，370-AL-100)；人類BMPRII-Fc(R&D system，811-BR-100)；人類ActRIIA-Fc(R&D system，340-R2-100)；人類ActRIIB-Fc(R&D system)。
基於如Biacore所檢驗，以高親和力結合huBMP9之能力，且針對阻斷特異性BMP9受體相互作用之能力，選擇兩個純系用於人類化。2B11G2抑制人類BMP9及人類Alk1之結合，而4E10D7抗體可抑制人類BMP9及人類BMPRII之結合。因此，2B11G2歸類為I型受體相互作用之抑制劑，而4E10D7歸類為II型受體相互作用之抑制劑。
小鼠融合瘤抗體2B11G2及4E10D7之結合特性及序列分別展示在表2及3中。
2B11G2人類化抗體之設計
藉由CDR移植，設計來源於2B11G2小鼠抗體之人類化抗體。簡言之，藉由將非人類動物抗體(稱作「供體」)之VH CDR或VL CDR之胺基酸序列移植至人類抗體(稱作「接受體」)之VH或VL之構架區中來產生。
選擇人類生殖系序列1-46(VBASE VH1 1-46；IMGT IGHV1-46*01)作為人類化2B11G2 VH之接受體構架；將2B11G2 VH之CDR移植至接受體構架中，以產生2B11G2 VH之第一人類化序列，稱為2B11G2_VH1_Hz0。使重鏈構架中之位置71、73、78、94(Chothia編號協定)突變成對應小鼠供體殘基，以產生序列2B11G2_VH1_Hz1。2B11G2_VH1_Hz0及2B11G2_VH1_Hz1之CDR2中的潛在轉譯後修飾(PTM)NG位點藉由分別在序列2B11G2_VH1_Hz0_N55Q及序列2B11G2_VH1_Hz1_N55Q中將NG取代成QG來移除。
選擇人類生殖系序列A10(VBASE VKVI A10；IMGT IGKV6-21*01)作為人類化2B11G2 VL之接受體構架；將2B11G2 VL之CDR移植至接受體構架中，以產生2B11G2 VL之第一人類化序列，稱為2B11G2_VK6_Hz0。由於供體與接受體序列之間構架高度保守，故不引入額外構架突變。
藉由密碼子最佳化產生每個人類化序列之核苷酸序列。
設計多個人類化VH序列及多個人類化VL序列；且可藉由將每個人類化VH序列與每個人類化VL序列組合來產生呈IgG1或Fab之一組人類化抗體。VH序列及VL序列運載在不同質體中，因此重鏈質體與輕鏈質體共轉染至表現宿主細胞(亦即HEK293-6E細胞)中以產生特異性抗體。在此人類化研究中，嵌合或人類化抗體以IgG1形式產生。
4E10D7人類化抗體之設計
來源於4E10D7小鼠抗體之人類化抗體藉由如上所述之CDR移植 設計。
選擇人類生殖系序列1-02(VBASE VH11-02；IMGT IGHV1-2*02)作為人類化4E10D7 VH之接受體構架；將4E10D7 VH之CDR移植至接受體構架中，以產生4E10D7 VH之第一人類化序列，稱為4E10D7_VH1_Hz0。使重鏈構架中之位置71、73、94(Chothia編號協定)突變成對應小鼠供體殘基，以產生序列4E10D7_VH1_Hz1。4E10D7_VH1_Hz1之CDR2中的潛在轉譯後修飾(PTM)NG位點藉由在序列4E10D7_VH1_Hz1_N55Q中將NG取代成QG來移除。
選擇人類生殖系序列L25(VBASE VKIII L25；IMGT IGKV3/OR2-268*01)作為人類化4E10D7 VL之接受體構架；將4E10D7 VL之CDR移植至接受體構架中，以產生4E10D7 VL之第一人類化序列，稱為4E10D7_VK3_Hz0。使輕鏈構架中之位置4、36、46、83及87(Chothia編號協定)突變成對應小鼠殘基，以產生稱為4E10D7_VK3_Hz3之人類化序列。
人類化VH及VL序列運載在不同質體中，且宿主細胞(亦即HEK293-6E細胞)用一種重鏈質體及一種輕鏈質體共轉染，以產生特異性IgG1抗體。
人類化抗體之產生及純化
將HEK293-6E細胞在補充有0.1% Pluronic F68(Invitrogen，24040-032)及4mM L-GlutaMAX(Invitrogen，35050-061)之F17培養基(Invitrogen，0050092DK)中培養。在轉染前一天細胞以1×106/ml之密度處理，且自培養基移除抗生素。在轉染當天，首先量測細胞密度及存活率以確保密度應在1.5-2.0×106個細胞/毫升內且存活率應超過95%。質體DNA之用量藉由細胞體積計算，總質體DNA量通常為每1×106個細胞1μg用於抗體表現。將重鏈(HC)質體及輕鏈(LC)質體(推薦之HC：LC比率為IgG表現1：1.5及Fab表現1.5：1)添加至補充有轉染強 化子293 Expression MAX-1(ACRO Biosystems，Exp-711)之滅菌水(Invitrogen，10977-015)中，其中強化子：DNA之比率=1-4μL：10μg，因此接著添加1mg/ml轉染試劑PEI(聚乙烯亞胺，線性，25Da,Polysciences,24885)，PEI：DNA之比率=4：1。接著混合物輕緩地添加至細胞中。在轉染之後24小時將胰蛋白腖(胰蛋白腖N1，Organotechnie,TekniScience Inc.,19553)添加至細胞中，最終濃度為0.5%。經轉染之細胞一般在轉染之後5至7天以60%-80%存活率收穫。
純化製程藉由AKTAxpress系統(GE Healthcare)進行。簡言之，收穫之細胞在10000G下離心10分鐘，且上清液經由0.22μm膜過濾以移除小細胞碎片。推薦添加相同體積之DPBS(GIBCO，A12586-01)至上清液中以提高捕捉效率。為純化IgG，MabSelect管柱(GE Healthcare)連接至AKTAxpress儀器，且為純化Fab，使用KappaSelect管柱(GE Healthcare)。在負載樣品前將管柱用10CV(管柱體積)操作緩衝液(DPBS)平衡。在負載樣品之後，將管柱用8CV DPBS洗滌。藉由檸檬酸溶離緩衝液梯度(50mM檸檬酸鈉、140mM NaCl，pH 2.5)自管柱溶離抗體樣品，且接著收集至具有中和緩衝液(1M Tris-HCl，pH9.0)之深孔盤(Thermo Scientific Nunc Plate，目錄號THM#278743)中。自該等孔彙集抗體樣品且接著在PBS中透析或藉由Amicon離心管過濾來處理。
人類化變異體之親和力成熟
分析基於4E10D7及基於2B11G2之人類化抗體的結合親和力，且選擇來源於各鼠類抗體之單個人類化變異體以藉由親和力成熟，藉由合理設計與跨越結合「熱點」及CDR區之突變誘發，使用酵母呈現庫進一步優化。分析變異抗體之結合親和力。
基於親本4E10D7衍生之人類化抗體hz45設計總共21個重鏈變異體(稱為4E10D7_AM_H_01至4E10D7_AM_H_21)，而在所有其他變異 體中使用來自4E10D7-hz45之輕鏈(稱為4E10D7_AM_L_00)。
基於親本2B11G2衍生之人類化抗體hz42或hz52 VH，設計總共50個重鏈變異體(稱為2B11G2_AM_H_01至2B11G2_AM_H_50)，且基於親本2B11G2衍生之人類化抗體hz52 VL，設計5個輕鏈變異體(稱為2B11G2_AM_L_01至2B11G2_AM_L_05)。
展示親和力提高之具有突變之鏈以IgG或Fab格式構築。所衍生之抗體隨後使用來自重鏈及輕鏈標識符之字尾重新命名。舉例而言，包含4E10D7_AM_H_01重鏈及4E10D7_AM_L_00輕鏈之IgG重新命名為AM0100；包含4E10D7_AM_H_19重鏈及4E10D7_AM_L_00輕鏈之IgG重新命名為AM1900；包含2B11G2_AM_H_44重鏈及2B11G2_AM_05輕鏈之IgG重新命名為AM4405。
使用本文中描述之BRE-Luc分析法，分析構築抗體與huBMP9之結合，及對BMP9信號傳導之抑制。
實例3：藉由噬菌體呈現技術產生抗BMP9抗體
與上述藉由小鼠融合瘤及人類化程序鑑別抗BMP9抗體之工作平行，噬菌體呈現用於鑑別完全人類抗BMP9抗體。簡言之，為選擇識別人類BMP9之抗體，採用多個淘選策略。針對人類BMP9蛋白質之治療抗體藉由使用市售噬菌體呈現文庫MorphoSys HuCAL PLATINUM®文庫作為抗體變異蛋白質來源，選擇具有高結合親和力之純系來產生。噬菌粒文庫係基於HuCAL®概念(Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296：57-86)且採用CysDisplay®技術用於在噬菌體表面上呈現Fab(Lohning之WO01/05950)。為增加抗體結合親和力，同時維持文庫多樣性，將溶液與固相淘選之第二輪輸出輸入RapMATTM製程，同時進入全細胞及差異全細胞淘選策略之第三輪輸出(Prassler等人，(2009)Immunotherapy；1：571-583)。
為表現全長IgG，重鏈(VH)及輕鏈(VL)之可變域片段自Fab表現 載體次選殖至包含人類恆定域之適當表現載體中。真核HKB11細胞經編碼IgG之重鏈與輕鏈之表現載體DNA轉染。
分析抗體之結合親和力、特異性及對BMP9與其受體之結合的抑制。抗BMP9抗體分成三組：I型抑制劑(能夠抑制ALKI與BMP9之結合)、II型抑制劑(能夠抑制ActRIIB及/或BMPRII之結合)或I型+II型抑制劑(能夠抑制ALKI與ActRIIB及/或BMPRII之結合)。
展示對huBMP9之最高親和力的抗體進行進一步工程改造。使用基於PCR之策略進行工程改造過程。在藉由重疊延伸PCR合成及組裝之後，將再次工程改造之VH及VL片段次選殖至適當載體主鏈中，用於隨後Fab或IgG表現。工程改造過程涉及以下態樣：生殖系、移除PTM位點及/或密碼子最佳化。
實例4：BMP受體抑制分析法
阻斷性ELISA用於鑑別可抑制BMP9與其受體之間的相互作用之陽性純系。可使用四種不同重組BMP9受體：人類Alk1-Fc(R&D system，370-AL-100)；人類BMPRII-Fc(R&D system，811-BR-100)；人類ActRIIA-Fc(R&D system，340-R2-100)；人類ActRIIB-Fc(R&D system)。
抗體樣品對特定配位體/受體組合之阻斷活性由ELISA量測。簡言之，在4℃下將50μl濃度為塗佈緩衝液(PBS)中1μg/ml之受體添加至96孔ELISA盤中隔夜，接著用PBST洗滌一次。ELISA盤用各孔中200μl阻斷緩衝液(含有1% BSA之PBST)阻斷且接著在室溫(RT)下培育1小時，接著用PBST洗滌3次。將稀釋之抗體樣品與生物素標記之人類BMP9(1μg/ml bio-hBMP9)混合且於室溫下培育45分鐘。將抗體與bio-hBMP9之混合物以50微升/孔添加至盤中，且接著於室溫下培育30分鐘，接著用PBST洗滌3次。將50μl Poly-HRP抗生蛋白鏈菌素(Thermofisher，21140)添加至盤各孔中，且於室溫下培育30分鐘，接 著用PBST洗滌5次。最後，將50μl TMB試劑(Invitrogen 002023)及50μl 1N HCl(Invitrogen SS01100)添加至各孔中，以終止反應。各孔之吸收度在450nm下讀取以得到讀數OD450。若抗體以IC50<1nM抑制Alk1與BMP9之結合，則其表徵為「I型」抑制劑。若抗體以IC50<1nM抑制ActRIIA、ActRIIB及/或BMPRII與BMP9之結合，則其表徵為「II型」抑制劑。若抗體以IC50<1nM抑制Alk1之結合且以IC50<1nM抑制ActRIIA、ActRIIB及/或BMPRII與BMP9之結合，則其表徵為「I型+II型」。在另一分析法中量測各BMP受體與人類BMP9之結合的抑制。
實例5：抗BMP9抗體對BMP9之結合親和力
溶液平衡滴定(SET)分析法允許測定緊密結合劑之Fab-抗原相互作用親和力(KD)(參見Friquet,B.,Chaffotte,A.F.,Djavadi-Ohaniance,L.,及Goldberg,M.E.(1985).Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay.J Immnunol Meth 77,305-319；以引用的方式併入本文中)。此項技術不需要任一相互作用搭配物之固定或標記，且適合於強相互作用(pM至低nM範圍)。簡言之，恆定濃度之Fab(濃度處於或低於預期K)之混合物與適合濃度範圍內之抗原一起共同培育，直至達到平衡。游離Fab結合位點之量藉由將混合物轉移在抗原塗佈之盤上且簡單培育來測定。因此，游離Fab結合於盤且在洗滌步驟以移除Fab-抗原複合物之後用偵測抗體偵測。所產生的信號相對於抗原濃度繪製；且藉由非線性曲線擬合準確測定KD。
