JP6649358B2 - アンジオポエチン様４抗体および使用法 - Google Patents

アンジオポエチン様４抗体および使用法 Download PDF

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Description

発明の背景
アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）とは、分泌タンパク質のアンジオポエチン様ファミリーのメンバーである。ＡＮＧＰＴＬ４は、二量体および四量体を形成することが可能なホモオリゴマータンパク質であって、マクロファージ、脂肪、筋肉、および肝細胞を含む細胞型によって発現するホモオリゴマータンパク質である。ＡＮＧＰＴＬ４はまた、肝臓フィブリノーゲン／アンジオポエチン関連タンパク質（ＨＦＡＲＰ）（Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610）、ＰＰＡＲガンマアンジオポエチン関連タンパク質（ＰＧＡＲ）（Yoon, et al. (2000) Mol. Cell Biol., 20:5343-5349）、および空腹誘導性脂肪細胞因子（ＦＩＡＦ）（Kerten et al. (2000) J. Biol. Chem., 275:28488-28493）としても公知である。ＡＮＧＰＴＬ４は、Ｎ末端のコイルドコイルドメインと、Ｃ末端のフィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインとを含有する（Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610）。
リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、血中のリポタンパク質レベルの維持を含み、その活性の組織特異的調節を介するリポタンパク質代謝において、中心的な役割を果たす。ＡＮＧＰＴＬ４のコイルドコイル領域は、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）に媒介されるトリグリセリド（ＴＧ）クリアランスを阻害することが公知である。したがって、ＡＮＧＰＴＬ４の機能喪失突然変異（例えば、ヒト対象において見られる）、遺伝子の欠失（例えば、トランスジェニックマウスにおいて見られる）、および抗体による阻害（例えば、マウスおよびカニクイザルにおいて見られる）は全て、血漿トリグリセリドを減少させることが観察されている。さらに、ＡＮＧＰＴＬ４抗体はまた、ＬＰＬを活性化させることが公知でもある。逆に、ＡＮＧＰＴＬ４の、マウスへの注射は、循環トリグリセリドの急速な増大をもたらし、この速度は、アンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）を注射した場合より大きい（Yoshida et al. (2002) J Lipid Res 43:1770-1772）。
本発明で記載される抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原結合性断片は、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４によるＬＰＬの阻害を遮断し、これにより、血漿トリグリセリドを減少させることにより、ＬＰＬの活性化を開始、促進、または増強する。これらの抗体は、トリグリセリドレベルの上昇を特徴とする疾患、例えば、原発性脂質異常症（primary dyslipidemia）、高トリグリセリド血症、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病などの、急性症状および慢性症状を防止および改善することが期待される。
発明の要旨
本発明は、ヒトアンジオポエチン様４タンパク質（以下、場合によって、「ＡＮＧＰＴＬ４」と称する）に結合するモノクローナル抗体、ならびにこれを含む医薬組成物および処置方法に関する。
本明細書で記載される単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗原結合性断片は、１００ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する。例えば、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、１５０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、７５０ｐＭ以下、６００ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、７５ｐＭ以下、６５ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５５ｐＭ以下のＫＤで、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態結合アッセイにより測定される４５ｐＭ以下のＫＤ、または溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定される２４ｐＭ以下のＫＤで、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合することも可能であり、また、ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態結合アッセイにより測定される８７ｐＭ以下のＫＤ、またはＳＥＴにより測定される２２ｐＭ以下のＫＤで、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４にも結合しうる。
本発明は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ４に結合し、表１に記載されている抗体との結合についてさらに競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はまた、表１に記載されている抗体と同じエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にもさらに関する。
本明細書で記載される単離抗体および抗原結合性断片の結合アフィニティーは、溶解平衡滴定（ＳＥＴ）により決定することができる。当技術分野では、ＳＥＴ法が知られており、以下でさらに詳細に記載される。代替的に、本明細書で記載される単離抗体または断片の結合アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより決定することもできる。当技術分野では、Ｂｉａｃｏｒｅ反応速度アッセイ法が知られており、以下でさらに詳細に記載される。
本明細書で記載される単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原結合性断片を使用して、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または３ｎＭ以下のＥＣ５０で、ＡＮＧＰＴＬ４の、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）への結合を阻害することができる。
単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合性断片を使用して、循環トリグリセリド（ＴＧ）レベルを低減することができる。
本明細書で記載される単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそれらの抗原結合性断片は、モノクローナル抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはｓｃＦｖ断片、および／またはＩｇＧアイソタイプでありうる。
本明細書で記載される単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそれらの抗原結合性断片はまた、アミノ酸が、ヒトＶＨ生殖細胞系列配列またはヒトＶＬ生殖細胞系列配列のそれぞれに由来する抗体フレームワークへと置換されたフレームワークも含みうる。
本発明の別の態様は、表１に記載されているヒト化抗体の完全重鎖および軽鎖配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、ＮＥＧ３１９の重鎖および軽鎖配列を有しうる。
本発明のさらなる態様は、表１に記載されているヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、ＮＥＧ３１９の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有しうる。
本発明はまた、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、および１３２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１３４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。別の態様では、このような単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む。
本発明はまた、配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含み、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号７、８、および９を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号１７、１８、および１９を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号３２、３３、および３４を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号４２、４３、および４４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号５２、５３、および５４を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号６２、６３、および６４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号７２、７３、および７４を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号８２、８３、および８４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号９２、９３、および９４を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号１０２、１０３、および１０４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号１１２、１１３、および１１４を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号１２２、１２３、および１２４を含むか；またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号１３２、１３３、および１３４を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号１４２、１４３、および１４４を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８の重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８の軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する抗体または抗原結合性断片にも関する。本発明の別の態様では、抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定される、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８の重鎖可変ドメイン配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８の軽鎖可変ドメイン配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有しうる。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む。単離抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可能であり、この場合、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとは、組み合わさって、ＡＮＧＰＴＬ４に対する抗原結合性部位を形成する。特に、軽鎖可変ドメイン配列は、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８から選択することができ、この場合、前記単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する。
本発明はまた、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。単離抗体または抗原結合性断片は、重鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可能であり、この場合、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとは、組み合わさって、ＡＮＧＰＴＬ４に対する抗原結合性部位を形成する。
特に、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１３および２３；３８および４８；５８および６８；７８および８８；９８および１０８；１１８および１２８；または１３８および１４８、の配列をそれぞれ含む、重鎖および軽鎖可変ドメインを有しうる。
本発明はさらに、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインも含む。本発明のさらなる態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定され、表１に記載されている、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する。
本発明はまた、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する。
本発明の別の態様では、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１００、１２０、および１４０の配列を含む重鎖を有しうる。単離抗体はまた、重鎖と組み合わさって、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に対する抗原結合性部位を形成しうる軽鎖も含みうる。特に、軽鎖は、配列番号２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５０を含む配列を有しうる。特に、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１５および２５；２８および２５；４０および５０；６０および７０；８０および９０；１００および１１０；１２０および１３０；または１４０および１５０、のそれぞれの配列を含む重鎖および軽鎖を有しうる。
本発明はなおさらに、配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１００、１２０、および１４０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖も含む。
本発明はなおさらに、配列番号２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５０からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する。
本発明はなおさらに、結合について、本明細書で記載される抗体または抗原結合性断片、例えば、ヒト化抗体であるＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、およびＮＥＧ３１９と競合する、単離抗体または抗原結合性断片にも関する。一実施形態では、２つの抗体または抗原結合性断片が、等モル濃度で存在する場合、本発明の単離抗体または抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、およびＮＥＧ３１９から選択されるヒト化抗体によるＡＮＧＰＴＬ４の結合を、５０％を超えて阻害することが可能である。
別の実施形態では、２つの抗体または抗原結合性断片が、等モル濃度で存在する場合、本発明の単離抗体または抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、およびＮＥＧ３１９から選択されるヒト化抗体によるＡＮＧＰＴＬ４の結合を、８０％を超えて阻害することが可能である。さらに他の実施形態では、２つの抗体または抗原結合性断片が、等モル濃度で存在する場合、本発明の単離抗体または抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、およびＮＥＧ３１９から選択されるヒト化抗体によるＡＮＧＰＴＬ４の結合を、８５％（または９０％、９５％、９８％、または９９％）を超えて阻害することが可能である。
本発明はまた、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。本発明は同様に、医薬的に許容される担体と組み合わせた抗体組成物にも関する。具体的に、本発明はさらに、例えば、ヒト化抗体であるＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、ＮＥＧ３１９など、表１の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を含む。本発明はまた、表１の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちの２つ以上の組合せを含む医薬組成物にも関する。
本発明はまた、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８から選択される配列を有する、重鎖可変ドメインをコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号１４、２７、３９、５９、７９、９９、１１９、および１３９からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性の配列（a sequence at least 90% sequence identity）を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号１４、２７、３９、５９、７９、９９、１１９、または１３９である。
本発明はまた、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８から選択される配列を有する軽鎖可変ドメインをコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号２４、３１、４９、６９、８９、１０９、１２９、および１４９からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性の配列（a sequence at least 90% sequence identity）を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号２４、３１、４９、６９、８９、１０９、１２９、または１４９である。
本発明はまた、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸にも関する。
本発明はまた、本明細書で記載される核酸分子のうちの１つまたは複数を含むベクターにも関する。
本発明はまた、上記で記載した抗体の重鎖をコードする組換えＤＮＡ配列と、上記で記載した抗体の軽鎖をコードする第２の組換えＤＮＡ配列とを含む単離宿主細胞にも関し、この場合、前記ＤＮＡ配列は、プロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞内で発現することが可能である。抗体は、ヒト化抗体でありうることが企図される。また、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物細胞であることも企図される。
細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。一実施形態では、細胞は、内皮細胞であることが企図される。他の実施形態では、細胞は、脂肪、筋肉、および肝細胞のうちの１つまたは複数でありうる。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
本発明はまた、患者におけるＡＮＧＰＴＬ４関連障害を処置、改善、または防止する方法であって、患者へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む、方法にも関する。一態様では、ＡＮＧＰＴＬ４関連障害は、高トリグリセリド血症（例えば、重度の高トリグリセリド血症（例えば、血漿トリグリセリド濃度が＞５００ｍｇ／ｄＬである）、肥満と関連する高トリグリセリド血症、およびＶ型高トリグリセリド血症）と関連する。他の態様では、ＡＮＧＰＴＬ４関連障害は、原発性脂質異常症、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病と関連する。患者は、ヒトであることも企図される。
前出の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちのいずれも、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片でありうる。
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
「ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質」または「ＡＮＧＰＴＬ４抗原」または「ＡＮＧＰＴＬ４」という用語は、互換的に使用され、異なる種におけるアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）タンパク質を指す。例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ４は、表１（配列番号１）に示される配列を有し、先行の報告および文献（Nature, Vol. 386, p. 73-77, 1997；Genomics, Vol. 54, No. 2, p. 191-199, 1998；Biochem. J., Vol. 339, Part 1, P. 177-184, 1999；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ００２５３４）において記載されている。ＡＮＧＰＴＬ４は、Ｎ末端のコイルドコイルドメインと、Ｃ末端のフィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインとを含有する（Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610）。ＡＮＧＰＴＬ４は、二量体および四量体を形成することが可能なホモオリゴマータンパク質であって、マクロファージ、脂肪、筋肉、および肝細胞を含む細胞型によって発現し、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）に媒介されるトリグリセリド（ＴＧ）クリアランスを阻害することが公知の、ホモオリゴマータンパク質である。
加えて、本発明の文脈では、「ＡＮＧＰＴＬ４」という用語は、天然のアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）タンパク質の突然変異体であって、上述の報告において記載されている、天然の一次構造（アミノ酸配列）のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する、突然変異体を含む。本明細書では、「実質的に同じアミノ酸配列を有する、天然のヒトアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）タンパク質の突然変異体」という用語は、このような突然変異体のタンパク質を指す。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合性部分」）またはそれらの単鎖体を意味する。全抗体は、ジスルフィド結合により相互接続される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよび各ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４からなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性部分」または「抗原結合性断片」という用語は、所与の抗原（例えば、ヒト酸化ＬＤＬ受容体（ＡＮＧＰＴＬ４））に特異的に結合する能力を保持する、インタクトな抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は、インタクトな抗体の断片により果たされうる。抗体の抗原結合性部分または抗原結合性断片という用語内に包含される結合性断片の例は、Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；ならびに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬドメインおよびＶＨドメインは、個別の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖として作製することを可能とする人工のペプチドリンカーにより付着することができ、この場合、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり、例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426；およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照されたい）を形成する。このような単鎖抗体は、抗体の１つまたは複数の抗原結合性部分または抗原結合性断片を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片も、インタクトな抗体と同じ形で有用性についてスクリーニングされる。
抗原結合性断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖ（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参照されたい）へと組み込むこともできる。抗体の抗原結合性部分は、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチド（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）に基づく足場へとグラフトすることができる。
抗原結合性断片は、相補的な軽鎖ポリペプチドと併せて抗原結合性領域の対を形成する、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む単鎖分子へと組み込むことができる（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062；および米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
本明細書で使用される「アフィニティー」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位において、弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用し、相互作用が大きいほど、アフィニティーは強くなる。抗体またはその抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片）について本明細書で使用される「高アフィニティー」という用語は一般に、ＫＤが１０−９Ｍ以下の抗体または抗原結合性断片を指す。
「アミノ酸」という用語は、自然発生のアミノ酸および合成アミノ酸のほか、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。自然発生のアミノ酸とは、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のほか、後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンでもある。アミノ酸類似体とは、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したアルファ炭素を有する化合物を指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、１つの抗原決定基だけと反応する個別の抗原結合部位の能力を指す。
抗体（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体）に「特異的に（または選択的に）結合する」という語句は、タンパク質および他の生体物質の異質な集団内のコグネイト抗原（例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ４またはカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）の存在を決定する結合反応を指す。本明細書では、「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句が、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
「ＡＮＧＰＴＬ４に媒介された」という用語は、ＡＮＧＰＴＬ４は、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）に媒介されるトリグリセリド（ＴＧ）クリアランスを阻害し、これにより、トリグリセリドレベルを上昇させることが公知であるという事実を指す。
本明細書で使用される「ＡＮＧＰＴＬ４関連障害」、「ＡＮＧＰＴＬ４関連状態」、または類似の用語は、ＡＮＧＰＴＬ４ＡＮＧＰＴＬ４ ＡＮＧＰＴＬ４に媒介されるＬＰＬの阻害の低減およびリポタンパク質のモジュレーションが求められる、任意の数の状態または疾患を指す（any number of conditions or diseases in which ANGPTL4ANGPTL4 a reduction of ANGPTL4-mediated LPL inhibition and lipoprotein modulation is sought）。これらの状態は、高脂血症、高リポタンパク血症、および脂質異常症など、脂質代謝に関与する状態であって、アテローム性脂質異常症、糖尿病性脂質異常症、高トリグリセリド血症（例えば、重度の高トリグリセリド血症（例えば、血漿トリグリセリド濃度が＞５００ｍｇ／ｄＬである）、肥満と関連する高トリグリセリド血症、およびＶ型高トリグリセリド血症）、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、混合型脂質異常症（肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病など）、リポジストロフィー、脂肪萎縮症、ならびに、例えば、ＬＰＬ活性の低下および／またはＬＰＬの欠損、ＬＤＬ受容体の活性の低下および／またはＬＤＬ受容体の欠損、ＡｐｏＣ２の改変、ＡｐｏＥの欠損、ＡｐｏＢの増大、極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生の増大および／またはＶＬＤＬの消失の減少、ある種の薬物処置（例えば、グルココルチコイド処置に誘導される脂質異常症）、任意の遺伝的素因、食餌、生活様式などにより引き起こされる他の状態を含む、状態を含むがこれらに限定されない。
高脂血症、高リポタンパク血症、および／または脂質異常症と関連するか、またはこれらから生じる、他のＡＮＧＰＴＬ４関連疾患または障害は、アテローム性動脈硬化、動脈瘤、高血圧症、狭心症、脳卒中、脳血管疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患などの心血管疾患または障害；急性膵炎；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；糖尿病などの血糖障害；肥満などを含むがこれらに限定されない。
