TWI675043B - 血管生成素樣４抗體及其使用方法 - Google Patents

血管生成素樣４抗體及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI675043B
TWI675043B TW104125679A TW104125679A TWI675043B TW I675043 B TWI675043 B TW I675043B TW 104125679 A TW104125679 A TW 104125679A TW 104125679 A TW104125679 A TW 104125679A TW I675043 B TWI675043 B TW I675043B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
seq
angptl4
antibodies
antigen
Prior art date
Application number
TW104125679A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201613978A (en
Inventor
約翰 特瑞格
安德利 伊格瑞維奇 沃茲尼森斯基
Original Assignee
瑞士商諾華公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 瑞士商諾華公司 filed Critical 瑞士商諾華公司
Publication of TW201613978A publication Critical patent/TW201613978A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI675043B publication Critical patent/TWI675043B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

本發明係關於結合至人類血管生成素樣4蛋白質(下文中有時稱為「ANGPTL4」)的單株抗體，以及包含其的醫藥組合物及治療方法。

Description

血管生成素樣4抗體及其使用方法
血管生成素樣4蛋白質(ANGPTL4)為所分泌蛋白質之血管生成素樣家族的成員。其為能夠形成二聚體及四聚體的同源寡聚體蛋白質，由包括巨噬細胞、脂肪、肌肉及肝臟細胞之細胞類型表現。ANGPTL4亦稱為肝纖維蛋白原/血管生成素相關蛋白質(HFARP)(Kim等人(2000)Biochem.J.346：603-610)；PPAR γ血管生成素相關蛋白質(PGAR)(Yoon等人(2000)Mol.Cell Biol.,20：5343-5349)，以及空腹誘導脂肪因子(FIAF)(Kerten等人(2000)J.Biol.Chem.,275：28488-28493)。ANGPTL4含有N末端雙螺旋域及C末端纖維蛋白原(FBN)樣域(Kim等人(2000)Biochem.J.346：603-610)。
脂蛋白脂肪酶(LPL)在脂蛋白代謝中起主要作用，作用包括維持血液中之脂蛋白含量及對其活性的全組織特異性調節。ANGPTL4之雙螺旋區域已知可抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)介導三酸甘油酯(TG)清除。因此，ANGPTL4功能喪失突變(例如如人類個體中所見)、基因缺失(例如如轉殖基因小鼠中所見)及抗體抑制(例如如小鼠及食蟹獼猴中所見)皆已觀測到可降低血漿三酸甘油酯。此外，亦已知ANGPTL4抗體可活化LPL。反之，ANGPTL4注射至小鼠中引起循環三酸甘油酯快速增加且此速率高於血管生成素樣蛋白質3(ANGPTL3)之注射(Yoshida等人(2002)J Lipid Res 43：1770-1772)。
本發明中所述之抗ANGPTL4抗體及抗原結合片段起始、促進或 增強LPL活化，例如藉由阻斷ANGPTL4抑制LPL，從而降低血漿三酸甘油酯。預期此等抗體可預防及改善以三酸甘油酯含量升高為特徵之疾病(例如原發血脂異常、高三酸甘油酯血症、代謝症候群、II型糖尿病及類似疾病)之急性及慢性表現。
本發明係關於結合至人類血管生成素樣4蛋白質(下文中有時稱為「ANGPTL4」)的單株抗體，以及包含其的醫藥組合物及治療方法。
本文所述之經分離之抗ANGPTL4抗體或抗原結合片段以小於或等於100pM之平衡解離常數(KD)結合ANGPTL4。舉例而言，本文所述之分離抗體或抗原結合片段可以小於或等於150nM、小於或等於50nM、小於或等於10nM、小於或等於750pM、小於或等於600pM、小於或等於500pM、小於或等於400pM、小於或等於300pM、小於或等於200pM、小於或等於100pM、小於或等於75pM、小於或等於65pM、小於或等於60pM、小於或等於55pM之KD結合至人類ANGPTL4。更特定言之，本文所述之分離抗體或抗原結合片段亦可以小於或等於45pM之KD結合人類ANGPTL4，如藉由ForteBio動力學結合分析所量測；或以小於或等於24pM之KD結合人類ANGPTL4，如藉由溶液平衡滴定分析(SET)所量測；且亦可以小於或等於87pM之KD結合食蟹獼猴ANGPTL4，如藉由ForteBio動力學結合分析所量測；或以小於或等於22pM之KD結合食蟹獼猴ANGPTL4，如藉由SET所量測。
本發明係關於結合至人類ANGPTL4的分離抗體或其抗原結合片段。本發明亦關於結合ANGPTL4且進一步與如表1中所述之抗體競爭結合的分離抗體或其抗原結合片段。本發明亦進一步關於一種與如表1中所述之抗體結合相同抗原決定基的分離抗體或其抗原結合片段。
本文所述之分離抗體及抗原結合片段的結合親和力可藉由溶液 平衡滴定(SET)加以測定。SET之方法在此項技術中已知，且進一步詳細描述於下文中。或者，本文所述之分離抗體或片段的結合親和力可藉由Biacore分析加以測定。Biacore動力學分析之方法在此項技術中已知，且進一步詳細描述於下文中。
本文所述之經分離抗ANGPTL4抗體及抗原結合片段可用於以小於或等於100nM、小於或等於50nM、小於或等於35nM、小於或等於25nM、小於或等於10nM或小於或等於3nM之EC50抑制ANGPTL4結合至脂蛋白脂肪酶(LPL)。
經分離之抗ANGPTL4抗體或其抗原結合片段可用於降低循環三酸甘油酯(TG)含量。
如本文所述之經分離抗ANGPTL4抗體或其抗原結合片段可為單株抗體、人類或人類化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、Fv片段、F(ab')2片段，或scFv片段，及/或IgG同型。
如本文所述之經分離抗ANGPTL4抗體或其抗原結合片段亦可包括其中來自相應人類VH或VL生殖系序列之抗體構架中之胺基酸已取代的構架。
本發明之另一態樣包括具有表1中所述之人類化抗體之完全重鏈及輕鏈序列的分離抗體或其抗原結合片段。更特定言之，分離抗體或其抗原結合片段可具有NEG276、NEG276-LALA、NEG278、NEG310、NEG313、NEG315、NEG318、NEG319之重鏈及輕鏈序列。
本發明之另一態樣包括具有表1中所述之人類化抗體之重鏈及輕鏈可變域序列的分離抗體或其抗原結合片段。更特定言之，分離抗體或其抗原結合片段可具有NEG276、NEG276-LALA、NEG278、NEG310、NEG313、NEG315、NEG318、NEG319之重鏈及輕鏈可變域序列。
本發明亦關於一種分離抗體或其抗原結合片段，其包括選自由SEQ ID NO：7、32、52、72、92、112及132組成之群的重鏈CDR1；選自由SEQ ID NO：8、33、53、73、93、113及133組成之群的重鏈CDR2；及選自由SEQ ID NO：9、34、54、74、94、114及134組成之群的重鏈CDR3，其中該分離抗體或其抗原結合片段結合至人類ANGPTL4。在另一態樣中，此分離抗體或其抗原結合片段進一步包括選自由SEQ ID NO：17、42、62、82、102、122及142組成之群的輕鏈CDR1；選自由SEQ ID NO：18、43、63、83、103、123及143組成之群的輕鏈CDR2；及選自由SEQ ID NO：19、44、64、84、104、124及144組成之群的輕鏈CDR3。
本發明亦關於一種分離抗體或其抗原結合片段，其包括選自由SEQ ID NO：17、42、62、82、102、122及142組成之群的輕鏈CDR1；選自由SEQ ID NO：18、43、63、83、103、123及143組成之群的輕鏈CDR2；及選自由SEQ ID NO：19、44、64、84、104、124及144組成之群的輕鏈CDR3，其中該分離抗體或其抗原結合片段結合至人類ANGPTL4。
本發明亦關於一種分離抗體或其抗原結合片段，其結合具有HCDR1、HCDR2及HCDR3以及LCDR1、LCDR2及LCDR3的ANGPTL4，其中HCDR1、HCDR2及HCDR3包含SEQ ID NO：7、8及9，且LCDR1、LCDR2、LCDR3包含SEQ ID NO：17、18及19；或HCDR1、HCDR2及HCDR3包含SEQ ID NO：32、33及34，且LCDR1、LCDR2、LCDR3包含SEQ ID NO：42、43及44；或HCDR1、HCDR2及HCDR3包含SEQ ID NO：52、53及54，且LCDR1、LCDR2、LCDR3包含SEQ ID NO：62、63及64；或HCDR1、HCDR2及HCDR3包含SEQ ID NO：72、73及74，且LCDR1、LCDR2、LCDR3包含SEQ ID NO：82、83及84；或HCDR1、HCDR2及HCDR3包含SEQ ID NO：92、93及 94，且LCDR1、LCDR2、LCDR3包含SEQ ID NO：102、103及104；或HCDR1、HCDR2及HCDR3包含SEQ ID NO：112、113及114，且LCDR1、LCDR2、LCDR3包含SEQ ID NO：122、123及124；或HCDR1、HCDR2及HCDR3包含SEQ ID NO：132、133及134，且LCDR1、LCDR2、LCDR3包含SEQ ID NO：142、143及144。
本發明亦關於一種抗體或抗原結合片段，其具有SEQ ID NO：13、38、58、78、98、118及138之重鏈可變域之HCDR1、HCDR2及HCDR3，以及SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128及148之輕鏈可變域之LCDR1、LCDR2及LCDR3，如藉由Chothia所定義。在本發明之另一態樣中，抗體或抗原結合片段可具有SEQ ID NO：13、38、58、78、98、118及138之重鏈可變域序列之HCDR1、HCDR2及HCDR3，以及SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128及148之輕鏈可變域序列之LCDR1、LCDR2及LCDR3，如藉由Kabat所定義。
在本發明之一個態樣中，分離抗體或其抗原結合片段包括選自由SEQ ID NO：13、38、58、78、98、118及138組成之群的重鏈可變域序列。分離抗體或抗原結合片段可進一步包含輕鏈可變域序列，其中重鏈可變域及輕鏈可變域組合而形成ANGPTL4之抗原結合位點。特定言之，輕鏈可變域序列可選自SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128及148，其中該分離抗體或其抗原結合片段結合ANGPTL4。
本發明亦關於一種分離抗體或其抗原結合片段，其包括選自由SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128及148組成之群的輕鏈可變域序列，其中該分離抗體或其抗原結合片段結合至人類ANGPTL4。分離抗體或抗原結合片段可進一步包含重鏈可變域序列，其中輕鏈可變域與重鏈可變域組合而形成ANGPTL4之抗原結合位點。
詳言之，結合ANGPTL4的分離抗體或其抗原結合片段可具有分別包含序列SEQ ID NO：13及23；38及48；58及68；78及88；98及 108；118及128；或138及148的重鏈及輕鏈可變域。
本發明進一步關於一種分離抗體或其抗原結合片段，其包括與選自由SEQ ID NO：13、38、58、78、98、118及138組成之群的序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變域，其中該抗體結合至ANGPTL4。在一個態樣中，分離抗體或其抗原結合片段亦包括與選自由SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128及148組成之群的序列具有至少90%序列一致性的輕鏈可變域。在本發明之另一態樣中，分離抗體或抗原結合片段具有如藉由Kabat所定義且如表1中所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。
本發明亦關於一種分離抗體或其抗原結合片段，其具有與選自由SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128及148組成之群之序列具有至少90%序列一致性的輕鏈可變域，其中該抗體結合ANGPTL4。
在本發明之另一態樣中，結合至ANGPTL4的分離抗體或其抗原結合片段可具有包含序列SEQ ID NO：15、28、40、60、80、100、120及140的重鏈。分離抗體亦可包括輕鏈，該輕鏈可與重鏈組合而形成人類ANGPTL4之抗原結合位點。特定言之，輕鏈可具有包含SEQ ID NO：25、50、70、90、110、130及150之序列。特定言之，結合ANGPTL4的分離抗體或其抗原結合片段可具有分別包含序列SEQ ID NO：15及25；28及25；40及50；60及70；80及90；100及110；120及130；或140及150的重鏈及輕鏈。
本發明仍進一步關於一種分離抗體或其抗原結合片段，其包括與選自由SEQ ID NO：15、28、40、60、80、100、120及140組成之群的序列具有至少90%序列一致性的重鏈，其中該抗體結合至ANGPTL4。在一個態樣中，分離抗體或其抗原結合片段亦包括與選自由SEQ ID NO：25、50、70、90、110、130及150組成之群的序列具有至少90%序列一致性的輕鏈。
本發明仍進一步關於一種分離抗體或其抗原結合片段，其包括與選自由SEQ ID NO：25、50、70、90、110、130及150組成之群的序列具有至少90%序列一致性的輕鏈，其中該抗體結合ANGPTL4。
本發明仍進一步關於一種分離抗體或抗原結合片段，其與本文所述之抗體或抗原結合片段(例如人類化抗體NEG276、NEG276-LALA、NEG278、NEG310、NEG313、NEG315、NEG318及NEG319)競爭結合。在一個實施例中，當兩種抗體或抗原結合片段以等莫耳濃度存在時，本發明之分離抗體或抗原結合片段能夠將選自NEG276、NEG276-LALA、NEG278、NEG310、NEG313、NEG315、NEG318及NEG319與ANGPTL4的結合抑制超過50%。
在另一個實施例中，當兩種抗體或抗原結合片段以等莫耳濃度存在時，本發明之分離抗體或抗原結合片段能夠將選自NEG276、NEG276-LALA、NEG278、NEG310、NEG313、NEG315、NEG318及NEG319之人類化抗體與ANGPTL4的結合抑制超過80%。在其他實施例中，當兩種抗體或抗原結合片段以等莫耳濃度存在時，本發明之分離抗體或抗原結合片段能夠將選自NEG276、NEG276-LALA、NEG278、NEG310、NEG313、NEG315、NEG318及NEG319之人類化抗體與ANGPTL4的結合抑制超過85%(或90%、95%、98%或99%)。
本發明亦關於包含本文所述之分離抗體或其抗原結合片段的組合物。以及，與醫藥學上可接受之載劑組合之抗體組合物。特定言之，本發明進一步包括醫藥組合物，其包含表1之抗體或其抗原結合片段，諸如人類化抗體NEG276、NEG276-LALA、NEG278、NEG310、NEG313、NEG315、NEG318、NEG319。本發明亦關於醫藥組合物，其包含表1之分離抗體或其抗原結合片段中之兩者或兩者以上之組合。
本發明亦關於編碼具有選自SEQ ID NO：13、38、58、78、98、 118及138之序列之重鏈可變域的經分離核酸序列。特定言之，核酸具有與選自由SEQ ID NO：14、27、39、59、79、99、119及139組成之群之序列至少90%序列一致的序列。在本發明之另一態樣中，序列為SEQ ID NO：14、27、39、59、79、99、119或139。
本發明亦關於編碼具有選自SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128及148之序列之輕鏈可變域的經分離核酸序列。特定言之，核酸具有與選自由SEQ ID NO：24、31、49、69、89、109、129及149組成之群的序列至少90%序列一致的序列。在本發明之另一態樣中，序列為SEQ ID NO：24、31、49、69、89、109、129或149。
本發明亦關於一種包含編碼多肽之序列的經分離核酸，該多肽包括與選自由SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128及148組成之群的序列具有至少90%序列一致性的輕鏈可變域。
本發明亦關於一種載體，其包括本文所述之核酸分子中之一或多者。
本發明亦關於一種經分離之宿主細胞，其包括編碼上述抗體之重鏈的重組DNA序列，及編碼上述抗體之輕鏈的第二重組DNA序列，其中該等DNA序列可操作地連接於啟動子且能夠表現於宿主細胞中。預期抗體可為人類化抗體。亦預期宿主細胞為非人類哺乳動物細胞。
預期細胞為人類細胞。進一步預期細胞存在於個體中。在一個實施例中，預期細胞為內皮細胞。在其他實施例中，細胞可為脂肪、肌肉及肝臟細胞中之一或多者。仍進一步預期個體為人類。
本發明亦關於一種治療、改善或預防患者之ANGPTL4相關病症的方法，其中該方法包括向該患者投與有效量之包含本文所述抗體或其抗原結台片段之組合物的步驟。在一個態樣中，ANGPTL4相關病症係與高三酸甘油酯血症(例如重度高三酸甘油酯血症(例如血漿三酸 甘油酯濃度>500mg/dL)、肥胖相關高三酸甘油酯血症及V型高三酸甘油酯血症)相關。在其他態樣中，ANGPTL4相關病症係與原發血脂異常、代謝症候群、II型糖尿病相關。預期患者為人類。
任一種前述分離抗體或其抗原結合片段可為單株抗體或其抗原結合片段。
定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。
術語「ANGPTL4蛋白質」或「ANGPTL4抗原」或「ANGPTL4」可互換使用且係指不同物種中的血管生成素樣4(ANGPTL4)蛋白質。舉例而言，人類ANGPTL4具有如表1中所示之序列(SEQ ID NO：1)，且已描述於先前報導及文獻中(Nature，第386卷，第73-77頁，1997；Genomics，第54卷，第2期，第191-199頁，1998；Biochem.J.，第339卷，第1部分，第177-184頁，1999；Genbank寄存編號NP 002534)。ANGPTL4含有N末端雙螺旋域及C末端纖維蛋白原(FBN)樣域(Kim等人(2000)Biochem.J.346：603-610)。其為能夠形成二聚體及四聚體的同源寡聚體蛋白質，由包括巨噬細胞、脂肪、肌肉及肝臟細胞之細胞類型表現，且已知可抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)介導三酸甘油酯(TG)清除。
另外，在本發明之上下文中，術語「ANGPTL4」包括天然血管生成素樣4(ANGPTL4)蛋白質突變體，其具有與上述報導中所述之原生初級結構(胺基酸序列)實質上相同的胺基酸序列。本文中，術語「具有實質上相同胺基酸序列之天然人類血管生成素樣4(ANGPTL4)蛋白質突變體」係指此類突變型蛋白質。
如本文所用之術語「抗體」意謂完整抗體及其任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或單鏈。完整抗體為包含藉由二硫鍵相互 連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的醣蛋白。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域：CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域CL。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，其中散置有更保守的區域，稱為構架區(FR)。各VH及VL由自胺基端至羧基端依以下順序排列之3個CDR及4個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體恆定區可介導免疫球蛋白結合至宿主組織或因子，包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指完整抗體的一或多個片段，該等片段保持特異性結合至指定抗原(例如人類氧化LDL受體(ANGPTL4))的能力。抗體之抗原結合功能可由完整抗體之片段執行。術語抗體之抗原結合部分或抗原結合片段內所涵蓋之結合片段的實例包括Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；F(ab)2片段，一種包含兩個Fab片段的二價片段，該兩個Fab片段經位於鉸鏈區之二硫橋鍵連接；Fd片段，其由VH及CH1域組成；Fv片段，其由抗體之單臂之VL及VH域組成；單域抗體(dAb)片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)，其由VH域或VL域組成；及經分離之互補決定區(CDR)。
此外，雖然Fv片段之兩個域VL及VH由各別基因編碼，但其可使用重組方法、藉由人工肽連接子連接，該人工肽連接子使其能夠以單一蛋白質鏈形式產生，其中VL與VH區域配對而形成單價分子(已知為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人，1988 Science 242：423-426；及Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此類單鏈抗體包括抗體之一或多個抗原結合部分或片段。此等抗體片段係使用熟習 此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式來篩選供使用的片段。
抗原結合片段亦可併入單域抗體、最大抗體、微型抗體、奈米抗體、胞內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙scFv中(參見例如Hollinger及Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136)。抗體之抗原結合部分可移植至基於諸如纖維結合蛋白III型(Fn3)之多肽之骨架中(參見美國專利第6,703,199號，其描述纖維結合蛋白多肽單功能抗體)。
抗原結合片段可併入包含一對串聯Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)之單鏈分子中，該等Fv片段連同互補輕鏈多肽形成一對抗原結合區(Zapata等人，1995 Protein Eng.8(10)：1057-1062；及美國專利第5,641,870號)。
如本文所用，術語「親和力」係指位於單一抗原位點處抗體與抗原之間相互作用的強度。在各抗原位點內，抗體「臂」之可變區經由弱非共價力與抗原在多個位點處相互作用；相互作用愈大，親和力愈強。如本文所用，術語抗體或其抗原結合片段(例如Fab片段)之「高親和力」通常係指具有10-9M或小於10-9M之KD的抗體或抗原結合片段。
術語「胺基酸」係指天然存在及合成之胺基酸，以及以類似於天然存在之胺基酸的方式發揮功能的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸為由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及隨後經修飾之胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷絲胺酸。胺基酸類似物係指基本化學結構與天然存在之胺基酸相同(亦即α碳與氫、羧基、胺基及R基團結合)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽主鏈，然而保持與天然存在之胺基酸相同之基本化 學結構。胺基酸模擬物係指具有與胺基酸之一般化學結構不同之結構，然而以與天然存在之胺基酸類似之方式起作用的化合物。
如本文所用，術語「結合特異性」係指個別抗體結合位點與僅一個抗原決定子反應之能力。
片語「特異性(或選擇性)結合」至抗體(例如ANGPTL4結合抗體)係指作為蛋白質及其他生物製劑之非均質群中存在同源抗原(例如人類ANGPTL4或食蟹獼猴ANGPTL4)之決定因素的結合反應。片語「識別抗原之抗體」及「特異性針對抗原之抗體」在本文中可與術語「特異性結合至抗原之抗體」互換使用。
術語「ANGPTL4介導」係指如下實情：ANGPTL4已知可抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)介導三酸甘油酯(TG)清除，且從而增加三酸甘油酯含量。
如本文所用，「ANGPTL4相關病症」、「ANGPTL4相關病狀」或類似術語係指尋求降低ANGPTL4介導性LPL抑制及脂蛋白調節的多種病狀或疾病。此等病狀包括(但不限於)牽涉脂質代謝的病狀，諸如高脂質血症、高脂蛋白血症及血脂異常，包括致動脈粥樣硬化的血脂異常、糖尿病血脂異常、高三酸甘油酯血症(例如重度高三酸甘油酯血症(例如血漿三酸甘油酯濃度>500mg/dL)、肥胖相關高三酸甘油酯血症及V型高三酸甘油酯血症)、高膽固醇血症、乳糜微粒血症、混合型血脂異常(肥胖、代謝症候群、糖尿病等)、脂質營養不良、脂萎縮，及以下原因引起的其他病狀：例如LPL活性降低及/或LPL缺乏、LDL受體活性降低及/或LDL受體缺乏、ApoC2改變、ApoE缺乏、ApoB增加、極低密度脂蛋白(VLDL)之產生增加及/或排除減少、某些藥物治療(例如糖皮質激素治療誘發血脂異常)、任何遺傳傾向性、膳食、生活樣式及類似因素。
與高脂質血症、高脂蛋白血症及/或血脂異常相關或由其產生的 其他ANGPTL4相關疾病或病症包括(但不限於)心血管疾病或病症，諸如動脈粥樣硬化、動脈瘤、高血壓、絞痛、中風、腦血管疾病、充血性心臟衰竭、冠狀動脈疾病、心肌梗塞、周邊血管疾病及類似疾病；急性胰臟炎；非酒精性脂肝炎(NASH)；血糖病症，諸如糖尿病、肥胖及類似病症。
術語「嵌合抗體」為一種抗體分子，其中(a)恆定區或其一部分變化、置換或交換，使得抗原結合位點(可變區)連接至不同或所變類別、效應功能及/或物種或賦予嵌合抗體(例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等)新特性之完全不同分子的恆定區；或(b)可變區或其一部分變成具有不同或所變抗原特異性之可變區、經具有不同或所變抗原特異性之可變區置換或交換。舉例而言，小鼠抗體可藉由用來自人類免疫球蛋白之恆定區置換其恆定區來修飾。由於經人類恆定區置換，因此嵌合抗體可保持其識別抗原之特異性，同時相較於初始小鼠抗體，其在人類中之抗原性降低。
術語「經保守修飾之變異體」適用於胺基酸與核酸序列。相對於特定核酸序列，經保守修飾之變異體係指編碼一致或基本上一致胺基酸序列之彼等核酸，或其中核酸不依照基本上一致序列來編碼胺基酸序列。由於遺傳密碼之簡併，因此許多在功能上相同之核酸編碼任何指定蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸藉由密碼子說明之每一位置上，密碼子可在不改變所編碼之多肽的情況下改變成任一個所述對應密碼子。此類核酸變異為「靜默變異」，其為一種保守修飾型變異。本文中編碼多肽之每一核酸序列亦描述核酸之每一可能的靜默變異。熟習此項技術者應認識到核酸中之各密碼子(除通常為甲硫胺酸之唯一密碼子之AUG及通常為色胺酸之唯一密碼子之TGG之外)可經修飾以產生功能上相同之分子。因此，編碼多肽之核酸之各種靜默變異隱含於各所述 序列中。
就多肽序列而言，「經保守修飾之變異體」包括使得胺基酸經化學上類似胺基酸取代的針對多肽序列之個別取代、缺失或添加。提供功能上類似之胺基酸的保守取代表在此項技術中已熟知。此類經保守修飾之變異體另外為且不排除本發明之多形性變異體、種間同源物及對偶基因。以下八個群組含有彼此為保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如Creighton,Proteins(1984))。在一些實施例中，術語「保守序列修飾」係用於指胺基酸修飾，其不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體之結合特徵。
術語「抗原決定基」意謂能夠特異性結合至抗體之蛋白質決定子。抗原決定基通常由依化學活性表面分類之分子(諸如胺基酸或糖側鏈)組成且通常具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。構形抗原決定基與非構形抗原決定基區別在於，在變性溶劑存在下，與前者之結合消失，但與後者之結合未消失。
如本文所用，術語「人類抗體」意欲包括可變區中之構架與CDR區均源於人類序列的抗體。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦源於此等人類序列，例如人類生殖系序列或人類生殖系序列之突變型。本發明之人類抗體可包括不由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定點突變誘發或藉由活體內體細胞突變所引入之突變)。
「人類化」抗體為保持非人類抗體(例如小鼠單株抗體)之抗原特異反應性、同時當作為治療劑投與人類時免疫原性降低的抗體。參見 例如Robello等人，Transplantation,68：1417-1420。此可如下達成：例如保留非人類抗原結合區且抗體剩餘部分用其人類對應物(亦即恆定區以及不涉及結合的可變區之一部分)置換。參見例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855,1984；Morrison及Oi,Adv.Immunol.,44：65-92,1989；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28：489-498,1991；及Padlan,Molec.Immun.,31：169-217,1994。人類工程改造技術之其他實例包括(但不限於)US 5,766,886中所揭示之Xoma技術。
在兩個或超過兩個核酸或多肽序列之上下文中，術語「一致」或「一致性」百分比係指兩個或超過兩個序列或子序列相同。當在比較窗或指定區域上根據最大一致性比較及比對時，若兩個序列具有特定百分比的相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即在特定區域上，或未說明時在整個序列上，60%一致、視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致)，如使用以下序列比較算法之一或藉由人工比對及目視檢查所量測，則兩個序列為「實質上一致」。視情況，一致性存在於至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)長度之區域上，或更佳存在於100至500或1000或超過1000個核苷酸(或20、50、200或超過200個胺基酸)長度之區域上。
序列比較時，典型地，一個序列充當與測試序列比較的參考序列。使用序列對比演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。序列比較演算法接著基於程式參數來計算測試序列相對於參考序列的序列一致性百分比。
如本文所用，「比較窗」包括提及在兩個序列最佳對準之後，一個序列可與具有相同鄰接位置數目之參考序列比較的區段，該區段具有任一個選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組 成之群的鄰接位置數目。用於比較之序列比對方法在此項技術中已熟知。用於比較之序列最佳比對可如下進行：例如Smith及Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源演算法；Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443,1970之同源比對演算法；Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444,1988之相似搜尋方法；此等演算法之電腦化實施方法(Wisconsin Genetics套裝軟體中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)，或人工比對及目測(參見例如Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(Ringbou編，2003))。
適用於測定序列一致性及序列相似性百分比之演算法之兩個實例為BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別描述於Altschul等人，Nuc.Acids Res.25：3389-3402,1977；及Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410,1990中。執行BLAST分析之軟體為可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。此演算法包括藉由鑑別查詢序列中之長度W之短字來首先鑑別高評分序列對(HSP)，該等短字當與資料庫序列中相同長度之字對準時匹配或滿足一些正值臨限值分數T。T稱為鄰域字分數臨限值(Altschul等人，前述)。此等初始鄰域字匹配充當用於起始搜尋之種子以尋找含有其之較長HSP。字匹配沿各序列在兩個方向上延伸，只要累積對準分數增加即可。就核苷酸序列而言，累積分數係使用參數M(一對匹配殘基之獎勵分數；始終>0)及N(失配殘基之罰分；始終<0)計算。就胺基酸序列而言，使用計分矩陣計算累積分數。當累積比對分數自其達成之最大值降低量X；累積分數因一或多次負分殘基比對之累積而變成0或低於0；或到達任一序列之末端時，則中斷字匹配在各方向上的延伸。BLAST演算法參數W、T及X決定比對之靈敏度及速度。BLASTN 程式(用於核苷酸序列)使用以下作為預設參數：字長(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=-4及雙股比較。就胺基酸序列而言，BLASTP程式使用以下作為預設參數：字長為3及期望值(E)為10，以及BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff及Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915,1989)比對(B)為50，期望值(E)為10，M=5，N=-4，及雙股比較。
BLAST演算法亦對兩個序列之間的相似性進行統計分析(參見例如Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787,1993)。藉由BLAST演算法提供之一種相似性度量為最小總和機率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然出現匹配之機率的指示。舉例而言，若測試核酸與參考核酸比較時的最小總和機率小於約0.2，更佳小於約0.01，且最佳小於約0.001，則認為核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列之間的一致性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17,1988)之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)、使用PAM120權重殘基表(空隙長度罰分為12且空隙罰分為4)測定。此外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol,Biol.48：444-453,1970)演算法(其已併入GCG套裝軟體(可在全球資訊網gcg.com獲得)之GAP程式中)，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及空隙權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。
除以上提到之序列一致性百分比之外，兩個核酸序列或多肽實質上一致之另一指示為，由第一核酸編碼之多肽與針對由第二核酸編碼之多肽產生的抗體具免疫交叉反應性，如下文所述。因此，多肽典型地與第二多肽實質上一致，例如其中兩個肽不同之處僅為保守性取代。兩個核酸序列實質上一致之另一指示為，兩個分子或其補體在嚴格條件下彼此雜交，如下文所述。兩個核酸序列實質上一致之又一指 示為，可使用相同引子擴增序列。
術語「分離抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體之抗體(例如特異性結合ANGPTL4之分離抗體實質上不含特異性結合除ANGPTL4之外之抗原的抗體)。然而，特異性結合ANGPTL4之分離抗體可與其他抗原具有交叉反應性。另外，分離抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
術語「同型」係指由重鏈恆定區基因得到的抗體類別(例如IgM、IgE、IgG，諸如IgG1或IgG4)。同型亦包括此等類別之一之修飾型，其中已進行修飾以改變Fc功能，例如以增強或減少效應子功能或與Fc受體之結合。
如本文所用之術語「kassoc」或「ka」意指特定抗體-抗原相互作用之結合速率，而如本文所用之術語「kdis」或「kd」意指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。如本文所用之術語「KD」意指解離常數，其獲自Kd與Ka之比率(亦即kd/ka)且以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可使用此項技術中沿用已久之方法來測定。測定抗體之KD之方法包括使用諸如Biacore®系統之生物感測器系統量測表面電漿子共振，或藉由溶液平衡滴定(SET)來量測溶液中之親和力。
如本文所用，術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指單一分子組成之抗體分子製劑。單株抗體組合物對於特定抗原決定基顯示單一結合特異性及親和力。