在培育緩衝液(含有0.5% BSA(Sigma Cat#A7906-500G)及0.02% Tween-20(VWR Cat#437082Q)之PBS(Teknova Cat#P0195))中製備抗原(人類BMP9(GD-43-KS00)；食蟹獼猴BMP9、大鼠BMP9(R&D Systems 5566-BP)或小鼠BMP9(iPROT101715))之22個連續2n稀釋液。 添加恆定濃度之Fab。60μl體積之各抗原：Fab混合物一式兩份分佈至384孔聚丙烯微量滴定盤(PP MTP，Greiner Cat#781280)中。培育緩衝液充當陰性對照且不含抗原之樣品充當陽性對照(Bmax)。將盤密封且在室溫(RT)下培育隔夜(O/N)。
將384孔標準MSD陣列盤(Meso Scale Discovery Cat#L21XA)塗上作為捕捉劑之在PBS中稀釋之30微升/孔人類BMP9且在4℃下培育隔夜。在用70微升/孔洗滌緩衝液(具有0.05% Tween-20之TBS(Teknova Cat#T1680))洗滌3次之後，在室溫下將盤用50微升/孔阻斷緩衝液(具有5% BSA之PBS)阻斷1小時。在洗滌之後，將30微升/孔體積之抗原：Fab混合物自PP MTP轉移至經塗佈之MSD盤中且於室溫下培育20分鐘。在額外洗滌步驟之後，將在培育緩衝液中1：1000稀釋之30μl偵測抗體(結合MSD SULFO-TAG NHS酯(Meso Scale Discovery Cat#R91AN-1)之山羊抗人類Fab特異性抗體(Jackson Immuno Research Cat#109-005-097))添加至各孔中且於室溫下培育30分鐘。洗滌MSD盤且添加35微升/孔讀取緩衝液(MSD讀取緩衝液T 4x，Meso Scale Discovery Cat#R92TC-1)且接著於室溫下培育5分鐘。用MSD SECTOR Imager 6000量測ECL信號。根據Fab之1：1擬合模型(根據Piehler等人，1997)，用XLfit(IDBS)軟體評估資料。
實例6：抗BMP9抗體之結合特異性
證實抗BMP9抗體對BMP9之結合親和力，且經由SPR，藉由Biacore T200儀器(Biacore,GE healthcare)測定對其他抗原之親和力(及特異性)。使用標準EDC-NHS胺偶合化學將抗原(重組人類(rh)BMP9或rhBMP2(R&D Cat#355-BM-010)、rhBMP7(R&D Cat#354-BP-010)或rhBMP10(R&D Cat#2926-BP-025))固定在CM5感測器晶片(Biacore,GE Healthcare)上，以達到特定表面積密度(rhBMP9為50RU，rhBMP2為800RU，rhBMP7為580RU，rhBMP10為390RU)。操作緩衝液為30 μl/min之HBS-EP+。使用2倍連續稀釋之六個不同Fab濃度(31.25nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM、1000nM)進行動力學量測。用KINJECT以30μl/min之流速量測樣品，注射時間為180s且解離時間為1500s。在各循環之後，用10mM甘胺酸pH 1.5(rhBMP9)或50mM NaOH(rhBMP2、rhBMP7或rhBMP10)使感測器晶片再生以移除結合分析物。原始數據使用Biacore T200評估軟體(Biacore,GE healthcare)擬合成1：1結合模型以確定kon及koff速率常數且接著計算KD。
一般技術者將瞭解其他方法可用於量測抗體對BMP9之親和力，包括例如ELISA或Octet(Forte-Bio Octet)。雖然預期各項技術產生實質上類似之結果，但認為如藉由MSD-SET所量測之結合親和力及KD對KD小於約10nM之抗體而言為決定性的。
實例7：抗BMP9抗體之活體外活性
使用穩定表現BRE(BMP9反應元件)驅動之螢火蟲螢光素酶的HEK293T ID-BRE2-luc細胞，分析抗體抑制BMP9誘發之信號傳導的能力。
經穩定轉染之HEK293T ID-BRE2-luc細胞在無抗生素之杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM，高葡萄糖；含有GlutaMAXTM-II、4.5g/l葡萄糖，但無丙酮酸鈉之DMEM；Gibco，# 31965)及10%熱失活胎牛血清(FBS，PAN # P30-1502，藉由在56℃下培育30分鐘熱失活)中生長。細胞在37℃下在5% CO2氛圍中培育。為繼代培養，在用1x DPBS(無CaCl2及MgCl2；Gibco，# 14190)洗滌一次之後，細胞用Accutase溶液(PAA，# L11-007)分離。細胞一週兩次繼代培養。作為選擇抗生素，滅瘟素(Blasticidin S HCL)(Invitrogen，# R210-01)以10μg/ml之最終濃度新鮮添加至繼代培養之細胞中。
對於報導基因分析法，使用Accutase分離細胞，且於量測培養基 (不具有選擇抗生素之培養基)中以每孔1×104個細胞之密度接種在384孔平底白色分析盤(Becton Dickinson Labware，#35-3988)中且在37℃及5% CO2下培育隔夜。次日，在37℃下純化之IgG與抗原(最終濃度：300pM)一起預培育30分鐘。對於人類BMP9誘發之活性，使用重組人類BMP9複合物(200ng/ml，藉由AutekBio FTZ Inc.純化)；對於人類BMP2誘發之活性，使用重組人類BMP2(100ng/ml，R&D #355-BM-010/CF)；對於人類BMP7誘發之活性，使用重組人類BMP7(400ng/ml，R&D #354-BP-010/CF)；對於大鼠BMP9誘發之活性，在接種在90mm培養皿中之293T細胞中過度表現6μg pcDNA3.1-大鼠BMP9質體，且48小時後，收集培養基作為大鼠BMP9條件培養基，且使用1/16稀釋之大鼠BMP9條件培養基。將預先培育之抗體-抗原混合物添加至細胞中且刺激後18小時，使細胞溶解且根據製造商方案，藉由添加Bright-GloTM(Bright-GloTM螢光素酶分析系統；Promega；# E2620)至細胞中，偵測螢光素酶活性。在Tecan讀數器(整合時間：250ms；減弱：無；移動與整合之間的時間：3ms)中量測發光。
實例8：Smad1/5/8磷酸化分析法
對於HUVEC細胞分析法，HUVEC細胞購自Allcells且在HUVEC培養基(Allcells，H-004)中培養。將6孔培養盤以3×105個細胞/孔接種且在培養基中培養。接著細胞在37℃與5% CO2下培育隔夜。向細胞中添加於DMEM加0.5% FBS中之BMP9抗體，有或無BMP9(重組人類BMP9複合物，如上所述)。在1小時之後，收穫細胞且在95℃下在SDS樣品緩衝液中變性10分鐘。蛋白質藉由SDS-PAGE分離且點墨至硝化纖維膜(iBlot Gene Transfer Stacks，Life Tech #34095)上。將膜用5%脫脂奶粉阻斷1小時，且接著在4℃下與初級抗體、抗磷酸化-Smad 1/5 Ab(CST #9516，1：1000)、抗ID1 Ab(Santa Cruz #SC-488，1：200)或抗GAPDH Ab(CST #2118，1：2000)一起培育隔夜。在洗滌之後，膜 在室溫下藉由使用適當辣根過氧化酶結合之二級抗體在室溫下1小時、抗小鼠IgG-HRP(CST #7076，1：2500)或抗兔IgG-HRP(CST #7074，1：2500)培育1小時。結果藉由BioRed ChemDoc Image機目測。
對於CFSC細胞分析法，CFSC細胞與DMEM加10% FBS一起培養。在第0天，將50微升/孔1.0×105個細胞/毫升懸浮液(5×103個細胞/孔)用培養基接種在黑色96孔PE盤中，在37℃、5% CO2下培育隔夜。在第1天，製備抗體稀釋液及人類BMP9溶液：重組人類BMP9複合物(200ng/ml)及Ab(自12μg/ml稀釋，比率為1：3且6次)。混合抗體及BMP9(1：1)，在37℃下培育30分鐘，接著添加50微升/孔BMP/Ab混合物至含有50μl來自前一天之培養基之細胞盤中，在37℃下與5% CO2一起培育。1.5小時後，在室溫下將盤固定在4%三聚甲醛中15分鐘，在用PBS洗滌之後，在室溫下用PBS中0.1% TritonX-100滲透細胞又15分鐘。再次洗滌，在室溫下用PBS中3% BSA阻斷細胞1小時。接著與p-Smad1/5/8抗體(Millipore #AB3848)在4℃下一起培育隔夜，在洗滌之後，與二級抗體(Alexa Fluor 488驢抗兔抗體，Life Tech #A21206)加DAPI染料在室溫下再一起培育2小時。澈底洗滌，接著供應100μl PBS，藉由Thermofisher Cellomics ArrayScan HCS系統讀取。
實例9：抗BMP9抗體之活體外活性
使用肝纖維化之流體動力學注射(HDI)小鼠模型量測抗BMP9抗體之活體內功效。
無特定病原體(SPF)及7-8週齡之雄性BALB/c小鼠由Shanghai Slac Laboratory Animal Co.,Ltd供應。到達設施後，使小鼠適應環境至少7天。在隨機分組之後，小鼠經BMP9 Ab或人類對照IgG靜脈內處理一次，且接著為BMP9質體或空白載體之流體動力學注射(HDI)。4天後，在稱重之後，處死所有小鼠以收集血液及肝臟組織樣品。在100 mg/kg氯胺酮麻醉下，進行心肌穿刺以得到儘可能多之血液。整個肝用生理食鹽水快速沖洗，簡單在紙巾上吸乾，且接著稱重，以量測肝重/體重比率。且在觀測肝臟形態之後，將肝切片，接著肝片轉移至低溫小瓶中且在液氮中速凍以進行分子生物學分析。在分析前所有樣品均儲存在-80℃下。
包括血清丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸轉胺酶(AST)含量之肝功能由HITACHI 7020自動生物化學分析器使用Quick Auto Neo ALT及Quick Auto Neo AST套組(SHINO-TEST CORPORATION,Japen)量測。肝臟組織進行基因表現型態分析及組織學分析。對於基因表現型態分析，用RNeasy微型套組(Qiagen)自組織提取總RNA，使用Superscript III逆轉錄套組，根據製造商之說明書(Life Technologies)進行純化RNA之逆轉錄，接著基因轉錄物之定量由定量即時PCR，使用Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI)及ABI 7500 Fast即時PCR系統量測。用於小鼠ID1之引子對為5'-CGAGGCGGCATGTGT TCC-3'(SEQ ID NO；219)及5'-TCTGGGGAACCGAGAGCAC-3'(SEQ ID NO：220)；對於小鼠GAPDH，5'-CGTGCCGCCTG GAGAAACC-3'(SEQ ID NO：221)及5'-TGGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTG-3'(SEQ ID NO：222)。使肝臟組織溶解在T-per緩衝液(Thermo,#78510)中以進行ID1及p-smad1/5西方墨點法，使用抗磷酸化Smad 1/5 Ab(CST #9516，1：1000)、抗ID1 Ab(Santa Cruz #SC-488，1：200)、抗GAPDH Ab(CST #2118，1：2000)、抗小鼠IgG-HRP(CST #7076，1：2500)及抗兔IgG-HRP(CST #7074,1：2500)，西方法與藉由smad 1/5磷酸化分析實驗之活體外活性測試相同。
實例10：肝臟損傷之活體內CCl4小鼠模型
無特定病原體(SPF)及7-8週齡之雄性BALB/c小鼠及C57BL/6小鼠由Shanghai Slac Laboratory Animal Co.,Ltd供應。