「キメラ抗体」という用語は、（ａ）抗原結合性部位（可変領域）を、クラス、エフェクター機能、および／もしくは種が異なるか、またはクラス、エフェクター機能、および／もしくは種を改変された定常領域、あるいはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などへと連結するように、定常領域またはその一部を、改変するか、置きかえるか、または交換した抗体分子；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部を、抗原特異性が異なるか、または抗原特異性を改変された可変領域により改変するか、置きかえるか、またはこれと交換した抗体分子である。例えば、マウス抗体は、その定常領域を、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域で置きかえることにより修飾することができる。ヒト定常領域による置きかえに起因して、キメラ抗体は、ヒトにおける抗原性を、元のマウス抗体と比較して低減しながら、抗原の認識におけるその特異性を保持しうる。
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一なアミノ酸配列もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、多数の機能的に同一な核酸が、所与の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンであるＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵのいずれも、アミノ酸であるアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを改変せずに、コドンを、記載された対応するコドンのうちのいずれかへと改変することができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異のうちの１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、核酸内の各コドン（通常メチオニンだけのコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンだけのコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一な分子をもたらしうることを認識するであろう。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が含意されている。
ポリペプチド配列では、「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸による置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個別の置換、欠失、または付加を含む。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換表が周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。以下の８つの群：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する（例えば、Creighton, Proteins(1984)を参照されたい）。いくつかの実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴にそれほど大きな影響を及ぼしたりこれを改変したりしないアミノ酸修飾を指すのに使用する。
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的な結合が可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通例、アミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からなり、通例、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有する。コンフォメーショナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープとは、前者への結合は、変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域のいずれもが、ヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列またはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させたバージョンに由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異により導入された突然変異）を含みうる。
「ヒト化」抗体とは、例えば、マウスモノクローナル抗体、ヒトにおいて治療剤として投与される場合の免疫原性は小さいが、非ヒト抗体の抗原特異的反応性を保持する抗体である。例えば、Robello et al., Transplantation, 68: 1417-1420を参照されたい。これは、例えば、非ヒト抗原結合性領域を保持し、抗体の残りの部分を、それらのヒト対応物（すなわち、定常領域、ならびに可変領域の結合に関与しない部分）で置きかえることにより達成することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984；Morrison and Oi、Adv. Immunol., 44:65-92, 1989；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988；Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991；およびPadlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994を参照されたい。ヒト操作技術の他の例は、米国特許第５，７６６，８８６号明細書において開示されているＸｏｍａ技術を含むがこれらに限定されない。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一な」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手作業のアライメントおよび目視により測定される比較域または指定領域にわたり、最大の対応性について比較され、配列決定された場合の、２つの配列の、指定された百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じであれば（すなわち、指定される領域にわたる、または、指定されない場合は、配列全体にわたる、６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有すれば）、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、１００〜５００、または１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、または２００アミノ酸以上）の長さの領域にわたり存在する。
配列比較では、１つの配列が、それに照らして被験配列を比較する基準配列として働くことが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および基準配列をコンピュータへと入力し、必要な場合は、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもでき、代替的なパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づき、被験配列について、基準配列と比べた配列同一性パーセントを計算する。
本明細書で使用される「比較域」は、２つの配列を最適に配列決定した後で、配列を、同じ数の連続的な位置による基準配列と比較しうる、２０〜６００、通例約５０〜約２００、より通例では、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続的な位置の数のうちのいずれか１つによるセグメントに対する言及を含む。当技術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cによる局所相同性アルゴリズムにより行うこともでき、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970による相同性アライメントアルゴリズムにより行うこともでき、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988による類似性の方法の検索（search for similarity method）により行うこともでき、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により行うこともでき、手作業のアライメントおよび目視（例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.（Ringbou ed., 2003）を参照されたい）により行うこともできる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの２つの例は、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990において記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードで配列決定したときに、ある正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列内の短いワード長Ｗを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを伴う。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（Altschul et al.,前出）と称する。これらの初期の隣接ワードヒットが、これらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメントスコアが増大しうる限りにおいて、ワードヒットを、各配列に沿っていずれの方向にも拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、達成されたその最大値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたは複数の負スコア残基のアライメントの累積のために、累積スコアが、ゼロ以下に低下した場合；または配列のいずれかの末端に達した場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムでは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性についての統計学的解析（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照されたい）も実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチングが偶然に生じる確率の指標をもたらす最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被験核酸を基準核酸に照らして比較したときの最小合計確率が約０．２未満であり、より好ましくは、約０．０１未満であり、最も好ましくは、約０．００１未満であれば、核酸は基準配列と類似すると考えられる。
２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、E. Meyers and W. Miller（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネット上のgcg.comで入手可能である）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、Needleman and Wunsch（J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。
上記で言及した配列同一性百分率以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけによって異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一なことが典型的である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、２つの分子またはそれらの相補体が、厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅しうることである。
「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞内物質および／または化学物質を実質的に含まない場合もある。
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によりもたらされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧ）を指す。アイソタイプはまた、これらのクラスのうちの１つの修飾バージョンも含み、その修飾は、Ｆｃ機能を改変する、例えば、エフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増強または低減するように施されている。
本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語が、特定の抗体−抗原間相互作用の会合速度を指すことを意図するのに対し、本明細書で使用される「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離速度を指すことを意図する。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指すことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表す。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用して表面プラズモン共鳴を測定するか、または溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により溶液中のアフィニティーを測定するステップを含む。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成による抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
本明細書では、「核酸」という用語が、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態または二本鎖形態におけるポリマーを指す。「核酸」という用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは修飾連結を含有する核酸であって、合成の核酸、自然発生の核酸、および非自然発生の核酸であり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと同様の形で代謝される核酸を包含する。このような類似体の例は、限定なしに述べると、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
別段に指し示されない限りにおいて、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も暗示的に包含するほか、明示的に指し示される配列も包含する。とりわけ、下記で詳述される通り、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作り出すことにより達成することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的関係を指す。「作動可能に連結された」という用語は、転写調節配列の、転写される配列に対する機能的関係を指すことが典型的である。例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内または他の発現系内のコード配列の転写を刺激またはモジュレートするとき、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列と物理的に隣接する、すなわち、シス作用型である。しかし、エンハンサーなど、一部の転写調節配列は、その転写をそれらが増強するコード配列に物理的に隣接する必要も、近接して配置される必要もない。
本明細書で使用される「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列を、産生細胞または産生生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア（Pichia）属細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように改変していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としてもまた公知の出発ヌクレオチド配列により本来コードされるアミノ酸配列を、完全に、または可能な限り多く保持するように操作する。本明細書の最適化された配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しかし、本明細書ではまた、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も企図される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されていると称する。
本明細書では、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語が、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーのほか、自然発生のアミノ酸ポリマーおよび非自然発生のアミノ酸ポリマーにも適用される。別段に指し示されない限りにおいて、特定のポリペプチド配列はまた、保存的に修飾されたその変異体も暗示的に包含する。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子 配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、他の任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体など、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される、全てのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある種の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、これらに関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内で天然には存在しない可能性がある配列である。
「組換え宿主細胞」（または、簡単に、「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけを指すことを意図するものではなく、このような細胞の子孫細胞も指すことを意図するものであることを理解されたい。後続する世代では、突然変異または環境的影響に起因して、ある種の修飾が生じうるため、このような子孫細胞は、実のところ、親細胞と同一ではない可能性もあるが、やはり本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、非ヒト霊長動物（例えば、カニクイザル）、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物）を含む。特記される場合を除き、本明細書では、「患者」または「対象」という用語が互換的に使用される。本明細書で使用される「カニクイザル（cyno）」または「カニクイザル（cynomolgus）」という用語は、カニクイザル（cynomolgus monkey）（カニクイザル（Macaca fascicularis））を指す。
一実施形態では、本明細書で使用される、任意の疾患または障害（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４関連障害）「〜を処置すること」またはこれらの「処置」という用語は、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患またはその臨床症状のうちの少なくとも１つの発症を緩徐化するか、停止させるか、または軽減すること）を指す。別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、患者により識別可能でない可能性があるパラメータを含む少なくとも１つの物理的パラメータを緩和または改善することを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害を、物理的にモジュレートする（例えば、識別可能な症状の安定化）か、生理学的にモジュレートする（例えば、物理的（physical）パラメータの安定化）か、または物理的かつ生理学的にモジュレートすることを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害の発生または発症または進行を防止するかまたは遅延させることを指す。
例えばＡＮＧＰＴＬ４関連障害を含む、本明細書で記載される適応に関する場合の「防止」とは、例えば、前記悪化の危険性がある患者における、下記で記載される、ＡＮＧＰＴＬ４関連疾患パラメータの悪化を防止または緩徐化する任意の作用を意味する。
「ベクター」という用語は、それが連結された別のポリヌクレオチドを輸送することが可能なポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターのうちの１つの種類は、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノムへとライゲーションしうる、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶまたはＡＡＶ２）などのウイルスベクターである。ある種のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）は、それらが導入された宿主細胞における自己複製が可能である。他のベクター（例えば、非哺乳動物のエピソームベクター）は、宿主細胞へと導入すると、宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿主ゲノムと共に複製する。さらに、ある種のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とを互換的に使用することができる。しかし、本発明は、同等な機能をもたらすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターの他の形態も含むことを意図する。
図１Ａ〜１Ｄは、本発明の、選択されたＡＮＧＰＴＬ４抗体による、ＡＮＧＰＴＬ４に媒介される、ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）タンパク質の阻害の逆転を描示する図である。 図１Ａ〜１Ｄは、本発明の、選択されたＡＮＧＰＴＬ４抗体による、ＡＮＧＰＴＬ４に媒介される、ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）タンパク質の阻害の逆転を描示する図である。 図２は、本発明の、選択された抗体の、全長ヒトＡＮＧＰＴＬ４およびヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端のコイルドコイルドメインへの結合と、ヒト全長ＡＮＧＰＴＬ３への結合の非存在とを描示する図である。ＡＮＧＰＴＬ３ Ａｂ＝ＡＮＧＰＴＬ３特異的基準抗体（reference antibody）である。 図３Ａ〜３Ｂは、本発明の、選択されたＡＮＧＰＴＬ４抗体の投与の後の、ヒトＡＮＧＰＴＬ４トランスジェニックマウスにおける、血漿トリグリセリドレベルの変化を描示する図である。 図４は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿総ヒト抗体濃度を描示する図である。 図５は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度の変化を描示する図である。 図６は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿総コレステロール濃度の変化を描示する図である。 図７は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）濃度の変化を描示する図である。 図８は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿総アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）濃度の変化を描示する図である。 図９は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体（ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ）の投与の後の、肥満した、糖尿病のカニクイザルにおける、血漿アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡｐｏＣ−ＩＩＩ）濃度の変化を描示する図である。 図１０は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体の投与の後の、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）による血漿リポタンパク質の分離により評価される、血漿リポタンパク質関連コレステロールレベルの変化を描示する図である。１匹のサルからのデータを示す（ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、サル６２９６）。略号：ＴＲＬ＝トリグリセリドに富むリポタンパク質；ＬＤＬ＝低密度リポタンパク質；ＨＤＬ＝高密度リポタンパク質。 図１１は、本発明の１つのＡＮＧＰＴＬ４抗体の投与の後の、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）による血漿リポタンパク質の分離により評価される、血漿リポタンパク質関連トリグリセリド（ＴＧ）レベルの変化を描示する図である。１匹のサルからのデータを示す（ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、サル６２９６）。略号：ＴＲＬ＝トリグリセリドに富むリポタンパク質；ＬＤＬ＝低密度リポタンパク質；ＨＤＬ＝高密度リポタンパク質。
詳細な説明
本発明は部分的に、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合し、その生物学的活性を阻害する抗体分子の発見に基づく。本発明は、完全ＩｇＧフォーマットの抗体（例えば、ヒト化抗体であるＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、ＮＥＧ３１９）、ならびにＦａｂ断片など、これらの抗原結合性断片の両方に関する。
したがって、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４（例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する抗体、医薬組成物、このような抗体および組成物の作製法および使用法を提供する。
ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合し、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）を活性化する能力を含む、その生物学的活性を阻害する抗体を提供する。
逆に（conversely）、
アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）とは、分泌タンパク質のアンジオポエチンファミリーのメンバーである。ＡＮＧＰＴＬ４は、二量体および四量体を形成することが可能なホモオリゴマータンパク質であって、マクロファージ、脂肪、筋肉、および肝細胞を含む細胞型によって発現するホモオリゴマータンパク質である。ＡＮＧＰＴＬ４はまた、肝臓フィブリノーゲン／アンジオポエチン関連タンパク質（ＨＦＡＲＰ）（Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610）、ＰＰＡＲガンマアンジオポエチン関連タンパク質（ＰＧＡＲ）（Yoon, et al. (2000) Mol. Cell Biol., 20:5343-5349）、および空腹誘導性脂肪細胞因子（ＦＩＡＦ）（Kerten et al. (2000) J. Biol. Chem., 275:28488-28493）としても公知である。ＡＮＧＰＴＬ４は、Ｎ末端のコイルドコイルドメインと、Ｃ末端のフィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインとを含有する（Kim et al. (2000) Biochem. J. 346:603-610）。
リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、リポタンパク質代謝において、血中の正常なリポタンパク質レベルを維持し、その活性の組織特異的調節を介して、いつ、どの組織に、トリグリセリド（ＴＧ）が取り込まれるのかを決定する、中心的な役割を果たす。ＡＮＧＰＴＬ４のコイルドコイル領域は、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）に媒介されるトリグリセリド（ＴＧ）クリアランスを阻害することが公知である。したがって、ＡＮＧＰＴＬ４の機能喪失突然変異（例えば、ヒト対象において見られる）、遺伝子の欠失（例えば、トランスジェニックマウスにおいて見られる）、および抗体による阻害（例えば、マウスおよびカニクイザルにおいて見られる）は全て、血漿トリグリセリドを減少させることが観察されている。さらに、ＡＮＧＰＴＬ４抗体はまた、ＬＰＬを活性化させることが公知でもある。逆に、ＡＮＧＰＴＬ４の、マウスへの注射は、循環トリグリセリドの急速な増大をもたらし、この速度は、アンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）を注射した場合より大きい（Yoshida et al. (2002) J Lipid Res 43:1770-1772）。
本発明で記載される抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原結合性断片は、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４によるＬＰＬの阻害を遮断し、これにより、血漿トリグリセリドを減少させることにより、ＬＰＬの活性化を開始、促進、または増強する。これらの抗体は、トリグリセリドレベルの上昇を特徴とする疾患、例えば、原発性脂質異常症、高トリグリセリド血症、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病などの、急性症状および慢性症状を防止および改善することが期待される。
本発明で記載される抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原結合性断片は、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４によるＬＰＬの阻害を遮断し、これにより、血漿トリグリセリドを減少させることにより、ＬＰＬの活性化を開始、促進、または増強する。これらの抗体は、トリグリセリドレベルの上昇を特徴とする疾患、例えば、原発性脂質異常症、高トリグリセリド血症、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病などの、急性症状および慢性症状を防止および改善することが期待される。
ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原結合性断片
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４にも特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、実施例で記載される通りに単離されたヒト化抗体およびＦａｂを含むがこれらに限定されない。
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する抗体であって、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＨ ＣＤＲを含む（または、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異的に結合する抗体であって、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する抗体であって、以下の表２に列挙されるＶＬ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＬ ＣＤＲを含む（または、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