術語「核酸」在本文中可與術語「聚核苷酸」互換使用且係指呈單股或雙股形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾之主鏈殘基或鍵聯的核酸，該等核酸為合成的、天然存在的及非天然存在的，具有與參考核酸類似之結合特性，且以類似於參考核苷酸之方式代謝。此類類似物之實例包括(但不限於)硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲 酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另外指明，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)及互補序列，以及明確指定之序列。特定言之，如下詳述，簡併密碼子取代可藉由產生其中一或多個所選(或所有)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代的序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081,1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608,1985；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98,1994)。
術語「可操作地連接」係指兩個或超過兩個聚核苷酸(例如DNA)片段之間的功能關係。典型地，術語係指轉錄調節序列相對於所轉錄序列的功能關係。舉例而言，啟動子或增強子序列若其在適當宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列之轉錄，則可操作地連接於編碼序列。一般而言，可操作地連接於轉錄序列之啟動子轉錄調節序列在實體上鄰接於所轉錄序列，亦即其為順式作用。然而，諸如增強子之一些轉錄調節序列無需在實體上鄰接於或緊鄰於其增強轉錄之編碼序列。
如本文所用，術語「最佳化」意謂使用生產細胞或生物體(通常為真核細胞，例如畢赤酵母(Pichia)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞)中的較佳密碼子改變可編碼胺基酸序列的核苷酸序列。最佳化核苷酸序列經工程改造可完全地或儘可能多地保留初始核苷酸序列最初所編碼之胺基酸序列，其亦稱為「親本」序列。本文中之最佳化序列已經工程改造以具有哺乳動物細胞中之較佳密碼子。然而，本文中亦預想此等序列在其他真核細胞或原核細胞中之最佳化表現。由最佳化核苷酸序列編碼之胺基酸序列亦稱為最佳化。
術語「多肽」或「蛋白質」在本文中可互換使用，且係指胺基酸殘基之聚合物。該術語適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸 殘基為天然存在之對應胺基酸之人工化學模擬物，且適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。除非另外指明，否則特定多肽序列亦隱含地涵蓋其保守修飾型變異體。
如本文所用，術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離的所有人類抗體，諸如自人類免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉殖染色體動物(例如小鼠)或自其製備之融合瘤中分離的抗體；自經轉形以表現人類抗體之宿主細胞(例如轉染瘤)中分離的抗體；自重組、組合人類抗體文庫中分離的抗體；及藉由任何其他方式(包括將人類免疫球蛋白基因序列之全部或一部分與其他DNA序列拼接)製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組人類抗體具有其中構架及CDR區源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，此類重組人類抗體可進行活體外突變誘發(或，當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時，為活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為活體內可不天然存在於人類抗體生殖系譜系內的序列，雖然該等序列源於人類生殖系VH及VL序列且與人類生殖系VH及VL序列有關。
術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)係指重組表現載體已引入其中之細胞。應瞭解，此類術語不僅意指特定個體細胞，而且指此類細胞之後代。因為某些修飾可能因突變或環境影響而出現在後代中，所以此類後代可能實際上不與親本細胞一致，然而仍包括於如本文所使用之術語「宿主細胞」範疇內。
術語「個體」包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物(例如：哺乳動物及非哺乳動物)，諸如非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物及爬行動物。除非提及，否則術語「患者」或「個體」在本文中互換使用。如本文所用，術語「食蟹獼猴(cyno或cynomolgus)」係指食蟹獼猴(Macaca fascicularis)。
如本文所用，術語「治療」任何疾病或病症(例如ANGPTL4相關病症)在一個實施例中係指改善疾病或病症(亦即減緩或遏制或減少疾病或其臨床症狀中之至少一者的發展)。在另一實施例中，「治療(treating或treatment)」係指緩解或改善至少一種身體參數，包括患者可能辨別不出之身體參數。在又另一個實施例中，「治療」係指在身體上(例如穩定可辯別的症狀)、生理上(例如穩定身體參數)或兩方面上調節疾病或病症。在又另一個實施例中，「治療」係指預防或延遲疾病或病症之發作或發展或進展。
「預防」當其與本文所述之適應症(包括例如ANGPTL4相關病症)有關時，意謂預防或減緩例如ANGPTL4相關疾病參數(如下文所述)惡化於面臨該惡化之風險之患者中的任何作用。
術語「載體」意指聚核苷酸分子，其能夠傳輸其已連接之另一聚核苷酸。一種載體類型為「質體」，其係指其中可連接其他DNA區段的環形雙股DNA環。另一種載體類型為病毒載體，諸如腺相關病毒載體(AAV或AAV2)，其中其他DNA區段可連接至病毒基因組。某些載體能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因組中，且從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠導引與其可操作地連接的基因之表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱「表現載體」)。一般而言，重組DNA技術中所用之表現載體通常呈質體形式。在本發明書中，由於質體為最常用之載體形式，因此「質體」與「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括發揮相等功能之該等其他形式之表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒以及腺相關病毒)。
圖1A至1D描繪ANGPTL4介導本發明之所選ANGPTL4抗體抑制人類脂蛋白脂肪酶(LPL)蛋白質的逆轉。
圖2描繪本發明之所選抗體相對於全長人類ANGPTL4及人類ANGPTL4 N末端雙螺旋域的結合，及相對於人類全長ANGPTL3之結合缺乏。ANGPTL3 Ab=ANGPTL3特異性參考抗體。
圖3A至3B描繪投與本發明之所選ANGPTL4抗體之後，人類ANGPTL4轉殖基因小鼠的血漿三酸甘油酯含量變化。
圖4描繪投與本發明之一種ANGPTL4抗體(NEG276-LALA)之後，肥胖糖尿病食蟹獼猴的血漿總人類抗體濃度。
圖5描繪投與本發明之一種ANGPTL4抗體(NEG276-LALA)之後，肥胖糖尿病食蟹獼猴的血漿三酸甘油酯(TG)濃度變化。
圖6描繪投與本發明之一種ANGPTL4抗體(NEG276-LALA)之後，肥胖糖尿病食蟹獼猴的血漿總膽固醇濃度變化。
圖7描繪投與本發明之一種ANGPTL4抗體(NEG276-LALA)之後，肥胖糖尿病食蟹獼猴的血漿高密度脂蛋白(HDL)濃度變化。
圖8描繪投與本發明之一種ANGPTL4抗體(NEG276-LALA)之後，肥胖糖尿病食蟹獼猴的血漿總脂蛋白元B(ApoB)濃度變化。
圖9描繪投與本發明之一種ANGPTL4抗體(NEG276-LALA)之後，肥胖糖尿病食蟹獼猴的血漿脂蛋白元C-III(ApoC-III)濃度變化。
圖10描繪投與本發明之一種ANGPTL4抗體之後，血漿脂蛋白相關膽固醇含量變化，如藉由快速蛋白質液相層析(FPLC)分離血漿脂蛋白所評估。所示為一個猴的資料(NEG276-LALA，猴#6296)。縮寫：TRL，富含三酸甘油酯的脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白；HDL，高密度脂蛋白。
圖11描繪投與本發明之一種ANGPTL4抗體之後，血漿脂蛋白相 關三酸甘油酯(TG)含量變化，如藉由快速蛋白質液相層析(FPLC)分離血漿脂蛋白所評估。所示為一個猴的資料(NEG276-LALA，猴#6296)。縮寫：TRL，富含三酸甘油酯的脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白；HDL，高密度脂蛋白。
本發明部分地係基於發現特異性結合至ANGPTL4且抑制其生物學活性的抗體分子。本發明係關於完全IgG形式抗體(例如人類化抗體NEG276、NEG276-LALA、NEG278、NEG310、NEG313、NEG315、NEG318、NEG319)以及其抗原結合片段，諸如Fab片段。
因此，本發明提供特異性結合至ANGPTL4(例如人類ANGPTL4)的抗體、醫藥組合物、製造方法及使用此等抗體及組合物的方法。
ANGPTL4蛋白質
本發明提供特異性結合至ANGPTL4且抑制其生物學活性(包括活化脂蛋白脂肪酶(LPL)的能力)的抗體。反之，血管生成素樣4蛋白質(ANGPTL4)為所分泌蛋白質之血管生成素家族的成員。其為能夠形成二聚體及四聚體的同源寡聚體蛋白質，其由包括巨噬細胞、脂肪、肌肉及肝臟細胞之細胞類型表現。ANGPTL4亦稱為肝纖維蛋白原/血管生成素相關蛋白質(HFARP)(Kim等人(2000)Biochem.J.346：603-610)；PPAR γ血管生成素相關蛋白質(PGAR)(Yoon等人(2000)Mol.Cell Biol.,20：5343-5349)，以及空腹誘導脂肪因子(FIAF)(Kerten等人(2000)J.Biol.Chem.,275：28488-28493)。ANGPTL4含有N末端雙螺旋域及C末端纖維蛋白原(FBN)樣域(Kim等人(2000)Biochem.J.346：603-610)。
脂蛋白脂肪酶(LPL)在脂蛋白代謝中具有維持血液正常脂蛋白含量及全組織特異性調節其活性的主要作用，以確定三酸甘油酯(TG)何時且在什麼組織中去載。ANGPTL4之雙螺旋區域已知可抑制脂蛋白 脂肪酶(LPL)介導三酸甘油酯(TG)清除。因此，ANGPTL4功能喪失突變(例如如人類個體中所見)、基因缺失(例如如轉殖基因小鼠中所見)及抗體抑制(例如如小鼠及食蟹獼猴中所見)皆已觀測到可降低血漿三酸甘油酯。此外，亦已知ANGPTL4抗體可活化LPL。反之，ANGPTL4注射至小鼠中引起循環三酸甘油酯快速增加且其速率高於血管生成素樣蛋白質3(ANGPTL3)之注射(Yoshida等人(2002)J Lipid Res 43：1770-1772)。
本發明中所述之抗ANGPTL4抗體及抗原結合片段起始、促進或增強LPL活化，例如藉由阻斷ANGPTL4抑制LPL，從而降低血漿三酸甘油酯。預期此等抗體可預防及改善以三酸甘油酯含量升高為特徵之疾病(例如原發血脂異常、高三酸甘油酯血症、代謝症候群、II型糖尿病及類似疾病)之急性及慢性表現。
本發明中所述之抗ANGPTL4抗體及抗原結合片段起始、促進或增強LPL活化，例如藉由阻斷ANGPTL4抑制LPL，從而降低血漿三酸甘油酯。預期此等抗體可預防及改善以三酸甘油酯含量升高為特徵之疾病(例如原發血脂異常、高三酸甘油酯血症、代謝症候群、II型糖尿病及類似疾病)之急性及慢性表現。
ANGPTL4抗體及抗原結合片段
本發明提供特異性結合至ANGPTL4之抗體。在一些實施例中，本發明提供特異性結合至人類及食蟹獼猴ANGPTL4的抗體。本發明之抗體包括(但不限於)人類化抗體及Fab，其如實例中所述分離。
本發明提供特異性結合ANGPTL4蛋白質(例如人類及食蟹獼猴ANGPTL4)的抗體，其中該等抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：13、38、58、78、98、118及138的VH域。本發明亦提供特異性結合至ANGPTL4蛋白質之抗體，其中該等抗體包含具有下文表1中所列之任一VH CDR之胺基酸序列的VH CDR。特定言之，本發明提供特異 性結合至ANGPTL4蛋白質(例如人類及食蟹獼猴ANGPTL4)的抗體，其中該等抗體包含(或者組成為)一個、兩個、三個或超過三個具有下文表1中所列之任一VH CDR之胺基酸序列的VH CDR。
本發明提供特異性結合至ANGPTL4蛋白質的抗體，該等抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128及148的VL域。本發明亦提供特異性結合至ANGPTL4蛋白質(例如人類及食蟹獼猴ANGPTL4)之抗體，該等抗體包含具有下文表2中所列之任一VL CDR之胺基酸序列的VL CDR。特定言之，本發明提供特異性結合至ANGPTL4蛋白質(例如人類及食蟹獼猴ANGPTL4)的抗體，該等抗體包含(或者組成為)一個、兩個、三個或超過三個具有下文表1中所列之任一VL CDR之胺基酸序列的VL CDR。
本發明之其他抗體包括已突變，然而CDR區域與表1所述序列中所描繪之CDR區域具有至少60%、70%、80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸。在一些實施例中，其包括CDR區域中不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸已發生突變(相較於表1所述序列中所描繪之CDR區域)的突變型胺基酸序列。
本發明亦提供編碼特異性結合至ANGPTL4蛋白質(例如人類及食蟹獼猴ANGPTL4)之抗體之VH、VL、全長重鏈及全長輕鏈的核酸序列。此等核酸序列可根據在哺乳動物細胞中的表現加以最佳化(例如表1顯示本發明抗體之重鏈及輕鏈之最佳化核酸序列)。
本發明之其他抗體包括其中胺基酸或編碼胺基酸之核酸已突變、然而與表1中所述之序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致性的彼等抗體。一些實施例包括可變區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已發生突變(相較於表1所述序列中所描繪的可變區)、同時保持實質上相同抗原結合活性的突變型胺基酸序列。
由於此等抗體中之每一者可結合至ANGPTL4，因此VH、VL、全長輕鏈及全長重鏈序列(胺基酸序列及編碼胺基酸序列之核苷酸序列)可經「混合及匹配」，以產生本發明之其他ANGPTL4結合抗體。此等「經混合及匹配」之ANGPTL4結合抗體可使用此項技術中已知之結合分析(例如ELISA及實例章節中所述之其他分析)來測試。當此等鏈經混合及匹配時，來自特定VH/VL對之VH序列應經結構上類似之VH序列置換。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長重鏈序列應經結構上類似之全長重鏈序列置換。同樣，來自特定VH/VL對之VL序列應經結構上類似之VL序列置換。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長輕鏈序列應經結構上類似的全長輕鏈序列置換。
因此，在一個態樣中，本發明提供分離抗體或其抗原結合區，其具有：包含選自由SEQ ID NO：13、38、58、78、98、118及138組成之群之胺基酸序列的重鏈可變域，及包含選自由SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128及148組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變域，其中該抗體特異性結合至ANGPTL4(例如人類ANGPTL4)。
更特定言之，在某些態樣中，本發明提供分離抗體或其抗原結合區，其具有分別包含選自SEQ ID NO：13及23；38及48；58及68；78及88；98及108；118及128；或138及148之胺基酸序列的重鏈可變域及輕鏈可變域。
在另一態樣中，本發明提供(i)分離抗體，其具有：全長重鏈，其包含選自由SEQ ID NO：15、28、40、60、80、100、120及140組成之群、根據在哺乳動物細胞中之表現經最佳化的胺基酸序列，及全長輕鏈，其包含選自由SEQ ID NO：25、50、70、90、110、130及150組成之群、根據在哺乳動物細胞中之表現經最佳化的胺基酸序列；或(ii)功能蛋白，其包含其抗原結合部分。更特定言之，在某些態樣中，本發明提供分離抗體或其抗原結合區，其具有分別包含選自SEQ ID NO：15及25；28及25；40及50；60及70；80及90；100及110；120及130；或140及150之胺基酸序列的重鏈及輕鏈。
如本文所用，術語「互補決定區」及「CDR」係指抗體可變區內之胺基酸序列，其賦予抗原特異性及結合親和力。一般而言，各重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，且各輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
所指定CDR之精確胺基酸序列邊界可容易使用多個熟知方案中的任一者確定，包括Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest」第5版，公共衛生服務署(Public Health Service)，國家衛生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,MD (「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(「Chothia」編號方案)所描述之方案。
舉例而言，根據Kabat，抗體FF1在重鏈可變域(VH)中之CDR胺基酸殘基編號為31至35(HCDR1)、50至66(HCDR2)及99至104(HCDR3)；且輕鏈可變域(VL)中之CDR胺基酸殘基編號為24至34(LCDR1)、50至55(LCDR2)及89至97(LCDR3)。根據Chothia，VH中之CDR胺基酸編號為26至32(HCDR1)、52至57(HCDR2)及99至104(HCDR3)；且VL中之胺基酸殘基編號為26至32(LCDR1)、50至52(LCDR2)及91至96(LCDR3)。根據Kabat與Chothia之CDR定義組合，CDR係由人類VH中之胺基酸殘基26至35(HCDR1)、50至66(HCDR2)及90至104(HCDR3)及人類VL中之胺基酸殘基24至34(LCDR1)、50至55(LCDR2)及89至97(LCDR3)組成。
在另一態樣中，本發明提供ANGPTL4結合抗體，其包含如表1中所述之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3或其組合。抗體VH CDR1胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：7、32、52、72、92、112及132中。抗體VH CDR2胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：8、33、53、73、93、113及133中。抗體VH CDR3胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：9、34、54、74、94、114及134中。抗體VL CDR1胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：17、42、62、82、102、122及142中。抗體VL CDR2胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：18、43、63、83、103、123及143中。抗體VL CDR3胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：19、44、64、84、104、124及144中。此等CDR區使用Kabat系統描繪。
或者，如使用Chothia系統(A1-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948)所定義，抗體VH CDR1胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：10、35、55、75、95、115及135中。抗體VH CDR2胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：11、36、56、76、96、116及136中。抗體VH CDR3胺基酸序列顯 示於SEQ ID NO：12、37、57、77、97、117及137中。抗體VL CDR1胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：20、45、65、85、105、125及145中。抗體VL CDR2胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：21、46、66、86、106、126及146中。抗體VL CDR3胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：22、47、67、87、107、127及147中。
鑒於此等抗體中之每一者可結合至ANGPTL4且抗原結合特異性主要由CDR1、2及3區域提供，因此VH CDR1、2及3序列與VL CDR1、2及3序列可「混合及匹配」(亦即，來自不同抗體的CDR可混合及匹配，但各抗體較佳含有VH CDR1、2及3以及VL CDR1、2及3以產生本發明之其他ANGPTL4結合分子。此等「混合及匹配」之ANGPTL4結合抗體可使用此項技術中已知之結合分析及實例中所述之分析(例如ELISA、SET、Biacore)來測試。當VH CDR序列混合及匹配時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之CDR序列置換。同樣，當VL CDR序列混合及匹配時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之CDR序列置換。一般技術者顯而易知，新穎的VH及VL序列可藉由用選自本文中針對本發明之單株抗體所示之CDR序列之結構類似序列取代一或多個VH及/或VL CDR區序列來產生。除前述之外，在一個實施例中，本文所述抗體之抗原結合片段可包含VH CDR1、2及3，或VL CDR 1、2及3，其中片段以單一可變域形式結合至ANGPTL4。
在本發明之某些實施例中，抗體或其抗原結合片段可具有表1中所述之人類化抗體的重鏈及輕鏈序列。更特定言之，抗體或其抗原結合片段可具有NEG276、NEG276-LALA、NEG278、NEG310、NEG313、NEG315、NEG318及NEG319之重鏈及輕鏈序列。
在本發明之其他實施例中，特異性結合ANGPTL4之抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區CDR1、重鏈可變區CDR2、重鏈可變區 CDR3、輕鏈可變區CDR1、輕鏈可變區CDR2及輕鏈可變區CDR3，如Kabat所定義且如表1中所述。在本發明之其他實施例中，特異性結合ANGPTL4之抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區CDR1、重鏈可變區CDR2、重鏈可變區CDR3、輕鏈可變區CDR1、輕鏈可變區CDR2及輕鏈可變區CDR3，如Chothia所定義且如表1中所述。
在一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：7之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：8之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：9之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：17之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：18之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：19之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：32之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：33之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：34之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：42之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：43之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：44之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：52之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：53之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：54之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：62之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：63之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：64之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：72之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：73之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：74之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：82之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：83之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：84之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之 抗體，該抗體包含SEQ ID NO：92之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：93之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：94之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：102之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：103之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：104之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：112之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：113之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：114之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：122之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：123之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：124之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：132之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：133之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：134之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：142之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：143之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：144之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：10之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：11之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：12之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：20之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：21之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：22之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：35之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：36之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：37之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：45之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：46之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：47之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：55之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO： 56之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：57之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：65之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：66之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：67之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：75之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：76之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：77之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：85之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：86之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：87之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：95之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：96之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：97之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：105之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：106之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：107之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：115之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：116之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：117之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：125之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：126之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：127之輕鏈可變區CDR3。
在另一個特定實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：135之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：136之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：137之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：145之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：146之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：147之輕鏈可變區CDR3。
在某些實施例中，本發明包括特異性結合至ANGPTL4的抗體或抗原結合片段，如表1中所述。在一個較佳實施例中，結合ANGPTL4的抗體或抗原結合片段為NEG276、NEG276-LALA、NEG278、 NEG310、NEG313、NEG315、NEG318、NEG319。
同源抗體
在又另一個實施例中，本發明提供包含與表1中所述之序列同源之胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段，且該抗體結合至ANGPTL4蛋白質(例如人類及食蟹獼猴ANGPTL4)，且保持表1中所述之彼等抗體的所要功能特性。
舉例而言，本發明提供包含重鏈可變域及輕鏈可變域的分離抗體或其功能性抗原結合片段，其中該重鏈可變域包含與選自由SEQ ID NO：13、38、58、78、98、118及138組成之群的胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%一致的胺基酸序列；該輕鏈可變域包含與選自由SEQ ID NO：23、23、48、68、88、108、128、148組成之群的胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%一致的胺基酸序列；且該抗體特異性結合至ANGPTL4(例如人類及食蟹獼猴ANGPTL4)。在本發明之某些態樣中，重鏈及輕鏈序列分別進一步包含如藉由Kabat所定義的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，例如SEQ ID NO：7、8、9、17、18及19。在本發明之某些其他態樣中，重鏈及輕鏈序列分別進一步包含如藉由Chothia所定義的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，例如SEQ ID NO：10、11、12、20、21及22。
在其他實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可與表1中所列之序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在其他實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可為一致的，但其中不超過1、2、3、4或5個胺基酸位置存在胺基酸取代。VH及VL區域與表1中所述之彼等VH及VL區域具有高度(亦即80%或大於80%)一致性的抗體可如下獲得：對分別編碼SEQ ID NO：13、38、58、78、98、118、118或138及SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128或148之核酸分子 進行突變誘發(例如定點或PCR介導突變誘發)，隨後使用本文所述之功能分析對所編碼之變化抗體的保留功能進行測試。
在其他實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈胺基酸序列可與表1中所列之序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。具有與SEQ ID NO：15、28、40、60、80、100、120、133或140中任一者之全長重鏈及SEQ ID NO：25、25、50、70、90、110、130或150中任一者之全長輕鏈高度(亦即80%或大於)一致之全長重鏈及全長輕鏈的抗體可如下獲得：對編碼此等多肽的核酸分子進行突變誘發(例如定點或PCR介導突變誘發)，隨後使用本文所述之功能分析對所編碼之變化抗體的保留功能進行測試。
在其他實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈核苷酸序列可與表1中所列之序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
在其他實施例中，重鏈可變區及/或輕鏈可變區核苷酸序列可與表1中所列之序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
如本文所用，考慮為了使兩個序列達成最佳對準而需要引入的空隙之數目及各空隙之長度，兩個序列之間的一致性百分比為序列所共有之一致位置之數目的函數(亦即，-致性%等於一致位置數/總位置數×100)。如下文非限制性實例中所述，序列比較及測定兩個序列之間的一致性百分比可使用數學演算法完成。