到達設施後，使小鼠適應環境至少7天。在隨機分組之後，小鼠經溶解於橄欖油中之4μl/g 25% CCl4腹膜內處理，一週兩次，歷時2週，以誘發肝纖維化。與第一次CCl4注射同時，亦經靜脈內注射BMP9 Ab(10mg/kg，每週兩次)以測試其在肝纖維化期間之功能。一週後處死小鼠，且肝臟組織進行蛋白質表現型態分析及組織學分析。
對於組織學，肝臟樣品用10%緩衝福馬林固定16-18小時，用石蠟包埋。藉由使用Ventana Discovery®自動化切片染色機(Ventana Medical Systems,Tucson,AZ,USA)進行免疫組織化學。兔多株抗磷酸化Smad1/5/8(Millipore,Billerica,MA)抗體以適當濃度用作初級抗體。對於蛋白質表現，進行西方墨點法。材料及方法與上述Smad 1/5磷酸化分析法之活體外活性測試中相同。
實例11：結合親和力、特異性及活體外抑制分析法之結果
人類化融合瘤產生之IgG的結合親和力、特異性及IC50值(如BRE-Luc RGA中量測)概述在表4及表5中。
*=基於親本鼠類抗體對受體亞型之抑制。
+=在小於約1nM之Ab濃度下抑制相互作用
-=在小於約1nM之Ab濃度下不抑制相互作用
表5. 抗BMP9抗體之動力學參數(至少三個獨立分析之平均值)。KD值如藉由MSD-SET量測。
n/a=未分析
nb=未結合
nsp=極弱結合，無法評估
噬菌體呈現產生之完全人類抗體的結合親和力、特異性及IC50值(如BRE-Luc RGA中量測)概述在表6及表7中。
+=在小於約1nM之Ab濃度下抑制相互作用
-=在小於約1nM之Ab濃度下不抑制相互作用
表7. 噬菌體呈現產生之抗BMP9抗體之動力學特性(至少三個獨立分析之平均值)。KD值如藉由MSD-SET量測。
n/a=未分析
nb=無結合
nsp=極弱結合，無法評估
綜合而言，此等資料展示能夠結合於人類BMP9之至少三個不同抗原決定基之抗BMP9抗體的鑑別。AM4405、MOR022928及MOR023787結合於huMBP9之抗原決定基，其中結合能夠抑制I型BMP受體(例如AlkI)與BMP9之相互作用。相比之下，AM0100、AM1900、MOR023073、MOR023793、MOR023795、MOR023796、MOR023090及MOR023093結合於huMBP9之抗原決定基，其中結合能夠抑制II型BMP受體(例如ActIIR、BMPRII)與BMP9之相互作用。MOR022962及MOR022965結合於另一抗原決定基，其中結合能夠抑制I型及II型BMP受體兩者與BMP9之相互作用。本文所揭示之抗體對I型BMP受體或II型BMP受體或I型及II型BMP受體兩者之抑制在小於或等於約1nM之IC50下實現。
此等資料亦表明已自兩個不同淘選來源鑑別能夠以高親和力及特異性結合huBMP9之抗體，包括人類及人類化抗體。舉例而言，所有鑑別之抗體均以小於1nM、例如小於500pm之KD結合於huBMP9。許多鑑別之抗體以小於200pM之KD結合於huBMP9。本發明之抗體亦 能夠與食蟹獼猴、大鼠及/或鼠類BMP9交叉反應，此為有益的，因為此等抗體可用於疾病之動物模型中。最後，所有抗體均對BMP9具有高度特異性，對BMP9之特異性超過人類BMP10、人類BMP7及人類BMP2至少1000倍，且在許多情況下，顯示不結合於人類BMP10、人類BMP7或人類BMP2。此等抗體亦能夠在報導基因分析法(「RGA」)中以小於1nM且在許多情況下小於200pM之IC50抑制BMP9信號誘發。綜合而言，此等結果證實本發明之抗體為高度特異性及有效的抗BMP9抗體。
實例12：2B11G2 Fab與huBMP9之晶體結構
人類BMP9與2B11G2嵌合Fab抗體之複合物的晶體結構在2.8Å下解析，其在每個不對稱單元中含有兩個hBMP9成熟結構域與兩個Fab分子之一個均二聚體。該結構以寄存編號1dpbd寄存至內部資料庫Proasis中(1dpbd在下文稱作hBMP9與2B11G2嵌合Fab之此結構)。
藉由將1dpbd之結構重疊至BMP9-Alk1-ActRIIb(PDB：4FAO)之結構上，展示2B11G2及Alk1共享BMP9之相同結合表面(成熟結構域)，此與2B11G2可與Alk1競爭BMP9結合之實驗觀測結果匹配。該結構亦表明ActRIIb與BMP9之相互作用在2B11G2 Fab結合於BMP9時不受影響。
2B11G2之所有6個CDR均與BMP9之相互作用有關；且在BMP9與HCDR2、HCDR3及LCDR3之間建立主要結合界面。HCDR1經由疏水相互作用結合於BMP9；特定言之，HCDR1之Thr28及Pro30與BMP9之Gly21、Ser24及Trp25相互作用(在針對BMP9成熟結構域之編號中)。HCDR2主要經由疏水相互作用結合於BMP9；特定言之，Val50由來自BMP9之苯基包圍，Tyr52與一個BMP9單體之Trp22形成H鍵且與另一BMP9單體之Leu60及Phe43形成疏水相互作用，Val57及Ser59與BMP9之Phe43及Pro44形成疏水相互作用。HCDR3主要經由疏水相互作用結 合於BMP9；特定言之，Phe102與一個BMP9單體之Phe43、Ile56及Leu60且與另一BMP9單體之Trp22及Trp25擠在一起，Tyr103與BMP9之Tyr86及Trp25堆疊。LCDR1中之Asn32為LCDR1中與BMP9相互作用之唯一殘基。LCDR2中之Tyr50與BMP9之Asp47形成H鍵。LCDR3經由混合疏水性及極性相互作用結合於BMP9；特定言之，Ser91及Ser93分別與BMP9之Asp47及Asp48形成H鍵，His92主鏈與BMP9中之Asp47及Asp48主鏈形成H鍵，Trp94及Tyr96與BMP9之Pro44及Ala46形成疏水相互作用。
受體競爭抑制分析之結果表明2B11G2為BMP9 I型受體抑制劑。晶體結構藉由展示2B11G2結合於與Alk1(BMP I型受體)結合位點重疊之抗原決定基證實此。
2B11G2 Fab與huBMP9之成熟片段(SEQ ID NO：215)之間的相互作用展示在表8中。
實例13：抗BMP9抗體之活體外活性評估結果
如以上在圖1A及表5中所示，融合瘤來源之抗體2B11G2-AM4405、4E10D7-AM0100可以相對較低之IC50抑制人類BMP9誘發之報導基因活性，而對人類BMP2或人類BMP7誘發之報導基因活性幾乎無作用。亦如圖1b中所示，親本抗體可抑制大鼠BMP9誘發之報導基因活性，且符合明顯降低曲線，此意謂此等抗體對人類及大鼠BMP9信號傳導具有類似抑制活性。總之，此等結果證實抗BMP9抗體能夠特異性抑制BMP9信號傳導，且能夠與來自不同物種之BMP9蛋白質交叉反應(例如可與人類及大鼠BMP9交叉反應)。
此外，噬菌體呈現產生之抗體亦展示對BMP9具有特異性，且與來自不同物種之BMP9交叉反應。如以上圖2A及表7中所示，完全人類抗BMP9抗體可在小於1nM之濃度下抑制BMP9信號傳導，但在高達1μM之濃度下不影響BMP2或BMP7之信號傳導。詳言之，Mor022962可以相對較低之IC50抑制人類BMP9誘發之報導基因活性，而對人類BMP2或人類BMP7誘發之報導基因活性幾乎無作用。如圖1b中所示，Mor022962抗體可抑制大鼠BMP9誘發之報導基因活性，且符合明顯降低曲線。總之，此等結果證實噬菌體呈現產生之BMP9抗體能夠特異性抑制BMP9信號傳導，且能夠與來自不同物種之BMP9蛋白質交叉反應(例如可與人類及大鼠BMP9交叉反應)。
實例14：活體外Smad 1/5/8磷酸化分析之結果
在兩種細胞株中量測抗BMP9抗體抑制BMP9誘發之Smad 1/5磷酸化及/或Id1表現之能力：如下所述之HUVEC及CFSC。
不受理論束縛，咸信在BMP9信號傳導期間，BMP9配位體首先結合其受體，接著藉助於Co-Smad使Smad1/5/8磷酸化。隨後，磷酸化之Smad1/5/8進入細胞核以促進BMP9標靶基因，例如ID1之表現。因此，測試磷酸化之Smad1/5/8(「p-Smad 1/5/8」)及ID1表現之水準作為BMP9信號傳導之讀取結果。如圖3a中所示，當用BMP9及融合瘤產 生之抗體處理CFSC細胞時，親本4E10D7抗體可抑制藉由BMP9誘發之p-Smad1/5/8染色水準。如圖3b中所示，噬菌體呈現產生之抗體MOR022962抗體可抑制CSFC細胞中藉由BMP9誘發之p-Smad1/5/8染色水準。此外，如圖3c中所示，在HUVEC細胞中，噬菌體呈現產生及融合瘤產生之抗BMP9抗體可降低藉由BMP9誘發之磷酸化之smad1/5及ID1表現的水準。所有以上資料均表明抗BMP9抗體抑制BMP9信號傳導。
實例15：抗BMP9抗體之活體內活性之結果
使用肝臟形態、肝重及體重、肝臟功能作為肝臟損傷之讀取結果，發現BMP9表現質體之流體動力學注射可誘發小鼠中嚴重肝臟損傷。如圖4及5中所示，BMP9質體之HDI可引起嚴重肝臟壞死(圖4a/5a)，伴隨肝重及體重減少(圖4b/5b)及ALT、AST含量增加(圖4c/5c)。當小鼠同時用抗BMP9抗體處理時，與僅僅BMP9質體之HDI相比，肝臟壞死、ALT及AST含量減少，而肝重及體重改善(圖4/圖5)。綜合而言，此等結果表明抗BMP9抗體可有效地阻斷活體內BMP9誘發之肝臟損傷。此外，抗BMP9抗體亦可抑制BMP9誘發之ID1(BMP9信號傳導之標靶基因)表現(圖4d/5d)。所有以上資料均展示抗BMP9抗體可阻斷活體內BMP9之信號傳導與功能。
實例16：肝臟損傷之活體內CCl4小鼠模型之結果
藉由西方墨點法與組織學，與油對照相比，CCl4處理小鼠中smad1/5/8之磷酸化上調(圖6a、6b及6c/圖7a、7b及7c)，表明BMP9上調及肝臟破壞。當小鼠用抗BMP9抗體處理時，抑制CCl4誘發之smad1/5/8磷酸化，表明BMP9抗體可有效抑制活體內BMP9信號傳導。
實例17：肝纖維化之長期活體內CCl4小鼠模型
無特定病原體(SPF)及7-8週齡之雌性BALB/c小鼠由Shanghai Slac Laboratory Animal Co.,Ltd供應。在隨機分組之後，小鼠經靜脈內注射(10mg/kg抗BMP9抗體或小鼠對照IgG)以測試其在肝纖維化期間之功能。在注射抗體2小時之後，小鼠經溶解於橄欖油中之4μl/g 25% CCl4腹膜內處理，且此後每週經相同CCl4劑量處理兩次，歷時兩週，以誘發肝纖維化。
在兩週之後，處死小鼠以收集血液及肝臟組織樣品。在異氟醚麻醉下，收集血液樣品。整個肝用生理食鹽水快速沖洗，簡單在紙巾上吸乾，且接著稱重。且在觀測肝臟形態之後，將肝切片，且轉移至低溫小瓶中且在液氮中速凍，以進行分子生物學分析。在分析前所有樣品均儲存在-80℃下。
藉由HITACHI 7020自動生物化學分析器，使用Quick Auto Neo ALT及Quick Auto Neo AST套組(SHINO-TEST CORPORATION,Japan)量測血清丙胺酸轉胺酶(ALT)含量。肝臟組織進行基因表現及組織學分析。對於基因表現分析，用RNeasy微型套組(Qiagen)自組織提取總RNA，使用Superscript III逆轉錄套組，根據製造商之說明書(Life Technologies)進行純化RNA之逆轉錄，接著基因轉錄物之定量由定量即時PCR，使用Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI)及ABI 7500 Fast即時PCR系統量測。用於小鼠ID1之引子對為5'-CGAGGCGGCATGTGT TCC-3'(SEQ ID NO：219)及5'-TCTGGGGAACCGAGAGCAC-3'(SEQ ID NO：220)；對於小鼠GAPDH，為5'-CGTGCCGCCTG GAGAAACC-3'(SEQ ID NO：221)及5'-TGGAAGAGTGGGAGTTGCTGTTG-3'(SEQ ID NO：222)。肝臟羥脯胺酸含量用經修改之羥脯胺酸分析套組(Sigma)分析。對於組織學，肝臟樣品用10%緩衝福馬林固定16-18小時，用石蠟包埋，接著進行天狼星紅染色及纖維化區域定量。
肝纖維化之活體內CCl4小鼠模型之結果