本発明の他の抗体は、突然変異させているが、なお、ＣＤＲ領域内で、表１に記載されている配列内で描示されるＣＤＲ領域と、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、または９５パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明の他の抗体は、ＣＤＲ領域内で、表１に記載されている配列内で描示されるＣＤＲ領域と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させた、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、および全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳動物細胞における発現について最適化することができる（例えば、表１は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖に最適化された核酸配列を示す）。
表１：ＡＮＧＰＴＬ４抗体、Ｆａｂ、およびＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の例
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異させているが、表１に記載されている配列となお少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５パーセントの同一性を有する抗体を含む。いくつかの実施形態は、可変領域内で、実質的に同じ抗原結合活性を保持しながら、表１に記載されている配列内で描示された可変領域と比較した場合に、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させている、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
これらの抗体の各々は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合しうるので、ＶＨ配列、ＶＬ配列、全長軽鎖配列、および全長重鎖配列（アミノ酸配列と、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と）を「混合し、マッチさせて」、本発明の他のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を創出することができる。このような「混合し、マッチさせた」ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例節で記載される他のアッセイ）を使用して調べることができる。これらの鎖を混合し、マッチさせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長重鎖配列を、構造的に類似する全長重鎖配列で置きかえるものとする。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長軽鎖配列を、構造的に類似する全長軽鎖配列で置きかえるものとする。
したがって、一態様では、本発明は、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供し、この場合、抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４（例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する。
より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号１３および２３；３８および４８；５８および６８；７８および８８；９８および１０８；１１８および１２８；または１３８および１４８、のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
別の態様では、本発明は、（ｉ）哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミノ酸配列であって、配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１００、１２０、および１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長重鎖、ならびに哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミノ酸配列であって、配列番号２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する単離抗体、または（ｉｉ）その抗原結合性部分を含む機能的タンパク質を提供する。より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号１５および２５；２８および２５；４０および５０；６０および７０；８０および９０；１００および１１０；１２０および１３０；または１４０および１５０、のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
本明細書で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性および抗原結合アフィニティーを付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲがあり、各軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲがある。
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al.,（1991）, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health、Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al.,（1997） JMB 273, 927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）により記載されているスキームを含む、周知の多数のスキームのうちのいずれかを使用して、たやすく決定することができる。
例えば、Ｋａｂａｔによれば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）内の抗体であるＦＦ１のＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６６（ＨＣＤＲ２）、および９９〜１０４（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のＣＤＲアミノ酸残基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５５（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。Ｃｈｏｔｈｉａによれば、ＶＨ内のＣＤＲアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５７（ＨＣＤＲ２）、および９９〜１０４（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、ＶＬ内のアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨ内のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６６（ＨＣＤＲ２）、および９０〜１０４（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬ内のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５５（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなる。
別の態様では、本発明は、表１に記載されている重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはこれらの組合せを含むＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を提供する。抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、および１３２に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３３に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１３４に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４に示されている。これらのＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用して表される。
代替的に、Ｃｈｏｔｈｉａシステム（Al-Lazikani et al.,（1997）, JMB 273 927-948）を使用して規定される通り、抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１０、３５、５５、７５、９５、１１５、および１３５に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１１、３６、５６、７６、９６、１１６、および１３６に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１２、３７、５７、７７、９７、１１７、および１３７に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号２０、４５、６５、８５、１０５、１２５、および１４５に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２１、４６、６６、８６、１０６、１２６、および１４６に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号２２、４７、６７、８７、１０７、１２７、および１４７に示されている。
これらの抗体の各々は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合することが可能であり、抗原結合特異性は主に、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域によりもたらされることを踏まえれば、各抗体は、本発明の他のＡＮＧＰＴＬ４結合性分子を創出するのに、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含有することが好ましいが、ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列を、「混合し、マッチさせる」ことができる（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合し、マッチさせることができる）。このような「混合し、マッチさせた」ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイおよび実施例で記載される結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して調べることができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。当業者には、新規のＶＨ配列およびＶＬ配列を、１つまたは複数のＶＨ ＣＤＲ領域配列および／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体のための、本明細書で示されるＣＤＲ配列に由来する、構造的に類似する配列で置換することにより創出しうることがたやすく明らかであろう。前出に加えて、一実施形態では、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３、またはＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むことが可能であり、この場合、断片は、ＡＮＧＰＴＬ４に、単一の可変ドメインとして結合する。
本発明のある種の実施形態では、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、表１に記載されているヒト化抗体の重鎖および軽鎖配列を有しうる。より具体的には、抗体またはその抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、およびＮＥＧ３１９の重鎖および軽鎖配列を有しうる。
本発明の他の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。本発明のさらに他の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号８の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号９の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１９の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号３２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号３４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号４２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号４４の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号５２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５３の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号５４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号６２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号６４の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号７２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７３の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号７４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号８２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号８３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号８４の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号９２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号９３の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号９４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１０２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１０３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１０４の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号１１２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１１３の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号１１４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１２２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１２３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１２４の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号１３２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１３３の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号１３４の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１４２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１４３の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１４４の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号１０の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号１２の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号２０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２１の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号２２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号３６の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号３７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号４５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号４７の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号５５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５６の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号５７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号６５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号６７の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号７５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７６の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号７７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号８５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号８６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号８７の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号９５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号９６の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号９７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１０５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１０６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１０７の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号１１５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１１６の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号１１７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１２５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１２６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１２７の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体であって、配列番号１３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１３６の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号１３７の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１４５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１４６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１４７の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
ある種の実施形態では、本発明は、表１に記載されている、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片を含む。好ましい実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する抗体または抗原結合性断片は、ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１３、ＮＥＧ３１５、ＮＥＧ３１８、ＮＥＧ３１９である。
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載されている配列と相同なアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供するが、抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に結合し、表１に記載されている抗体の所望の機能的特性を保持する。
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体またはその機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番号２３、２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、１４８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み；抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する。本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号７、８、９、１７、１８、および１９をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号１０、１１、１２、２０、２１、および２２をさらに含む。
他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４、または５カ所以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除き同一でありうる。表１に記載されている抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、１１８、または１３８、および配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、または１４８、のそれぞれをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
他の実施形態では、全長重鎖アミノ酸配列および／または全長軽鎖アミノ酸配列は、表１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１００、１２０、または１４０のうちのいずれかの全長重鎖、および配列番号２５、２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、または１５０、のうちのいずれかの全長軽鎖と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
他の実施形態では、全長重鎖ヌクレオチド配列および／または全長軽鎖ヌクレオチド配列は、表１に示される配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
他の実施形態では、重鎖可変領域のヌクレオチド配列および／または軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、表１に示される配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
本明細書で使用される、２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する配列により共有される、同一な位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、下記の非限定的な例で記載されている、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列は、公表されたデータベースに照らして検索を実施する、例えば、関連の配列を同定するための「クエリー配列」としてさらに使用することもできる。例えば、このような検索は、Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10によるＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。
保存的修飾を伴う抗体
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、この場合、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。
したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域からなる単離抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、および１３２、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３３、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１３４、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現について最適化されており、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖からなる、哺乳動物細胞における発現について最適化された単離抗体であって、全長重鎖が、配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１００、１２０、および１４０、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、全長軽鎖が、配列番号２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５０、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＡＮＧＰＴＬ４（例えば、ヒト、およびカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する抗体を提供する。
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に記載されているＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。したがって、ＡＮＧＰＴＬ４結合アッセイ（実施例で記載されるＡＮＧＰＴＬ４結合アッセイなど）において、本発明の他の抗体と競合する（例えば、本発明の他の抗体の結合を、統計学的に有意な形で競合的に阻害する）それらの能力に基づき、さらなる抗体を同定することができる。本発明の抗体の、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質への結合を阻害する被験抗体の能力により、被験抗体が、その抗体と、ＡＮＧＰＴＬ４への結合について競合することが可能であり、このような抗体は、非限定的な理論によれば、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質上の、それが競合する抗体と同じであるかまたは関連の（例えば、構造的に類似するか、または空間的に近接した）エピトープに結合しうることが裏付けられる。ある種の実施形態では、本発明の抗体と同じＡＮＧＰＴＬ４上のエピトープに結合する抗体は、ヒト化抗体である。このようなヒト化抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離することができる。本明細書で使用される通り、等モル濃度の競合抗体の存在下で、競合抗体が、本発明の抗体または抗原結合性断片のＡＮＧＰＴＬ４との結合を、５０％を超えて（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）阻害するとき、抗体は、結合について「競合する」。
他の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ＡＮＧＰＴＬ４の１つまたは複数のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、本抗体または本抗原結合性断片が結合するエピトープは、直鎖状エピトープである。他の実施形態では、本抗体または本抗原結合性断片が結合するエピトープは、非直鎖状のコンフォメーショナルエピトープである。
操作抗体および修飾抗体
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、本明細書で示されるＶＨ配列および／またはＶＬ配列のうちの１つまたは複数を有する抗体を使用して、本発明の抗体をさらに調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内、および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することにより操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾して、例えば、抗体のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる。
実施しうる可変領域操作のうちの１つの種類は、ＣＤＲグラフティングである。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由で、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個別の抗体の間の多様性が、ＣＤＲの外部の配列より大きい。ＣＤＲ配列は、大半の抗体−抗原間相互作用の一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグラフトされた特異的自然発生抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327；Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525；Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029-10033；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、および１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列のそれぞれを含む重鎖可変領域と、配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、ならびに配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列のそれぞれを有する軽鎖可変領域とを含む単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体のＶＨ ＣＤＲ配列およびＶＬ ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有しうる。