另外地或可替代地，本發明之蛋白質序列可進一步用作「查詢序列」以針對公共資料庫進行搜尋，例如鑑別相關序列。舉例而言，此類搜尋可使用Altschul等人，1990 J.Mol.Biol.215：403-10之BLAST程式(2.0版)進行。
具有保守性修飾之抗體
在某些實施例中，本發明抗體具有包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中此等CDR序列中之一或多者具有基於本文所述之抗體或其保守性修飾的特定胺基酸序列，且其中抗體保持本發明之ANGPTL4結合抗體之所要功能特性。
因此，本發明提供由以下組成的分離抗體或其抗原結合片段：包含CDR1、CDR2及CDR3序列的重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列的輕鏈可變區，其中：重鏈可變區CDR1胺基酸序列選自由SEQ ID NO：7、32、52、72、92、112及132以及其保守性修飾組成之群；重鏈可變區CDR2胺基酸序列選自由SEQ ID NO：8、33、53、73、93、113及133以及其保守性修飾組成之群；重鏈可變區CDR3胺基酸序列選自由SEQ ID NO：9、34、54、74、94、114及134以及其保守性修飾組成之群；輕鏈可變區CDR1胺基酸序列選自由SEQ ID NO：17、42、62、82、102、122及142以及其保守性修飾組成之群；輕鏈可變區CDR2胺基酸序列選自由SEQ ID NO：18、43、63、83、103、123及143以及其保守性修飾組成之群；輕鏈可變區CDR3胺基酸序列選自由SEQ ID NO：19、44、64、84、104、124及144以及其保守性修飾組成之群；且該抗體或其抗原結合片段特異性結合至ANGPTL4。
在其他實施例中，根據在哺乳動物細胞中之表現經最佳化的本發明抗體具有全長重鏈序列及全長輕鏈序列，其中此等序列中之一或多者具有基於本文所述抗體或其保守性修飾之特定胺基酸序列，且其中抗體保持本發明之ANGPTL4結合抗體之所要功能特性。因此，本發明提供根據在哺乳動物細胞中之表現經最佳化、由全長重鏈及全長輕鏈組成的分離抗體，其中全長重鏈具有選自SEQ ID NO：15、28、40、60、80、100、120及140以及其保守性修飾之群組的胺基酸序列；且全長輕鏈具有選自SEQ ID NO：25、50、70、90、110、130及 150以及其保守性修飾之群組的胺基酸序列；且該抗體特異性結合至ANGPTL4(例如人類及食蟹獼猴ANGPTL4)。
結合至相同抗原決定基之抗體
本發明提供與表1中所述之ANGPTL4結合抗體結合至相同抗原決定基的抗體。其他抗體因此可在ANGPTL4結合分析(諸如實例中所述之分析)中基於其與本發明之其他抗體競爭(例如以統計學顯著方式競爭性地抑制結合)之能力加以鑑別。測試抗體抑制本發明之抗體結合至ANGPTL4蛋白質之能力表明，測試抗體可與該抗體競爭結合至ANGPTL4；根據非限制性理論，此類抗體可與其所競爭之抗體結合至ANGPTL4蛋白質上之相同或相關(例如結構上類似或空間上鄰近)抗原決定基。在某一實施例中，與本發明之抗體結合至ANGPTL4上之相同抗原決定基的抗體為人類化抗體。此等人類化抗體可如本文所述製備及分離。如本文所用，當在等莫耳濃度之競爭抗體存在下，競爭抗體將本發明之抗體或抗原結合片段之ANGPTL4結合抑制超過50%(例如80%、85%、90%、95%、98%或99%)時，抗體「競爭」結合。
在其他實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段結合至ANGPTL4之一或多個抗原決定基。在一些實施例中，本發明抗體或抗原結合片段所結合的抗原決定基為線性抗原決定基。在其他實施例中，本發明抗體或抗原結合片段所結合的抗原決定基為非線性、構形抗原決定基。
經工程改造及經修飾之抗體
本發明之抗體可進一步使用具有本文所示之VH及/或VL序列中之一或多者的抗體作為起始物質來製備以對經修飾之抗體進行工程改造，該經修飾之抗體相對於初始抗體可具有改變之特性。抗體可藉由修飾一或兩個可變區(亦即VH及/或VL)內(例如一或多個CDR區內及/ 或在一或多個構架區內)的一或多個殘基而經工程改造。另外地或可替代地，抗體可藉由修飾恆定區內之殘基(例如以改變抗體之效應功能)而經工程改造。
可進行之可變區工程改造之一種類型為CDR移植。抗體主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)的胺基酸殘基與靶抗原相互作用。出於此原因，與CDR外部之序列相比，CDR內部之胺基酸序列在個別抗體之間更多樣化。由於CDR序列引起大部分抗體-抗原相互作用，因此可藉由構建表現載體來表現模擬天然存在之特定抗體的重組抗體，該等表現載體包括移植至來自具有不同特性之不同抗體之構架序列上的來自天然存在之特定抗體的CDR序列(參見例如Riechmann,L.等人，1998 Nature 332：323-327；Jones,P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen,C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86：10029-10033；Winter之美國專利第5,225,539號，及Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
因此，本發明之另一個實施例係關於分離抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區分別包含具有選自由SEQ ID NO：7、32、52、72、92、112及132組成之群之胺基酸序列的CDR1序列、具有選自由SEQ ID NO：8、33、53、73、93、113及133組成之群之胺基酸序列的CDR2序列、具有選自由SEQ ID NO：9、34、54、74、94、114及134組成之群之胺基酸序列的CDR3序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區分別包含具有選自由SEQ ID NO：17、42、62、82、102、122及142組成之群之胺基酸序列的CDR1序列；具有選自由SEQ ID NO：18、43、63、83、103、123及143組成之群之胺基酸序列的CDR2序列；及由選自由SEQ ID NO：19、44、64、84、104、124及144組成之群之胺基酸序列組成的CDR3序列。因此，此類抗體含有單株抗體之VH及VL CDR序列，然而可能含有來自此等抗體之不同構架 序列。
此類構架序列可獲自包括生殖系抗體基因序列的公共DNA資料庫或公開參考文獻。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可發現於「VBase」人類生殖系序列資料庫(可獲得於全球資訊網mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，以及Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國健康及人類服務部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公告第91-3242號；Tomlinson,I.M.等人，1992 J.Mol.Biol.227：776-798；及Cox,J.P.L.等人，1994 Eur.J Immunol.24：827-836；該等各文獻之內容明確地以引用的方式併入本文中。
用於本發明抗體之構架序列之一個實例為結構上類似於本發明之所選抗體所使用之構架序列的構架序列，例如本發明之單株抗體所使用之共同序列及/或構架序列。VH CDR1、2及3序列以及VL CDR1、2及3序列可移植至序列與構架序列所來源之生殖系免疫球蛋白基因中所發現之序列一致的構架區，或CDR序列可移植至相較於生殖系序列含有一或多種突變之構架區上。舉例而言，已發現，在某些情況下，在構架區內之殘基突變有益於維持或增強抗體之抗原結合能力(參見例如Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。可用作在上面建構本文所述之抗體及抗原結合片段之骨架的構架包括(但不限於)VH1A、VH1B、VH3、Vk1、Vl2及Vk2。其他構架在此項技術中已知，且可發現於例如基於全球資訊網vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php？&MMN_position=1：1之vBase資料中。
因此，本發明之一個實施例係關於經分離之ANGPTL4結合抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：13、38、58、78、98、118及138組成之群的胺基酸序 列，或此等序列之構架區中具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列，且進一步包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有選自由SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128及148組成之群的胺基酸序列，或此等序列之構架區中具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列。
可變區修飾之另一類型為使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內的胺基酸殘基發生突變以藉此改良所關注抗體之一或多種結合特性(例如親和力)，稱為「親和力成熟」。可進行定點突變誘發或PCR介導突變誘發以引入突變且對抗體結合的影響或所關注之其他功能特性可在如本文所述及實例所提供之活體外或活體內分析中進行評價。可引入保守性修飾(如上文所論述)。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。另外，典型地，CDR區內變化的殘基不超過一個、兩個、三個、四個或五個。
因此，在另一個實施例中，本發明提供由以下組成的經分離之ANGPTL4結合抗體或其抗原結合片段：重鏈可變區，其具有VH CDR1區，該VH CDR1區由選自具有SEQ ID NO：7、32、52、72、92、112及132之群的胺基酸序列或相較於SEQ ID NO：7、32、52、72、92、112及132具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列組成；VH CDR2區，該VH CDR2區具有選自由SEQ ID NO：8、33、53、73、93、113及133組成之群的胺基酸序列或相較於SEQ ID NO：8、33、53、73、93、113及133具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列；VH CDR3區，該VH CDR3區具有選自由SEQ ID NO：9、34、54、74、94、114及134組成之群的胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：9、34、54、74、94、114及134具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列；VL CDR1區，該VL CDR1區具有選自 由SEQ ID NO：17、42、62、82、102、122及142組成之群的胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：17、42、62、82、102、122及142具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列；VL CDR2區，該VL CDR2區具有選自由SEQ ID NO：18、43、63、83、103、123及143組成之群的胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：18、43、63、83、103、123及143具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列；以及VL CDR3區，該VL CDR3區具有選自由SEQ ID NO：19、44、64、84、104、124及144組成之群的胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：19、44、64、84、104、124及144具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列。
因此，在另一個實施例中，本發明提供由以下組成的經分離之ANGPTL4結合抗體或其抗原結合片段：重鏈可變區，該重鏈可變區具有VH CDR1區，該VH CDR1區由選自具有SEQ ID NO：10、35、55、75、95、115及135之群的胺基酸序列或相較於SEQ ID NO：10、35、55、75、95、115及135具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列組成；VH CDR2區，該VH CDR2區具有選自由SEQ ID NO：11、36、56、76、96、116及136組成之群的胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：11、36、56、76、96、116及136具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列；VH CDR3區，該VH CDR3區具有選自由SEQ ID NO：12、37、57、77、97、117及137組成之群的胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：12、37、57、77、97、117及137具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列；VL CDR1區，該VL CDR1區具有選自由SEQ ID NO：20、45、65、85、105、125及145組成之群的胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：20、45、 65、85、105、125及145具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列；VL CDR2區，該VL CDR2區具有選自由SEQ ID NO：21、46、66、86、106、126及146組成之群的胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：21、46、66、86、106、126及146具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列；以及VL CDR3區，該VL CDR3區具有選自由SEQ ID NO：22、47、67、87、107、127及147組成之群的胺基酸序列，或相較於SEQ ID NO：22、47、67、87、107、127及147具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸序列。
抗原結合域移植至替代構架或骨架中
可使用廣泛多種抗體/免疫球蛋白構架或骨架，只要所得多肽包括特異性結合至ANGPTL4之至少一個結合區即可。此類構架或骨架包括人類免疫球蛋白之5種主要個體基因型或其片段，且包括其他動物物種之免疫球蛋白，其較佳具有人類化態樣。就此而言，單一重鏈抗體(諸如在駱駝中所鑑別之單一重鏈抗體)備受關注。熟習此項技術者繼續發現及開發新穎的構架、骨架及片段。
在一個態樣中，本發明係關於使用本發明之CDR可移植於其上之非免疫球蛋白骨架產生基於非免疫球蛋白之抗體。可使用已知或未來的非免疫球蛋白構架及骨架，只要其包含特異性針對標靶ANGPTL4蛋白質之結合區即可。已知非免疫球蛋白構架或骨架包括(但不限於)纖維結合蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham，MA)、錨蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、域抗體(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA及Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂質運載蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模組免疫藥物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)、最大抗體(Avidia,Inc.,Mountain View,CA)、蛋白質A(Affibody AG,Sweden)及阿菲林(affilin)(γ-晶狀 體球蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)。
纖維結合蛋白骨架係基於纖維結合蛋白III型域(例如纖維結合蛋白III型之第十模組(10 Fn3域))。纖維結合蛋白III型域具有分佈在兩個β片之間的7或8個β股，其自身彼此間填塞而形成蛋白質之核心，且進一步含有使β股彼此間連接且暴露於溶劑的環(與CDR類似)。在β片夾層結構之各邊緣處存在至少三個此類環，其中邊緣為蛋白質垂直於β股方向之邊界(參見US 6,818,418)。此等基於纖維結合蛋白之骨架不為免疫球蛋白，然而總體摺疊與包含駱駝及駱馬IgG之完整抗原識別單元之最小功能抗體片段(重鏈可變區)之摺疊密切相關。由於此結構，因此非免疫球蛋白抗體模擬在性質及親和力上與彼等抗體類似之抗原結合特性。類似於活體內抗體親和力成熟方法，活體外環隨機化及改組策略中可使用此等骨架。此等基於纖維結合蛋白之分子可用作骨架，其中分子之環區域可使用標準選殖技術用本發明之CDR置換。
錨蛋白技術係基於使用其中以錨蛋白源重複模組作為承載可用於結合至不同標靶之可變區之骨架的蛋白質。錨蛋白重複模組為一種由兩個逆平行α螺旋及β轉彎組成之33個胺基酸多肽。可變區之結合主要藉由使用核糖體呈現來最佳化。
高親和性多聚體源於天然含A域蛋白質，諸如LRP-1。此等域本質上用於蛋白質-蛋白質相互作用，且在人類中逾250種蛋白質在結構上係基於A域。高親和性多聚體係由多個不同「A域」單體(2至10個)經由胺基酸連接子連接而組成。可結合至靶抗原的高親和性多聚體可使用例如美國專利申請公開案第20040175756號、第20050053973號、第20050048512號及第20060008844號中所述之方法產生。
親和抗體親和性配位體為由三螺旋束組成的小型簡單蛋白質，該三螺旋束係基於蛋白質A之IgG結合域之一之骨架。蛋白質A為來自細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白質。此骨架域 係由58個胺基酸組成，其中13個隨機化以產生具有許多配位體變異體之親和抗體文庫(參見例如US 5,831,012)。親和抗體分子模擬抗體，與分子量為150kDa之抗體相比，其分子量為6kDa。與親和抗體分子之小尺寸無關，親和抗體分子之結合位點類似於抗體之結合位點。
抗運載蛋白(Anticalins)為Pieris ProteoLab AG公司開發之產品。其源於脂質運載蛋白(一組廣泛的小型穩定蛋白質，其通常涉及化學敏感或不溶化合物之生理學運輸或儲存)。若干種天然脂質運載蛋白出現於人類組織或體液中。蛋白質架構使人聯想到免疫球蛋白，其中高變環位於剛性構架上。然而，與抗體或其重組片段相比，脂質運載蛋白由具有160至180個胺基酸殘基之單一多肽鏈組成，該多肽鏈僅略大於單一免疫球蛋白域。一組構成結合袋之四個環顯示明顯的結構可塑性且包容多個側鏈。結合位點因此可以專有方法再成形以利用高親和性及特異性識別不同形狀之指定靶分子。大菜粉蝶(Pieris Brassicae)之後膽色素結合蛋白(bilin-binding protein；BBP)，脂質運載蛋白家族中之一種蛋白質，已用於藉由對該組四個環進行突變誘發來開發抗運載蛋白。描述抗運載蛋白之專利申請案之一個實例存在於PCT公開案第WO 1999/16873號中。
阿菲林分子為小型非免疫球蛋白蛋白質，其經設計而對蛋白質及小分子具特異性親和力。新阿菲林分子可極快速地選自兩個文庫，各文庫均基於不同的人類源骨架蛋白。阿菲林分子對免疫球蛋白蛋白質不顯示任何結構同源性。目前使用兩種阿菲林骨架，其一為γ結晶體(人類結構性眼晶狀體蛋白質)，且另一者為「泛素」超家族蛋白質。兩種人類骨架均極小，顯示高溫穩定性且對pH值變化及變性劑幾乎具有抗性。此高穩定性主要歸因於蛋白質之β片結構擴大。γ結晶體源蛋白質之實例描述於WO200104144中且「泛素樣」蛋白質之實例描述於WO2004106368中。
蛋白質抗原決定基模擬物(PEM)為模擬蛋白質之β髮夾二級結構(涉及蛋白質-蛋白質相互作用的主要二級結構)的中型、環狀、肽樣分子(MW 1-2kDa)。
本發明提供特異性結合至ANGPTL4蛋白質之完全人類抗體。相較於嵌合或人類化抗體，當投與人類個體時，本發明之人類ANGPTL4結合抗體之抗原性進一步減小。
駱駝科抗體
自駱駝及單峰駝(雙峰駱駝(Camelus bactrianus)及單峰駱駝(Calelus dromaderius))家族成員(包括新世界成員，諸如駱馬物種(羊駝(Lama paccos)、大羊駝(Lama glama)及瘦駝(Lama vicugna))獲得之抗體蛋白已在尺寸、結構複雜性及對人類個體之抗原性方面加以表徵。如自然界中所發現之來自此哺乳動物家族之某些IgG抗體缺少輕鏈，且因此在結構上不同於其他動物抗體之具有兩條重鏈及兩條輕鏈之典型四鏈四級結構。參見PCT/EP93/02214(1994年3月3日公開之WO 94/04678)。
駱駝科抗體之鑑別為VHH之區域(小型單一可變域)可藉由遺傳工程改造來獲得，以產生對標靶具有高親和力之小型蛋白質，從而產生低分子量抗體源蛋白質，稱為「駱駝科奈米抗體」。參見美國專利1998年6月2日頒予的第5,759,808號；亦參見Stijlemans,B.等人，2004 J Biol Chem 279：1256-1261；Dumoulin,M.等人，2003 Nature 424：783-788；Pleschberger,M.等人，2003 Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo,V.等人，2002 Int J Cancer 89：456-62；及Lauwereys,M.等人，1998 EMBO J 17：3512-3520。經工程改造之駱駝科抗體及抗體片段之文庫可購自例如Ablynx,Ghent,Belgium。如同非人類來源之其他抗體，駱駝科抗體之胺基酸序列可重組改變以得到與人類序列更密切類似之序列，亦即，奈米抗體可經「人類化」。從而可進一步減 小駱駝科抗體對人類之天然低抗原性。
駱駝科奈米抗體之分子量為人類IgG分子之約十分之一，且蛋白質之實體直徑僅為幾奈米。小尺寸之一種結果為駱駝科奈米抗體結合能夠結合至較大抗體蛋白質在功能上不可見的抗原位點，亦即，駱駝科奈米抗體適用作偵測抗原之試劑(否則使用經典免疫技術，抗原會隱匿)，及可能之治療劑。因此，小尺寸之又一結果為駱駝科奈米抗體由於結合至靶蛋白之凹槽或窄隙中之特定位點而可具抑制作用，且因此相較於經典抗體之功能，可以更緊密類似於經典低分子量藥物之功能的能力來發揮作用。
低分子量及緊湊尺寸進一步使駱駝科奈米抗體具有極大的熱穩定性(對極端pH值及蛋白水解消化具有穩定性)，及弱抗原性。另一結果為駱駝科奈米抗體容易自循環系統移至組織中，且甚至跨過血腦障壁且可治療影響神經組織之病症。奈米抗體可進一步促進藥物傳輸跨過血腦障壁。參見2004年8月19日公開之美國專利申請案20040161738。此等特徵與對人類之低抗原性組合指示巨大治療潛力。另外，此等分子可充分表現於諸如大腸桿菌之原核細胞中，且以與噬菌體形成之融合蛋白形式表現且具功能性。
因此，本發明之一個特徵為對ANGPTL4具有高親和力之駱駝科抗體或奈米抗體。在本文之某些實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體在駱駝科動物中天然產生，亦即，駱駝科動物使用本文針對其他抗體所述之技術經ANGPTL4或其肽片段免疫接種之後而產生。或者，對結合ANGPTL4的駱駝科奈米抗體進行工程改造，亦即以ANGPTL4作為標靶，使用淘選程序，自例如呈現經適當誘變之駱駝科奈米抗體蛋白質之噬菌體文庫中選擇而產生。經工程改造之奈米抗體可進一步藉由遺傳工程改造定製以使其在受者個體中之半衰期為45分鐘至2週。在一個特定實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體係藉由將本發明之人類抗 體之重鏈或輕鏈之CDR序列移植至奈米抗體或單域抗體構架序列中來獲得，如PCT/EP93/02214中之實例所述。
雙特異性分子及多價抗體
在另一態樣中，本發明提供包含本發明之ANGPTL4結合抗體或其片段之雙特異性或多特異性分子。本發明之抗體或其抗原結合區可衍生化或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如受體之另一抗體或配位體)，以產生結合至至少兩個不同結合位點或靶分子之雙特異性分子。本發明之抗體實際上可衍生化或連接至超過一種其他功能分子以產生結合至超過兩個不同結合位點及/或靶分子之多特異性分子；如本文所用之術語「雙特異性分子」亦意欲涵蓋此類多特異性分子。為了產生本發明之雙特異性分子，本發明之抗體可在功能上與一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬劑)連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價結合或以其他方式連接)，從而產生雙特異性分子。
因此，本發明包括包含至少一種針對ANGPTL4之第一結合特異性及針對第二標靶抗原決定基之第二結合特異性的雙特異性分子。舉例而言，第二標靶抗原決定基為ANGPTL4之另一抗原決定基，其不同於第一標靶抗原決定基。
另外，就本發明中雙特異性分子具多特異性而言，除第一及第二標靶抗原決定基之外，分子可進一步包括第三結合特異性。
在一個實施例中，本發明之雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv)作為結合特異性。抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，諸如Fv或單鏈構築體，如Ladner等人之美國專利第4,946,778號中所述。
雙功能抗體為二價雙特異性分子，其中VH及VL域在單多肽鏈上表現，其由過短而不容許同一鏈上之兩個域之間配對的連接子連接。 VH及VL域與另一鏈之互補域配對，從而產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak等人，1994 Structure 2：1121-1123)。雙功能抗體可藉由在同一細胞內表現具有結構VHA-VLB及VHB-VLA(VH-VL組態)或VLA-VHB及VLB-VHA(VL-VH組態)之兩個多肽鏈來產生。其中大多數可在細菌中以可溶形式表現。單鏈雙功能抗體(scDb)係藉由約15個胺基酸殘基之連接子連接兩個形成雙功能抗體的多肽鏈來產生(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(3-4)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology,2(1)：21-36)。scDb可以可溶性、活性單體形式表現於細菌中(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol. Immunother.,45(34)：128-30；Wu等人，1996Immunotechnology,2(1)：21-36；Pluckthun及Pack,1997 Immunotechnology,3(2)：83-105；Ridgway等人，1996 Protein Eng.,9(7)：617-21)。雙功能抗體可與Fc融合而產生「二-雙功能抗體」(參見Lu等人，2004 J.Biol.Chem.,279(4)：2856-65)。
可用於本發明之雙特異性分子中之其他抗體為鼠類、嵌合及人類化單株抗體。
雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法使組成性結合特異性結合來製備。舉例而言，雙特異性分子之各結合特異性可分別產生，且接著彼此結合。當結合特異性為蛋白質或肽時，可使用多種偶合劑或交聯劑進行共價結合。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及磺基丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)(參見例如Karpovsky等人，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu,MA等人，1985 Proc. Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括以下文獻中所述之方法：Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等人，1985 Science 229：81-83)，及Glennie等人，1987 J.Immunol.139：2367-2375)。結合劑為SATA及磺基-SMCC，其均購自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
當結合特異性為抗體時，其可藉由兩條重鏈之C末端鉸鏈區之硫氫基鍵結來結合。在一個特定實施例中，在結合之前，鉸鏈區經修飾以含有奇數個硫氫基殘基，例如1個。
或者，兩種結合特異性可在同一載體中編碼，且在同一宿主細胞中表現及組裝。在雙特異性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配位體×Fab融合蛋白的情況下，此方法特別適用。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子之單鏈分子，或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性分子之方法描述於例如美國專利5,260,203號、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881,175號、美國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第5,258,498號及美國專利第5,482,858號中。
雙特異性分子與其特異性標靶之結合可藉由例如酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(REA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析來確認。此等分析中之每一者通常藉由使用經標記之試劑(例如抗體)來偵測備受關注之蛋白質-抗體複合物的存在，該經標記之試劑對所關注之該複合物具特異性。
在另一態樣中，本發明提供包含結合至ANGPTL4之本發明抗體之至少兩個相同或不同抗原結合部分的多價化合物。抗原結合部分可經由蛋白質融合或共價或非共價鍵連接在一起。或者，已描述雙特異 性分子之鍵聯方法。四價化合物可例如藉由本發明抗體與結合至本發明抗體之恆定區(例如Fc或鉸鏈區)之抗體形成的交聯抗體獲得。
三聚域描述於例如Borean專利EP 1 012 280B1中。五聚模組描述於例如PCT/EP97/05897中。
半衰期延長之抗體
本發明提供特異性結合至ANGPTL4蛋白質、活體內半衰期延長之抗體。
許多因素可影響蛋白質之活體內半衰期。舉例而言，腎臟過濾、肝中代謝、藉由蛋白水解酶(蛋白酶)降解及免疫原性反應(例如蛋白質被抗體中和及被巨噬細胞及樹突狀細胞吸收)。多種策略可用於延長本發明抗體之半衰期。舉例而言，藉由化學連接至聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗體骨架、聚唾液酸(PSA)、羥乙基澱粉(HES)、結合白蛋白之配位體及碳水化合物遮蔽物；藉由與結合至血清蛋白質之蛋白質(諸如白蛋白、IgG、FcRn)遺傳融合且轉移；藉由與結合至血清蛋白質之其他結合部分(諸如奈米抗體、Fab、DARPin、高親和性多聚體、親和抗體及抗運載蛋白)偶合(遺傳方式或化學方式)；藉由與rPEG、白蛋白、白蛋白域、白蛋白結合蛋白及Fc遺傳融合；或藉由併入奈米載體、緩釋調配物或醫學裝置中。
為了延長活體內抗體之血清循環，諸如高分子量PEG之惰性聚合物分子可經由PEG與抗體之N末端或C末端之位點特異性結合或經由存在於離胺酸殘基上之ε胺基、使用或不使用多官能性連接子連接至抗體或其片段。為使抗體發生聚乙二醇化，典型地使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在其中使一或多個PEG基團連接至抗體或抗體片段的條件下反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶聚合物)之醯化反應或烷化反應來進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋 白質之任一種PEG形式，諸如單(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為去糖基化抗體。將使用使生物活性損失降至最小之線性或分支鏈聚合物衍生化。結合度可藉由SDS-PAGE及質譜密切監測以確保PEG分子與抗體之適當結合。未反應之PEG可藉由尺寸排阻或藉由離子交換層析而與抗體-PEG結合物分離。可使用熟習此項技術者熟知的方法(例如本文所述之免疫分析)測試PEG衍生化抗體的結合活性以及活體內功效。蛋白質聚乙二醇化方法在此項技術中已知且可應用於本發明之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
其他經修改之聚乙二醇化技術包括再建化學正交導引工程改造技術(ReCODE PEG)，其經由包括tRNA合成酶及tRNA之再建系統將化學上特定的側鏈併入生物合成蛋白質中。此技術能夠將超過30種新胺基酸併入生物大腸桿菌、酵母及哺乳動物細胞之合成蛋白質中。tRNA將非原生胺基酸併入琥珀密碼子所定位之任何位置，從而將琥珀密碼子自終止密碼子轉換為傳遞化學上特定胺基酸之合併信號的密碼子。
重組聚乙二醇化技術(rPEG)亦可用於延長血清半衰期。此技術包括以遺傳方式將300至600個胺基酸非結構化蛋白質尾與現有醫藥蛋白質融合。由於此類非結構化蛋白質鏈之表觀分子量比其實際分子量大約15倍，因此蛋白質之血清半衰期大大延長。與需要化學結合及再純化之傳統聚乙二醇化相比，此製造方法大大簡化且產物為均質的。
另一技術為聚唾液酸化，其使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)延長有效壽命且改良治療肽及蛋白質之穩定性。PSA為唾液酸聚合物(一種糖)。當用於遞送蛋白質及治療肽藥物時，聚唾液酸為結合提供保護性微環境。此提高治療性蛋白質在循環中之有效壽命且防止其被免 疫系統識別。PSA聚合物天然地發現於人體中。進化逾數百萬年之某些細菌採用PSA聚合物覆蓋其壁。此等天然聚唾液酸化細菌接著能夠憑藉分子擬態來阻擋人體防禦系統。此類細菌中可容易產生大量的具有預定物理特徵之PSA(天然之終極隱匿技術)。由於細菌PSA與人體中之PSA在化學上相同，因此細菌PSA完全不具免疫原性，即使與蛋白質偶合。
另一技術包括使用連接至抗體之羥乙基澱粉(「HES」)衍生物。HES為源於糯性玉米澱粉之經修飾之天然聚合物，且可藉由人體之酶代謝。通常投與HES溶液以取代血容量不足及改良血液之流變特性。抗體之羥乙基澱粉化能夠藉由提高分子穩定性以及藉由減小腎清除率而延長循環半衰期，從而提高生物活性。藉由改變不同參數，諸如HES分子量，可定製廣泛範圍之HES抗體結合物。
亦可藉由將一或多個胺基酸修飾(亦即取代、插入或缺失)引入IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈Fc域片段)中來產生活體內半衰期延長的抗體。參見例如國際公開案第WO 98/23289號；國際公開案第WO 97/34631號；及美國專利第6,277,375號。
另外，抗體可與白蛋白(例如人類血清白蛋白；HSA)結合以便使得抗體或抗體片段在活體內更穩定或在活體內具有較長半衰期。該等技術為此項技術中所熟知，參見例如國際公開案第WO 93/15199號、第WO 93/15200號及第WO 01/77137號，及歐洲專利第EP 413,622號。另外，在如上所述之雙特異性抗體之情況下，抗體之特異性可經設計以使得抗體之一個結合域結合至ANGPTL4，而抗體之第二結合域結合至血清白蛋白(較佳為HSA)。
延長半衰期之策略尤其適用於奈米抗體、基於纖維結合蛋白之結合子及需要延長活體內半衰期之其他抗體或蛋白質。
抗體結合物
本發明提供特異性結合至ANGPTL4蛋白質之抗體或其片段，其與異源蛋白質或多肽(或其片段，較佳至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸之多肽)以重組方式融合或以化學方式結合(包括共價與非共價結合)而產生融合蛋白。特定言之，本發明提供融合蛋白，其包含本文所述抗體之抗原結合片段(例如Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)及異源蛋白質、多肽或肽。使蛋白質、多肽或肽與抗體或抗體片段融合或結合之方法在此項技術中已知。參見例如美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號及第5,112,946號；歐洲專利第EP 307,434號及第EP 367,166號；國際公開案第WO 96/04388號及第WO 91/06570號；Ashkenazi等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539；Zheng等人，1995,J.Immunol.154：5590-5600；及Vil等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341。
其他融合蛋白可經由基因改組、基元改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)技術產生。DNA改組可用於改變本發明抗體或其片段之活性(例如具有較高親和力及較低解離速率的抗體或其片段)。一般參見美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；Patten等人，1997,Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等人，1999,J.Mol.Biol.287：265-76；及Lorenzo及Blasco,1998,Biotechniques 24(2)：308-313(此等專利及公開案各以全文引用的方式併入本文中)。抗體或其片段，或所編碼之抗體或其片段在重組之前可如下改變：藉由易錯PCR進行隨機突變誘發、隨機核苷酸插入或其他方法。編碼特異性結合至ANGPTL4蛋白質之抗體 或其片段的聚核苷酸可與一或多種異源分子之一或多種組分、基元、區段、部分、域、片段等重組。