使用天狼星紅染色及肝臟羥脯胺酸含量作為肝纖維化之讀取結果，發現注射CCl4可誘發小鼠中肝纖維化。如圖8中所示，如藉由陽性天狼星紅染色及肝臟羥脯胺酸含量增加(圖8a及8b)所測定，注射CCl4加對照IgG可誘發肝纖維化。此等伴隨ALT含量增加(圖8c)及肝重增加(圖8d)。CCl4處理亦藉由上調其標靶基因Id1活化BMP9信號傳導(圖8e)。當小鼠用抗BMP9抗體處理時，Id1基因誘發顯著減少，表明BMP9抗體充分阻斷BMP9信號傳導。同時，與對照IgG組相比，CCl4誘發之肝纖維化及ALT含量大大減少，而肝重改善(圖8)。綜合而言，長期活體內模型之此等結果表明抗BMP9抗體可在活體內有效地阻斷BMP9信號傳導且改善CCl4誘發之肝纖維化。
實例18：藥物動力學(PK)分析 小鼠PK-抗體4E10D7
無特定病原體(SPF)及7-8週齡之雄性C57BL/6小鼠由Shanghai Laboratory Animal Co.,Ltd(SLAC)供應。到達設施後，使小鼠適應環境至少7天。整體上，該研究中使用15隻雄性小鼠，且基於不同處理及各種時程隨機化成5組。第0天，用10mg/Kg抗BMP9抗體4E10D7注射(經靜脈內)組1-4；用10mg/Kg抗對照IgG注射組5，劑量體積為5ml/kg。在第-1天及給藥後2h、6h、24h、48h、72h、96h、168h、336h自某些組收集血液(表9)。不同組在特定時間點處死。對於非終末出血，在麻醉下經由眼眶採血/剪尾收集血液。對於終末出血(T)，經由心肌穿刺收集血液。
藉由競爭Elisa分析偵測各時間點之IgG濃度。將0.25μg/mL、100微升/孔人類BMP9複合物塗佈在96孔盤上，在4℃下培育隔夜。在用洗滌緩衝液(1×PBS+0.1% Tween20)洗滌3次之後，添加300微升/孔阻斷緩衝液(1×PBS+0.1% Tween20+1% BSA)，在室溫下在450rpm下震盪1小時。接著製備樣品進行測試：對於標準曲線，將120μl Ab(在含有8%未處理小鼠血清之分析緩衝液中自100μg/ml稀釋，比率為1：3且7次)與120μl生物素標記之Ab(在分析緩衝液中稀釋至0.067μg/ml)混合；對於血清樣品，添加9.6μl血清樣品至120μl分析緩衝液(稀釋12.5倍)中，且與120μl生物素標記之Ab(在分析緩衝液中稀釋至0.067μg/ml)混合。分析緩衝液為1×PBS+0.05% Tween20+1% BSA。用洗滌緩衝液洗滌盤3次，接著添加100微升/孔製備樣品，各點一式兩份，在室溫下培育2小時。隨後，在另外3次洗滌之後，添加100微升/孔HRP-抗生蛋白鏈菌素(1：5000，Pierce #21140)至各孔，在黑暗中在450rpm下震盪下培育1小時。接著，洗滌且添加TMB受質(Life Tech #002023)至分析盤之各孔，密封且在室溫下在450rpm下震盪下培育約5分鐘。藉由添加100微升/孔1M HCl終止反應，接著在450nM下讀取OD。
ANIT大鼠模型中之PK分析-4E10D7
7-8週齡之雄性SD大鼠由Shanghai Slac Laboratory Animal Co.,Ltd供應。到達設施後，使大鼠適應環境至少7天。6隻雄性大鼠用於 此研究中，基於不同處理隨機化成2組。第0天，用10mg/Kg抗BMP9 IgG注射(經靜脈內)1組；用10mg/Kg對照IgG注射組2，組1及2餵食ANIT飲食(由SLAC供應)。在第-1天及給藥後2h、6h、8h、24h、48h、72h、120h、192h、336h、504h自各大鼠收集血液。所有組均在3週後處死。對於非終末出血，在麻醉下經由眼眶採血/剪尾收集血液。對於終末出血，經由心肌穿刺收集血液。各時間點之IgG濃度藉由競爭Elisa分析法偵測，類似於正常小鼠中之PK分析。
結果
結果展示於圖9中。正常小鼠與ANIT大鼠模型中親本Ab 4E10D7展示類似PK型態。Ab在2小時內達到峰值濃度，且在24小時前開始降低且降達一半，接著在1週內相對穩定在50μg/ml下。
食蟹獼猴中藥物動力學(PK)分析-MOR022962
單劑量研究：
向3至4歲及2.5至4kg之3隻雄性食蟹獼猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))經靜脈內投與10mg/kg抗BMP9抗體MOR022962(Ab BMP9-2)。在給藥前及給藥後0.25h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、240h、336h、408h、504h、576h、672h、744h、840h、912h及1008h收集血液。各時間點之總MOR022962 Ab濃度藉由識別抗體之Fc域之夾心ELISA偵測。各個體隨時間變化之總MOR022962濃度展示在圖10中。在所有個體中，最大濃度在0.25h觀測到，此為給藥後第一次取樣時間。終末消除半衰期(t 1/2)為132至145小時(5.5至6.0天)。在研究第32天開始之一隻動物中MOR022962明顯加速之清除(圖10)與同時偵測到抗藥物抗體一致。
重複劑量研究：
向2至5歲及2.3至3.8kg雄性食蟹獼猴(食蟹猴)經靜脈內投與每週10、30或100mg/kg(n=2/組)抗BMP9抗體(MOR022962)，歷時4週(5 劑)。對照動物(n=2)接收同等劑量體積(1mL/kg)之媒劑，歷時4週(5劑)。在各劑量投與前、在各劑量之後0.25h及在第一次及倒數第二次劑量之後6h、24h、48h、72h、96h、120h收集血液。各時間點之總MOR022962 Ab濃度藉由識別抗體之Fc域之夾心ELISA偵測。隨時間變化之總MOR022962 Ab濃度展示在圖11中。在所有處理動物中，最大濃度(C max)在0.25h觀測到，此為給藥後第一次取樣時間。MOR022962暴露(C max或AUC0-7d)在10-100mg/kg之劑量範圍內按比例增加劑量。在3個劑量組中，藥物累積(在第一次及倒數第二次劑量之後AUC0-7d之比率)範圍為1.3-2.3。
實例19：可研發性
使用此項技術中已知之分析法，評估對huBMP9(相對於結合於huBMP7、huBMP2及huBMP10)具有良好親和力及特異性之IgG抗體的可研發性。簡言之，由尺寸排阻層析量測抗體凝聚；在pH=7.5下評估熔融溫度；在硫酸銨(NH4)2SO4、組胺酸pH=6中藉由疏水相互作用層析(HIC)評估疏水性；且在HEK-293T表現系統中量測產生力價。結果概述在表11中。此等結果證實本發明之抗BMP9抗體展現意外良好之可研發性，因此適合於作為藥劑研發。
實例20：MOR022962 Fv與hBMP9二聚體之晶體結構
人類BMP9與MOR022962 Fv域之複合物的晶體結構以2.2Å解析。各不對稱單元含有一個hBMP9均二聚體及兩個Fv分子。結構以寄存編號1ssod寄存至內部資料庫Proasis中(1ssod在下文稱作hBMP9與MOR022962 Fv之此結構)。
藉由將1ssod之結構疊加至BMP9-Alk1-ActRIIb(PDB：4FAO)之結構上，展示MOR022962及ActRIIb共享BMP9(成熟結構域)上之重疊接觸表面，此與MOR022962可與ActRIIb競爭結合BMP9的實驗觀測結果良好一致。結構亦展示MOR022962與BMP9之結合表面不直接與Alk1與BMP9之結合表面重疊。
晶體結構展示MOR022962結合於BMP9中包括涉及疏水相互作用之L85、L95、Y97、H98及涉及氫鍵網路之S83、H98、E100的抗原決定基。MOR022962 Fv與huBMP9之成熟片段(SEQ ID NO：215)之間的詳細相互作用展示在下表12中。
因為生物化學實驗展示在生物化學實驗中MOR022962意外地能夠在一定程度上阻斷ActRIIb(II型BMP受體)及AlkI(I型BMP受體)結合於BMP9，所以此表明MOR022962所結合之抗原決定基代表引起I型與II型BMP9受體類型之阻斷的新結合抗原決定基，不過機制仍然不明確。
HC：重鏈，LC：輕鏈
除非另有定義，否則本文所用之技術及科學術語均具有與熟習本發明所屬之技術者通常所理解相同的意義。
如熟習此項技術者清楚，除非另外指明，否則所有未特定詳細描述之方法、步驟、技術及操作可以本身已知之方式進行且已以本身已知之方式進行。例如再次提及標準手冊及本文中提及之一般背景技術及其中所引用之其他參考文獻。除非另外指明，否則本文中所引用之參考文獻各以全文引用的方式併入本文中。
在本申請案之文本通篇中，本說明書之文本(例如表1)與序列表之間若存在不一致，則應以本說明書之文本為準。
本發明之申請專利範圍為非限制性的且提供於下文中。
雖然本文已詳細揭示特定態樣及申請專利範圍，但此已藉助於實例僅僅出於說明之目的進行，且不意欲對所附申請專利範圍之範疇或任何對應將來申請案之申請專利範圍之主題範疇具有限制性。詳言之，本發明人預期在不背離如申請專利範圍所界定之本發明之精神及範疇下可對本發明進行各種取代、改變及修改。咸信核酸起始物質、相關純系或文庫類型的選擇對於具有本文中描述之態樣之知識的一般技術者而言為慣例。認為其他態樣、優點及修改在以下申請專利範圍之範疇內。熟習此項技術者應認識到或能夠使用不超過常規實驗，即可確定本文中所述之本發明的特定態樣的許多同等物。此類同等物意 欲涵蓋於以下申請專利範圍中。在後來申請之對應申請案中申請專利範圍範疇的改寫可能歸因於各個國家之專利法律的限制且不應解釋為放棄申請專利範圍之主題。
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 157
<210> 158
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 158
<210> 159
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 159
<210> 160
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 160
<210> 161
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 161
<210> 162
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 162
<210> 163
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 163
<210> 164
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 164
<210> 165
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 165
<210> 166
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 166
<210> 167
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 167
<210> 168
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 168
<210> 169
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 169
<210> 170
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 170
<210> 171
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 171
<210> 172
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 172
<210> 173
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 173
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 174
<210> 175
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 175
<210> 176
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 176
<210> 177