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公表されたＤＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、ヒト生殖細胞系列の配列データベースである「ＶＢａｓｅ」（インターネットのmrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能である）のほか、それらの各々の内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Kabat, E. A. et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson, I. M. et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798；およびCox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836においても見出すことができる。
本発明の抗体における使用のためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択された抗体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するフレームワーク配列である。ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域へとグラフトすることもでき、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して、１つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領域へとグラフトすることもできる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持または増強することが有益であると見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。本明細書で記載される抗体および抗原結合性断片をその上に構築する足場として活用されうるフレームワークは、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ３、Ｖｋ１、Ｖｌ２、およびＶｋ２を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、さらなるフレームワークが知られており、例えば、インターネットのvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1上のｖＢａｓｅデータベースにおいて見出すことができる。
したがって、本発明の実施形態は、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をさらに含む、単離ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片に関する。
可変領域修飾の別の種類は、「アフィニティー成熟」として公知の、ＶＨ ＣＤＲ１領域内、ＶＨ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＨ ＣＤＲ３領域内、ならびに／またはＶＬ ＣＤＲ１領域内、ＶＬ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＬ ＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、これにより、対象の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、アフィニティー）を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、突然変異を導入することができ、本明細書で記載され、実施例でも提示される、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて、抗体結合性または他の対象の機能的特性に対する効果を査定することができる。保存的修飾（上記で論じた）を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換の場合もあり、付加の場合もあり、欠失の場合もある。さらに、ＣＤＲ領域内の、典型的には１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の残基も改変する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、および１３２を有する群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、１１２、および１３２と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１領域、配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３３と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域、配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、１１４、および１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１３４と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域、配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域、配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域、ならびに配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域からなる単離ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号１０、３５、５５、７５、９５、１１５、および１３５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１０、３５、５５、７５、９５、１１５、および１３５と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１領域、配列番号１１、３６、５６、７６、９６、１１６、および１３６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１１、３６、５６、７６、９６、１１６、および１３６と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域、ならびに配列番号１２、３７、５７、７７、９７、１１７、および１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３７、５７、７７、９７、１１７、および１３７と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域と、配列番号２０、４５、６５、８５、１０５、１２５、および１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２０、４５、６５、８５、１０５、１２５、および１４５と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域、配列番号２１、４６、６６、８６、１０６、１２６、および１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２１、４６、６６、８６、１０６、１２６、および１４６と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域、ならびに配列番号２２、４７、６７、８７、１０７、１２７、および１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２２、４７、６７、８７、１０７、１２７、および１４７と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域とからなる単離ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
抗原結合性ドメインの、代替的なフレームワークまたは足場へのグラフティング
結果として得られるポリペプチドが、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する少なくとも１つの結合性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体／免疫グロブリンのフレームワークまたは足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブリンまたはそれらの断片の５つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同定される単一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフレームワーク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトしうる非免疫グロブリン足場を使用して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出すことに関する。それらが、標的のＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異的な結合性領域を含む限りにおいて、公知または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、低分子モジュラー免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むがこれらに限定されない。
フィブロネクチン足場は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンの第１０モジュール（１０ Ｆｎ３ドメイン））に基づく。ＩＩＩ型フィブロネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループもさらに含有する（ＣＤＲと類似する）、２つのベータシートの間に分配された、７つまたは８つのベータ鎖を有する。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも３つのこのようなループがあり、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号明細書を参照されたい）。全体的なフォールドは、ラクダおよびラマＩｇＧ内の抗原認識単位全体を含む最小の機能的抗体断片である重鎖可変領域のフォールドと密接に関連するが、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではない。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗体の性質およびアフィニティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体のアフィニティー成熟の工程と類似する、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるループのランダム化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。これらのフィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子のループ領域を本発明のＣＤＲで置きかえうる、足場として使用することができる。
アンキリン技術は、アンキリンに由来するリピートモジュールを伴うタンパク質を、異なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく。アンキリンリピートモジュールとは、２つのアンチパラレルのα−ヘリックスおよびβ−ターンからなる、３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用することにより大部分が最適化される。
アビマーは、ＬＲＰ−１など、天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインは、本来、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、２５０を超えるタンパク質が、構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結された多数の（２つ〜１０の）異なる「Ａドメイン」単量体からなる。標的抗原に結合しうるアビマーは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書；同第２００５００５３９７３号明細書；同第２００５００４８５１２号明細書；および同第２００６０００８８４４号明細書において記載されている方法を使用して創出することができる。
アフィニティーリガンドであるアフィボディとは、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメインのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパク質である。プロテインＡとは、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの１３が、多数のリガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを作り出す、ランダム化されている５８アミノ酸からなる（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書を参照されたい）。アフィボディ分子は、抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、分子量が６ｋＤａである。その小サイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体の結合部位と同様である。
アンチカリンとは、Ｐｉｅｒｉｓ ＰｒｏｔｅｏＬａｂ ＡＧ社により開発された生成物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカリンに由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織内またはヒト体液中で生じる。タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上部の超可変ループを伴う免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりかろうじて大きい、１６０〜１８０アミノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合性ポケットを構成する４つのループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる形状の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合性部位を独自の工程で再形成することができる。４つのループのセットを突然変異誘発することによりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの１つのタンパク質である、オオモンシロチョウ（Pieris Brassicae）のビリン結合性タンパク質（ＢＢＰ）が使用されている。アンチカリンについて記載する特許出願の１つの例は、ＰＣＴ国際公開第１９９９１６８７３号パンフレットにある。
アフィリン分子とは、タンパク質および低分子に対する特異的なアフィニティーのためにデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく２つのライブラリーから非常に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対するいかなる構造相同性も示さない。現在、２つのアフィリン足場が援用されており、それらのうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も非常に小型で、高度な熱安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高度な安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリンに由来するタンパク質の例は、国際公開第２００１０４１４４号パンフレットにおいて記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、国際公開第２００４１０６３６８号パンフレットにおいて記載されている。
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）とは、タンパク質間相互作用に関与する主要な二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの環状ペプチド様分子（分子量：１〜２ｋＤａ）である。
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラ抗体またはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体は、ヒト対象へと投与された場合の抗原性がさらに低減されている。
ラクダ科動物抗体
ラマ種（アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vicugna））などの新世界メンバー含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（dromedary）（フタコブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Calelus dromaderius））ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺乳動物に由来するある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する抗体の場合の、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する、典型的な４つの鎖の四次構造とは構造的に異なっている。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に公表された国際公開第９４／０４６７８号パンフレット）を参照されたい。
ＶＨＨとして同定される小型の単一の可変ドメインである、ラクダ科動物抗体の領域は、標的に対して高いアフィニティーを有する低分子タンパク質をもたらすことから、「ラクダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質を結果としてもたらす遺伝子操作により得ることができる。１９９８年６月２日に取得された米国特許第５，７５９，８０８号明細書を参照されたい。また、Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279:1256-1261；Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424:783-788；Pleschberger, M. et al., 2003 Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo, V. et al., 2002 Int J Cancer 89:456-62；およびLauwereys, M. et al., 1998 EMBO J 17:3512-3520も参照されたい。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト由来の他の抗体と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により酷似する配列を得るように、組換えにより改変することができる、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」することができる。したがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然の小さな抗原性を、さらに低減することができる。
ラクダ科動物ナノボディの分子量は、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１０分の１で、タンパク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの１つの帰結は、大型の抗体タンパク質には機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科動物ナノボディの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技法を使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり、可能な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の特異的部位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、よって、古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力において用いられうることである。
低分子量およびコンパクトなサイズはさらに、熱安定性が極めて大きく、極端なｐＨおよびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボディを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織へとたやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうることである。ナノボディはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。２００４年８月１９日に公表された米国特許出願公開第２００４０１６１７３８号明細書を参照されたい。これらの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大きな治療的可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの原核細胞内で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現させ、機能的である。
したがって、本発明の特色は、ＡＮＧＰＴＬ４に対して高いアフィニティーを有するラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディである。本明細書のある種の実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディは、天然ではラクダ科動物において産生される、すなわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、ＡＮＧＰＴＬ４またはそのペプチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される。代替的に、ＡＮＧＰＴＬ４結合性ラクダ科動物ナノボディは、操作もされる、すなわち、例えば、本明細書の実施例において記載されている、標的としてのＡＮＧＰＴＬ４を伴うパニング手順を使用する、適切に突然変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質を提示するファージライブラリーからの選択によっても作製される。操作されたナノボディはさらに、遺伝子操作により、レシピエント対象における半減期が、４５分間〜２週間となるようにカスタマイズすることもできる。具体的な実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディを、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４において記載されている通り、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配列へとグラフトすることにより得る。
二特異性分子および多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体またはその断片を含む二特異性分子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合性領域は、少なくとも２つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）へと連結することもできる。本発明の抗体は実際、３つ以上の異なる結合性部位および／または標的分子に結合する多特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、他の２つ以上の機能的分子へと連結することもでき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子」という用語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには、本発明の抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合性模倣体など、１つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結する（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以外の形で）ことができる。
したがって、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープと異なる、ＡＮＧＰＴＬ４の別のエピトープである。
加えて、二特異性分子が多特異性である本発明では、分子は、第１の標的エピトープおよび第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性もさらに含みうる。
一実施形態では、本発明の二特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号明細書において記載されている、Ｆｖもしくは単鎖構築物など、その任意の最小断片でありうる。
ダイアボディとは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーにより接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖上で発現させた、二価の二特異性分子である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対合し、これにより、２つの抗原結合性部位を創出する（例えば、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123を参照されたい）。ダイアボディは、ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ構造（ＶＨ−ＶＬ立体配置）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ構造（ＶＬ−ＶＨ立体配置）を伴う２つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることにより作製することができる。ダイアボディの大半は、細菌内の可溶性形態で発現させることができる。単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を、約１５アミノ酸残基のリンカーで接続することにより作製する（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45（3〜4）:128〜30；Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2（1）:21-36を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌内の可溶性で活性の単量体形態で発現させることができる（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45（34）:128-30；Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2（1）:21-36；Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3（2）:83-105；Ridgway et al.,、1996 Protein Eng., 9（7）:617-21を参照されたい）。ダイアボディをＦｃへと融合させて、「ジダイアボディ」を作り出すことができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279（4）:2856-65を参照されたい）。
本発明の二特異性分子内で援用しうる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素である結合特異性をコンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分子の各結合特異性は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング剤または架橋剤を、共有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法は、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78、118-132；Brennan et al., 1985 Science 229:81-83；およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139:2367-2375において記載されている方法を含む。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれも、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。
結合特異性が、抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
代替的に、いずれの結合特異性も、同じベクター内でコードさせ、同じ宿主細胞内で発現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、２つの結合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８号明細書において記載されている。
それらの特異的な標的に対する二特異性分子の結合は、例えば、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害アッセイ）、またはウェスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合体に特異的な、標識された試薬（例えば、抗体）を援用することにより、特に対象となるタンパク質−抗体間複合体の存在が検出される。
別の態様では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４に結合する、本発明の抗体の少なくとも２つの同一であるかまたは異なる抗原結合性部分を含む、多価化合物を提供する。抗原結合性部分は、タンパク質の融合または共有結合的連結もしくは非共有結合的連結を介して、併せて連結することができる。代替的に、二特異性分子のための連結法も記載されている。四価化合物は、例えば、本発明の抗体（antibodies of the antibodies of the invention）を、本発明の抗体の定常領域に結合する抗体、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域と架橋することにより得ることができる。
三量体化ドメインについては、例えば、Ｂｏｒｅａｎによる特許である欧州特許第１０１２２８０号明細書において記載されている。五量体化モジュールについては、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７において記載されている。
半減期を延長した抗体
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。