另外，抗體或其片段可與諸如肽之標記序列融合以促進純化。在較佳實施例中，標記胺基酸序列為六組胺酸肽，尤其諸如pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)中所提供之標記，其中許多可市購。如Gentz等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，例如六組胺酸為融合蛋白之純化提供方便。適用於純化之其他肽標記包括(但不限於)紅血球凝集素(「HA」)標記，其對應於源於流感紅血球凝集素蛋白質之抗原決定基(Wilson等人，1984,Cell 37：767)；及「flag」標記。
在其他實施例中，本發明之抗體或其片段與診斷劑或偵測劑結合。作為臨床測試程序之一部分，此類抗體可適用於監測或預後疾病或病症之發作、發展、進展及/或嚴重程度，諸如測定特定療法之功效。此類診斷及偵測可藉由使抗體與可偵測物質偶合來實現，可偵測物質包括(但不限於)不同酶，諸如(但不限於)辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如(但不限於)抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；螢光物質，諸如(但不限於)傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、二甲胺基磺萘醯氯或藻紅素；發光物質，諸如(但不限於)魯米諾(魯米諾)；生物發光物質，諸如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母素；放射性物質，諸如(但不限於)碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In及111In)、鎝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、 51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin；及使用各種正電子發射斷層攝影之正電子發光金屬，及非放射性順磁金屬離子。
本發明進一步涵蓋與治療部分結合之抗體或其片段之用途。抗體或其片段可與治療部分(諸如細胞毒素，例如細胞抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α-發射體)結合。細胞毒素或細胞毒性劑包括損害細胞之任何藥劑。
另外，抗體或其片段可與調節所指定生物反應的治療部分或藥物部分結合。治療部分或藥物部分不應解釋為限於經典化學治療劑。舉例而言，藥物部分可為具有所要生物活性之蛋白質、肽或多肽。此類蛋白質可包括例如毒素，諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如腫瘤壞死因子、α干擾素、β干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化因子；細胞凋亡劑；抗血管生成劑；或生物反應調節劑，諸如淋巴激素。
此外，抗體可與以下結合：治療部分，諸如放射性金屬離子，諸如α-發射體，諸如213Bi；或適用於放射金屬離子(包括(但不限於)131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)與多肽之結合的巨環螯合劑。在某些實施例中，巨環螯合劑為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸(DOTA)，其可經由連接子分子連接至抗體。此類連接子分子在此項技術中通常已知且描述於Denardo等人，1998,Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等人，1999,Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；及Zimmerman等人，1999,Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，各以全文引用的方式併入本文中。
使治療部分與抗體結合的技術已熟知，參見例如Arnon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」，於Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等 人(編)，第243-56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」，於Controlled Drug Delivery(第2版)；Robinson等人(編)，第623-53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」，於Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編)，第475-506頁(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」，於Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編)，第303-16頁(Academic Press 1985)；及Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.62：119-58。
抗體亦可連接至固體載體，其特別適用於靶抗原之免疫分析或純化。此類固體載體包括(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
製造本發明抗體之方法 編碼抗體之核酸
本發明提供經實質上純化之核酸分子，其編碼包含上述ANGPTL4結合抗體鏈之片段或域的多肽。本發明之一些核酸包含編碼SEQ ID NO：13、38、58、78、98、118或138中所示之重鏈可變區的核苷酸序列及/或編碼SEQ ID NO：23、48、68、88、108、128或148中所示之輕鏈可變區的核苷酸序列。在一特定實施例中，核酸分子為表1中所鑑別之核酸分子。本發明之一些其他核酸分子包含與表1中所鑑別之核酸分子之核苷酸序列實質上一致(例如至少65%、80%、95%或99%)的核苷酸序列。當由適當表現載體表現時，由此等聚核苷酸編碼的多肽能夠展現ANGPTL4抗原結合能力。
本發明中亦提供編碼來自上述ANGPTL4結合抗體重鏈或輕鏈之 至少一個CDR區域且通常所有三個CDR區域的聚核苷酸。一些其他聚核苷酸編碼上述ANGPTL4結合抗體之重鏈及/或輕鏈之所有或實質上所有可變區序列。由於密碼簡併，因此多個核酸序列將編碼免疫球蛋白胺基酸序列中之每一者。
本發明之核酸分子可編碼抗體之可變區與恆定區。本發明之一些核酸序列包含編碼與SEQ ID NO：15、28、40、60、80、100、120及140中所列之重鏈序列實質上一致(例如至少80%、90%或99%)之重鏈序列的核苷酸。一些其他核酸序列包含編碼與SEQ ID NO：25、50、70、90、110、130及150中所列之輕鏈序列實質上一致(例如至少80%、90%或99%)之輕鏈序列的核苷酸。
聚核苷酸序列可藉由重新固相DNA合成或藉由編碼ANGPTL4結合抗體或其結合片段之現有序列(例如如下文實例中所述之序列)之PCR突變誘發來產生。核酸之直接化學合成可藉由此項技術中已知之方法實現，諸如Narang等人，1979,Meth.Enzymol.68：90之磷酸三酯法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109,1979之磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22：1859,1981之胺基磷酸二乙酯法；及美國專利第4,458,066號之固體載體法。藉由PCR向聚核苷酸序列引入突變可如以下文獻中所述進行：例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編),Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編)，Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991。
本發明亦提供產生上述ANGPTL4結合抗體之表現載體及宿主細胞。不同表現載體可用於表現編碼ANGPTL4結合抗體鏈或結合片段之聚核苷酸。基於病毒之表現載體與非病毒表現載體均可用於在哺乳 動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體及系統包括質體、游離型載體，其典型地具有用於表現蛋白質或RNA及人類人工染色體的表現卡匣(參見例如Harrington等人，Nat Genet 15：345,1997)。舉例而言，適用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現ANGPTL4結合聚核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、B及C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B及C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV載體及此項技術中已知用於表現其他蛋白質之許多其他載體。適用的病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒之載體；基於SV40、乳頭狀瘤病毒、HBP埃-巴二氏病毒(HBP Epstein Barr virus)、牛痘病毒載體及勝利基森林病毒(Semliki Forest virus；SFV)之載體。參見Brent等人，同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49：807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。
表現載體之選擇視欲表現載體之預定宿主細胞而定。典型地，表現載體含有啟動子及可操作地連接於編碼ANGPTL4結合抗體鏈或片段之聚核苷酸的其他調節序列(例如增強子)。在一些實施例中，誘導性啟動子用於防止所插入之序列表現，在誘導條件下除外。誘導性啟動子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱休克啟動子。經轉形之生物體培養物可在使群體不偏向表現產物被宿主細胞良好耐受的非誘導條件下擴增。除啟動子之外，其他調節元件亦可為ANGPTL4結合抗體鏈或片段之有效表現所必需或需要的。此等元件典型地包括ATG起始密碼子及相鄰的核糖體結合位點或其他序列。另外，表現效率可藉由包括適於所用細胞系統之增強子來增強(參見例如Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125,1994；及Bittner等人，Meth.Enzymol.,153：516,1987)。舉例而言，SV40增強子或CMV增強子可用於增強哺乳動物宿主細胞中之表現。
表現載體亦可提供分泌信號序列位置以與由所插入之ANGPTL4 結合抗體序列編碼之多肽形成融合蛋白。更通常，所插入之ANGPTL4結合抗體序列在包含於載體中之前連接至與信號序列。待用於接收編碼ANGPTL4結合抗體輕鏈及重鏈可變域之序列的載體有時亦編碼恆定區或其一部分。此類載體允許可變區以與恆定區形成之融合蛋白形式表現，從而產生完整抗體或其片段。典型地，此類恆定區為人類恆定區。
含有及表現ANGPTL4結合抗體鏈之宿主細胞可為原核或真核細胞。大腸桿菌為一種適用於選殖及表現本發明聚核苷酸之原核宿主。適用之其他微生物宿主包括桿菌(諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis))，及其他腸內菌科(諸如沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia))，及多種假單胞菌種。在此等原核宿主中，亦可產生表現載體，其典型地含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)。另外，將存在任何數目之多種熟知啟動子，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trP)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子典型地控制表現(視情況與操縱序列一起控制表現)，且具有用於起始且完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及其類似序列。諸如酵母之其他微生物亦可用於表現本發明之ANGPTL4結合多肽。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體之組合。
在一些較佳實施例中，哺乳動物宿主細胞用於表現及產生本發明之ANGPTL4結合多肽。舉例而言，其可為表現內源免疫球蛋白基因之融合瘤細胞株(例如如實例中所述之1D6.C9骨髓瘤融合瘤純系)或含有外源表現載體之哺乳動物細胞株(例如下文舉例說明之SP2/0骨髓瘤細胞)。此等細胞包括任何正常死亡或正常或異常永生動物或人類細胞。舉例而言，已開發出能夠分泌完整免疫球蛋白之多種適合宿主細胞株，包括CHO細胞株、各種Cos細胞株、海拉細胞(HeLa cells)、骨髓瘤細胞株、經轉形之B細胞及融合瘤。哺乳動物組織細胞培養物 用於表現多肽之用途一般性論述於例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子及增強子(參見例如Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68,1986)，及必需的處理資訊位點(諸如核糖體結合位點、RNA拼接位點、聚腺苷酸化位點，及轉錄終止子序列)。此等表現載體通常含有源於源於哺乳動物基因或源於哺乳動物病毒之啟動子。適合啟動子可為組成性、細胞類型特異性、階段特異性及/或可調節或可調控的。適用啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成性腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松(dexamethasone)誘導性MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成性MPSV啟動子、四環素(tetracycline)誘導性CMV啟動子(諸如人類即刻早期CMV啟動子)、組成性CMV啟動子及此項技術中已知之啟動子-增強子組合。
引入含有所關注之聚核苷酸序列之表現載體的方法視細胞宿主之類型而變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。(一般參見Sambrook等人，同上)。其他方法包括例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導轉形、注射及顯微注射、衝擊法、病毒顆粒(virosome)、免疫脂質體、聚陽離子：核酸結合物、裸DNA、人工病毒粒子、與疱疹病毒結構蛋白VP22融合(Elliot及O'Hare,Cell 88：223,1997)、DNA之藥劑增強性吸收，及離體轉導。就長期高產率生產重組蛋白質而言，通常需要穩定的表現。舉例而言，穩定表現ANGPTL4結合抗體鏈或結合片段之細胞株可使用本發明之表現載體製備，本發明之表現載體含有病毒複製起點或內源性表現元件及可選標記基因。在引入載體之後，可允許細胞在豐富培養基中生長1-2天，隨後將豐富培養基與選擇性培養基交換。可選標記之目的為賦予選擇耐藥性，且其存在允許成功表現所引入序 列的細胞在選擇性培養基中生長。經穩定轉染之耐藥性細胞可使用適合於該細胞類型之組織培養技術增殖。
產生本發明之單株抗體
單株抗體(mAb)可藉由多種技術產生，包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,1975 Nature 256：495之標準體細胞雜交技術。產生單株抗體之許多技術可採用例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉形。
製備融合瘤之動物系統包括鼠類、大鼠及兔系統。小鼠中之融合瘤產生為沿用已久的程序。分離經免疫之脾細胞用於融合之免疫接種及技術為此項技術中已知。融合搭配物(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序亦已知。
本發明之嵌合或人類化抗體可基於如上所述製備之鼠類單株抗體之序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可使用標準分子生物學技術獲自所關注之鼠類融合瘤且經工程化以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。舉例而言，為產生嵌合抗體，可使用此項技術中已知的方法使鼠類可變區與人類恆定區連接(參見例如Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人類化抗體，可使用此項技術中已知之方法將鼠類CDR區插入人類構架中。參見例如Winter之美國專利第5225539號及Queen等人之美國專利第5530101號、第5585089號、第5693762號及第6180370號。
在某一實施例中，本發明之抗體為人類化抗體。此類針對ANGPTL4之人類化抗體可使用攜有人類免疫系統之一部分而非小鼠系統的轉殖基因或轉染色體小鼠來產生。此等轉殖基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠且在本文中統稱為「人類Ig小鼠」之小鼠。
HuMAb小鼠®(Medarex,Inc.)含有編碼未重排人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列的人類免疫球蛋白基因微型基因座；以及不活化 內源性μ及κ鏈基因座的靶向突變(參見例如Lonberg等人，1994 Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠展現降低之小鼠IgM或κ表現，且作為對免疫接種的反應，所引入的人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換及體細胞突變而產生高親和性單株人類IgGκ(Lonberg,N.等人，1994，同上；回顧於Lonberg,N.,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg,N.及Huszar,D.,1995 Intern.Rev.Immunol.13：65-93；及Harding,F.及Lonberg,N.,1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb小鼠之製備及用途以及此類小鼠所攜帶的基因組修飾進一步描述於Taylor,L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen,J.等人，1993 International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人.,1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等人，1993 Nature Genetics 4：117-123；Chen,J.等人，1993 EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，1994 J.Immunol.152：2912-2920；Taylor,L.等人，1994 International Immunology 579-591；及Fishwild,D.等人，1996 Nature Biotechnology 14：845-851，該等所有文獻之內容以全文引用之方式特此併入本文中。此外參見美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號(皆頒予Lonberg及Kay)；美國專利第5,545,807號(頒予Surani等人)；PCT公開案第WO 92103918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97113852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號(皆頒予Lonberg及Kay)；及PCT公開案第WO 01/14424號(頒予Korman等人)。
在另一實施例中，本發明之人類抗體可使用在轉殖基因及轉染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠(諸如攜帶人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠)來產生。此類小鼠(在本文中稱為「KM 小鼠」)詳細描述於Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
再者，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉殖基因動物系統可在此項技術中獲得，且可用於產生本發明之ANGPTL4結合抗體。舉例而言，可使用稱作Xenomouse(Abgenix,Inc.)之替代轉殖基因系統。此類小鼠描述於例如美國專利第5,939,598號、第6,075,181號、第6,114,598號、第6,150,584號及第6,162,963號(頒予Kucherlapati等人)中。
另外，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉染色體動物系統可在此項技術中獲得，且可用於產生本發明之ANGPTL4結合抗體。舉例而言，可使用攜帶人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體之小鼠，稱作「TC小鼠」；此類小鼠描述於Tomizuka等人，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，攜帶人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛在此項技術中已描述(Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20：889-894)，且可用於產生本發明之ANGPTL4結合抗體。
本發明之人類化抗體亦可使用篩選人類免疫球蛋白基因之噬菌體呈現方法來製備。分離人類抗體之此類噬菌體呈現方法在此項技術中已確立或描述於下文實例中。參見例如：Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698號；Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；及Griffiths等人之美國專利第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號及第6,593,081號。
本發明之人類化抗體亦可使用人類免疫細胞已重建於其中以使得免疫接種時可產生人類抗體反應之SCID小鼠來製備。此類小鼠描述於例如Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
構架或Fc工程改造
經工程改造之本發明抗體包括其中VH及/或VL內之構架殘基已進行修飾(以改良抗體特性)的抗體。典型地進行此類構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法為使一或多個構架殘基「回復突變」成相應生殖系序列。更特定言之，已經歷體細胞突變之抗體可含有不同於抗體所來源之生殖系序列的構架殘基。此類殘基可藉由比較抗體構架序列與抗體所來源之生殖系序列來鑑別。為了使構架區序列恢復其生殖系組態，體細胞突變可藉由例如定點突變誘發「回復突變」為生殖系序列。本發明亦意欲涵蓋此類「回復突變」抗體。
構架修飾之另一類型包括使構架區內或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
除構架或CDR區內所作之修飾之外或可替代地，本發明之抗體可經工程改造以包括Fc區內之修飾，典型地以改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如可使一或多個化學部分連接至抗體)，或經修飾以改變其糖基化，再改變抗體之一個多種功能特性。此等實施例各進一步詳細描述於下文中。Fc區中之殘基編號為Kabat EU索引編號。
在一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數目改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。CH1鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數經改變以例如促進輕鏈及重鏈之組裝或提高或降低抗體之穩定性。
在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以減少抗體之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區以使得抗體對葡萄球菌蛋白A(SpA)的結合相對於原生 Fc鉸鏈域SpA結合減弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在另一實施例中，抗體經修飾以延長其生物半衰期。可執行多種方法。舉例而言，可引入以下突變中之一或多者：T252L、T254S、T256F，如Ward之美國專利第6,277,375號中所述。或者，為了延長生物半衰期，抗體可在CH1或CL區內改變以含有獲自IgG之Fc區之CH2域之兩個環的救助受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述。
在其他實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變，以改變抗體之效應功能。舉例而言，一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換以使得該抗體具有改變之針對效應子配位體的親和力、但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應子配位體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第號5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實施例中，選自胺基酸殘基之一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，以使得抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實施例中，一或多個胺基酸殘基經改變以藉此改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在又另一個實施例中，Fc區藉由一或多個胺基酸之修飾而經修飾以提高抗體介導抗體依賴性細胞之細胞毒性(ADCC)之能力及/或提高抗體對Fcγ受體之親和力。此方法進一步描述於Presta之PCT公開案WO 00/42072中。此外，人類IgG1上之針對FcγRl、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點已定位，且已描述結合改良之變異體(參見Shields, R.L.等人，2001 J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
在再另一個實施例中，抗體之糖基化經修改。舉例而言，可產生去糖基化抗體(亦即，缺乏糖基化之抗體)。糖基化可經改變以例如提高抗體對「抗原」之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來實現。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，從而排除一或多個可變區構架糖基化位點，以藉此消除該位點之糖基化。此類去糖基化可提高抗體對抗原之親和力。此方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
另外地或可替代地，可產生糖基化類型改變之抗體，諸如海藻糖基殘基量減少之低海藻糖基化抗體或二分GlcNac結構增加之抗體。此類經改變之糖基化模式已證明會提高抗體之ADCC能力。此類碳水化合物修飾可藉由例如在糖基化機制改變之宿主細胞中表現抗體來實現。糖基化機制改變之細胞在此項技術中已有描述且可用作表現本發明之重組抗體以藉此產生糖基化改變之抗體的宿主細胞。舉例而言，Hang等人之EP 1,176,195描述一種細胞株，其中編碼海藻糖基轉移酶之FUT8基因在功能上中斷，使得此細胞株中所表現之抗體展現低海藻糖基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述一種變異型CHO細胞株Lecl3細胞，其使海藻糖連接至Asn(297)所連碳水化合物之能力降低，亦導致該宿主細胞中所表現之抗體發生低海藻糖基化(亦參見Shields,R.L.等人，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述其經工程改造以表現醣蛋白修飾型醣基轉移酶(例如β(1,4)-N乙醯基葡糖胺轉移酶III(GnTIII))的細胞株，使得經工程改造之細胞株內所表現之抗體展現增加之二分GlcNac結構，從而提高抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人，1999 Nat.Biotech.17：176-180)。
所改變之抗體工程改造方法
如上文所論述，藉由修飾全長重鏈及/或輕鏈序列、VH及/或VL序列或其所連接之恆定區，本文所示之具有VH及VL序列或全長重鏈或輕鏈的ANGPTL4結合抗體可用於產生新的ANGPTL4結合抗體。因此，在本發明之另一態樣中，本發明之ANGPTL4結合抗體之結構特徵用於產生結構上相關之ANGPTL4結合抗體，其保留本發明抗體之至少一種功能特性，諸如結合至人類ANGPTL4且亦抑制ANGPTL4之一或多種功能特性(例如抑制ANGPTL4結合ANGPTL4受體、抑制ANGPTL4依賴性細胞增殖)。
舉例而言，本發明抗體之一或多個CDR區或其突變可與已知構架區及/或其他CDR重組組合以產生本發明之以重組方式經工程改造之其他ANGPTL4結合抗體，如上文所論述。其他修飾類型包括先前章節中所述之修飾。用於工程改造方法之起始物質為本文中所提供之VH及/或VL序列中之一或多者，或其一或多個CDR區。為產生經工程改造之抗體，不必實際上製備(亦即以蛋白質形式表現)具有本文所提供之VH及/或VL序列中之一或多者或其一或多個CDR區的抗體。實情為，序列中所含之資訊用作起始物質以產生來源於初始序列之「第二代」序列，接著「第二代」序列以蛋白質形式製備且表現。
因此，在另一個實施例中，本發明提供一種製備ANGPTL4結合抗體的方法，該抗體由重鏈可變區抗體序列及輕鏈可變區抗體序列組成，該重鏈可變區抗體序列具有選自由SEQ ID NO：7、32、52、72、92、112及132組成之群的CDR1序列、選自由SEQ ID NO：8、33、53、73、93、113及133組成之群的CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：9、34、54、74、94、114及134組成之群的CDR3序列，該輕鏈可變區抗體序列具有選自由SEQ ID NO：17、42、62、82、102、122及142組成之群的CDR1序列、選自由SEQ ID NO：18、43、63、83、103、123 及143組成之群的CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：19、44、64、84、104、124及144組成之群的CDR3序列；改變該重鏈可變區抗體序列及/或該輕鏈可變區抗體序列內之至少一個胺基酸殘基以產生至少一個所改變之抗體序列；及使該所改變之抗體序列以蛋白質形式表現。
因此，在另一個實施例中，本發明提供一種製備ANGPTL4結合抗體的方法，該抗體由重鏈可變區抗體序列及輕鏈可變區抗體序列組成，該重鏈可變區抗體序列具有選自由SEQ ID NO：10、35、55、75、95、115及135組成之群的CDR1序列、選自由SEQ ID NO：11、36、56、76、96、116及136組成之群的CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：12、37、57、77、97、117及137組成之群的CDR3序列，該輕鏈可變區抗體序列具有選自由SEQ ID NO：20、45、65、85、105、125及145組成之群的CDR1序列、選自由SEQ ID NO：21、46、66、86、106、126及146組成之群的CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：22、47、67、87、107、127及147組成之群的CDR3序列；改變該重鏈可變區抗體序列及/或該輕鏈可變區抗體序列內之至少一個胺基酸殘基以產生至少一個所改變之抗體序列；及使該所改變之抗體序列以蛋白質形式表現。
因此，在另一實施例中，本發明提供一種製備ANGPTL4結合抗體的方法，該抗體根據在哺乳動物細胞中之表現加以最佳化且由以下組成：具有選自SEQ ID NO：15、28、40、60、80、100、120及140之群之序列的全長重鏈抗體序列；及具有選自SEQ ID NO：25、50、70、90、110、130及150之群之序列的全長輕鏈抗體序列；改變該全長重鏈抗體序列及/或該全長輕鏈抗體序列內之至少一個胺基酸殘基以產生至少一個所改變抗體序列；及使所改變抗體序列以蛋白質形式表現。在一個實施例中，重鏈或輕鏈之改變發生於重鏈或輕鏈之構架 區中。
所改變抗體序列亦可藉由篩選具有固定CDR3序列或最小主要結合決定子的抗體文庫(如US2005/0255552中所述)以及CDR1及CDR2序列之多樣性來製備。篩選可根據適於自抗體文庫篩選抗體之任何篩選技術(諸如噬菌體呈現技術)進行。
標準分子生物學技術可用於製備及表現所改變之抗體序列。由所改變抗體序列編碼之抗體為保持本文所述ANGPTL4結合抗體之一種、一些或所有功能特性之抗體，該等功能特性包括(但不限於)特異性結合至人類、食蟹獼猴、大鼠及/或小鼠ANGPTL4；及在F36E及/或Ba/F3-ANGPTL4R細胞增殖分析中抗體抑制ANGPTL4依賴性細胞增殖。
在本發明抗體工程改造方法的某些實施例中，可循著ANGPTL4結合抗體編碼序列之全部或一部分隨機或選擇性引入突變，且所得經修飾之ANGPTL4結合抗體可根據結合活性及/或其他功能特性加以篩選，如本文所述。突變方法已描述於此項技術中。舉例而言，Short之PCT公開案WO 02/092780描述使用飽和突變誘發、合成連接組裝或其組合來產生及篩選抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679描述使用電腦篩選方法使抗體之物理化學特性最佳化的方法。
在本發明之某些實施例中，抗體已經工程改造以移除去醯胺位點。去醯胺已知可促使肽或蛋白質產生結構及功能變化。去醯胺可引起生物活性降低，以及蛋白質醫藥之藥物動力學及抗原性發生變化。(Anal Chem.2005年3月1日；77(5)：1432-9)。
在本發明之某些實施例中，抗體已經工程改造以提高pI且改良其藥物樣特性。蛋白質之pI為分子之總體生物物理學特性之關鍵決定因素。具有低pI之抗體已知不易溶解、不太穩定且易於聚集。此外，具 有低pI之抗體之純化具挑戰性，且在臨床用途之規模放大期間尤其成問題。提高本發明之抗ANGPTL4抗體或Fab之pI可改良其溶解度，使得抗體能夠在較高濃度(>100mg/ml)下調配。抗體在高濃度(例如>100mg/ml)下調配提供的優點為能夠經由玻璃體內注射向患者眼睛中投與較高劑量抗體，此又能夠降低給藥頻率，此為治療慢性疾病(包括心血管病症)之顯著優點。較高pI亦可增強FcRn介導之IgG型抗體再循環，從而使得藥物能夠在體內保持較長時間，減少必需的注射。最終，抗體之總體穩定性由於引起較長儲存期限的較高pI及活體內生物活性而顯著改良。pI較佳為大於或等於8.2。
經改變之抗體之功能特性可使用此項技術中可獲得及/或本文所述之標準分析(諸如實例中所述之分析(例如ELISA))評估。
預防及治療用途
如本文所述結合ANGPTL4的抗體可在治療上適用的濃度下使用，以便藉由向需要其之個體投與有效量之本發明抗體或抗原結合片段來治療與ANGPTL4含量及/或活性增加相關的疾病或病症。本發明提供一種藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體來治療ANGPTL4相關心血管病症的方法。本發明提供一種藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體來治療ANGPTL4相關心血管病症的方法。
本發明之抗體尤其可用於預防性治療、預防及改善ANGPTL4相關病狀或病症，包括(但不限於)其中ANGPTL4蛋白質含量異常地高且/或尋求降低ANGPTL4蛋白質含量的多種病狀或疾病。此等病狀包括(但不限於)牽涉脂質代謝的病狀，諸如高脂質血症、高脂蛋白血症及血脂異常，包括致動脈粥樣硬化的血脂異常、糖尿病血脂異常、高三酸甘油酯血症(例如重度高三酸甘油酯血症(例如TG>1000mg/dL)、肥胖相關高三酸甘油酯血症及V型高三酸甘油酯血症)、高膽固醇血症、 乳糜微粒血症、混合型血脂異常(肥胖、代謝症候群、糖尿病等)、脂質營養不良、脂萎縮，及以下原因引起的其他病狀：例如LPL活性降低及/或LPL缺乏、LDL受體活性降低及/或LDL受體缺乏、ApoC2改變、ApoE缺乏、ApoB增加、極低密度脂蛋白(VLDL)之產生增加及/或排除減少、某些藥物治療(例如糖皮質激素治療誘發血脂異常)、任何遺傳傾向性、膳食、生活樣式及類似因素。
與高脂質血症、高脂蛋白血症及/或血脂異常相關或由其產生的其他ANGPTL4相關疾病或病症包括(但不限於)心血管疾病或病症，諸如動脈粥樣硬化、動脈瘤、高血壓、絞痛、中風、腦血管疾病、充血性心臟衰竭、冠狀動脈疾病、心肌梗塞、周邊血管疾病及類似疾病；急性胰臟炎；非酒精性脂肝炎(NASH)；血糖病症，諸如糖尿病、肥胖及類似病症。
本發明之抗體亦可與預防、治療或改善ANGPTL4相關病症之其他藥劑組合使用。舉例而言，抑制素療法可與本發明之ANGPTL4抗體及抗原結合片段組合使用以便治療患有三酸甘油酯相關病症之患者。
醫藥組合物