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 177
<210> 178
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 178
<210> 179
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 179
<210> 180
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 180
<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 181
<210> 182
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 182
<210> 183
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 183
<210> 184
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 184
<210> 185
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 185
<210> 186
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 186
<210> 187
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 187
<210> 188
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 188
<210> 189
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 189
<210> 190
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 190
<210> 191
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 191
<210> 192
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 192
<210> 193
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 193
<210> 194
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 194
<210> 195
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 195
<210> 196
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 196
<210> 197
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 197
<210> 198
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 198
<210> 199
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 199
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 200
<210> 201
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 201
<210> 202
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 202
<210> 203
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 203
<210> 204
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 204
<210> 205
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 205
<210> 206
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 206
<210> 207
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 207
<210> 208
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 208
<210> 209
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 209
<210> 210
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 210
<210> 211
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 211
<210> 212
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 212
<210> 213
<211> 429
<212> PRT
<213> 智人
<400> 213
<210> 214
<211> 1942
<212> DNA
<213> 智人
<400> 214
<210> 215
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 215
<210> 216
<211> 414
<212> PRT
<213> 智人
<400> 216
<210> 217
<211> 1584
<212> DNA
<213> 智人
<400> 217
<210> 218
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成6xHis標籤
<400> 218
<210> 219
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 219
<210> 220
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 220
<210> 221
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 221
<210> 222
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 222

Claims (70)

  1. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合人類BMP9且包含：(a)分別SEQ ID NO：21、22及23之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：31、32及33之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(b)分別SEQ ID NO：24、25及26之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：34、35及36之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(c)分別SEQ ID NO：1、2及3之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：11、12及13之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(d)分別SEQ ID NO：4、5及6之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：14、15及16之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(e)分別SEQ ID NO：41、42及43之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：51、52及53之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(f)分別SEQ ID NO：44、45及46之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：54、55及56之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(g)分別SEQ ID NO：61、62及63之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：71、72及73之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(h)分別SEQ ID NO：64、65及66之HCDR1、HCDR2及 HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：74、75及76之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(i)分別SEQ ID NO：81、82及83之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：91、92及93之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(j)分別SEQ ID NO：84、85及86之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：94、95及96之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(k)分別SEQ ID NO：101、102及103之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：111、112及113之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(l)分別SEQ ID NO：104、105及106之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：114、115及116之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(m)分別SEQ ID NO：121、122及123之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：131、132及133之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(n)分別SEQ ID NO：124、125及126之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：134、135及136之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(o)分別SEQ ID NO：141、142及143之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：151、152及153之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(p)分別SEQ ID NO：144、145及146之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：154、155及156之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列； (q)分別SEQ ID NO：161、162及163之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：171、172及173之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或(r)分別SEQ ID NO：164、165及166之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：174、175及176之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