多くの因子が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。例えば、腎臓における濾過、肝臓における代謝、タンパク質分解性酵素（プロテアーゼ）による分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和およびマクロファージおよび樹状細胞による取込み）。様々な戦略を使用して、本発明の抗体の半減期を延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合性リガンド、および炭水化物シールドとの化学的連結により、アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎ、およびトランスフェリン（transferring）などの血清タンパク質に結合するタンパク質との遺伝子融合により、ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディ、およびアンチカリンなど、血清タンパク質に結合する他の結合部分とカップリングする（遺伝子的または化学的に）ことにより、ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合性タンパク質、およびＦｃとの遺伝子融合により、またはナノ担体、徐放製剤、もしくは医療デバイスへの組込みにより、本発明の抗体の半減期を延長することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の血清中循環を延長するため、高分子量のＰＥＧなど、不活性のポリマー分子を、ＰＥＧの、抗体のＮ末端もしくはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない、抗体またはそれらの断片へと付着することができる。抗体をＰＥＧ化するには、抗体またはその断片を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのＰＥＧと、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応させることが典型的である。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレングリコールもしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のうちのいずれかを包含することを意図するものである。ある種の実施形態では、ＰＥＧ化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導体化が、使用されるであろう。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により緊密にモニタリングして、ＰＥＧ分子の抗体への適正なコンジュゲーションを確認することができる。反応しなかったＰＥＧは、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で記載されるイムノアッセイにより、結合活性ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性について調べることができる。当技術分野では、タンパク質をＰＥＧ化する方法が知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照されたい。
他の改変されたＰＥＧ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系を介して、化学的に特定された側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、再構成化学的直交性直接操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering）（ＲｅＣＯＤＥ ＰＥＧ）を含む。この技術は、３０を超える新たなアミノ酸の、大腸菌（E. coli）細胞内、酵母細胞内、および哺乳動物細胞内の生合成タンパク質への組込みを可能とする。ｔＲＮＡは、非天然アミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の位置へと組み込み、終止コドンから、化学的に特定されたアミノ酸の組込みをシグナル伝達するコドンへとアンバーを転換する。
組換えＰＥＧ化技術（ｒＰＥＧ）はまた、血清半減期の延長にも使用することができる。この技術は、３００〜６００アミノ酸の非構造化タンパク質テールを、既存の医薬用タンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期は、大きく増大する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要求する従来のＰＥＧ化とは対照的に、製造工程は大きく簡略化され、生成物は、均質である。
ポリシアリル化は、天然のポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術である。ＰＳＡとは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの薬物送達に使用される場合、コンジュゲーション時に、ポリシアル酸は、保護的微小環境をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系により認識されることを防止する。ＰＳＡポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される。ＰＳＡは、数百万年にわたり、それらの壁をＰＳＡでコーティングするように進化したある種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシアリル化した細菌は、分子的模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった。自然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、このような細菌から、大量に、かつ、所定の物理的特徴を伴って、容易に作製することができる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内ではＰＳＡと化学的に同一であるので、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完全に非免疫原性である。
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳとは、蝋状トウモロコシデンプンに由来する、修飾された天然ポリマーであり、体内の酵素により代謝されうる。ＨＥＳ溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増大させることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。ＨＥＳの分子量など、異なるパラメータを改変することにより、広範にわたるＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体はまた、１つまたは複数のアミノ酸修飾（すなわち、置換、挿入、または欠失）を、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合性断片（好ましくはＦｃドメイン断片またはヒンジＦｃドメイン断片）へと導入しても作り出すことができる。例えば、国際公開第９８／２３２８９号パンフレット、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット；および米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照されたい。
さらに、抗体または抗体断片を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてより安定的とするか、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン；ＨＳＡ）へとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、技法が周知であり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号パンフレット、同第９３／１５２００号パンフレット、および同第０１／７７１３７号パンフレット；ならびに欧州特許第４１３，６２２号明細書を参照されたい。加えて、上記で記載した二特異性抗体の文脈では、抗体の特異性は、抗体の１つの結合性ドメインが、ＡＮＧＰＴＬ４に結合するのに対し、抗体の第２の結合性ドメインは、血清アルブミン、好ましくは、ＨＳＡに結合するようにデザインすることもできる。
半減期を延長するための戦略は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の延長が所望される、ナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、および他の抗体またはタンパク質においてとりわけ有用である。
抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチドへと（またはその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドへと）、組換えにより融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異的に結合する抗体またはそれらの断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ ＣＤＲ）と、異種タンパク質、異種ポリペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技術分野では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合またはコンジュゲートさせる方法が知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、および同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書および同第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレットおよび同第９１／０６５７０号パンフレット；Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539；Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600；およびVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて、「ＤＮＡシャフリング」と称する）の技法を介して作り出すことができる。ＤＮＡシャフリングを援用して、本発明の抗体またはそれらの断片の活性を改変する（例えば、アフィニティーが大きく、解離速度が小さい抗体またはそれらの断片）ことができる。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同第５，８３４，２５２号明細書、および同第５，８３７，４５８号明細書；Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16（2）:76-82；Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；ならびにLorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24（2）:308-313（これらの特許および刊行物の各々は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体もしくはそれらの断片、またはコードされる抗体もしくはそれらの断片は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法にかけることにより改変することができる。ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、区間、一部、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
さらに、抗体またはそれらの断片は、精製を容易とするペプチドなどのマーカー配列へと融合させることもできる。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、それらのうちの多くが市販されている中でとりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）において提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824において記載されている通り、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープ（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）に対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ、および「フラッグ」タグを含むがこれらに限定されない。
他の実施形態では、本発明の抗体またはそれらの断片を、診断剤または検出可能薬剤へとコンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発生、発症、進行、および／または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査手順の一部としてモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断および検出は、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない多様な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどであるがこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネシウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定されない放射性材料；ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および非放射性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質へとカップリングすることにより達成することができる。
本発明は、治療用部分へとコンジュゲートさせた抗体またはそれらの断片の使用もさらに包含する。抗体またはその断片は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分へとコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。
さらに、抗体またはその断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物部分へとコンジュゲートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的化学的治療剤に限定されるとは見なされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤；または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾剤などのタンパク質を含みうる。
さらに、抗体は、２１３Ｂｉなどのアルファ放射体（alph-emiter）などの放射性金属イオン、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むがこれらに限定されない放射性金属イオンを、ポリペプチドへとコンジュゲートするのに有用な大環状キレート化剤などの治療用部分へとコンジュゲートさせることもできる。ある種の実施形態では、大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体へと付着させうる、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々が参照によりそれらの全体において組み込まれる、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4（10）:2483-90；Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10（4）:553-7；およびZimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26（8）:943-50において記載されている。
治療用部分を、抗体へとコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.（eds.）, pp.243-56（Alan R. Liss, Inc. 1985）；Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery（2nd Ed.）, Robinson et al.,（eds.）, pp.623-53（Marcel Dekker, Inc. 1987）；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.（eds.）, pp.475-506（1985）；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.（eds.）, pp.303-16（Academic Press 1985）；およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
抗体はまた、特に、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に有用な固体支持体へと付着させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに限定されない。
本発明の抗体を作製する方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、または１３８に示される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、または１４８に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分子は、表１において同定される核酸分子である。本発明の他のいくつかの核酸分子は、表１において同定される核酸分子のヌクレオチド配列と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、または９９％）同一なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現させるとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、ＡＮＧＰＴＬ４抗原結合能を呈示することが可能である。
本発明ではまた、上記で示したＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の重鎖または軽鎖に由来する少なくとも１つのＣＤＲ領域、および、通例３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、上記で示したＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。コードの縮重性のために、様々な核酸配列は、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードするであろう。
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードしうる。本発明の核酸配列のうちのいくつかは、配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１００、１２０、および１４０に示される重鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な重鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。他のいくつかの核酸配列は、配列番号２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５０に示される軽鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相ＤＮＡ合成、またはＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体またはその結合性断片をコードする既存の配列（例えば、下記の実施例で記載される配列）に対するＰＣＲによる突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接的な化学合成は、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979によるホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981によるジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号明細書による固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により達成することができる。ＰＣＲによる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich（Ed.）, Freeman Press, NY, NY, 1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al.（Ed.）, Academic Press, San Diego, CA, 1990；Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991；およびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991において記載されている通りに実施することができる。
本発明ではまた、上記で記載したＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。多様な発現ベクターを、援用して、ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体鎖または結合性断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても、哺乳動物宿主細胞内で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系は、プラスミド、典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを伴うエピソームベクター、およびヒト人工染色体を含む（例えば、Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内のＡＮＧＰＴＬ４結合性ポリヌクレオチドおよびＡＮＧＰＴＬ４結合性ポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｂ、およびｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ｂ、およびｐＥＢＶＨｉｓ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための、当技術分野で公知の他の多数のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brent et al.,前出；Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995；およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
発現ベクターの選択は、その中でベクターを発現させる、意図される宿主細胞に依存する。発現ベクターは、ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有することが典型的である。いくつかの実施形態では、誘導条件下を除き、挿入された配列の発現を防止するのに、誘導的プロモーターを援用する。誘導的プロモーターは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により良好に許容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させることができる。プロモーターに加えて、他の調節的エレメントもまた、ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体鎖または断片の効率的な発現に要求または所望される可能性がある。これらのエレメントは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接のリボソーム結合性部位または他の配列を典型的に含む。加えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れることにより増強することもできる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞内の発現を増大させることができる。
発現ベクターはまた、挿入されたＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体配列によりコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置ももたらしうる。挿入されたＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナル配列へと連結することが多い。ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってまた、定常領域またはそれらの一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体またはそれらの断片の作製をもたらす。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型的である。
ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体鎖を保有し、これを発現させるための宿主細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。大腸菌（E. coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させるのに有用な１つの原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主は、枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌、およびサルモネラ（Salmonella）属種、セラチア（Serratia）属種、および多様なシュードモナス（Pseudomonas）属種など、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的に、宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来するプロモーター系など、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、任意選択で、オペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を開始して終結させるためのリボソーム結合性部位配列なども有する。本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性ポリペプチドを発現させるのに、酵母など、他の微生物もまた援用することができる。また、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性ポリペプチドを発現させ、作製するのに、哺乳動物宿主細胞を使用する。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現させるハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例で記載される、１Ｄ６．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）の場合もあり、外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞系（例えば、下記で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）の場合もある。それらは、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常不死化動物細胞またはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、およびハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロブリンを分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において一般に論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照されたい）、ならびにリボソーム結合性部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの、必要なプロセシング情報部位を含みうる。これらの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、および／またはモジュレート可能プロモーターもしくは調節可能プロモーターでありうる。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト即初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せを含むがこれらに限定されない。
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使用することができる（一般に、Sambrook et al.,前出を参照されたい）。他の方法は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロインジェクション、遺伝子銃法、ウィロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質であるＶＰ２２との融合体（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強型取込み、およびｅｘ ｖｉｖｏにおける形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる高収率作製のためには、安定的発現が所望されることが多い。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体鎖または結合性断片を安定的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含有する、本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で１〜２日間にわたり成長させてから、選択培地へと切り替えることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の成長を可能とし、これにより、導入された配列を選択培地中で発現させることに成功することである。耐性で安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができる。
本発明のモノクローナル抗体の作出
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーションの技法を含む、様々な技法により作製することができる。モノクローナル抗体を作製するための多くの技法、例えば、Ｂリンパ球の、ウイルスによる形質転換または発がん性形質転換を援用することができる。
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系、ラット系、およびウサギ系を含む。マウスにおけるハイブリドーマの作製は、十分に確立された手順である。当技術分野では、免疫化プロトコールと、融合のための、免疫化された脾臓細胞を単離するための技法とが公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた公知である。