本發明提供醫藥組合物，其包含與醫藥學上可接受之載劑一起調配之ANGPTL4結合抗體(完整或結合片段)。組合物可另外含有適用於治療或預防例如心血管病症之一或多種其他治療劑。醫藥學上可接受之載劑增強或穩定組合物，或可用於促進組合物之製備。醫藥學上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。
本發明之醫藥組合物可藉由此項技術中已知之多種方法投與。投藥途徑及/或模式根據所要結果來變化。投藥較佳為玻璃體內、靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下投藥，或鄰近靶點投與。醫藥學上可接 受之載劑應適用於玻璃體內、靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊髓或表皮投藥(例如藉由注射或輸液)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦即抗體、雙特異性及多特異性分子)可用保護化合物不受酸作用及可使化合物不活化之其他天然條件影響的物質塗佈。
組合物應為無菌的且具有流動性。舉例而言，可藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液之情況下維持必要粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在許多情況下，組合物中較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)及氯化鈉。藉由使組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)，可達成可注射組合物之長期吸收。
本發明之醫藥組合物可根據此項技術中熟知且常規實施之方法製備。參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.，第20版，2000；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。醫藥組合物較佳在GMP條件下製造。典型地，本發明之醫藥組合物中使用治療上有效劑量或靈驗劑量的ANGPTL4結合抗體。ANGPTL4結合抗體藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配成醫藥學上可接受之劑型。調整劑量方案以得到最佳所需響應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單一藥團，可隨時間投與若干分次劑量，或可如治療情形之緊急程度所指示而依比例減少或增加劑量。就投藥簡易性及劑量之均一性而言，非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的實體上不連續單元；各單元含有與所需醫藥載劑結合，經計算以產生所需治療效果之預定量活性化合物。
可改變本發明醫藥組合物中活性成分的實際劑量水準，以便使得活性成分的量有效達成針對特定患者、組合物及投藥模式之所要治 療反應，而不會對患者產生毒性。所選劑量水準視多種藥物動力學因素而定，其包括本發明所用特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投藥途徑、投藥時間、所用特定化合物之排泄速率、治療持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、大體健康狀況及先前病史及其類似因素。
醫師或獸醫初始給予的醫藥組合物中所用本發明抗體劑量可低於為達成所要治療作用所必需的水準且逐漸增加劑量直至達成所要作用。一般而言，用於治療本文所述心血管病症之本發明組合物的有效劑量視許多不同因素變化，其包括投藥方式、靶點、患者之生理狀態、患者是否為人類或動物、所投與之其他藥物，且治療是否為預防或治療。需要滴定治療劑量以使安全及功效最佳化。全身性投與抗體時，劑量範圍為每公斤宿主體重約0.0001mg至100mg，且更通常為每公斤宿主體重0.01mg至15mg。玻璃體內投與抗體時，劑量範圍可為每眼0.1mg至每眼5mg。舉例而言，0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml、2.1mg/ml、2.2mg/ml、2.3mg/ml、2.4mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.7mg/ml、2.8mg/ml、2.9mg/ml、3.0mg/ml、3.1mg/ml、3.2mg/ml、3.3mg/ml、3.4mg/ml、3.5mg/ml、3.6mg/ml、3.7mg/ml、3.8mg/ml、3.9mg/ml、4.0mg/ml、4.1mg/ml、4.2mg/ml、4.3mg/ml、4.4mg/ml、4.5mg/ml、4.6mg/ml、4.7mg/ml、4.8mg/ml、4.9mg/ml或5.0mg/ml。例示性治療方案需要全身性投藥，每兩週一次或一月一次或每3至6個月一次。例示性治療方案需要全身性投藥，每兩週一次或一月一次或每3至6個月一次，或根據 需要(PRN)。
抗體通常多次投與。單次劑量之間隔時間可依週、月或年算。如藉由量測患者血液中之ANGPTL4結合抗體含量所指示，間隔時間亦可為不規則的。另外，替代的給藥間隔時間可由醫師確定，且每月或根據有效性需要來投與。在全身性投藥之一些方法中，調整劑量以達成1至1000μg/ml之血漿抗體濃度且在一些方法中為25μg/ml至500μg/ml。或者，抗體可以持續釋放調配物之形式投與，在此情況下，需要降低投藥的頻率。劑量及頻率視患者中抗體之半衰期變化。一般而言，人類化抗體顯示的半衰期比嵌合抗體及非人類抗體之半衰期長。投藥劑量及頻率可視治療是否為預防或治療而變化。在預防性應用中，在長時間段內，在相對不頻繁之間隔時間投與相對低之劑量。一些患者在其餘生中繼續接受治療。在治療性應用中，有時需要在相對較短之間隔時間投與相對較高之劑量，直至疾病之進展降低或終止，且較佳直至患者疾病症狀顯示部分或完全改善。其後，可向患者投與預防性療法。
實例
提供以下實例以進一步說明本發明，然而不限制其範疇。本發明之其他變型對於一般技術者而言顯而易見且涵蓋於隨附申請專利範圍中。
實例1：製備經純化之重組人類ANGPTL4用作抗原及用於抗體表徵實驗中
將編碼全長人類ANGPTL4多肽(胺基酸26-406，匹配NCBI序列NM_139314.2)與來自人類IgG-κ之N末端信號肽(MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA)(SEQ ID NO：152)及C末端FLAG抗原決定基(DYKDDDDKH)(SEQ ID NO：153)、六組胺酸純化標記(HHHHHH)(SEQ ID NO：154)及Avi標記(亦即BirA生物素化序列 GGGLNDIFEAQKIEWHE)(SEQ ID NO：155)的核酸序列次選殖入哺乳動物細胞表現載體pRS5a中以產生質體pRS-Ikk-hANGPTL4(26-406)-FLAG-6HIS-Avi，該質體含有20個胺基酸IKK信號序列、繼之為具有羧基末端Flag、6HIS及Avi標記的人類ANGPTL4之胺基酸26-406(表2，SEQ ID NO：156)。
在一些製備中，使用以下程序表現、純化及生物素化人類ANGPTL4蛋白質(方法1)：適於懸浮液之HEK293T細胞在無血清的FreeStyle 293表現培養基(Life Technologies，目錄號12338-018)中培養且使用聚伸乙基亞胺轉染試劑(Polysciences，目錄號23966)、經質體pRS-Ikk-hANGPTL4(26-406)-FLAG-His6-Avi轉染。轉染之後5小時，向培養基中添加肝素(Alfa Aesar，目錄號A16198)直至最終濃度為0.5mg/ml。接著培養細胞72-96小時，接著在4℃藉由離心來收集細胞培養上清液且使用0.22μm過濾器(Thermo，目錄號567-0010)進行無菌過濾。接著藉由切向流過濾將所過濾之細胞培養上清液濃縮至約100ml。經濃縮之上清液用TBS-甘油緩衝液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl及15%甘油，pH 7.4)稀釋至1公升體積，且藉由切向流過濾將樣品濃縮至約200ml。接著向樣品中添加經TBS-甘油緩衝液預平衡之抗Flag M2瓊脂糖樹脂(Sigma，目錄號220102-177)，且所得溶液在4℃平緩地混合1小時。瓊脂糖樹脂接著用25ml TBS-甘油洗滌5次，且所結合之ANGPTL4蛋白質用20ml含有0.2mg/mL Flag肽(Sigma，目錄號220176-317)的TBS-甘油溶離。將不含過氧化物的Tween-20(AppliChem，目錄號A1284,0025)添加至經溶離之蛋白質溶液中直至0.1%之最終濃度，且所得溶液裝載至在含有0.1%Tween-20之TBS-甘油(緩衝液A)中預平衡的5ml HiTrap肝素管柱(GE Lifesciences，目錄號17-0407-01)上。管柱用50ml緩衝液A洗滌，隨後用含有300mM NaCl的50ml緩衝液A洗滌。ANGPTL4蛋白質接著用含有600mM NaCl的20ml緩衝液A溶離。所溶離之蛋白質使用具有30kDa分子量截斷的離心濃縮器(Amicon Ultra，目錄號UFC903024)濃縮。如藉由SDS-PAGE所評估之經純化之ANGPTL4蛋白質純度為>90%。
在一些應用中，ANGPTL4蛋白質在C末端Avi標記處使用每毫克ANGPTL4 10μg經純化之生物素-蛋白質連接酶(BirA)(Avidity)進行位點特異性生物素化。向緩衝液中補充最終濃度10mM ATP、10mM乙酸鎂及0.5M d-生物素。反應混合物在30℃培育2小時，接著在4℃培育隔夜，接著裝載至在緩衝液A中平衡的HiLoad Superdex 200管柱(26mm×600mm)(GE Lifesciences，目錄號28-9893-36)上。使用SDS-PAGE分析得自Superdex 200管柱的溶離份，且合併含有ANGPTL4的溶離份且使用離心濃縮器濃縮。
在其他製備中，使用以下程序表現、純化及生物素化人類ANGPTL4蛋白質(方法2)。質體pRS-Ikk-hANGPTL4(26-406)C-Flag6HisAvi使用標準聚伸乙基亞胺(PEI)轉染方法短暫轉染至HEK293T細胞中。細胞在Freestyle 293表現培養基中以懸浮培養方式增殖且使用1公升燒瓶、在4公升培養基中、以每毫升1×106個細胞的最終細胞濃度進行轉染。轉染之後5小時，添加最終濃度為500μg/ml的肝素。細胞在37℃及5%CO2下生長72小時。接著藉由離心獲得細胞離心塊，且使上清液通過0.22μm無菌過濾器。濃縮經澄清之上清液且使用切向流過濾(TFF)緩衝交換至緩衝液B(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、10%甘油、10mM咪唑，pH 7.4)中。接著使濃縮樣品通過經緩衝液C(50mM Tris.HCl、150mM NaCl、10%甘油、10mM咪唑、0.1%正辛基-β-麥芽糖苷，pH 7.4)平衡之5ml Ni-NTA親和性管柱。裝載樣品之後，管柱用相同緩衝液洗滌直至達到280nm之基線吸光度。接著藉由使用咪唑梯度(10mM至500mM)溶離所結合之ANGPTL4蛋白質。合併含有人類ANGPTL4的溶離份，使用Amicon濃 縮器(分子量截斷為10kD)濃縮，使用PD-10管柱緩衝交換至儲存緩衝液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、15%甘油，pH 7.4)中，等分試樣，在液氮中急驟冷凍且在-80℃儲存。如藉由SDS-PAGE所評估之經純化之人類ANGPTL4蛋白質純度為>90%。
在一些應用中，如上文所述製備之經純化ANGPTL4蛋白質如下進行位點特異性生物素化：最終濃度為約1mg/mL的經純化蛋白質在50mM二甘胺酸(pH 8.3)緩衝液中、在10mM ATP、10mM乙酸鎂、0.1mM生物素及BirA生物素連接酶(Avidity)存在下、在30℃培育1小時，接著在4℃培育隔夜。接著使用Amicon濃縮器(分子量截斷為10kD)濃縮蛋白質，使用PD-10管柱緩衝交換至儲存緩衝液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、15%甘油，pH 7.4)中，等分試樣，在液氮中急驟冷凍且在-80℃儲存。
實例2：製備經純化之重組人類ANGPTL4 N末端雙螺旋域蛋白質用於抗體表徵實驗
人類ANGPTL4(胺基酸26-161)之N末端雙螺旋域的表現、純化及生物素化係使用實例1方法2中針對人類全長人類ANGPTL4所述之基本相同方法進行。經純化之人類ANGPTL4 N末端域蛋白質序列顯示於表2(SEQ ID NO：157)中。
實例3：單株抗體之製備及篩選
重組人類ANGPTL4蛋白質如實例1中所述內部製備，且用作產生抗ANGPTL4融合瘤純系的免疫原。Bcl-2轉殖基因小鼠係根據標準快速免疫接種方案免疫接種重組人類ANGPTL4。使用基於電融合之標準方法產生融合瘤。
使用標準方法產生穩定表現與跨膜域融合之人類ANGPTL4的CHO-K1PD細胞。由於存在跨膜域，因此此等細胞在細胞表面上呈現ANGPTL4。因此，可使用流式細胞術偵測抗體對此等細胞表面上之ANGPTL4的結合。
藉由偵測上清液中存在之抗體對CHO-K1PD細胞表面上所表現之人類ANGPTL4的結合來篩選融合瘤上清液。使用經螢光標記之抗小鼠二級抗體及流式細胞術偵測抗體對細胞的結合。不表現ANGPTL4的親本CHO-K1PD細胞用作陰性對照物。對於結合至ANGPTL4的融合瘤而言，使用標準方法自細胞上清液純化抗體，且所得之增濃上清液在使用CHO-K1PD/ANGPTL4及CHO-K1PD-親本細胞的流式細胞術分析中加以測試。
藉由使用標準直接型ELISA分析來測定融合瘤上清液中的ANGPTL4抗體效價，其中使重組人類ANGPTL4蛋白質固著於ELISA盤表面上。對經確認之陽性融合瘤進行次選殖，且使用標準方法測定由此等融合瘤產生之單株抗體的序列。
單株抗體14P18、17B1、19C16及37P1隨後顯示可抑制人類ANGPTL4介導之人類脂蛋白脂肪酶抑制(使用下文實例7中所述之方法)。使用標準方法測定14P18、17B1、19C16及37P1之重鏈及輕鏈可 變區的核苷酸及胺基酸序列。
實例4：單株抗體之人類化
人類化方法充分描述於此項技術中(Jones等人1986,Queen等人1989,Riechmann等人1988,Verhoeyen,Milstein及Winter 1988)。術語人類化描述為非人類抗體(例如鼠源抗體)之抗原結合位點轉移至人類受體構架，例如人類生殖系序列(Retter等人2005)。對抗體進行人類化之主要原理為當抗體以治療劑投與人類時，使產生針對抗體之免疫原性反應的風險最小化(Rebello等人1999)。
抗原結合位點包含直接或間接影響結合之可變域(VL及VH)之互補決定區(CDR)(Chothia及Lesk 1987,Kabat等人1991)及構架區中的位置。可直接影響結合的構架殘基可例如發現於位於CDR2與CDR3之間的所謂「外」環區域中。間接影響結合的殘基例如發現於所謂的維尼爾區域(Vernier Zones)(Foote及Winter 1992)。其被認為可支持CDR構形。當選擇適合受體構架以使最終人類化抗體在構架區中偏離人類生殖系受體序列之數目最小化的時，考慮CDR外部的彼等位置。
實例5：抗體序列最佳化及親和力成熟
某些胺基酸序列基元已知可經歷轉譯後修飾(PTM)，諸如糖基化(例如NxS/T，其中x為除P外的任何胺基酸)、自由半胱胺酸之氧化、去醯胺(例如NG序列中N之去醯胺)或異構化(例如DG序列)。若存在於CDR區域中，理想地藉由定點突變誘發來移除彼等基元以便增加產物均質性。
親和力成熟方法充分描述於此項技術中。在許多呈現系統中，噬菌體呈現(Smith 1985)及諸如酵母之真核細胞呈現(Boder及Wittrup 1997)為根據抗體-抗原相互作用來選擇的最常用系統。此等呈現系統的優點在於，其適於廣泛範圍之抗原且選擇嚴格度可容易調整。在噬菌體呈現時，可呈現scFv或Fab片段且在酵母呈現時，可呈現scFv、 Fab或全長IgG。此等常用方法允許自多樣性超過1×107的較大文庫中選擇所要抗體變異體。多樣性較小(例如1,000)的文庫可藉由微表現及ELISA篩選。
非靶向或隨機抗體變異體文庫可藉由例如易錯PCR(Cadwell及Joyce 1994)產生且提供非常簡單、但有時有侷限的方法。另一策略為CDR導向的候選抗體多樣化。可使用例如簡併寡核苷酸(Thompson等人1996)、三核苷酸突變誘發(TRIM)(Kayushin等人1996)或此項技術已知的任何其他方法特異性靶向一或多個CDR中的一或多個位置
實例6：人類化抗體之表現及純化
在GeneArt(Life Technologies,Inc.,Regensburg,Germany)訂購編碼人類化VL及VH域之DNA序列，包括智人最佳化密碼子。VL及VH域之編碼序列係藉由自源於GeneArt之載體切割且黏貼至適於由哺乳動物細胞表現及分泌之表現載體中而進行次選殖。將重鏈及輕鏈選殖入允許共轉染的個別表現載體中。表現載體之元件包括啟動子(細胞巨大病毒(CMV)增強子-啟動子)、促進分泌之信號序列、聚腺苷酸化信號及轉錄終止子(來自牛生長激素(BGH)基因)、允許游離型複製及在原核生物中複製的元件(例如SV40起點及ColE1或此項技術中已知之其他元件)及允許選擇的元件(安比西林(ampicillin)抗性基因及勻黴素(zeocin)標記)。
組成性表現SV40大T抗原(HEK293-T ATCC11268)的人類胚腎細胞為用於短暫表現人類化及/或最佳化IgG蛋白質之較佳宿主細胞株之一。使用PEI(聚伸乙基亞胺，線性MW 25,000，Polysciences，USA，目錄號23966)作為轉染試劑來執行轉染。藉由在室溫(RT)下小心地將1g PEI溶解於900ml細胞培養級水中來製備PEI儲備溶液。為了促進PEI溶解，藉由添加HCl至pH 3-5而將溶液酸化，隨後用NaOH中和至7.05之最終pH。最後，將體積調整至1L且溶液經由0.22μm過濾器過 濾，等分試樣且在-80℃冷凍直至進一步使用。使用用於轉染及繁殖細胞的Novartis專有無血清培養基及ExCell VPRO無血清培養基(SAFC Biosciences,USA，目錄號24561C)作為生產/饋料培養基來培養HEK 293T細胞。針對短暫轉染所製備的細胞在懸浮培養液中培養。對於小規模(<5L)轉染而言，細胞在定軌振盪器(100-120rpm)上之Corning振盪燒瓶(Corning,Tewksbury,MA)中，在增濕保溫箱中，在5%CO2下生長(接種燒瓶)。接種培養物中之細胞應維持在指數生長期(細胞密度在5×105/ml與3×106/ml之間)且顯示轉染具有>90%之存活率。對於小規模(<5L)轉染而言，自接種培養物中獲得細胞等分試樣且以36%最終體積、用Novartis無血清培養基調節至1.4×106個細胞/毫升。藉由以7%最終培養體積將DNA稀釋至1mg/l(最終體積)、隨後平緩混合來製備DNA溶液(溶液1：0.5mg重鏈及0.5mg輕鏈表現質體用於1L轉染)。為了防止細菌污染，使用0.22μm過濾器(例如Millipore Stericup)過濾此溶液。3mg/L(最終體積)PEI溶液接著亦以7%最終培養體積稀釋且平緩混合(溶液2)。兩種溶液均在室溫(RT)下培育5-10分鐘。隨後在平緩混合下，向溶液1中添加溶液2且在室溫下另外培育5-15分鐘。接著向細胞中添加轉染混合物且繼續培養細胞4至6個小時。最後，藉由添加ExCell® VPRO無血清培養基而達成剩餘50%之總生產體積。轉染後繼續培養細胞11天。
藉由在4℃、以4500rpm離心20分鐘(Heraeus®,Multifuge 3 S-R,Thermo Scientific,Rockford,IL)來收集培養物。所回收的細胞上清液經由stericup過濾器(0.22μm)無菌過濾且在4℃儲存直至進一步處理。在冷卻櫃中，在使用剛經消毒(0.25M NaOH)之HiTrap 5ml蛋白質A MabSelect®SuRe管柱的「ÄKTA 100 Explorer Air」層析系統中在4℃下進行純化。管柱經5個管柱體積的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS,Gibco,Life Technologies,Carlsbad,CA)平衡，接著以4.0ml/min裝載經無菌過濾 的上清液。用13個管柱體積之PBS洗滌管柱。抗體接著用5個管柱體積之50mM檸檬酸鹽、70mM NaCl(pH 3.2)溶離。以3ml溶離份收集溶離液且用1M Tris-HCl(pH 10)調節至pH 7。合併含有抗體的溶離份且無菌過濾(Millipore Steriflip，0.22um)，使用分光光度計(NanoDrop ND-1000)量測OD 280nm，且基於OD 280及莫耳濃度消光係數來計算蛋白質濃度，該莫耳濃度消光係數係基於蛋白質序列來計算。使用多角度光散射偵測器(SEC-MALS)、藉由尺寸排阻層析來測試溶離液的聚集度且藉由凝膠電泳(SDS-PAGE)、內毒素分析(LAL)及質譜(MS)來評估純度。在第二純化步驟中，需要時，將首次純化所得的抗體裝載至剛經消毒(0.5M NaOH)的凝膠過濾管柱(Hi Load 16/60 Superdex 200，120mL，GE-Helthcare)上。管柱經PBS平衡且使用PBS緩衝液、在1ml/min流速下進行運作。以1.2ml溶離份收集溶離液。合併含有抗體的蛋白質，且所得經純化之抗體如針對第一純化步驟所述加以分析。
使用上述方法製備以下人類化抗體、表現且純化：NEG276、NEG276-LALA、NEG278、NEG310、NEG318、NEG318-LALA、NEG319、NEG313及NEG315。此等人類化抗體之構架及親本抗體顯示於表3中，且核苷酸及胺基酸序列顯示於表1中。所有人類化抗體均如同人類IgG1抗體製備，但其中NEG276-LALA及NEG318-LALA係使用經修飾之Fc區(人類IgG1-LALA)製備，其中重鏈中之Leu234-Leu235序列經Ala234-Ala235置換。相較於野生型人類IgG1抗體，人類IgG1-LALA抗體已知具有降低之抗體效應功能。
實例7：人類脂蛋白脂肪酶分析
使用標準聚伸乙基亞胺(PEI)轉染方法，用編碼全長人類脂蛋白脂肪酶(LPL)多肽(匹配NCBI序列NM_000237.2)的哺乳動物表現質體轉染在FreeStyle表現培養基(Invitrogen)中培養的HEK 293T細胞。轉染之後24小時，將肝素添加至培養基中直至3U/ml之最終濃度，以增強所分泌hLPL自細胞表面中釋放。轉染後60小時，收集培養基，使用0.2μm過濾器過濾且添加甘油直至10%v/v之最終濃度。所得溶液裝載至已經緩衝液A(50mM Tris-HCl、200mM NaCl、10%v/v甘油，pH7.2)預平衡之5ml肝素瓊脂糖HiTrap管柱(GE)上。管柱用緩衝液A洗滌，且人類LPL蛋白質接著在緩衝液A中用500mM NaCl、1M NaCl及2M NaCl之步驟梯度加以溶離。最純且最具催化活性的人類LPL在2M NaCl存在下溶離。將經純化之人類LPL等分試樣急驟冷凍且在-80℃儲存直至使用。
以下方案用於評估本發明抗體阻斷ANGPTL4抑制人類脂蛋白脂肪酶的能力。384孔分析盤(Corning，目錄號3573)及樣品盤(Greiner Bio-one，目錄號781201)在室溫下用1%牛血清白蛋白(BSA)(每孔0.1ml)洗滌30分鐘。接著用0.05%Tween-20溶液洗滌盤兩次。
向樣品盤中添加含有ANGPTL4抗體的100mM HEPES pH 7.0(每孔20μl，連續稀釋液，最終分析濃度範圍為0.02nM至500nM)，隨後 添加含有20μl人類ANGPTL4蛋白質(10nM最終分析濃度)的分析緩衝液(100mM HEPES、2mM MgCl2，7.0)，且盤在室溫下、在平緩振盪下培育20分鐘。接著添加在分析緩衝液(20μl)中稀釋的脂蛋白脂肪酶且盤在室溫下、在平緩振盪下培育10分鐘。
製備偶合酶混合物，該混合物含有醯基輔酶A氧化酶(Sekisui Diagnostics，目錄號T-17)、醯基輔酶A合成酶(Sekisui Diagnostics，目錄號T-16)及辣根過氧化酶(Sekisui Diagnostics)、ATP(Sigma，目錄號A7699)及輔酶A(MP Biomedicals，目錄號100493)於分析緩衝液中。向偶合酶混合物中添加催化酶瓊脂糖珠粒(Sigma，目錄號C9284)，且在4℃、在振盪下培育混合物30分鐘，接著藉由離心移除催化酶瓊脂糖珠粒。
人類VLDL(Millipore，目錄號LP1)在分析緩衝液中稀釋，經催化酶瓊脂糖珠粒處理30分鐘，且藉由離心自溶液中移除珠粒。添加含有Amplex Red(Invitrogen，目錄號A12222)的分析緩衝液直至33μM之濃度。
向樣品盤中之含有LPL、ANGPTL4及ANGPTL4抗體的溶液中添加偶合酶混合物(20μl)，且轉移54μl所得溶液至分析盤中。為了起始脂蛋白脂肪酶反應，添加VLDL/Amplex Red溶液(18μl)，且使用EnVision多孔盤讀取器(Perkin Elmer)連續監測試鹵靈螢光(resorufin fluorescence)30分鐘。最終分析濃度為：9.4nM ANGPTL4、約4nM 人類脂蛋白脂肪酶、2.3μg/ml人類VLDL、0.75mM ATP、90μM輔酶A、0.5U/ml ACO、1.25U/ml ACS、1.2U/ml HRP及10μM Amplex Red。
所得試鹵靈螢光相對於時間的資料用於測定各樣品的脂蛋白脂肪酶酶活性(初始速率)。不具有LPL的對照樣品(背景對照)或不具有ANGPTL4或ANGPTL4抗體的對照樣品(LPL活性對照)用於校正酶活 性，其以LPL對照活性之百分比表示。使用GraphPad Prism軟體對不同ANGPTL4抗體濃度下的酶活性資料作圖，且擬合資料以根據ANGPTL4抗體介導的脂蛋白脂肪酶酶活性增加來產生EC50值。在此分析中，人類ANGPTL4在10nM濃度下典型地將LPL活性抑制70-95%。本發明之ANGPTL4抗體以劑量依賴性方式逆轉ANGPTL4對LPL之抑制。此分析之EC50結果顯示於表4中。所選本發明抗體之代表性資料顯示於圖1中。
實例8：製備食蟹獼猴、小鼠及大鼠ANGPTL4及人類ANGPTL3蛋白質用於抗體表徵
藉由擴增得自食蟹獼猴肝臟cDNA文庫之基因序列(Biochain，目錄號C1534149-Cy，批號B409051)來測定食蟹獼猴ANGPTL4序列。引子5-UT-食蟹獼猴5'-ATCCCCGCTCCCAGGCTAC-3'(SEQ ID NO：158)及3-UT-食蟹獼猴5'-CAGCAAGGAGTGAAG-CTCCATGCC-3'(SEQ ID NO：159)係基於人類ANGPTL4 cDNA(NCBI序列NM_139314.2)之5'及3'未轉譯區來設計。將經凝膠純化之PCR產物接入pCR4-鈍端-TOPO (Life Technologies，目錄號K2875-40)且測序。所選殖之食蟹獼猴ANGPTL4 cDNA編碼與人類ANGPTL4具有95%同源性的406個胺基酸蛋白質。將編碼食蟹獼猴ANGPTL4之胺基酸26-406的核酸序列次選殖入哺乳動物表現載體pRS5中，以產生質體pRS-Ikk-食蟹獼猴ANGPTL4(26-406)-FLAG-6HIS-Avi，該質體具有20個胺基酸Ikk信號序列、食蟹獼猴ANGPTL4之胺基酸26-406，以及羧基末端FLAG、6HIS及Avi標記(表5中之SEQ ID NO：160)。
使用如實例1中針對人類ANGPTL4(26-406)-FLAG-6HIS-Avi蛋白質所述之類似方法，表現且純化食蟹獼猴ANGPTL4(26-406)-FLAG-6HIS-Avi蛋白質。在一些應用中，經純化之食蟹獼猴ANGPTL4蛋白質係使用如實例1中針對人類ANGPTL4蛋白質所述之類似方法進行位點特異性生物素化。如SDS-PAGE所評估之經純化食蟹獼猴ANGPTL4蛋白質純度為>90%。
使用類似方法製備食蟹獼猴ANGPTL4(26-161)-FLAG-6HIS-Avi蛋白質。由相應表現構築體編碼之食蟹獼猴ANGPTL4(26-161)蛋白質的序列顯示於表5(SEQ ID NO：161)中。
小鼠ANGPTL4(胺基酸26-410)及大鼠ANGPTL4(胺基酸24-405)之表現、純化及生物素化係使用如實例1方法2中針對人類ANGPTL4所述之基本相同方法進行。由相應表現構築體編碼之小鼠及大鼠ANGPTL4蛋白質中的序列顯示於表5(分別為SEQ ID NO：162及163)中。如SDS-PAGE所評估之經純化小鼠ANGPTL4及大鼠ANGPTL4蛋白質純度為>90%。
ANGPTL3(SEQ ID NO：5，表1)為與ANGPTL4密切相關的人類蛋白質。為了能夠評價本發明抗體對ANGPTL3的可能結合，人類ANGPTL3(14-460)-FLAG-His-Avi蛋白質(SEQ ID NO：164，表5)使用如實例1方法2中針對人類ANGPTL4所述的類似方法表現、純化及生 物素化。
實例9：藉由直接型ELISA分析表徵抗體結合特異性
執行直接型ELISA分析以表徵本發明所選抗體之抗體結合特異性。如下進行分析：經抗生蛋白鏈菌素塗佈之Meso Scale Discovery(MSD)384孔盤藉由將該盤與每孔50μL阻斷緩衝液(PBS，pH 7.4，5%w/v牛血清白蛋白)一起在22℃、在恆定振盪(600rpm)下培育1小時加以阻斷。經阻斷之MSD盤接著使用洗盤器(BioTek)、用洗滌緩衝液(PBS pH 7.4及0.05%v/v Tween-20)洗滌3次。洗滌之後，在分析緩衝液(不含CaCl2或MgCl2的PBS pH 7.4、0.5%w/v無脂肪酸的牛血清白蛋白及0.02%v/v Tween-20)中稀釋的生物素化人類ANGPTL4蛋白質藉由在1nM濃度(每孔15μL)下、在22℃培育一小時而固著於表面上：全長人類ANGPTL4(hANGPTL4)、人類ANGPTL4雙螺旋域(hANGPTL4-CCD)及全長人類ANGPTL3(hANGPTL3)。接著如前所述洗滌盤3次。接著將在分析緩衝液中稀釋至1nM濃度的抗體塗覆至MSD盤(每孔15μL)上，且盤在22℃、在恆定振盪(600rpm)下培育1小時。藉由每孔添加15μL之磺基標記山羊抗人類IgG 1：500稀釋液來偵測所結合抗體。接著在恆定振盪(600rpm)下培育盤一小時。洗滌盤3次，接著每孔添加15μL 1×MSD讀取緩衝液T，且盤使用Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery)顯影。將資料轉移至Microsoft Excel中分析且使用GraphPad Prism v6作圖。此等實驗顯示，此分析中所測試的所有本發明抗體均結合至全長人類ANGPTL4且結合至人類ANGPTL4之N末端域，且不結合至全長人類ANGPTL3。在ANGPTL3結合分析中，ANGPTL3特異性參考抗體用作陽性對照(圖2)。
實例10：藉由溶液平衡滴定(SET)分析測定抗體解離常數
如下進行SET分析。在聚丙烯96孔盤中，將恆定濃度的ANGPTL4抗體(10pM)與不同濃度的人類、食蟹獼猴、小鼠或大鼠非生物素化全長ANPGLT4蛋白質或人類ANGPTL4N末端域蛋白質(5倍 連續稀釋液，範圍為0.01pM至100nM)在SET緩衝液(不含CaCl2或MgCl2的PBS pH 7.4、0.5%w/v牛血清白蛋白(不含脂肪酸)及0.02%v/v Tween-20)中混合。最終反應體積為80μL。使用黏著膜密封盤且在22℃、在恆定振盪(300rpm)下培育14小時。在相同時間段期間，經抗生蛋白鏈菌素塗佈之Meso Scale Discovery(MSD)384孔盤藉由將該盤與每孔50μL阻斷緩衝液(PBS pH 7.4、5%w/v牛血清白蛋白)一起在4℃培育加以阻斷。經阻斷之MSD盤使用洗盤器(BioTek)、用洗滌緩衝液(PBS pH 7.4及0.05%v/v Tween-20)洗滌3次。生物素化ANGPTL4(人類、食蟹獼猴、小鼠或大鼠全長ANGPTL4，或人類ANGPTL4 N末端域)蛋白質(1nM，每孔15μL)藉由在22℃、在恆定振盪(600rpm)下培育一小時而固著於經抗生蛋白鏈菌素塗佈之MSD盤表面上。接著如前所述洗滌盤3次。
將平衡結合反應物(每孔15μL)塗覆至固著有ANGPTL4的MSD盤上且在22℃培育20分鐘。藉由洗滌緩衝液洗滌盤3次來移除未結合的物質，且藉由每孔添加15μL之磺基標記山羊抗人類IgG(Meso Scale Discovery)1：500稀釋液來偵測所捕捉的抗體。接著在恆定振盪(600rpm)下培育盤一小時。洗滌盤3次，接著每孔添加15μL 1×MSD讀取緩衝液T，且盤使用Sector Imager 6000(Meso Scale Discovery)顯影。將資料轉移至Microsoft Excel中分析且使用GraphPad Prism v6作圖。藉由將資料與以下方程式擬合來確定KD值：y=(Bmax/(CAb/2))*((CAb/2)-((((((CAg+CAb)+KD)/2)-((((((CAg+CAb)+KD)^2)/4)-(CAg*CAb))^0.5))^2)/(2*CAb)))，其中Bmax為當溶液中不存在ANGPTL4蛋白質時的信號，CAb為溶液中ANGPTL4抗體的恆定濃度，CAg為溶液中的ANGPTL4濃度，且KD為平衡解離常數。使用此方法確定的平衡解離常數顯示於表6中。
表6. 藉由溶液平衡滴定(SET)分析所測定之本發明抗體結合至
實例11：抗體結合動力學及藉由Octet動力學結合分析所測定的解離常數
藉由使用Octet(ForteBio)動力學結合分析測定本發明所選抗體的解離常數(KD)。ForteBio 10X動力學緩衝液(ForteBio，目錄號18-5032)用DPBS(Life Technologies，目錄號14190-136)以10倍稀釋，且所得溶液添加(0.2毫升/孔)至96孔盤(Greiner，目錄號65520)中。將抗生蛋白鏈菌素感測器(ForteBio，目錄號18-5020)浸沒於溶液中且在室溫下平衡至少10分鐘。在第二個96孔盤(Greiner，目錄號65520)中，感測器用1×動力學緩衝液洗滌，接著在室溫下、在200ul 25nM生物素化人類ANGPTL4或生物素化參考蛋白質(用於減去背景)中浸沒1000sec(秒)。感測器接著用1×動力學緩衝液洗滌120秒，且浸沒於200ul各種濃度之ANGPTL4抗體稀釋液(於1×動力學緩衝液中連續2倍稀釋；最高濃度為12.5nM或25nM；最低濃度在0.8nM至3.1nM範圍 內；每次KD測定使用4-6種不同的抗體濃度)中，且監測抗體結合480秒。接著轉移感測器至含有200ul 1×動力學緩衝液的孔中，且監測抗體解離1200秒。藉由Octet軟體(ForteBio)對經背景校正之結合及解離曲線進行全面擬合以產生結合速率常數(ka)及解離速率常數(kd)，此兩種速率常數又用於計算平衡解離常數(KD)。本發明所選抗體的所得資料顯示於表7及表8中。
實例12：藉由氫-氘交換/質譜進行的抗原決定基定位
氫-氘交換(HDx)與質譜(MS)組合(Woods,2001)用於對抗體NEG276及NEG318之針對ANGPTL4 N末端域之結合位點進行定位。在HDx中，蛋白質之可交換醯胺氫經氘置換。此方法對蛋白質結構/動力學及溶劑可接近性敏感且因此能夠報導配位體結合。此等實驗之目標為鑑別NEG276及NEG318之針對ANGPTL4之抗原決定基。
使用類似於文獻(Chalmers,2006)中所述方法的方法進行自動化HDx/MS實驗。在Waters HDX-MS平台上進行實驗，該平台包括LEAP自動取樣器、nanoACQUITY UPLC系統及Synapt G2質譜儀。用於以氘標記蛋白質主鏈的氘緩衝液為50mM D-Tris-HCl(pH 7.4)、500mM NaCl、15%甘油及0.1%正辛基β-D-麥芽糖苷；溶液中之氘總百分比為82.5%。在缺乏ANGPTL4抗體的人類ANGPTL4(26-161)氘標記實驗中，在冷卻管中使用100μl氘緩衝液稀釋300pmol人類ANGPLT4(26-161)(1.3μl)且在4℃、在旋轉器上培育25分鐘。標記反應接著在冰上用100μl經冷卻之淬滅緩衝液淬滅3分鐘。3分鐘之後，將經淬滅之溶 液注射至LC-MS系統上進行自動化胃蛋白酶消化及肽分析。在存在所結合之ANGPTL4抗體的人類ANGPTL4(26-161)氘標記實驗中，首先使300pmol ANGPTL4抗體固著於Thermo Protein G Plus珠粒上且使用辛二酸二丁二醯亞胺酯(DSS)發生交聯。為進行標記實驗，將抗體珠粒(含有300pmol抗體)與300pmol人類ANGPTL4(26-161)一起在4℃培育30分鐘。30分鐘後，用200μl Tris緩衝液洗滌珠粒。接著添加200μl經冷卻之氘緩衝液且複合物在4℃培育25分鐘。25分鐘之後，標記反應在冰上用125μl經冷卻之淬滅緩衝液淬滅2.5分鐘。樣品在離心機中離心30秒之後，將所淬滅之溶液注射至LC-MS系統上進行自動化胃蛋白酶消化及肽分析。
所有量測均使用最少三次分析、一式三份來進行。所有氘交換實驗均使用0.5M TCEP及3M尿素(pH=2.5)淬滅。淬滅後，在12℃使用Poroszyme胃蛋白酶固著管柱(2.1×30mm)對所交換抗原進行線上胃蛋白酶消化，隨後捕捉於Waters Vanguard HSS T3捕捉管柱上。自捕捉管柱中溶離出肽且在Waters CSH C18 1×100mm管柱(維持於1℃)上、在40μl/min流速下、使用2%至35%B之二元8分鐘梯度(移動相A為99.9%水及0.1%甲酸；移動相B為99.9%乙腈及0.1%甲酸)進行分離。
在此等氘交換實驗中，偵測到涵蓋87%之ANGPTL4 N末端域序列的肽。所偵測之肽及各種肽中氘併入之降低指示於表9中。HDxMS定位實驗鑑別出ANGPTL4 N末端域之明顯受NEG276與NEG318保護的三個區域：胺基酸26-35(G26PVQSKSPRF35)(SEQ ID NO：165)、胺基酸42-68(N42VLAHGLLQLGQGLREHAERTRSQLSA68)(SEQ ID NO：174)及胺基酸69-95(L69ERRLSACGSACQTEGSTDLPLAPES95)(SEQ ID NO：190)。NEG276及NEG318保護ANGPTL4 N末端域之多個區域不併入氘的觀測結果與線性肽抗原決定基定位的結果一致，表明 NEG276及NEG318具有構形抗原決定基而非線性抗原決定基(參見實例13)。
實例13：藉由線性肽結合所進行的抗原決定基定位
測試本發明所選抗體(亦即NEG276及NEG318)結合至源於人類ANGPTL4 N末端雙螺旋域之15個胺基酸線性肽的能力。使用標準方法合成總共43種肽且純化；肽序列顯示於表10中。將肽固著於玻璃表面上，且在JPT Peptide Technologies(Berlin,Germany)使用用於線性肽 抗原決定基定位的最佳化實驗方法評價NEG276及NEG318結合至所固著肽的能力。不結合至ANGPTL4的抗體用作非特異性結合對照物。在此等實驗中未觀測到NEG276或NEG318特異性結合至43種15聚體肽中之任一者。此等結果強烈表明，NEG276及NEG318之抗原決定基不為線性ANGPTL4肽，實際上為構形抗原決定基。
實例14：本發明ANGPTL4抗體對人類ANGPTL4轉殖基因小鼠之血漿三酸甘油酯濃度的影響