  2. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)SEQ ID NO：27之VH序列；(b)SEQ ID NO：7之VH序列；(c)SEQ ID NO：47之VH序列；(d)SEQ ID NO：67之VH序列；(e)SEQ ID NO：87之VH序列；(f)SEQ ID NO：107之VH序列；(g)SEQ ID NO：127之VH序列；(h)SEQ ID NO：147之VH序列；或(i)SEQ ID NO：167之VH序列。
  3. 如請求項1至2中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)SEQ ID NO：37之VL序列；(b)SEQ ID NO：17之VL序列；(c)SEQ ID NO：57之VL序列；(d)SEQ ID NO：77之VL序列；(e)SEQ ID NO：97之VL序列；(f)SEQ ID NO：117之VL序列；(g)SEQ ID NO：137之VL序列；(h)SEQ ID NO：157之VL序列；或 (i)SEQ ID NO：177之VL序列。
  4. 如請求項1之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)SEQ ID NO：27之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列；(b)SEQ ID NO：7之VH序列及SEQ ID NO：17之VL序列；(c)SEQ ID NO：47之VH序列及SEQ ID NO：57之VL序列；(d)SEQ ID NO：67之VH序列及SEQ ID NO：77之VL序列；(e)SEQ ID NO：87之VH序列及SEQ ID NO：97之VL序列；(f)SEQ ID NO：107之VH序列及SEQ ID NO：117之VL序列；(g)SEQ ID NO：127之VH序列及SEQ ID NO：137之VL序列；(h)SEQ ID NO：147之VH序列及SEQ ID NO：157之VL序列；或(i)SEQ ID NO：167之VH序列及SEQ ID NO：177之VL序列。
  5. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)SEQ ID NO：29之重鏈序列；(b)SEQ ID NO：9之重鏈序列；(c)SEQ ID NO：49之重鏈序列；(d)SEQ ID NO：69之重鏈序列；(e)SEQ ID NO：89之重鏈序列；(f)SEQ ID NO：109之重鏈序列；(g)SEQ ID NO：129之重鏈序列；(h)SEQ ID NO：149之重鏈序列；或(i)SEQ ID NO：169之重鏈序列。
  6. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)SEQ ID NO：39之輕鏈序列； (b)SEQ ID NO：19之輕鏈序列；(c)SEQ ID NO：59之輕鏈序列；(d)SEQ ID NO：79之輕鏈序列；(e)SEQ ID NO：99之輕鏈序列；(f)SEQ ID NO：119之輕鏈序列；(g)SEQ ID NO：139之輕鏈序列；(h)SEQ ID NO：159之輕鏈序列；或(i)SEQ ID NO：179之輕鏈序列。
  7. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)SEQ ID NO：29之重鏈序列；及SEQ ID NO：39之輕鏈序列；(b)SEQ ID NO：9之重鏈序列；及SEQ ID NO：19之輕鏈序列；(c)SEQ ID NO：49之重鏈序列；及SEQ ID NO：59之輕鏈序列；(d)SEQ ID NO：69之重鏈序列；及SEQ ID NO：79之輕鏈序列；(e)SEQ ID NO：89之重鏈序列；及SEQ ID NO：99之輕鏈序列；(f)SEQ ID NO：109之重鏈序列；及SEQ ID NO：119之輕鏈序列；(g)SEQ ID NO：129之重鏈序列；及SEQ ID NO：139之輕鏈序列；(h)SEQ ID NO：149之重鏈序列；及SEQ ID NO：159之輕鏈序列；或 (i)SEQ ID NO：169之重鏈序列；及SEQ ID NO：179之輕鏈序列。
  8. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中：(a)該抗體或其抗原結合片段以KD1nM結合人類BMP9；(b)該抗體或其抗原結合片段以KD500pM結合人類BMP9；(c)該抗體或其抗原結合片段以KD200pM結合人類BMP9；(d)該抗體或其抗原結合片段以KD100pM結合人類BMP9；(e)該抗體或其抗原結合片段以KD50pM結合人類BMP9；及/或(f)該抗體或其抗原結合片段以KD20pM結合人類BMP9。
  9. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中：(a)該抗體或其抗原結合片段對人類BMP9之親和力比對人類BMP10大至少約1000倍；(b)該抗體或其抗原結合片段對人類BMP9之親和力比對人類BMP7大至少約1000倍；(c)該抗體或其抗原結合片段對人類BMP9之親和力比對人類BMP2大至少約1000倍；(d)該抗體或其抗原結合片段對人類BMP9之親和力比對人類BMP2、對人類BMP7及對人類BMP10大至少約100倍；及/或(e)該抗體或其抗原結合片段對人類BMP9之親和力比對人類BMP2、人類BMP7及人類BMP10大至少約1000倍。
  10. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中：(a)該抗體或其抗原結合片段以KD1nM結合於食蟹獼猴 BMP9、大鼠BMP9及/或小鼠BMP9；(b)該抗體或其抗原結合片段以KD0.5nM結合於食蟹獼猴BMP9、大鼠BMP9及/或小鼠BMP9；(c)該抗體或其抗原結合片段以KD0.2nM結合於食蟹獼猴BMP9、大鼠BMP9及/或小鼠BMP9；及/或(d)該抗體或其抗原結合片段以KD0.05nM結合於食蟹獼猴BMP9、大鼠BMP9及/或小鼠BMP9。
  11. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或抗原結合片段抑制人類BMP9與以下各者之結合：(a)人類BMPI型受體；及/或(b)選自由人類ALK1、人類ALK2及人類ALK3組成之群的人類BMPI型受體。
  12. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或抗原結合片段抑制人類BMP9與以下各者之結合：(a)人類BMP II型受體；(b)選自由人類BMPRII、人類ActRIIA及人類ActRIIB組成之群的人類BMP受體；(c)人類ActRIIA；(d)人類BMPRII；及/或(e)人類ActRIIB。
  13. 如請求項11之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中例如如阻斷性ELISA分析法所量測，人類BMP9與該BMP I型及/或BMP II型受體之結合的抑制係在小於約1nM之濃度下發生。
  14. 如請求項12之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中例如如阻斷性ELISA分析法所量測，人類BMP9與該BMP I型及/或BMP II型受體之結合的抑制係在小於約1nM之濃度下發生。
  15. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中：(a)該經分離之抗體或其抗原結合片段展現活體外或活體內肝細胞株或初級肝細胞中，使BMP9誘發之ID1表現減少至少約 50%；(b)例如如HEKT-BRE-Luc報導基因分析法中所量測，該經分離之抗體或其抗原結合片段降低活體外人類BMP9之活性；及/或(c)該經分離之抗體或其抗原結合片段降低活體內人類BMP9之活性。
  16. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或抗原結合片段為IgG或來源於IgG。
  17. 如請求項16之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG係選自由IgG1、IgG2、IgG3及IgG4組成之群。
  18. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或抗原結合片段係選自由以下各者組成之群：單株抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab及scFv。
  19. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該經分離之抗體或其抗原結合片段為免疫結合物之組分。
  20. 如請求項1、2及4中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其經由Fc區內之胺基酸突變而具有改變之效應功能。
  21. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其交叉阻斷前述請求項中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段。
  22. 一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，(a)其對人類BMP9之親和力比對人類BMP10、對人類BMP7及對人類BMP2大至少約1000倍；以及(b)以小於1nM之KD結合於人類BMP9、食蟹獼猴BMP9、大鼠BMP9及鼠類BMP9。
  23. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其：(a)結合於人類BMP9且抑制人類BMP9與例如ALK1、ALK2或ALK3之BMP I型受體之結合；(b)結合於人類BMP9且抑制人類BMP9與例如ActIIRB之BMP II 型受體之結合；或(c)結合於人類BMP9且抑制人類BMP9與例如ALK1、ALK2或ALK3之BMP I型受體及例如ActIIRB之BMP II型受體兩者的結合。
  24. 如請求項23之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中人類BMP9與該BMP I型受體、該BMP II型受體、或該BMP I型受體及該BMP II型受體之結合的該抑制係在小於或等於約1nM之IC50下。
  25. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其(a)在SEQ ID NO：215之胺基酸殘基21-25、43-60、86及96內的抗原決定基結合於人類BMP9之成熟片段；或(b)在SEQ ID NO：215之胺基酸殘基83-85及95-100內的抗原決定基結合於人類BMP9之成熟片段。