本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体は、上記で記載した通りに調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づき、調製することができる。重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得、標準的な分子生物学の技法を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）を使用して、マウス可変領域を、ヒト定常領域へと連結することができる。ヒト化抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法を使用して、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワークへと挿入することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５２２５５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎらによる、米国特許第５５３０１０１号明細書；同第５５８５０８９号明細書；同第５６９３７６２号明細書；および同第６１８０３７０号明細書を参照されたい。
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。ＡＮＧＰＴＬ４を指向する、このようなヒト化抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の部分を保有する、トランスジェニックマウスまたはトランスクロモソミックマウスを使用して作り出すことができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソミックマウスは、本明細書では、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称するマウスを含み、本明細書ではまとめて、「ヒトＩｇマウス」と称する。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座であって、再配列されていないヒト重（μおよびγ）鎖免疫グロブリン配列およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン配列を、内因性μ鎖遺伝子座および内因性κ鎖遺伝子座を不活化させる標的突然変異と併せてコードする、ミニ遺伝子座（例えば、Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859を参照されたい）を含有する。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはマウスＩｇκの発現の低減を呈示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を経て、高アフィニティーのヒトＩｇＧκモノクローナルを産出する（Lonberg, N. et al., 1994 supra；Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546において総説されている）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにこのようなマウスにより保有されるゲノム修飾については、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に具体的に組み込まれる、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656；Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724；Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123；Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830；Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591；およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851においてさらに記載されている。さらに、全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；および同第５，７７０，４２９号明細書；Ｓｕｒａｎｉらによる米国特許第５，５４５，８０７号明細書；全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、ＰＣＴ国際公開第９２１０３９１８号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９７１１３８５２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、および国際公開第９９／４５９６２号パンフレット；ならびにＫｏｒｍａｎらによるＰＣＴ国際公開第０１／１４４２４号パンフレットも参照されたい。
別の実施形態では、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスなど、導入遺伝子上および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用して、本発明のヒト抗体をもたらすことができる。本明細書では、このようなマウスを、「ＫＭマウス」と称するが、これについては、Ｉｓｈｉｄａらによる、ＰＣＴ国際公開第０２／４３４７８号パンフレットにおいて詳細に記載されている。
ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる、当技術分野では、なおさらに代替的なトランスジェニック動物系が利用可能であり、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体をもたらすのに使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称する、代替的なトランスジェニック系も使用することができる。このようなマウスについては、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる、米国特許第５，９３９，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書；および同第６，１６２，９６３号明細書において記載されている。
さらに、当技術分野では、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる、代替的なトランスクロモソミック動物系が利用可能であり、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体をもたらすのに使用することができる。例えば、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方を保有するマウスであって、「ＴＣマウス」と称するマウスを使用しうるが、このようなマウスについては、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727において記載されている。当技術分野ではさらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を保有するウシについても記載されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体をもたらすのに使用することができる。
本発明のヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。当技術分野では、ヒト抗体を単離するための、このようなファージディスプレイ法が確立されているか、または下記の実施例において記載される。例えば、Ｌａｄｎｅｒらによる、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；および同第５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒらによる、米国特許第５，４２７，９０８号明細書；および同第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによる、米国特許第５，９６９，１０８号明細書；および同第６，１７２，１９７号明細書；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらによる、米国特許第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；および同第６，５９３，０８１号明細書を参照されたい。
本発明のヒト化抗体はまた、免疫化したら、ヒト抗体応答を発生させうるように、ヒト免疫細胞を再構築した、ＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。このようなマウスについては、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらによる、米国特許第５，４７６，９９６号明細書；および同第５，６９８，７６７号明細書において記載されている。
フレームワークまたはＦｃの操作
本発明の操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基へと修飾を施した操作抗体を含む。このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるように施すことが典型的である。例えば、１つの手法は、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すには、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、本発明により包含されることを意図する。
フレームワーク修飾の別の種類は、１つもしくは複数のフレームワーク領域内の残基、なおまたは、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法はまた、「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書においてさらに詳細に記載されている。
フレームワーク内またはＣＤＲ領域内に施された修飾に加えて、またはこれと代替的に、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含んで、典型的に、血清半減期、補体の結合、Ｆｃ受容体の結合、および／または抗原依存性細胞性細胞傷害など、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように操作することもできる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾することもでき（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に付着することができる）、そのグリコシル化を改変して、ここでもまた、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように修飾することもできる。これらの実施形態の各々については、下記でさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスである。
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変する、例えば、増大または減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とするか、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるように改変する。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌属プロテインＡ（Staphylococcyl protein A）（ＳｐＡ）への結合が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインのＳｐＡへの結合と比べて損なわれるように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間界面領域へと導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。多様な手法が可能である。例えば、以下の突然変異：Ｗａｒｄによる米国特許第６，２７７，３７５号明細書において記載されている、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１つまたは複数を導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、抗体を、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書；および同第６，１２１，０２２号明細書において記載されている、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取されたサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、ＣＨ１領域内またはＣＬ領域内で改変することもできる。
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、抗体のエフェクター機能を改変する異なるアミノ酸残基で置きかえることにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを改変しているが、親抗体の抗原結合能は保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。それに対するアフィニティーを改変するエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。この手法は、両方ともＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号明細書；および同第５，６４８，２６０号明細書においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体が、Ｃ１ｑへの結合を改変し、かつ／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。この手法は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基を改変して、これにより、補体に結合する抗体の能力を改変する。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ国際公開第９４／２９３５１号パンフレットにおいてさらに記載されている。
さらに別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法は、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第００／４２０７２号パンフレットにおいてさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対する結合性部位もマップされており、結合を改善させた変異体も記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604を参照されたい）。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、脱グリコシル化抗体（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）を作製することができる。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体のアフィニティーを増大させるように改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、１つまたは複数のアミノ酸置換を作製して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる。このような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させることができる。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書；および同第６，３５０，８６１号明細書においてさらに詳細に記載されている。
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体または二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を改変した抗体を作製することもできる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を増大させることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を改変した宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分野では、グリコシル化機構を改変した細胞が記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、これにより、グリコシル化を改変した抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、このような細胞系内で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットは、フコースをＡｓｎ（２９７）連結された炭水化物へと付着する能力を低減し、また、その宿主細胞内で発現させた抗体の低フコシル化も結果としてもたらす、変異体のＣＨＯ細胞系である、Ｌｅｃｌ３細胞について記載している（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ国際公開第９９／５４３４２号パンフレットは、操作細胞系内で発現させた抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大を結果としてもたらす二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈示するように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるように操作された細胞系について記載している（また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照されたい）。
改変抗体を操作する方法
上記で論じた通り、本明細書で示されるＶＨ配列およびＶＬ配列または全長重鎖および全長軽鎖配列を有するＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体は、全長重鎖配列および／もしくは全長軽鎖配列、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはこれらへと付着された定常領域を修飾することにより、新たなＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を創出するのに使用することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明のＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の構造特色を使用して、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合し、また、ＡＮＧＰＴＬ４の１つまたは複数の機能的特性も阻害すること（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４とＡＮＧＰＴＬ４受容体の結合を阻害する、ＡＮＧＰＴＬ４依存性の細胞増殖を阻害する）など、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する、構造的に関連するＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を創出する。
例えば、本発明の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域またはそれらの突然変異は、組換えにより、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合わせて、組換えにより操作された、上記で論じた、本発明の、さらなるＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を創出することができる。他の種類の修飾は、前出の節で記載した修飾を含む。操作法のための出発材料は、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。操作抗体を創出するのに、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含有される情報を、元の配列に由来する「第２世代の」配列を創出するための出発材料として使用し、次いで、「第２世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、および１３２からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３３からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１３４からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とからなるＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を作製するステップと、重鎖可変領域の抗体配列および／または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出するステップと、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるステップとを含む方法を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号１０、３５、５５、７５、９５、１１５、および１３５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１１、３６、５６、７６、９６、１１６、および１３６からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号１２、３７、５７、７７、９７、１１７、および１３７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号２０、４５、６５、８５、１０５、１２５、および１４５からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２１、４６、６６、８６、１０６、１２６、および１４６からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号２２、４７、６７、８７、１０７、１２７、および１４７からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とからなるＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を調製し、重鎖可変領域の抗体配列および／または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞における発現について最適化されたＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体であって、配列番号１５、２８、４０、６０、８０、１００、１２０、および１４０の群から選択される配列を有する全長重鎖抗体配列と、配列番号２５、５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５０の群から選択される配列を有する全長軽鎖抗体配列とからなるＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を調製し、全長重鎖抗体配列および／または全長軽鎖抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法を提供する。一実施形態では、重鎖または軽鎖の改変は、重鎖または軽鎖のフレームワーク領域内である。
改変抗体配列はまた、ＣＤＲ３配列、または米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号明細書において記載されている、最小限の不可欠な結合決定基を固定し、ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列には多様性を持たせた抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても調製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など、抗体を、抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技術に従い実施することができる。
標準的な分子生物学の技法を使用して、改変抗体配列を調製し、発現させることができる。改変抗体配列によりコードされる抗体は、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合すること；ならびに抗体が、Ｆ３６Ｅ細胞増殖アッセイおよび／またはＢａ／Ｆ３−ＡＮＧＰＴＬ４Ｒ細胞増殖アッセイにおいて、ＡＮＧＰＴＬ４依存性の細胞増殖を阻害することを含むがこれらに限定されない、本明細書で記載されるＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の機能的特性のうちの１つ、一部、または全部を保持する抗体である。
本発明の抗体を操作する方法のある種の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体コード配列の全部または一部に沿って、ランダムに、または選択的に、突然変異を導入することができ、結果として得られる修飾ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体を、本明細書で記載される結合活性および／または他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。当技術分野では、突然変異法が記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ国際公開第０２／０９２７８０号パンフレットは、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはこれらの組合せを使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニングするための方法について記載している。代替的に、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ国際公開第０３／０７４６７９号パンフレットは、コンピュータによるスクリーニング法を使用して、抗体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。
本発明のある種の実施形態では、抗体は、脱アミド化部位を除去するように操作されている。脱アミド化は、ペプチド内またはタンパク質内の構造的変化および機能的変化を引き起こすことが公知である。脱アミドは、生物学的活性の低下のほか、タンパク質医薬品の薬物動態および抗原性の改変も結果としてもたらしうる（Anal Chem. 2005 March 1,;77（5）:1432-9）。
本発明のある種の実施形態では、抗体は、ｐＩを増大させ、それらの薬物様特性を改善するように操作されている。タンパク質のｐＩは、分子の全体的な生物物理的特性の鍵となる決定因子である。ｐＩが小さな抗体は、可溶性が小さく、安定性が小さく、凝集しやすいことが公知である。さらに、ｐＩが小さな抗体の精製は、とりわけ、臨床における使用のためのスケールアップにおいて、困難であり、問題を生じる可能性がある。本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはＦａｂのｐＩを増大させることにより、それらの可溶性が改善され、抗体を高濃度（＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することが可能となった。抗体を高濃度（例えば、＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することにより、高用量の抗体を、患者の眼へと、硝子体内注射を介して投与することが可能な利点がもたらされ、これにより、心血管障害を含む慢性疾患を処置するための著明な利点である、投与頻度の低減を可能とすることができる。ｐＩの増大はまた、抗体のＩｇＧバージョンのＦｃＲｎを媒介するリサイクリングも増大させ、これにより、薬物が長時間にわたり体内にとどまり、要求される注射の回数を少なくすることも可能としうる。最後に、ｐＩの増大に起因して、抗体の全体的な安定性が著明に改善され、その結果として、保管寿命およびｉｎ ｖｉｖｏにおける生物学的活性の延長がもたらされる。ｐＩは、８．２以上であることが好ましい。
改変抗体の機能的特性は、実施例において示されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）など、当技術分野において利用可能であり、かつ／または本明細書で記載される標準的なアッセイを使用して評価することができる。
予防的使用および治療的使用
本明細書で記載されるＡＮＧＰＴＬ４に結合する抗体は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体または抗原結合性断片を投与することにより、ＡＮＧＰＴＬ４レベルの上昇および／またはＡＮＧＰＴＬ４活性の増大と関連する疾患または障害を処置するのに治療的に有用な濃度で使用することができる。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、ＡＮＧＰＴＬ４関連心血管障害を処置する方法を提供する。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、ＡＮＧＰＴＬ４関連心血管障害を処置する方法を提供する。
本発明の抗体を使用して、とりわけ、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質レベルが異常に高く、かつ／またはＡＮＧＰＴＬ４タンパク質レベルの低減が求められる、任意の数の状態または疾患を含むがこれらに限定されない、ＡＮＧＰＴＬ４に関連する状態または障害を防止 処置、防止、および改善することができる。これらの状態は、高脂血症、高リポタンパク血症、および脂質異常症など、脂質代謝に関与する状態であって、アテローム性脂質異常症、糖尿病性脂質異常症、高トリグリセリド血症（例えば、重度の高トリグリセリド血症（例えば、ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬとする）、肥満と関連する高トリグリセリド血症、およびＶ型高トリグリセリド血症）、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、混合型脂質異常症（肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病など）、リポジストロフィー、脂肪萎縮症、ならびに、例えば、ＬＰＬ活性の低下および／またはＬＰＬの欠損、ＬＤＬ受容体の活性の低下および／またはＬＤＬ受容体の欠損、ＡｐｏＣ２の改変、ＡｐｏＥの欠損、ＡｐｏＢの増大、極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生の増大および／またはＶＬＤＬの消失の減少、ある種の薬物処置（例えば、グルココルチコイド処置に誘導される脂質異常症）、任意の遺伝的素因、食餌、生活様式などにより引き起こされる他の状態を含む、状態を含むがこれらに限定されない。
高脂血症、高リポタンパク血症、および／または脂質異常症と関連するか、またはこれらから生じる、他のＡＮＧＰＴＬ４関連疾患または障害は、アテローム性動脈硬化、動脈瘤、高血圧症、狭心症、脳卒中、脳血管疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患などの心血管疾患または障害；急性膵炎；非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；糖尿病などの血糖障害；肥満などを含むがこれらに限定されない。
本発明の抗体はまた、ＡＮＧＰＴＬ４関連障害を防止、処置、または改善するための他の薬剤と組み合わせても使用することができる。例えば、スタチン療法を、トリグリセリドに関連する障害を伴う患者を処置するために、本発明のＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗原結合性断片と組み合わせて使用することができる。
医薬組成物