藉由將全長人類ANGPTL4 cDNA序列插入pLIVLE6載體之多酶切點接頭區域中來製得構築體以在小鼠中表現轉殖基因人類ANGPTL4，該構築體含有人類脂蛋白元E基因啟動子及其肝控制區。基於C57BL/6J背景產生ANGPTL4轉殖基因小鼠且在Novartis(East Hanover,NJ)繁殖。轉殖基因小鼠在7日齡時截尾且使用REDExtract- N-Amp組織PCR套組(Sigma-Aldrich；St.Louis,MO；目錄號XNATR)自尾提取DNA。藉由使用靶向pLIVLE6載體及靶向ANGPTL4 cDNA的引子對來偵測人類ANGPTL4轉殖基因。小鼠圈養於經裝備可自動隨意供水之支架上的實心底籠子中，以12小時光亮/黑暗循環(6am至6pm)維持，且給予標準嚙齒動物食物(Harlan-Teklad；,MD；目錄號8604)。飼養室維持在68-76℉、30-70%濕度。小鼠與同窩幼畜一起圈養且在研究期間隨意接受食物及水，但在樣品收集之前4小時禁食。
動物禁食4小時且短暫麻醉以便收集頜下血液以量測基線血漿三酸甘油酯濃度。小鼠接著腹膜內(i.p.)注射在PBS(10mL/kg注射體積)中稀釋的30mg/kg抗體。給藥後第1、2及5天，在禁食4小時之後，收集血液以量測血漿三酸甘油酯及總人類IgG濃度。血液收集至具有EDTA的BD Microtainer收集/分離管(Becton,Dickinson,and Company；Franklin Lakes,NJ，目錄號365973)中。樣品以20,817×g離心10分鐘，且轉移血漿至0.2mL Thermo-strip管(Thermo-Scientific；Pittsburg,PA；目錄號AB 0451)中且在-80℃冷凍及儲存。
使用三酸甘油酯(GPO)液體試劑組(Pointe Scientific,Canton,MI,目錄號T7532-500)量測血漿三酸甘油酯濃度。簡言之，將300μL預溫熱至37℃的分析試劑添加至平底透明96孔盤(Thermo Scientific，目錄號269620)中之5μL血漿中。盤在盤振盪器上混合30秒，接著在37℃保溫箱中置放5分鐘。混合20秒之後，使用Molecular Devices SPECTRAmax PLUS讀盤器量測500nm吸光度。藉由使用校準曲線來計算三酸甘油酯濃度，該校準曲線係使用三酸甘油酯標準物(Pointe Scientific，目錄號T7531-STD)之已知量產生。
抗體NEG276與NEG318投與人類ANGPTL4轉殖基因小鼠時均使血漿三酸甘油酯含量降低(圖3)。
實例15：本發明ANGPTL4抗體之一投與肥胖、糖尿病、高三酸甘油 酯症食蟹獼猴的作用
為了評價NEG276-LALA之藥物動力學概況及藥理學效應，將單一的皮下3mg/kg劑量投與四個高三酸甘油酯症食蟹獼猴。此研究中所用的猴具有207mg/dL至2438mg/dL範圍內的基線血漿三酸甘油酯含量。在NEG276-LALA給予之後5週期間的不同時間點，收集血漿樣品(早晨餵食之前，自動物抽取血液樣品，但動物不禁食隔夜)。
藉由標準方法測定總NEG276-LALA血漿濃度。給藥後第3天，NEG276-LALA達到15,536±2281ng/ml之平均最大血漿濃度(Cmax)。給藥後第21天，平均NEG276-LALA血漿濃度為2663ng/mL(圖4)。
使用市購分析套組(TG：三酸甘油酯(GPO)液體試劑組，Pointe Scientific，目錄號T7532-500；總膽固醇：膽固醇試劑組，Pointe Scientific，目錄號C7510-500；HDL：膽固醇沈澱試劑，得自人工HDL試劑套組，Wako，目錄號431-52501；總ApoB：K-分析Apo B，Kamiya Biomedical Company，目錄號KAI-004；ApoC-III：ApoC-III分析試劑，Randox，目錄號LP-3865)測定血漿TG、總膽固醇、高密度脂蛋白(HDL)膽固醇、總脂蛋白元B(apoB)及脂蛋白元CIII(apoCIII)濃度。
NEG276-LALA投與引起血漿三酸甘油酯(TG)含量顯著降低。給藥後第7天觀測到峰值血漿TG降低；此時，血漿TG濃度比基線血漿TG含量低58%。給藥後第7天發生峰值TG降低之後，血漿TG濃度相對於基線濃度仍被抑制大於40%直至給藥後第21天，接著恢復至基線(圖5)。除了影響血漿TG之外，NEG276-LALA投與使血漿總膽固醇濃度降低，相對於基線而言降低約30%(圖6)且在給藥後第7天至第21天，使HDL膽固醇濃度增加，相對於基線而言增加大於20%(圖7)。另外，在給藥後第7天至第21天觀測到血漿總apoB濃度降低30%約(圖8)，且在第7天至第21天觀測到血漿apoC-III濃度相對於基線而言降低 約25%(圖9)。亦評價NEG276-LALA投與對脂蛋白相關三酸甘油酯及膽固醇含量的影響，此係藉由使用標準尺寸排阻層析方法分離脂蛋白組分。給藥前(第0天)與給藥後第7天樣品之比較顯示，NEG276-LALA投與引起富三酸甘油酯脂蛋白(TRL)相關膽固醇及三酸甘油酯濃度出現顯著降低(一個猴的結果顯示於圖10及圖11中)。
以引用的方式併入
本文中所引用之全部參考文獻(包括專利、專利申請案、論文、教科書及類似者)及其中引用的參考文獻就其尚未引用的程度而言係以全文引用之方式特此併入本文中。
等效物
前述書面說明被認為足以能夠使熟習此項技術者實施本發明。前述說明及實例詳述本發明的某些較佳實施例且描述本發明人所預期之最佳方式。然而應瞭解，無論以文字呈現的前述內容如何詳細，本發明可以許多方式實施，且本發明應根據隨附申請專利範圍及其任何等效物來解釋。
<110> 瑞士商諾華公司
<120> 血管生成素樣4抗體及其使用方法
<140> 104125679
<141> 2015-08-06
<150> 62/034,409
<151> 2014-08-07
<160> 233
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 406
<212> PRT
<213> 人類
<400> 1
<210> 2
<211> 1225
<212> DNA
<213> 人類
<400> 2
<210> 3
<211> 406
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<400> 3
<210> 4
<211> 1221
<212> DNA
<213> 食蟹獼猴
<400> 4
<210> 5
<211> 460
<212> PRT
<213> 人類
<400> 5
<210> 6
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人類
<400> 6
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 7
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 8
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 9
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 10
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 11
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 12
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 13
<210> 14
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 14
<210> 15
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 15
<210> 16
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 16
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 17
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 18
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 19
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 20
<210> 21
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 21
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 22
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 23
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 24
<210> 25
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 25
<210> 26
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 26
<210> 27
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 27
<210> 28
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 28
<210> 29
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 29
<210> 30
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 30
<210> 31
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 31
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 32
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 33
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 34
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 35
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 36
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 37
<210> 38
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 38
<210> 39
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 39
<210> 40
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 40
<210> 41
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 41
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 42
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 43
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 44
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 45
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 46
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 47
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 48
<210> 49
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 49
<210> 50
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 50
<210> 51
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 51
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 52
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 53
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 54
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 55
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 56
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 57
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 58
<210> 59
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 59
<210> 60
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 60
<210> 61
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 61
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 62
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 63
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 64
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 65
<210> 66
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 66
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 67
<210> 68
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 68
<210> 69
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 69
<210> 70
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 70
<210> 71
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 71
<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 72
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 73
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 74
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 75
<210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 76
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 77
<210> 78
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 78
<210> 79
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 79
<210> 80
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 80
<210> 81
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 81
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 82
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 83
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 84
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 85
<210> 86
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 86
<210> 87
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 87
<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 88
<210> 89
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 89
<210> 90
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 90
<210> 91
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 91
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 92
<210> 93
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 93
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 94
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 95
<210> 96
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 96
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 97
<210> 98
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 98
<210> 99
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 99
<210> 100
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 100
<210> 101
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 101
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 102
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 103
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 104
<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 105
<210> 106
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 106
<210> 107
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 107
<210> 108
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 108
<210> 109
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 109
<210> 110
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 110
<210> 111
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 111
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 112
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 113
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 114
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 115
<210> 116
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 116
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 117
<210> 118
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 118
<210> 119
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 119
<210> 120
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 120
<210> 121
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 121
<210> 122
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 122
<210> 123
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 123
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 124
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 125
<210> 126
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 126
<210> 127
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 127
<210> 128
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 128
<210> 129
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 129
<210> 130
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 130
<210> 131
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 131
<210> 132
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 132
<210> 133
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 133
<210> 134
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 134
<210> 135
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 135
<210> 136
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 136
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 137
<210> 138
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 138
<210> 139
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 139
<210> 140
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 140
<210> 141
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 141
<210> 142
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 142
<210> 143
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 143
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 144
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 145
<210> 146
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 146
<210> 147
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 147
<210> 148
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 148
<210> 149
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 149
<210> 150
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 150
<210> 151
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 151
<210> 152
<211> 24
<212> PRT
<213> 人類
<400> 152
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 153
<210> 154
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成6xHis tag
<400> 154
<210> 155
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 155
<210> 156
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 156
<210> 157
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 157
<210> 158
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成引子
<400> 158
<210> 159
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成引子
<400> 159
<210> 160
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 160
<210> 161
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 161
<210> 162
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 162
<210> 163
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 163
<210> 164
<211> 501
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 164
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類
<400> 165
<210> 166
<211> 11
<212> PRT
<213> 人類
<400> 166
<210> 167
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類
<400> 167
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類
<400> 168
<210> 169
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類
<400> 169
<210> 170
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類
<400> 170
<210> 171
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類
<400> 171
<210> 172
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類
<400> 172
<210> 173
<211> 25
<212> PRT
<213> 人類
<400> 173
<210> 174
<211> 27
<212> PRT
<213> 人類
<400> 174
<210> 175
<211> 23
<212> PRT
<213> 人類
<400> 175
<210> 176
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類
<400> 176
<210> 177
<211> 22
<212> PRT
<213> 人類
<400> 177
<210> 178
<211> 18
<212> PRT
<213> 人類
<400> 178
<210> 179
<211> 15
<212> PRT
<213> 人類
<400> 179
<210> 180
<211> 32
<212> PRT
<213> 人類
<400> 180
<210> 181
<211> 25
<212> PRT
<213> 人類
<400> 181
<210> 182
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類
<400> 182
<210> 183
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類
<400> 183
<210> 184
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類
<400> 184
<210> 185
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類
<400> 185
<210> 186
<211> 26
<212> PRT
<213> 人類
<400> 186
<210> 187
<211> 16
<212> PRT
<213> 人類
<400> 187
<210> 188
<211> 7
<212> PRT
<213> 人類
<400> 188
<210> 189
<211> 12
<212> PRT
<213> 人類
<400> 189
<210> 190
<211> 26
<212> PRT
<213> 人類
<400> 190
<210> 191
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 191
<210> 192
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 192
<210> 193
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 193
<210> 194
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 194
<210> 195
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 195
<210> 196
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 196
<210> 197
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 197
<210> 198
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 198
<210> 199
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 199
<210> 200
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 200
<210> 201
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 201
<210> 202
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 202
<210> 203
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 203
<210> 204
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 204
<210> 205
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 205
<210> 206
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 206
<210> 207
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 207
<210> 208
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 208
<210> 209
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 209
<210> 210
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 210
<210> 211
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 211
<210> 212
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 212
<210> 213
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 213
<210> 214
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 214
<210> 215
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 215
<210> 216
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 216
<210> 217
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 217
<210> 218
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 218
<210> 219
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 219
<210> 220
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 220
<210> 221
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 221
<210> 222
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 222
<210> 223
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 223
<210> 224
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 224
<210> 225
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 225
<210> 226
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 226
<210> 227
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 227
<210> 228
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 228
<210> 229
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 229
<210> 230
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 230
<210> 231
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 231
<210> 232
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 232
<210> 233
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 233