  26. 如請求項25之經分離之抗體或其抗原結合片段，其如下結合於人類BMP9之成熟片段：(a)在包含SEQ ID NO：215之胺基酸殘基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96的抗原決定基；(b)在包含SEQ ID NO：215之胺基酸殘基S83、L85、L95、Y97、H98及E100的抗原決定基；(c)在由SEQ ID NO：215之胺基酸殘基G21、W22、S24、W25、F43、P44、L45、A46、D47、D48、K53、I56、L60、L63、Y86及K96組成的抗原決定基；或(d)在由SEQ ID NO：215之胺基酸殘基S83、L85、L95、Y97、H98及E100組成的抗原決定基。
  27. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)分別SEQ ID NO：184、185及186之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：192、193及194之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列； (b)分別SEQ ID NO：181、182及183之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：189、190及191之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(c)分別SEQ ID NO：197、198及199之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：205、206及207之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；或(d)分別SEQ ID NO：200、201及202之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：208、209及210之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
  28. 如請求項1、2、4及21至27中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為嵌合、人類化或完全人類。
  29. 如請求項1、2、4及21至27中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其用作藥劑。
  30. 如請求項1、2、4及21至27中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其用於療法。
  31. 如請求項1、2、4及21至27中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其用於治療患有肝病之個體。
  32. 如請求項31之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該肝病為以下或係與以下相關聯：C型肝炎病毒(「HCV」)感染；B型肝炎病毒(「HBV」)感染；自體免疫性肝炎；酒精暴露；毒素暴露；藥物暴露；肝臟外傷；膽道阻塞；原發性膽汁性肝硬化；阿拉吉歐症候群(alagille syndrome)；慢性肝淤血；非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)；原發性硬化性膽管炎；血色沉著病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；以及威爾遜氏病(Wilson disease)。
  33. 如請求項31之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中該肝病係 選自由肝纖維化、門靜脈高血壓、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、脂肪肝病或肝硬化組成之群。
  34. 如請求項1、2、4及21至27中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其用於降低有需要之患者中BMP9之活性。
  35. 一種組合物，其包含前述請求項中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，及：(a)醫藥學上可接受之載劑；(b)其他治療劑；或(c)其組合。
  36. 如請求項35之組合物，其中該其他治療劑降低BMP9之活性。
  37. 如請求項36之組合物，其中該其他治療劑為siRNA、抗體或其抗原結合片段、可溶性受體、蛋白質或小分子。
  38. 如請求項35之組合物，其中該其他治療劑係選自由以下各者組成之群：抗病毒劑、消炎劑、抗纖維化劑、抗脂肪變性劑、抗細胞凋亡劑、保肝劑及其組合。
  39. 如請求項35之組合物，其中該其他治療劑係選自由以下各者組成之群：替諾福韋(tenofovir)、恩替卡韋(entecavir)、拉米夫定(lamivudine)、特布維定(telbuvudine)、阿德福韋(adefovir)、聚乙二醇化干擾素、索非布韋(sofusbuvir)、特拉匹韋(telaprevir)、達拉斯韋(daclatsivir)、西咪匹韋(simeprevir)、萊達普韋(ledasprevir)、皮質類固醇、GFT-505、賽瑞維克(cenicriviroc)、維生素E、吡格列酮(pioglitazone)、二甲雙胍(metformin)、奧貝膽酸(obeticholic acid)、GR-MD-02及其組合。
  40. 一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至28中任一項之抗體或其抗原結合片段的核酸序列。
  41. 一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼結合人類BMP9之抗體或其 抗原結合片段之VH或VL序列的核酸序列，其中該抗體或其抗原結合片段包含：(a)分別SEQ ID NO：21、22及23之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：31、32及33之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(b)分別SEQ ID NO：24、25及26之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：34、35及36之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(c)分別SEQ ID NO：1、2及3之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：11、12及13之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(d)分別SEQ ID NO：4、5及6之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：14、15及16之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(e)分別SEQ ID NO：41、42及43之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：51、52及53之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(f)分別SEQ ID NO：44、45及46之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：54、55及56之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(g)分別SEQ ID NO：61、62及63之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：71、72及73之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(h)分別SEQ ID NO：64、65及66之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：74、75及76之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列； (i)分別SEQ ID NO：81、82及83之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：91、92及93之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(j)分別SEQ ID NO：84、85及86之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：94、95及96之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(k)分別SEQ ID NO：101、102及103之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：111、112及113之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(l)分別SEQ ID NO：104、105及106之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：114、115及116之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(m)分別SEQ ID NO：121、122及123之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：131、132及133之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(n)分別SEQ ID NO：124、125及126之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：134、135及136之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(o)分別SEQ ID NO：141、142及143之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：151、152及153之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(p)分別SEQ ID NO：144、145及146之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：154、155及156之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列；(q)分別SEQ ID NO：161、162及163之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：171、172及173之LCDR1、 LCDR2及LCDR3序列；或(r)分別SEQ ID NO：164、165及166之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列，及分別SEQ ID NO：174、175及176之LCDR1、LCDR2及LCDR3序列。
  42. 如請求項41之經分離之聚核苷酸，其中該核酸序列編碼包含以下之VH序列：(a)SEQ ID NO：27之VH序列；(b)SEQ ID NO：7之VH序列；(c)SEQ ID NO：47之VH序列；(d)SEQ ID NO：67之VH序列；(e)SEQ ID NO：87之VH序列；(f)SEQ ID NO：107之VH序列；(g)SEQ ID NO：127之VH序列；(h)SEQ ID NO：147之VH序列；或(i)SEQ ID NO：167之VH序列。