本発明は、医薬的に許容される担体と併せて製剤化されたＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体（インタクトなまたは結合性断片）を含む医薬組成物を提供する。組成物は加えて、例えば、心血管障害の処置または防止に適する１つまたは複数の他の治療剤も含有しうる。医薬的に許容される担体は、組成物を増強するかもしくは安定化させるか、または、組成物の調製を容易とするのに使用することもできる。医薬的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。投与経路および／または投与方式は、所望される結果に応じて変化する。投与は、硝子体内投与、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、もしくは皮下投与であるか、または標的部位に近接して投与することが好ましい。医薬的に許容される担体は、硝子体内投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適するものとする。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、二特異性分子および多特異性分子である抗体は、化合物を、化合物を不活化しうる酸および他の天然の状態の作用から保護する材料でコーティングすることができる。
組成物は、滅菌であり、かつ、流体であるものとする。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知であり、日常的に実施されている方法に従い調製することができる。例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000；およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造することが好ましい。本発明の医薬組成物中では、ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の治療的に有効な用量（dose）または治療的に効果的な用量を援用することが典型的である。ＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体は、当業者に公知の従来の方法により、医薬的に許容される剤形（dosage form）へと製剤化する。投与レジメン（dosage regimen）は、所望される最適応答（例えば、治療的応答）をもたらすように調整する。例えば、単一のボーラスを投与することもでき、複数に分割された用量をある期間にわたり投与することもでき、治療状況の要件により指し示されるのに応じて、用量を比例的に低減するかまたは増大させることもできる。投与の容易さおよび投与量（dosage）の均一性のために、非経口組成物を、投与量単位形態（dosage unit form）で製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される投与量単位形態とは、処置される対象のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位を指す。各単位は、要求される医薬担体との関連で、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性化合物を含有する。
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与方式に所望される治療的応答を達成するのに有効な量の有効成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、援用される本発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、援用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、援用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および医療既往歴などの因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
医師または獣医師は、医薬組成物中で援用される本発明の抗体の投与を、所望の治療効果を達成するのに要求されるレベル未満のレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、投与量を漸増させることができる。一般に、本明細書で記載される心血管障害を処置するのに有効な、本発明の組成物の用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるのか治療的であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するように滴定することが必要である。抗体の全身投与では、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇの範囲であり、より通例では、宿主の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１５ｍｇの範囲である。抗体の硝子体内投与では、投与量は、眼１つ当たり０．１ｍｇ〜眼１つ当たり５ｍｇの範囲でありうる。例えば０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．１ｍｇ／ｍｌ、２．２ｍｇ／ｍｌ、２．３ｍｇ／ｍｌ、２．４ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、２．６ｍｇ／ｍｌ、２．７ｍｇ／ｍｌ、２．８ｍｇ／ｍｌ、２．９ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．１ｍｇ／ｍｌ、３．２ｍｇ／ｍｌ、３．３ｍｇ／ｍｌ、３．４ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、３．６ｍｇ／ｍｌ、３．７ｍｇ／ｍｌ、３．８ｍｇ／ｍｌ、３．９ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．１ｍｇ／ｍｌ、４．２ｍｇ／ｍｌ、４．３ｍｇ／ｍｌ、４．４ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、４．６ｍｇ／ｍｌ、４．７ｍｇ／ｍｌ、４．８ｍｇ／ｍｌ、４．９ｍｇ／ｍｌ、または５．０ｍｇ／ｍｌ。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与を伴う。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与、または必要に応じた（ＰＲＮ）全身投与を伴う。
抗体は通例、複数回投与する。単回の投与の間の間隔は、毎週、毎月、または毎年でありうる。間隔はまた、患者におけるＡＮＧＰＴＬ４結合性抗体の血中レベルを測定することにより指し示される通り、不規則でもありうる。加えて、医師が代替的な投与間隔を決定する場合もあり、毎月または効果的であるのに必要な間隔で投与する。全身投与のいくつかの方法では、投与量は、抗体の血漿中濃度１〜１０００μｇ／ｍｌを達成するように調整し、いくつかの方法では、２５〜５００μｇ／ｍｌを達成するように調整する。代替的に、抗体は、持続放出製剤として投与することもでき、この場合は、低頻度の投与が要求される。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体の半減期より長い半減期を示す。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるのか治療的であるのかに応じて変化しうる。予防的適用では、比較的低投与量を、比較的低頻度の間隔で、長期にわたり投与する。一部の患者には、彼らの余生にわたり処置を施し続ける。治療的適用では場合によって、比較的高投与量が、疾患の進行が軽減されるか終結するまで、比較的短い間隔で要求され、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで要求される。その後、患者には、予防的レジメを投与することができる。
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提示されるものであり、その範囲を限定するために提示されるものではない。当業者には、本発明の他の変形がたやすく明らかであろうし、添付の特許請求の範囲によっても包含される。
実施例１：抗原としての、抗体特徴付け実験における使用のための、精製組換えヒトＡＮＧＰＴＬ４の調製
全長ヒトＡＮＧＰＴＬ４ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列であるＮＭ＿１３９３１４．２にマッチする、アミノ酸２６〜４０６）を、ヒトＩｇＧ−カッパに由来するＮ末端シグナルペプチド（ＭＫＴＦＩＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＩＦＬＬＰＧＡＴＡ）（配列番号１５２）、ならびにＣ末端ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫＨ）（配列番号１５３）、ヘキサヒスチジン精製タグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１５４）、およびＡｖｉタグ（すなわち、ＢｉｒＡビオチニル化配列であるＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号１５５）と共にコードする核酸配列を、哺乳動物細胞発現ベクターであるｐＲＳ５ａへとサブクローニングして、プラスミドであるｐＲＳ−Ｉｋｋ−ｈＡＮＧＰＴＬ４（２６〜４０６）−ＦＬＡＧ−６ＨＩＳ−Ａｖｉであって、２０アミノ酸のＩＫＫシグナル配列に続いて、ヒトＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸２６〜４０６を、カルボキシル末端のＦｌａｇタグ、６ＨＩＳタグ、およびＡｖｉタグと共に含有する、プラスミドを作り出した（表２、配列番号１５６）。
一部の調製物には、以下の手順を使用して、ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を発現させ、精製し、ビオチニル化した（方法１）：懸濁液に適合させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番１２３３８−０１８）中で培養し、ポリエチレンイミントランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番２３９６６）を使用して、プラスミドであるｐＲＳ−Ｉｋｋ−ｈＡＮＧＰＴＬ４（２６〜４０６）−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ６−Ａｖｉをトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後において、ヘパリン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、型番Ａ１６１９８）を、培養培地へと、０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。次いで、細胞を、７２〜９６時間にわたり培養し、次いで、細胞培養物上清を、４℃の遠心分離により採取し、０．２２μｍのフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ、型番５６７−００１０）を使用して、滅菌濾過した。次いで、濾過された細胞培養物上清を、接線流濾過により、約１００ｍｌまで濃縮した。濃縮された上清を、ＴＢＳ−グリセロール緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１５％のグリセロール、ｐＨ７．４）により、１リットルの容量まで希釈し、試料を、接線流濾過により、約２００ｍｌまで濃縮した。次いで、ＴＢＳ−グリセロール緩衝液であらかじめ平衡化させた抗Ｆｌａｇ Ｍ２アガロース樹脂（Ｓｉｇｍａ、型番２２０１０２−１７７）を、試料へと添加し、結果として得られる溶液を、４℃で１時間にわたり、静かに混合した。次いで、アガロース樹脂を、２５ｍｌのＴＢＳ−グリセロールで５回にわたり洗浄し、結合したＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を、０．２ｍｇ／ｍｌのＦｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ、型番２２０１７６−３１７）を含有する、２０ｍｌのＴＢＳ−グリセロールで溶出させた。ペルオキシド非含有Ｔｗｅｅｎ−２０（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、型番Ａ１２８４，００２５）を、溶出させたタンパク質溶液へと、０．１％の最終濃度まで添加し、結果として得られる溶液を、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（緩衝液Ａ）を含有するＴＢＳ−グリセロール中であらかじめ平衡化させた、５ｍｌのＨｉＴｒａｐヘパリンカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番１７−０４０７−０１）へとロードした。カラムを、５０ｍｌの緩衝液Ａに続き、３００ｍＭのＮａＣｌを含有する、５０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。次いで、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を、６００ｍＭのＮａＣｌを含有する、２０ｍｌの緩衝液Ａで溶出させた。分子量カットオフを３０ｋＤとする遠心分離型濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、型番ＵＦＣ９０３０２４）を使用して、溶出させたタンパク質を濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価される、精製ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の純度は、＞９０％であった。
一部の適用には、ＡＮＧＰＴＬ４ １ｍｇ当たり１０μｇの精製ビオチン−タンパク質リガーゼ（ＢｉｒＡ）（Ａｖｉｄｉｔｙ）を使用して、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を、Ｃ末端のＡｖｉタグ上で、部位特異的にビオチニル化した。緩衝液に、最終濃度が１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、および０．５Ｍのｄ−ビオチンを補充した。反応混合物を、３０℃で２時間にわたり、次いで、４℃で一晩にわたりインキュベートし、次いで、緩衝液Ａ中で平衡化させた、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（２６ｍｍ×６００ｍｍ）（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、型番２８−９８９３−３６）へとロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムからの画分を解析し、ＡＮＧＰＴＬ４を含有する画分をプールし、遠心分離型濃縮器を使用して、濃縮した。
他の調製物には、以下の手順を使用して、ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を発現させ、精製し、ビオチニル化した（方法２）。標準的なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション法を使用して、プラスミドであるｐＲＳ−Ｉｋｋ−ｈＡＮＧＰＴＬ４（２６〜４０６）Ｃ−Ｆｌａｇ６ＨｉｓＡｖｉを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと、一過性にトランスフェクトした。細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地中の懸濁培養により増殖させ、トランスフェクションは、１リットルのフラスコを使用して、培地４リットル中に、１ｍｌ当たり１×１０６個の細胞の最終細胞濃度で、実行した。トランスフェクションの５時間後において、５００μｇ／ｍｌの最終濃度のヘパリンを添加した。細胞を、３７℃および５％のＣＯ２で７２時間にわたり増殖させた。次いで、細胞を、遠心分離によりペレット化させ、上清を、０．２２μｍの滅菌フィルターに通した。清明化させた上清を、濃縮し、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）へと、緩衝液を交換した。次いで、濃縮された試料を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、０．１％のｎ−オクチル−β−マルトシド、ｐＨ７．４）で平衡化させた、５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムに通した。試料をロードした後で、２８０ｎｍにおけるベースラインの吸光度に達するまで、カラムを、同じ緩衝液で洗浄した。次いで、イミダゾール勾配（１０ｍＭ〜５００ｍＭ）を使用することにより、結合したＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を溶出させた。ヒトＡＮＧＰＴＬ４を含有する溶出画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器（分子量カットオフを１０ｋＤとする）を使用して、濃縮し、ＰＤ−１０カラムを使用して、保存緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５％のグリセロール、ｐＨ７．４）へと緩衝液を交換し、アリコート分割し、液体窒素中で瞬時凍結させ、−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価される、精製ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の純度は、＞９０％であった。
一部の適用には、上記で記載した通りに調製された、精製ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を、以下の通りに部位特異的にビオチニル化した。５０ｍＭのビシン（ｐＨ８．３）緩衝液中、約１ｍｇ／ｍＬの最終濃度の精製タンパク質を、１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍＭのビオチン、およびＢｉｒＡビオチンリガーゼ（Ａｖｉｄｉｔｙ）の存在下において、３０℃で１時間にわたり、次いで、４℃で一晩にわたりインキュベートした。次いで、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器（分子量カットオフを１０ｋＤとする）を使用して、タンパク質を濃縮し、ＰＤ−１０カラムを使用して、保存緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５％のグリセロール、ｐＨ７．４）へと緩衝液を交換し、アリコート分割し、液体窒素中で瞬時凍結させ、−８０℃で保存した。
実施例２：抗体特徴付け実験における使用のための、精製組換えヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端コイルドコイルドメインタンパク質の調製
ヒトＡＮＧＰＴＬ４（アミノ酸２６〜１６１）のＮ末端コイルドコイルドメインの発現、精製、およびビオチニル化は、実施例１の方法２で、ヒト全長ヒトＡＮＧＰＴＬ４について記載された、本質的に同じ方法を使用して実行した。精製ヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端ドメインタンパク質の配列を、表２（配列番号１５７）に示す。
実施例３：モノクローナル抗体の調製およびスクリーニング
組換えヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質は、実施例１に記載した通りに自家調製し、抗ＡＮＧＰＴＬ４ハイブリドーマクローンを作り出すための免疫原として使用した。標準的な急速免疫化プロトコールに従い、Ｂｃｌ−２トランスジェニックマウスを、組換えヒトＡＮＧＰＴＬ４で免疫化した。ハイブリドーマは、標準的なエレクトロフュージョンベースの方法を使用することにより作り出した。
標準的な方法を使用して、膜貫通ドメインへと融合させたヒトＡＮＧＰＴＬ４を安定的に発現させるＣＨＯ−Ｋ１ＰＤ細胞を作り出した。膜貫通ドメインの存在のために、これらの細胞は、ＡＮＧＰＴＬ４を、細胞表面上に提示する。したがって、これらの細胞の表面上の、抗体の、ＡＮＧＰＴＬ４への結合は、フローサイトメトリーを使用して検出することができる。
ハイブリドーマ上清は、上清中に存在する抗体の、ＣＨＯ−Ｋ１ＰＤ細胞の表面上に発現させたヒトＡＮＧＰＴＬ４への結合を検出することによりスクリーニングした。抗体の、細胞への結合は、蛍光標識した抗マウス二次抗体およびフローサイトメトリーを使用して検出した。ＡＮＧＰＴＬ４を発現させない親ＣＨＯ−Ｋ１ＰＤ細胞は、陰性対照として使用した。ＡＮＧＰＴＬ４に結合したハイブリドーマについて、標準的な方法を使用して、抗体を、細胞上清から精製し、結果として得られる富化上清を、フローサイトメトリーアッセイにおいて、ＣＨＯ−Ｋ１ＰＤ／ＡＮＧＰＴＬ４細胞およびＣＨＯ−Ｋ１ＰＤ親細胞を用いて調べた。
ハイブリドーマ上清中のＡＮＧＰＴＬ４抗体力価は、組換えヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を、ＥＬＩＳＡプレートの表面上に固定化した、標準的な直接的ＥＬＩＳＡアッセイを使用することにより決定した。確認された陽性ハイブリドーマをサブクローニングし、標準的な方法を使用して、これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の配列を決定した。
その後、下記の実施例７で記載される方法を使用して、モノクローナル抗体である、１４Ｐ１８、１７Ｂ１、１９Ｃ１６、および３７Ｐ１は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に媒介される、ヒトリポタンパク質リパーゼの阻害を阻害することを示した。１４Ｐ１８、１７Ｂ１、１９Ｃ１６、および３７Ｐ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、標準的な方法を使用して決定した。
実施例４：モノクローナル抗体のヒト化
当技術分野では、ヒト化の工程について十分に記載されている（Jones, et al 1986, Queen, et al 1989, Riechmann, et al 1988, Verhoeyen, Milstein and Winter 1988）。ヒト化という用語は、非ヒト抗体、例えば、マウス由来抗体の抗原結合性部位の、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト生殖細胞系列配列への導入として説明される（Retter, et al 2005）。抗体をヒト化する主要な根拠は、抗体を、ヒトにおける治療剤として投与する場合に、抗体に対する免疫原性応答を発生させる危険性を最小化することである（Rebello, et al 1999）。
抗原結合性部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）（Chothia and Lesk 1987, Kabat, et al 1991）と、可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）のフレームワーク領域内の位置であって、結合に直接的または間接的に影響を及ぼす位置とを含む。結合に直接的に影響を及ぼしうるフレームワーク残基は、例えば、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する、いわゆる「アウター」ループ領域内に見出すことができる。結合に間接的に影響を及ぼす残基は、例えば、いわゆるバーニヤ帯域において見出される（Foote and Winter 1992）。これらは、ＣＤＲのコンフォメーションを支持すると考えられる。ＣＤＲの外側のこれらの位置は、フレームワーク領域内のヒト生殖細胞系列アクセプター配列に照らした、最終的なヒト化抗体の逸脱の数を最小化するのに適する、アクセプターフレームワークを選び出す場合に考慮される。
実施例５：抗体配列の最適化およびアフィニティー成熟
ある種のアミノ酸配列モチーフは、グリコシル化（例えば、ＮｘＳ／Ｔ［配列中、ｘは、Ｐ以外の任意のアミノ酸である］）、遊離システインの酸化、脱アミノ化（例えば、ＮＧ配列中の、Ｎの脱アミノ化）または異性体化（例えば、ＤＧ配列における）などの翻訳後修飾（ＰＴＭ）を経ることが公知である。ＣＤＲ領域内に存在する場合、これらのモチーフは、産物の均質性を増大させるために、部位特異的突然変異誘発により除去することが理想的である。
当技術分野では、アフィニティー成熟の工程について十分に記載されている。多くのディスプレイ系の中で、ファージディスプレイ（Smith 1985）および酵母など、真核細胞上のディスプレイ（Boder and Wittrup 1997）は、抗体−抗原間相互作用について選択するのに、最も一般的に適用される系である。これらのディスプレイ系の利点は、広範にわたる抗原に適し、選択厳密性を容易に調整しうることである。ファージディスプレイでは、ｓｃＦｖ断片またはＦａｂ断片を提示することができ、酵母ディスプレイでは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または全長ＩｇＧを提示することができる。これらの一般的に適用される方法は、多様性が１×１０７を超える、大規模なライブラリーからの、所望の抗体変異体の選択を可能とする。多様性が小規模（例えば、１，０００）のライブラリーは、マイクロ発現およびＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができる。
非標的化抗体変異体ライブラリーまたはランダム抗体変異体ライブラリーは、例えば、エラープローンＰＣＲ（Cadwell and Joyce 1994）により作り出すことができ、非常に簡便であるが、場合によって限定的な手法をもたらす。別の戦略は、抗体候補物質のＣＤＲ指向性多様化である。１つまたは複数のＣＤＲ内の１つまたは複数の位置は、例えば、縮重オリゴヌクレオチド（Thompson, et al 1996）、トリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）（Kayushin, et al 1996）、または当技術分野で公知の、他の任意の手法を使用して、特異的に標的とすることができる。
実施例６：ヒト化抗体の発現および精製
ヒト（Homo Sapiens）へのコドン最適化を含む、ヒト化ＶＬドメインおよびヒト化ＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に依頼した。ＶＬドメインおよびＶＨドメインをコードする配列は、ＧｅｎｅＡｒｔによるベクターからのカットアンドペーストにより、哺乳動物細胞による発現および分離に適する発現ベクターへとサブクローニングした。重鎖および軽鎖は、共トランスフェクションを可能とするように、個別の発現ベクターへとクローニングした。発現ベクターのエレメントは、プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を容易とするシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子に由来する）、エピソームにおける複製および原核生物内の複製を可能とするエレメント（例えば、ＳＶ４０起点およびＣｏｌＥ１エレメントまたは当技術分野で公知の他のエレメント）、ならびに選択を可能とするエレメント（アンピシリン耐性遺伝子およびゼオシンマーカー）を含む。
ＳＶ４０ラージＴ抗原を構成的に発現させるヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３−Ｔ ＡＴＣＣ１１２６８）は、ヒト化ＩｇＧタンパク質および／または最適化されたＩｇＧタンパク質の一過性発現に好ましい宿主細胞系のうちの１つである。トランスフェクションは、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＭＷ：２５，０００、直鎖状；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、型番２３９６６）を、トランスフェクション試薬として使用して実施する。ＰＥＩ原液は、９００ｍｌの細胞培養グレード水中に、１ｇのＰＥＩを、室温（ＲＴ）で、注意深く溶解することにより調製する。ＰＥＩの溶解を容易とするために、溶液を、ＨＣｌを添加することにより、ｐＨ３〜５まで酸性化させるのに続いて、ＮａＯＨにより、７．０５の最終ｐＨまで中和する。最後に、容量を、１Ｌへと調整し、溶液を、０．２２μｍのフィルターに通して濾過し、アリコート分割し、さらなる使用まで、−８０℃で凍結させた。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、細胞のトランスフェクションおよび増殖のためのＮｏｖａｒｔｉｓの特許品である無血清培養培地、ならびに産生／フィード培地としてのＥｘＣｅｌｌ ＶＰＲＯ無血清培養培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、型番２４５６１Ｃ）を使用して培養する。一過性トランスフェクションのために調製した細胞は、懸濁培養により培養する。小スケール（＜５Ｌ）のトランスフェクションには、細胞を、５％のＣＯ２（播種用フラスコ）で加湿されたインキュベーター内のオービタルシェーカー（１００〜１２０ｒｐｍ）上のＣｏｒｎｉｎｇ振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）内で増殖させる。種培養物中の細胞は、指数増殖期（１ｍｌ当たりの細胞５×１０５個〜１ｍｌ当たりの細胞３×１０６個の間の細胞密度）に維持され、トランスフェクションのために、＞９０％の生存率を提示するものとする。小スケール（＜５Ｌ）のトランスフェクションには、細胞のアリコートを、種培養物から採取し、Ｎｏｖａｒｔｉｓ無血清培養培地により、最終容量の３６％中に１ｍｌ当たりの細胞１．４×１０６個へと調整する。ＤＮＡ溶液（溶液１：１Ｌのトランスフェクションのための、０．５ｍｇの重鎖発現プラスミドおよび０．５ｍｇの軽鎖発現プラスミド）は、ＤＮＡを、最終培養物容量の７％中に１ｍｇ／ｌ（最終容量）まで希釈することに続く、静かな混合により調製する。細菌の混入を防止するには、０．２２μｍのフィルター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｃｕｐ）を使用して、この溶液を濾過する。次いで、３ｍｇ／Ｌ（最終容量）のＰＥＩ溶液もまた、最終培養物容量の７％中に希釈し、静かに混合する（溶液２）。いずれの溶液も、室温（ＲＴ）で５〜１０分間にわたりインキュベートする。その後、静かに混合しながら、溶液２を、溶液１へと添加し、室温でさらに５〜１５分間にわたりインキュベートする。次いで、トランスフェクションミックスを、細胞へと添加し、細胞の培養を、４〜６時間にわたり継続する。最後に、総生成容量の残りの５０％は、ＥｘＣｅｌｌ（登録商標）ＶＰＲＯ無血清培養培地の添加により達成する。細胞の培養は、トランスフェクション後１１日間にわたり継続する。
培養物は、４℃、４５００ｒｐｍで２０分間にわたる遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ（登録商標）、Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３ Ｓ−Ｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により採取する。回収された細胞上清は、ステリカップフィルター（０．２２μｍ）に通して滅菌濾過し、さらなる処理まで、４℃で保存する。精製は、消毒（０．２５ＭのＮａＯＨ）したばかりのＨｉＴｒａｐ ５ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅカラムを使用して、冷却キャビネット内４℃の「ＡＫＴＡ １００ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ａｉｒ」クロマトグラフィーシステム上で実施した。カラムは、５カラム容量のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で平衡化させ、次いで、滅菌濾過された上清を、４．０ｍｌ／分でロードした。カラムを、１３カラム容量のＰＢＳで洗浄した。次いで、抗体を、５０ｍＭのクエン酸塩、７０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．２ ５カラム容量で溶出させた。溶出物を、３ｍｌの画分に回収し、１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ１０で、ｐＨ７へと調整した。抗体を含有する画分をプールし、滅菌濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ、０．２２ｕｍ）し、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００）を使用して、ＯＤ ２８０ｎｍを測定し、ＯＤ ２８０と、タンパク質配列に基づき計算されるモル吸光係数とに基づき、タンパク質濃度を計算した。溶出物を、多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）を伴うサイズ除外クロマトグラフィーにより、凝集について調べ、純度を、ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、内毒素アッセイ（ＬＡＬ）、および質量分析（ＭＳ）により評価した。必要な場合、第２の精製ステップのために、第１の精製からの抗体を、消毒（０．５ＭのＮａＯＨ）したばかりのゲル濾過カラム（gel viltration column）（Ｈｉ Ｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、１２０ｍＬ、ＧＥ−Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）へとロードした。カラムを、ＰＢＳで平衡化させ、流量を１ｍｌ／分とするＰＢＳ緩衝液で試行した。溶出物は、１．２ｍｌの画分に回収した。抗体を含有するタンパク質をプールし、結果として得られる精製抗体を、第１の精製ステップについて記載された通りに解析した。