Claims (18)

  1. 一種經分離抗-ANGPTL4抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)SEQ ID NO：7之重鏈可變區互補決定區(HCDR)1、SEQ ID NO：8之HCDR2及SEQ ID NO：9之HCDR3；及SEQ ID NO：17之輕鏈可變區互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO：18之LCDR2及SEQ ID NO：19之LCDR3；或(ii)SEQ ID NO：10之HCDR1、SEQ ID NO：11之HCDR2、SEQ ID NO：12之HCDR3；及SEQ ID NO：20之LCDR1、SEQ ID NO：21之LCDR2及SEQ ID NO：22之LCDR3。
  2. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：13具有至少90%序列一致性之重鏈可變域。
  3. 如請求項1或2之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：23具有至少90%序列一致性的輕鏈可變域。
  4. 如請求項1或2之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：13具有至少90%序列一致性之重鏈可變域，及與SEQ ID NO：23具有至少90%序列一致性的輕鏈可變域。
  5. 如請求項1或2之經分離抗體或其抗原結合片段，其具有：包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈可變域；及包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的輕鏈可變域。
  6. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：28具有至少90%序列一致性的重鏈。
  7. 如請求項1或6之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：25具有至少90%序列一致性的輕鏈。
  8. 如請求項1或6之經分離抗體或其抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：28具有至少90%序列一致性的重鏈，且包含與SEQ ID NO：25具有至少90%序列一致性的輕鏈。
  9. 如請求項1或6之經分離抗體或其抗原結合片段，其具有：包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：28的重鏈。
  10. 如請求項1或6之經分離抗體或其抗原結合片段，其具有：包含SEQ ID NO：25的輕鏈。
  11. 如請求項1或6之經分離抗體或其抗原結合片段，其具有：包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：28的重鏈；及包含SEQ ID NO：25的輕鏈。
  12. 如請求項1、2及6中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段，其係單株抗體、人類化抗體、單鏈抗體、Fab片段、Fv片段、F(ab')2片段或scFv片段。
  13. 如請求項12之經分離抗體或其抗原結合片段，其係IgG1或IgG4同型(isotype)。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至13中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
  15. 一種如請求項1至13中任一項之經分離抗體或其抗原結合片段或如請求項14之醫藥組合物的用途，其用於製造供治療患者之ANGPTL4病症的藥物。
  16. 如請求項15之用途，其中該患者罹患重度高三酸甘油酯血症、肥胖相關高三酸甘油酯血症、V型高三酸甘油酯血症及乳糜微粒血症中之一或多者。
  17. 如請求項16之用途，其中該重度高三酸甘油酯血症係由血漿三酸甘油酯濃度>500mg/dL表徵。
  18. 如請求項15之用途，其中該患者罹患原發血脂異常、代謝症候群及2型糖尿病中之一或多者。
TW104125679A 2014-08-07 2015-08-06 血管生成素樣４抗體及其使用方法 TWI675043B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462034409P 2014-08-07 2014-08-07
US62/034,409 2014-08-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201613978A TW201613978A (en) 2016-04-16
TWI675043B true TWI675043B (zh) 2019-10-21