  43. 如請求項41或42之經分離之聚核苷酸，其中該核酸序列編碼包含以下之VL序列：(a)SEQ ID NO：37之VL序列；(b)SEQ ID NO：17之VL序列；(c)SEQ ID NO：57之VL序列；(d)SEQ ID NO：77之VL序列；(e)SEQ ID NO：97之VL序列；(f)SEQ ID NO：117之VL序列；(g)SEQ ID NO：137之VL序列；(h)SEQ ID NO：157之VL序列；或(i)SEQ ID NO：177之VL序列。
  44. 如請求項41或42之經分離之聚核苷酸，其包含編碼VH序列之核酸序列及編碼VL序列之核酸序列，其中該抗體或其抗原結合片段包含：(a)SEQ ID NO：27之VH序列及SEQ ID NO：37之VL序列；(b)SEQ ID NO：7之VH序列及SEQ ID NO：17之VL序列；(c)SEQ ID NO：47之VH序列及SEQ ID NO：57之VL序列；(d)SEQ ID NO：67之VH序列及SEQ ID NO：77之VL序列；(e)SEQ ID NO：87之VH序列及SEQ ID NO：97之VL序列；(f)SEQ ID NO：107之VH序列及SEQ ID NO：117之VL序列；(g)SEQ ID NO：127之VH序列及SEQ ID NO：137之VL序列；(h)SEQ ID NO：147之VH序列及SEQ ID NO：157之VL序列；或(i)SEQ ID NO：167之VH序列及SEQ ID NO：177之VL序列。
  45. 如請求項41或42之經分離之聚核苷酸，其中該抗體或其抗原結合片段包含：(a)SEQ ID NO：29之重鏈序列；(b)SEQ ID NO：9之重鏈序列；(c)SEQ ID NO：49之重鏈序列；(d)SEQ ID NO：69之重鏈序列；(e)SEQ ID NO：89之重鏈序列；(f)SEQ ID NO：109之重鏈序列；(g)SEQ ID NO：129之重鏈序列；(h)SEQ ID NO：149之重鏈序列；或 (i)SEQ ID NO：169之重鏈序列。
  46. 如請求項41或42之經分離之聚核苷酸，其中該抗體或其抗原結合片段包含：(a)SEQ ID NO：39之輕鏈序列；(b)SEQ ID NO：19之輕鏈序列；(c)SEQ ID NO：59之輕鏈序列；(d)SEQ ID NO：79之輕鏈序列；(e)SEQ ID NO：99之輕鏈序列；(f)SEQ ID NO：119之輕鏈序列；(g)SEQ ID NO：139之輕鏈序列；(h)SEQ ID NO：159之輕鏈序列；或(i)SEQ ID NO：179之輕鏈序列。
  47. 如請求項41或42之經分離之聚核苷酸，其中該抗體或其抗原結合片段包含：(a)SEQ ID NO：29之重鏈序列；及SEQ ID NO：39之輕鏈序列；(b)SEQ ID NO：9之重鏈序列；及SEQ ID NO：19之輕鏈序列；(c)SEQ ID NO：49之重鏈序列；及SEQ ID NO：59之輕鏈序列；(d)SEQ ID NO：69之重鏈序列；及SEQ ID NO：79之輕鏈序列；(e)SEQ ID NO：89之重鏈序列；及SEQ ID NO：99之輕鏈序列；(f)SEQ ID NO：109之重鏈序列；及SEQ ID NO：119之輕鏈序列； (g)SEQ ID NO：129之重鏈序列；及SEQ ID NO：139之輕鏈序列；(h)SEQ ID NO：149之重鏈序列；及SEQ ID NO：159之輕鏈序列；或(i)SEQ ID NO：169之重鏈序列；及SEQ ID NO：179之輕鏈序列。
  48. 一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼結合人類BMP9之抗體或其抗原結合片段之重鏈或輕鏈的核酸，該聚核苷酸包含以下任一者之序列：(a)SEQ ID NO：30之重鏈序列；(b)SEQ ID NO：28之VH序列；(c)SEQ ID NO：40之輕鏈序列；(d)SEQ ID NO：38之VL序列；(e)SEQ ID NO：10之重鏈序列；(f)SEQ ID NO：8之VH序列；(g)SEQ ID NO：20之輕鏈序列；(h)SEQ ID NO：18之VL序列；(i)SEQ ID NO：50之重鏈序列；(j)SEQ ID NO：48之VH序列；(k)SEQ ID NO：60之輕鏈序列；(l)SEQ ID NO：58之VL序列；(m)SEQ ID NO：70之重鏈序列；(n)SEQ ID NO：68之VH序列；(o)SEQ ID NO：80之輕鏈序列；(p)SEQ ID NO：78之VL序列；(q)SEQ ID NO：90之重鏈序列； (r)SEQ ID NO：88之VH序列；(s)SEQ ID NO：100之輕鏈序列；(t)SEQ ID NO：98之VL序列；(u)SEQ ID NO：110之重鏈序列；(v)SEQ ID NO：108之VH序列；(w)SEQ ID NO：120之輕鏈序列；(x)SEQ ID NO：118之VL序列；(y)SEQ ID NO：130之重鏈序列；(z)SEQ ID NO：128之VH序列；(aa)SEQ ID NO：140之輕鏈序列；(bb)SEQ ID NO：138之VL序列；(cc)SEQ ID NO：150之重鏈序列；(dd)SEQ ID NO：148之VH序列；(ee)SEQ ID NO：160之輕鏈序列；(ff)SEQ ID NO：158之VL序列；(gg)SEQ ID NO：170之重鏈序列；(hh)SEQ ID NO：168之VH序列；(ii)SEQ ID NO：180之輕鏈序列；或(jj)SEQ ID NO：178之VL序列。
  49. 一種經分離之聚核苷酸，其編碼結合人類BMP9之抗體或其抗原結合片段之VH及VL，該聚核苷酸包含以下任一者之序列：(a)SEQ ID NO：28之VH序列及SEQ ID NO：38之VL序列；(b)SEQ ID NO：8之VH序列及SEQ ID NO：18之VL序列；(c)SEQ ID NO：48之VH序列及SEQ ID NO：58之VL序列；(d)SEQ ID NO：68之VH序列及SEQ ID NO：78之VL序列；(e)SEQ ID NO：88之VH序列及SEQ ID NO：98之VL序列； (f)SEQ ID NO：108之VH序列及SEQ ID NO：118之VL序列；(g)SEQ ID NO：128之VH序列及SEQ ID NO：138之VL序列；(h)SEQ ID NO：148之VH序列及SEQ ID NO：158之VL序列；或(i)SEQ ID NO：168之VH序列及SEQ ID NO：178之VL序列。
  50. 如請求項40至42、48及49中任一項之經分離之聚核苷酸，其安置於單一連續聚核苷酸上。
  51. 如請求項40至42、48及49中任一項之經分離之聚核苷酸，其安置於兩個或兩個以上連續聚核苷酸上。
  52. 一種載體，其包含如請求項40至51中任一項之聚核苷酸。
  53. 一種細胞，其包含如請求項52之載體。
  54. 一種如請求項1至28中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段、如請求項35至39中任一項之組合物、如請求項40至51中任一項之經分離之聚核苷酸、如請求項52之載體或如請求項53之細胞的用途，其係用於製造藥劑。
  55. 一種如請求項1至28中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段或如請求項35至39中任一項之組合物的用途，其係用於製造療法中之藥劑。
  56. 一種如請求項1至28中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段或如請求項35至39中任一項之組合物的用途，其係用於製造降低細胞中BMP9之活性之藥劑。
  57. 一種如請求項1至28中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段或如請求項35至39中任一項之組合物的用途，其係用於製造抑 制有需要之患者中BMP9之藥劑。
  58. 一種如請求項1至28中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段或如請求項35至39中任一項之組合物的用途，其係用於製造治療患有肝病之個體之藥劑。
  59. 如請求項58之用途，其中該肝病為以下或係與以下相關聯：C型肝炎病毒(「HCV」)感染；B型肝炎病毒(「HBV」)感染；自體免疫性肝炎；酒精暴露；毒素暴露；藥物暴露；肝臟外傷；膽道阻塞；原發性膽汁性肝硬化；阿拉吉歐症候群；慢性肝淤血；非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)；原發性硬化性膽管炎；血色沉著病；α1-抗胰蛋白酶缺乏症；或威爾遜氏病。
  60. 如請求項58之用途，其中該肝病係選自由肝纖維化、門靜脈高血壓、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、脂肪肝病及肝硬化組成之群。
  61. 如請求項54至60中任一項之用途，其中該藥劑用於與其他治療劑一起投與。
  62. 如請求項61之用途，其中該其他治療劑降低BMP9之活性。
  63. 如請求項61之用途，其中該其他治療劑為siRNA、抗體或其抗原結合片段、可溶性受體、蛋白質或小分子。
  64. 如請求項61之用途，其中該其他治療劑係選自由以下各者組成之群：抗病毒劑、消炎劑、抗纖維化劑、抗脂肪變性劑、抗細胞凋亡劑、保肝劑及其組合。
  65. 如請求項64之用途，其中該其他治療劑係選自由以下各者組成之群：替諾福韋、恩替卡韋、拉米夫定、特布維定、阿德福韋、聚乙二醇化干擾素、索非布韋、特拉匹韋、達拉斯韋、西咪匹韋、萊達普韋、皮質類固醇、GFT-505、賽瑞維克、維生素E、吡格列酮、二甲雙胍、奧貝膽酸、GR-MD-02及其組合。
  66. 如請求項61至6542中任一項之用途，其中(a)該經分離之抗體或其抗原結合片段及該其他治療劑同時或依序投與，及/或(b)該經分離之抗體或其抗原結合片段輔助該其他治療劑之投與來投與。
  67. 一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含表1中列出之CDR。
  68. 一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其在表1中列出。
  69. 一種結合人類BMP9的經分離之抗體或其抗原結合片段，其(a)包含與表1中描述之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的VH胺基酸序列；(b)包含與表1中描述之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的VL胺基酸序列；(c)包含與表1中描述之VH胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的VH胺基酸序列，及與表1中描述之VL胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的VL胺基酸序列；(d)包含與表1中描述之輕鏈胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的輕鏈胺基酸序列；(e)包含與表1中描述之重鏈胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的重鏈胺基酸序列；或 (f)包含與表1中描述之輕鏈胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的輕鏈胺基酸序列，及與表1中描述之重鏈胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致的重鏈胺基酸序列。
  70. 一種經分離之聚核苷酸，其編碼如請求項67至69中任一項之抗體或其抗原結合片段。
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