Family

ID=53836146

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104125679A TWI675043B (zh) 2014-08-07 2015-08-06 血管生成素樣４抗體及其使用方法

Country Status (32)

Country Link
US (4) US9771417B2 (zh)
EP (2) EP4122957A1 (zh)
JP (4) JP6649358B2 (zh)
KR (2) KR20240056627A (zh)
CN (1) CN107148428B (zh)
AP (1) AP2017009721A0 (zh)
AR (1) AR101486A1 (zh)
AU (1) AU2015300685B2 (zh)
BR (1) BR112017002173B1 (zh)
CA (1) CA2957219A1 (zh)
CL (1) CL2017000212A1 (zh)
CO (1) CO2017001087A2 (zh)
CR (1) CR20170040A (zh)
CU (1) CU24453B1 (zh)
DK (1) DK3177642T3 (zh)
EA (1) EA201790336A1 (zh)
EC (1) ECSP17013904A (zh)
ES (1) ES2906216T3 (zh)
IL (1) IL250289B2 (zh)
JO (1) JO3565B1 (zh)
MA (1) MA40512A (zh)
MX (2) MX2017001746A (zh)
NZ (1) NZ728425A (zh)
PE (1) PE20170287A1 (zh)
PH (1) PH12017500156A1 (zh)
PL (1) PL3177642T3 (zh)
PT (1) PT3177642T (zh)
SG (2) SG10201805646WA (zh)
TN (1) TN2017000019A1 (zh)
TW (1) TWI675043B (zh)
UY (1) UY36262A (zh)
WO (1) WO2016020880A2 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3194437B1 (en) 2014-08-07 2021-01-20 Novartis AG Angiopoietin-like 4 (angptl4) antibodies and methods of use
KR20240056627A (ko) 2014-08-07 2024-04-30 노파르티스 아게 안지오포이에틴-유사 4 항체 및 사용 방법
GB2569144B (en) * 2017-12-06 2021-06-16 Proimmune Ltd Method for screening the activity of mutated expressed polypeptides
CN111868082A (zh) * 2018-02-02 2020-10-30 博奥泰克尼公司 调节vista和vsig3的相互作用的化合物及其制备和使用方法
CR20210492A (es) * 2019-03-26 2021-11-19 Janssen Pharmaceutica Nv ANTICUERPOS CONTRA AMILOIDES-ß CON PIROGLUTAMATO Y USOS DE ESTOS
WO2023175022A1 (en) * 2022-03-16 2023-09-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method to treat infectious diseases

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006074228A1 (en) * 2005-01-07 2006-07-13 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies against angiopoietin-like protein 4 (angptl4 )
WO2011079257A2 (en) * 2009-12-24 2011-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to human angiopoietin-like protein 4

Family Cites Families (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
JPH02500329A (ja) 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69123241T2 (de) 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
ES2202310T3 (es) 1991-12-13 2004-04-01 Xoma Corporation Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
DK1087013T3 (da) 1992-08-21 2009-05-11 Univ Bruxelles Immunoglobuliner uden lette kæder
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
AU1397895A (en) 1993-12-22 1995-07-10 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptide analogs of the activated platelet binding site on factor xi
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
CA2196200A1 (en) 1994-07-29 1996-02-15 Michael Joseph Browne Novel compounds
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
MA24512A1 (fr) 1996-01-17 1998-12-31 Univ Vermont And State Agrienl Procede pour la preparation d'agents anticoagulants utiles dans le traitement de la thrombose
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US7368531B2 (en) 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
CA2304254C (en) 1997-06-11 2012-05-22 Hans Christian Thogersen Trimerising module
EP0985039B1 (en) 1997-06-12 2008-02-20 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
US6030831A (en) 1997-09-19 2000-02-29 Genetech, Inc. Tie ligand homologues
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
US7001766B2 (en) 1999-07-20 2006-02-21 Curagen Corporation Nucleic acid sequences encoding human angiopoietin-like polypeptides
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
NZ521540A (en) 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
CA2405709A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2441903C (en) 2000-05-26 2012-07-31 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
ATE378403T1 (de) 2000-11-30 2007-11-15 Medarex Inc Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humänen antikörpern
AU2002245978A1 (en) 2001-04-04 2002-10-21 Jane E. Aubin Estrogen receptor-related receptor alpha (err) agonist for inducing cartilage formation
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
EP1443961B1 (en) 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
US20040180855A1 (en) 2003-02-19 2004-09-16 Schumacher William A. Methods of treating thrombosis with reduced risk of increased bleeding times
WO2004089297A2 (en) 2003-04-02 2004-10-21 Suntory Pharmaceutical Research Laboratories, Llc Compounds and methods for treatment of thrombosis
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
CA2531796A1 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Transtech Pharma, Inc. Aryl and heteroaryl compounds, compositions, and methods of use
CA2553692C (en) 2004-01-20 2014-10-07 Kalobios, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
US8604185B2 (en) 2004-07-20 2013-12-10 Genentech, Inc. Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use
BRPI0513534A (pt) 2004-07-20 2008-05-06 Genentech Inc inibidores de proteìna 4 semelhante à angiopoietina, combinações, e seu uso
DK1781698T3 (en) 2004-07-20 2016-10-03 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE USE OF Angiopoietin-like-4-PROTEIN
EP1773771A2 (en) 2004-07-23 2007-04-18 Daiamed, Inc. Compounds and methods for treatment of thrombosis
US7459564B2 (en) 2005-01-13 2008-12-02 Bristol-Myers Squibb Company Substituted biaryl compounds as factor XIa inhibitors
CA2648522A1 (en) 2005-04-04 2006-10-12 Daiamed, Inc. Substituted azetidinones
US20070041905A1 (en) 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AU2006283532B2 (en) 2005-08-19 2012-04-26 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
JP5225098B2 (ja) 2005-12-14 2013-07-03 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 第ＸＩａ因子インヒビターとしてのアリールプロピオンアミド、アリールアクリルアミド、アリールプロピンアミド、またはアリールメチルウレアアナログ
WO2007109307A2 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 Curagen Corporation Antibodies directed to angiopoietin-like protein 4 and uses thereof
EP2222707B1 (en) 2007-11-21 2016-01-06 Oregon Health & Science University Anti-factor xi monoclonal antibodies and methods of use thereof
US8168586B1 (en) 2007-11-21 2012-05-01 Celera Corporation Cancer targets and uses thereof
ES2380648T3 (es) 2008-03-13 2012-05-17 Bristol-Myers Squibb Company Derivados de piridazina como inhibidores del factor XIA
TR201820051T4 (tr) 2008-06-19 2019-01-21 Prothix Bv Anti-faktör XI Antikorlarının Trombüs Oluşumunun Engellenmesi Veya Tedavisi İçin Kullanılması
NZ592203A (en) 2008-10-15 2013-01-25 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of factor 11 expression
JP5823871B2 (ja) 2008-12-10 2015-11-25 アブリンクス エン．ヴェー． 血管新生に関連した疾患及び障害の治療のための、アンジオポイエチン／Ｔｉｅシステムに指向性を有するアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド
US20120207770A1 (en) 2009-10-14 2012-08-16 Nanyang Technological University Antiproliferative agent
WO2012088302A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Half immunoglobulin binding proteins and uses thereof
CN102692500B (zh) * 2011-03-21 2015-06-10 上海市肿瘤研究所 Angptl4作为血清学检测肝癌转移的标志物及其应用
US20140242084A1 (en) * 2011-08-08 2014-08-28 Nanyang Technological University Angiopoietin-Like 4 and Its Use in Modulating Cell Leakiness
AU2013245630A1 (en) 2012-04-13 2014-10-30 The Johns Hopkins University Treatment of ischemic retinopathies
PL2847228T3 (pl) 2012-05-10 2019-03-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Przeciwciała zdolne do wiązania się z czynnikiem krzepnięcia XI i/lub jego aktywowaną postacią, czynnikiem Xla oraz ich zastosowanie
CN104768972B (zh) 2012-08-14 2019-12-06 南洋理工大学 血管生成素样4抗体及其用在癌症治疗中的方法
KR20240056627A (ko) 2014-08-07 2024-04-30 노파르티스 아게 안지오포이에틴-유사 4 항체 및 사용 방법
EP3194437B1 (en) 2014-08-07 2021-01-20 Novartis AG Angiopoietin-like 4 (angptl4) antibodies and methods of use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006074228A1 (en) * 2005-01-07 2006-07-13 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies against angiopoietin-like protein 4 (angptl4 )
WO2011079257A2 (en) * 2009-12-24 2011-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to human angiopoietin-like protein 4

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lee, E-Chiang, et al. "Identification of a new functional domain in angiopoietin-like 3 (ANGPTL3) and angiopoietin-like 4 (ANGPTL4) involved in binding and inhibition of lipoprotein lipase (LPL)." Journal of Biological Chemistry 284.20 (2009): 13735-13745. *

Also Published As

Publication number Publication date
PH12017500156A1 (en) 2017-05-29
JP2017529324A (ja) 2017-10-05
WO2016020880A2 (en) 2016-02-11
ECSP17013904A (es) 2019-02-28
AU2015300685B2 (en) 2018-07-19
US20160145326A1 (en) 2016-05-26
SG10201805646WA (en) 2018-08-30
CN107148428A (zh) 2017-09-08
IL250289A0 (en) 2017-03-30
CU20170012A7 (es) 2017-04-05
KR102659872B1 (ko) 2024-04-24
US20220213181A1 (en) 2022-07-07
EP4122957A1 (en) 2023-01-25
CU24453B1 (es) 2019-11-04
CA2957219A1 (en) 2016-02-11
PL3177642T3 (pl) 2022-03-07
TW201613978A (en) 2016-04-16
US20180044410A1 (en) 2018-02-15
MX2017001746A (es) 2017-04-27
PE20170287A1 (es) 2017-04-05
EA201790336A1 (ru) 2017-06-30
US10577411B2 (en) 2020-03-03
NZ728425A (en) 2022-05-27
BR112017002173B1 (pt) 2023-11-21
UY36262A (es) 2016-04-01
TN2017000019A1 (en) 2018-07-04
IL250289B2 (en) 2023-02-01
DK3177642T3 (da) 2022-02-21
WO2016020880A3 (en) 2016-05-19
JP6649358B2 (ja) 2020-02-19
KR20240056627A (ko) 2024-04-30
CR20170040A (es) 2017-04-28
JP2024026226A (ja) 2024-02-28
PT3177642T (pt) 2022-02-14
MA40512A (fr) 2021-03-24
EP3177642A2 (en) 2017-06-14
KR20170039711A (ko) 2017-04-11
US9771417B2 (en) 2017-09-26
EP3177642B1 (en) 2021-11-24
AR101486A1 (es) 2016-12-21
JO3565B1 (ar) 2020-07-05
ES2906216T3 (es) 2022-04-13
US20200392215A1 (en) 2020-12-17
IL250289B (en) 2022-10-01
AU2015300685A1 (en) 2017-02-23
CO2017001087A2 (es) 2017-05-10
MX2022002635A (es) 2022-03-25
CN107148428B (zh) 2021-03-09
BR112017002173A2 (pt) 2017-11-21
AP2017009721A0 (en) 2017-01-31
JP2020075929A (ja) 2020-05-21
CL2017000212A1 (es) 2017-07-14
JP2022058685A (ja) 2022-04-12
SG11201700473QA (en) 2017-02-27
JP7397104B2 (ja) 2023-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108350072B (zh) 治疗fgf21相关病症的方法
TWI675043B (zh) 血管生成素樣４抗體及其使用方法
US9988455B2 (en) Methods of treating cardiovascular disorders with lectin-like oxidized LDL receptor 1 antibodies
CN105492462B (zh) 凝集素样氧化的ldl受体1抗体和使用方法
US9988443B2 (en) Angiopoetin-like 4 (ANGPTL4) antibodies and methods of use
JP6991246B2 (ja) Ｆｇｆ２１模倣抗体及びその使用
EA041397B1 (ru) Антитела к ангиопоэтинподобному белку 4 и способы применения