上記で記載した方法を使用して、以下のヒト化抗体：ＮＥＧ２７６、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ２７８、ＮＥＧ３１０、ＮＥＧ３１８、ＮＥＧ３１８−ＬＡＬＡ、ＮＥＧ３１９、ＮＥＧ３１３、およびＮＥＧ３１５を、調製し、発現させ、精製した。これらのヒト化抗体のフレームワークおよび親抗体を、表３に示し、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、表１に示す。全てのヒト化抗体は、重鎖内のＬｅｕ２３４−Ｌｅｕ２３５配列を、Ａｌａ２３４−Ａｌａ２３５で置きかえた、修飾Ｆｃ領域（ヒトＩｇＧ１−ＬＡＬＡ）を使用して調製した、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡおよびＮＥＧ３１８−ＬＡＬＡを除き、ヒトＩｇＧ１抗体として調製した。ヒトＩｇＧ１−ＬＡＬＡ抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、抗体のエフェクター機能が低減されていることが公知である。
実施例７：ヒトリポタンパク質リパーゼアッセイ
標準的なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション法を使用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養されたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、全長ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列であるＮＭ＿０００２３７．２にマッチする）をコードする、哺乳動物発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後において、ヘパリンを、培養培地へと、３Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加して、細胞表面から分泌されるｈＬＰＬの放出を増強した。トランスフェクションの６０時間後において、培養培地を回収し、０．２μｍのフィルターを使用して濾過し、グリセロールを、１０％ｖ／ｖの最終濃度まで添加した。結果として得られる溶液を、緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｖ／ｖのグリセロール、ｐＨ７．２）であらかじめ平衡化させた、５ｍｌのＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ）へとロードした。カラムを、緩衝液Ａで洗浄し、次いで、ヒトＬＰＬタンパク質を、緩衝液Ａ中に５００ｍＭのＮａＣｌ、１ＭのＮａＣｌ、および２ＭのＮａＣｌの段階的勾配により溶出させた。最も純度が高く、最も触媒活性が大きなヒトＬＰＬは、２ＭのＮａＣｌで溶出した。精製ヒトＬＰＬのアリコートは、瞬時凍結させ、使用まで−８０℃で保存した。
以下のプロトコールを使用して、ＡＮＧＰＴＬ４による、ヒトリポタンパク質リパーゼの阻害を遮断する、本発明の抗体の能力を評価した。３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、型番３５７３）および試料プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ、型番７８１２０１）を、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ウェル１つ当たり０．１ｍｌ）により、室温で３０分間にわたり洗浄した。次いで、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０溶液で、２回にわたり洗浄した。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中のＡＮＧＰＴＬ４抗体（最終アッセイ濃度を０．０２ｎＭ〜５００ｎＭの範囲とする、ウェル１つ当たり２０μｌの系列希釈液）を、試料プレートへと添加するのに続いて、アッセイ緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０）中に２０μｌのヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（１０ｎＭの最終アッセイ濃度）を添加し、プレートを、静かに振とうしながら、室温で２０分間にわたりインキュベートした。次いで、アッセイ緩衝液（２０μｌ）中で希釈されたリポタンパク質リパーゼを添加しプレートを、静かに振とうしながら、室温で１０分間にわたりインキュベートした。
アッセイ緩衝液中にアシル−補酵素Ａオキシダーゼ（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、型番Ｔ−１７）、アシル−補酵素Ａシンテターゼ（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、型番Ｔ−１６）、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ、型番Ａ７６９９）および補酵素Ａ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、型番１００４９３）を含有する、カップリング酵素ミックスを調製した。カタラーゼアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ、型番Ｃ９２８４）を、カップリング酵素ミックスへと添加し、混合物を、振とうしながら、４℃で３０分間にわたりインキュベートし、次いで、カタラーゼアガロースビーズを、遠心分離により除去した。
ヒトＶＬＤＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、型番ＬＰ１）を、アッセイ緩衝液中で希釈し、カタラーゼアガロースビーズで３０分間にわたり処理し、遠心分離により、ビーズを、溶液から除去した。アッセイ緩衝液中のＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、型番Ａ１２２２２）を、３３μＭの濃度まで添加した。
ＬＰＬ、ＡＮＧＰＴＬ４、およびＡＮＧＰＴＬ４抗体を含有する試料プレート内の溶液へと、カップリング酵素ミックス（２０μｌ）を添加し、結果として得られる溶液５４μｌを、アッセイプレートへと移した。リポタンパク質リパーゼ反応を開始するために、ＶＬＤＬ／Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ溶液（１８μｌ）を添加し、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチウェルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、レゾルフィン蛍光を、３０分間にわたり、持続的にモニタリングした。最終アッセイ濃度は、９．４ｎＭのＡＮＧＰＴＬ４、約４ｎＭのヒトリポタンパク質リパーゼ、２．３μｇ／ｍｌのヒトＶＬＤＬ、０．７５ｍＭのＡＴＰ、９０μＭの補酵素Ａ、０．５Ｕ／ｍｌのＡＣＯ、１．２５Ｕ／ｍｌのＡＣＳ、１．２Ｕ／ｍｌのＨＲＰ、および１０μＭのＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄであった。
結果として得られるレゾルフィン蛍光対時間データを使用して、各試料について、リポタンパク質リパーゼ酵素活性（初期速度）を決定した。ＬＰＬを伴わない対照試料（バックグラウンド対照）、またはＡＮＧＰＴＬ４もしくはＡＮＧＰＴＬ４抗体を伴わない対照試料（ＬＰＬ活性対照）を使用して、酵素活性を標準化し、これを、ＬＰＬ対照活性に対する百分率として表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、異なるＡＮＧＰＴＬ４抗体濃度についての酵素活性データをプロットし、データを当てはめて、ＡＮＧＰＴＬ４抗体に媒介される、リポタンパク質リパーゼ酵素活性の増大についてのＥＣ５０値を生成した。このアッセイでは、１０ｎＭの濃度におけるヒトＡＮＧＰＴＬ４は、ＬＰＬ活性を、７０〜９５％阻害することが典型的であった。本発明のＡＮＧＰＴＬ４抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４によるＬＰＬの阻害を、用量依存的に逆転した。このアッセイからのＥＣ５０結果を、表４に示す。本発明の、選択された抗体についての代表的なデータを、図１に示す。
実施例８：抗体の特徴付けにおける使用のための、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４タンパク質、マウスＡＮＧＰＴＬ４タンパク質、およびラットＡＮＧＰＴＬ４タンパク質、ならびにヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の調製
カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４の配列は、カニクイザル肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｂｉｏｃｈａｉｎ、型番Ｃ１５３４１４９−Ｃｙ、ロット番号Ｂ４０９０５１）に由来する遺伝子配列を増幅することにより決定した。プライマーである、５−ＵＴ−Ｃｙｎｏ５’−ＡＴＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＡＣ−３’（配列番号１５８）および３−ＵＴ−ｃｙｎｏ５’−ＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧ−ＣＴＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列番号１５９）は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４ ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ配列であるＮＭ＿１３９３１４．２）の５’側非翻訳領域および３’側非翻訳領域に基づきデザインした。ゲル精製されたＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番Ｋ２８７５−４０）へとライゲーションし、配列決定した。クローニングされたカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４ ｃＤＮＡは、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に対する９５％の相同性を伴う、４０６アミノ酸のタンパク質をコードした。カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸２６〜４０６をコードする核酸配列を、哺乳動物発現ベクターであるｐＲＳ５へとサブクローニングして、２０アミノ酸のＩｋｋシグナル配列、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸２６〜４０６、ならびにカルボキシル末端のＦＬＡＧタグ、６ＨＩＳタグ、およびＡｖｉタグ（表５における配列番号１６０）を有するプラスミドである、ｐＲＳ−Ｉｋｋ−ｃｙｎｏＡＮＧＰＴＬ４（２６〜４０６）−ＦＬＡＧ−６ＨＩＳ−Ａｖｉを作製した。
実施例１において、ヒトＡＮＧＰＴＬ４（２６〜４０６）−ＦＬＡＧ−６ＨＩＳ−Ａｖｉタンパク質について記載したのと同様の方法を使用して、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４（２６〜４０６）−ＦＬＡＧ−６ＨＩＳ−Ａｖｉタンパク質を発現させ、精製した。一部の適用には、実施例１において、ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質について記載したのと同様のものを使用して、精製カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を、部位特異的にビオチニル化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価される、精製カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の純度は、＞９０％であった。
同様の方法を使用して、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４（２６〜１６１）−ＦＬＡＧ−６ＨＩＳ−Ａｖｉタンパク質を調製した。その対応する発現構築物によりコードされる、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４（２６〜１６１）タンパク質の配列を、表５に示す（配列番号１６１）。
マウスＡＮＧＰＴＬ４（アミノ酸２６〜４１０）およびラットＡＮＧＰＴＬ４（アミノ酸２４〜４０５）の発現、精製、およびビオチニル化を、実施例１の方法２において、ヒトＡＮＧＰＴＬ４について記載した方法と本質的に同じ方法を使用して実行した。対応する発現構築物によりコードされる、マウスＡＮＧＰＴＬ４タンパク質およびラットＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の配列を、表５に示す（それぞれ、配列番号１６２および１６３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価される、精製マウスＡＮＧＰＴＬ４タンパク質および精製ラットＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の純度は、＞９０％であった。
ＡＮＧＰＴＬ３（配列番号５、表１）とは、ＡＮＧＰＴＬ４と近縁のヒトタンパク質である。本発明の抗体の、ＡＮＧＰＴＬ３への可能な結合についての査定を可能とするために、実施例１の方法２において、ヒトＡＮＧＰＴＬ４について記載した方法と同様の方法を使用して、ヒトＡＮＧＰＴＬ３（１４〜４６０）−ＦＬＡＧ−Ｈｉｓ−Ａｖｉタンパク質（配列番号１６４、表５）を、発現させ、精製し、ビオチニル化した。
実施例９：直接的ＥＬＩＳＡアッセイによる抗体結合特異性の特徴付け
直接的ＥＬＩＳＡアッセイを行って、本発明の選択された抗体の抗体結合特異性を特徴付けた。アッセイは、以下の通りに実施した。プレートを、ウェル１つ当たり５０μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン）と共に、一定の振とう（６００ｒｐｍ）を伴って、２２℃で１時間にわたりインキュベートすることにより、３８４ウェルの、ストレプトアビジンでコーティングしたＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｅｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートをブロッキングした。次いで、プレート洗浄器（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、ブロッキングされたＭＳＤプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０）で、３回にわたり洗浄した。洗浄に続き、アッセイ緩衝液（ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２を伴わないＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ｗ／ｖの脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン、および０．０２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０）中で希釈された、ビオチニル化ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質：全長ヒトＡＮＧＰＴＬ４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）、ヒトＡＮＧＰＴＬ４コイルドコイルドメイン（ｈＡＮＧＰＴＬ４−ＣＣＤ）、および全長ヒトＡＮＧＰＴＬ３（ｈＡＮＧＰＴＬ３）を、１ｎＭの濃度（ウェル１つ当たり１５μＬ）、２２℃で１時間にわたるインキュベーションにより、表面上に固定化した。次いで、プレートを、前出で記載した通りに、３回にわたり洗浄した。次いで、アッセイ緩衝液中１ｎＭの濃度まで希釈された抗体を、ＭＳＤプレートへと適用し（ウェル１つ当たり１５μＬ）、プレートを、一定の振とう（６００ｒｐｍ）を伴って、２２℃で１時間にわたりインキュベートした。結合した抗体は、Ｓｕｌｆｏタグ付けされたヤギ抗ヒトＩｇＧの１：５００希釈液、ウェル１つ当たり１５μＬを添加することにより検出した。次いで、プレートを、一定の振とう（６００ｒｐｍ）を伴って、１時間にわたりインキュベートした。プレートを３回にわたり洗浄し、次いで、１倍濃度のＭＳＤ ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ、ウェル１つ当たり１５μＬを添加し、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｅｖｅｒｙ）を使用して、プレートを現像した。解析のために、データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌへと移し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６を使用してプロットした。これらの実験により、このアッセイにおける本発明の被験抗体の全ては、全長ヒトＡＮＧＰＴＬ４およびヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端ドメインに結合するが、全長ヒトＡＮＧＰＴＬ３には結合しないことが示された。ＡＮＧＰＴＬ３特異的基準抗体は、ＡＮＧＰＴＬ３結合アッセイ（図２）のための陽性対照として使用した。
実施例１０：溶液平衡滴定（ＳＥＴ）アッセイによる抗体の解離定数の決定
ＳＥＴアッセイは、以下の通りに実施した。９６ウェルポリプロピレンプレート内で、一定濃度のＡＮＧＰＴＬ４抗体（１０ｐＭ）を、ＳＥＴ緩衝液（ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２を伴わないＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン（脂肪酸非含有）、および０．０２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０）中、異なる濃度の、非ビオチニル化のヒト、カニクイザル、マウスもしくはラットの全長ＡＮＰＧＬＴ４タンパク質、またはヒトＡＮＧＰＴＬ４ Ｎ末端ドメインタンパク質（０．０１ｐＭ〜１００ｎＭの範囲にわたる、５倍の系列希釈液）と共に混合した。最終反応容量は、８０μＬであった。接着性フィルムを使用して、プレートをシーリングし、一定の振とう（３００ｒｐｍ）を伴って、２２℃で１４時間にわたりインキュベートした。同じ時間において、プレートを、ウェル１つ当たり５０μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン）と共に、４℃でインキュベートすることにより、３８４ウェルの、ストレプトアビジンでコーティングしたＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｅｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートをブロッキングした。プレート洗浄器（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、ブロッキングされたＭＳＤプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０）で、３回にわたり洗浄した。ビオチニル化ＡＮＧＰＴＬ４（全長ヒトＡＮＧＰＴＬ４、全長カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４、全長マウスＡＮＧＰＴＬ４、または全長ラットＡＮＧＰＴＬ４、またはヒトＡＮＧＰＴＬ４ Ｎ末端ドメイン）タンパク質（１ｎＭ、ウェル１つ当たり１５μＬ）を、一定の振とう（６００ｒｐｍ）を伴う、２２℃で１時間にわたるインキュベーションにより、ストレプトアビジンでコーティングしたＭＳＤプレートの表面上に固定化した。次いで、プレートを、前出で記載した通りに、３回にわたり洗浄した。
平衡結合反応物（ウェル１つ当たり１５μＬ）を、ＡＮＧＰＴＬ４を固定化したＭＳＤプレートへと適用し、２２℃で２０分間にわたりインキュベートした。結合しなかった材料は、プレートを、洗浄緩衝液で、３回にわたり洗浄することにより除去し、捕捉された抗体は、Ｓｕｌｆｏタグ付けされたヤギ抗ヒトＩｇＧの１：５００希釈液、ウェル１つ当たり１５μＬ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｅｖｅｒｙ）を添加することにより検出した。次いで、プレートを、一定の振とう（６００ｒｐｍ）を伴って、１時間にわたりインキュベートした。プレートを３回にわたり洗浄し、次いで、１倍濃度のＭＳＤ ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ、ウェル１つ当たり１５μＬを添加し、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｅｖｅｒｙ）を使用して、プレートを現像した。解析のために、データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌへと移し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６を使用してプロットした。ＫＤ値は、データを、以下の式：
ｙ＝（Ｂｍａｘ／（ＣＡｂ／２））×（（ＣＡｂ／２）−（（（（（（ＣＡｇ＋ＣＡｂ）＋ＫＤ）／２）−（（（（（（ＣＡｇ＋ＣＡｂ）＋ＫＤ）２）／４）−（ＣＡｇ×ＣＡｂ））０．５））２）／（２×ＣＡｂ）））
［式中、Ｂｍａｘは、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質が溶液中に存在しない場合のシグナルであり、ＣＡｂは、溶液中のＡＮＧＰＴＬ４抗体の一定の濃度であり、ＣＡｇは、溶液中のＡＮＧＰＴＬ４の濃度であり、ＫＤは、平衡解離定数である］へと当てはめることにより決定した。この方法を使用して決定された平衡解離定数を、表６に示す。
実施例１１：Ｏｃｔｅｔ動態結合アッセイにより決定される抗体の結合動態および解離定数
本発明の、選択された抗体について解離定数（ＫＤ）を、Ｏｃｔｅｔ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）動態結合アッセイを使用することにより決定した。ＦｏｒｔｅＢｉｏ １０× Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、型番１８−５０３２）を、ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番１４１９０−１３６）で１０倍に希釈し、結果として得られる溶液を、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、型番６５５２０）へと添加した（ウェル１つ当たり０．２ｍｌ）。ストレプトアビジンセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、型番１８−５０２０）を、溶液中に浸漬し、室温で少なくとも１０分間にわたり平衡化させた。第２の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、型番６５５２０）内では、センサーを、１× Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ中で洗浄し、次いで、２５ｎＭのビオチニル化ヒトＡＮＧＰＴＬ４またはビオチニル化基準タンパク質（バックグラウンドを差し引くための）２００ｕｌ中に、室温で１０００秒間にわたり（for 1000 sec at seconds）浸漬した。次いで、センサーを、１× Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ中で１２０秒間にわたり洗浄し、１× Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ中、多様な濃度（２倍の系列希釈液；最高濃度は、１２．５ｎＭまたは２５ｎＭであり；最低濃度は、０．８〜３．１ｎＭの範囲であり；各ＫＤの決定のために、４つ〜６つの異なる抗体濃度を使用した）で希釈されたＡＮＧＰＴＬ４抗体２００ｕｌ中に浸漬し、抗体の会合は、４８０秒間にわたりモニタリングした。次いで、センサーを、１× Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ ２００ｕｌを含有するウェルへと移し、抗体の解離を、１２００秒間にわたりモニタリングした。バックグラウンド補正した会合曲線および解離曲線を、Ｏｃｔｅｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により、大域的に当てはめて、会合速度定数（ｋａ）および解離速度定数（ｋｄ）を生成し、これを使用して、平衡解離定数（ＫＤ）を計算した。結果として得られる、本発明の、選択された抗体についてのデータを、表７および表８に示す。
実施例１２：水素−重水素交換／質量分析によるエピトープマッピング
質量分析（ＭＳ）と組み合わせた水素−重水素交換（ＨＤｘ）（Woods, 2001）を使用して、ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端ドメイン上の、抗体であるＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８の結合部位をマッピングした。ＨＤｘでは、タンパク質の、交換可能なアミド水素を、重水素で置きかえる。この工程は、タンパク質の構造／動態および溶媒接触性に対して高感度であり、したがって、リガンドの結合について報告することが可能である。これらの実験の目標は、ＡＮＧＰＴＬ４上の、ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８のエピトープの同定であった。
自動式ＨＤｘ／ＭＳ実験は、文献（Chalmers, 2006）に記載されている方法と同様の方法を使用して実施した。実験は、ＬＥＡＰ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ、およびＳｙｎａｐｔ Ｇ２質量分析計を含む、Ｗａｔｅｒｓ ＨＤｘ−ＭＳプラットフォーム上で実施した。タンパク質骨格を重水素で標識付けするのに使用される重水素緩衝液は、５０ｍＭのＤ−トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１５％のグリセロール、および０．１％のｎ−オクチルβ−Ｄ−マルトシドであり、溶液中の重水素の全百分率は、８２．５％であった。ＡＮＧＰＴＬ４抗体の非存在下における、ヒトＡＮＧＰＴＬ４（２６〜１６１）の重水素による標識付け実験のために、冷却された試験管内で、１００μｌの重水素緩衝液を使用して、３００ピコモルのヒトＡＮＧＰＬＴ４（２６〜１６１）（１．３μｌ）を希釈し、４℃のローテーター上で、２５分間にわたりインキュベートした。次いで、標識付け反応を、１００μｌの冷却クエンチ緩衝液により、氷上で３分間にわたりクエンチした。３分後、クエンチされた溶液を、自動式ペプシン消化およびペプチド解析のための、ＬＣ−ＭＳシステムへと注入した。結合したＡＮＧＰＴＬ４抗体の存在下における、ヒトＡＮＧＰＴＬ４（２６〜１６１）重水素による標識付け実験のために、３００ピコモルのＡＮＧＰＴＬ４抗体を、まず、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｐｌｕｓビーズ上に固定化し、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）を使用して架橋した。標識付け実験を実施するために、抗体ビーズ（３００ピコモルの抗体を含有する）を、３００ピコモルのヒトＡＮＧＰＴＬ４（２６〜１６１）と共に、４℃で３０分間にわたりインキュベートした。３０分後、ビーズを、２００μｌのトリス緩衝液で洗浄した。次いで、２００μｌの冷却された重水素緩衝液を添加し、複合体を、４℃で２５分間にわたりインキュベートした。２５分後、標識付け反応を、１２５μｌの冷却されたクエンチ緩衝液により、氷上で２．５分間にわたりクエンチした。試料を、遠心分離機内で、３０秒間にわたりスピンした後、クエンチされた溶液を、自動式ペプシン消化およびペプチド解析のための、ＬＣ−ＭＳシステムへと注入した。
全ての測定は、最低３回にわたる三連解析試行を使用して実行した。全ての重水素交換実験は、０．５ＭのＴＣＥＰおよび３Ｍの尿素（ｐＨ＝２．５）を使用してクエンチした。クエンチの後、交換された抗原を、１２℃でＰｏｒｏｓｚｙｍｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｅｐｓｉｎカラム（２．１×３０ｍｍ）を使用するオンラインペプシン消化に続く、Ｗａｔｅｒｓ Ｖａｎｇｕａｒｄ ＨＳＳ Ｔ３トラッピングカラム上のトラッピングにかけた。ペプチドを、トラッピングカラムから溶出させ、Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨ Ｃ１８ １×１００ｍｍカラム（１℃で維持される）上、４０μｌ／分の流量で、２〜３５％Ｂの二成分の８分の勾配（移動相Ａは、９９．９％の水および０．１％のギ酸であり；移動相Ｂは、９９．９％のアセトニトリルおよび０．１％のギ酸である）を使用して分離した。
これらの重水素交換実験では、ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端ドメイン配列のうちの、８７％をカバリングするペプチドを検出した。検出されたペプチド、および各ペプチドについての重水素の取込みの低減を、表９に指し示す。ＨＤｘＭＳマッピング実験により、ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端ドメインの３つの領域であって、ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８の両方により著明に保護される３つの領域：アミノ酸２６〜３５（Ｇ２６ＰＶＱＳＫＳＰＲＦ３５）（配列番号１６５）、アミノ酸４２〜６８（Ｎ４２ＶＬＡＨＧＬＬＱＬＧＱＧＬＲＥＨＡＥＲＴＲＳＱＬＳＡ６８）（配列番号１７４）、およびアミノ酸６９〜９５（Ｌ６９ＥＲＲＬＳＡＣＧＳＡＣＱＴＥＧＳＴＤＬＰＬＡＰＥＳ９５）（配列番号１９０）が同定された。ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８が、ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端ドメインの複数の領域を、重水素の取込みから保護するという観察は、直鎖状ペプチドエピトープマッピングからの結果であって、ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８が、直鎖状エピトープではなく、コンフォメーショナルエピトープを有することを示唆する結果と符合する（実施例１３を参照されたい）。
実施例１３：直鎖状ペプチドの結合によるエピトープマッピング
本発明の、選択された抗体、すなわち、ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８が、ヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端コイルドコイルドメインに由来する、１５アミノ酸の直鎖状ペプチドに結合する能力について調べた。標準的な方法を使用して、合計４３のペプチドを合成および精製した（ペプチドの配列を、表１０に示す）。ペプチドを、ガラス表面上に固定化し、ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、直鎖状ペプチドエピトープマッピングのために最適化された実験法を使用して、ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８が、固定化されたペプチドに結合する能力を査定した。ＡＮＧＰＴＬ４に結合しない抗体は、非特異的結合についての対照として使用した。これらの実験では、ＮＥＧ２７６またはＮＥＧ３１８の、１５マーのペプチド４３のうちのいずれに対する特異的結合も観察されなかった。これらの結果は、ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８のエピトープが、直鎖状ＡＮＧＰＴＬ４ペプチドではなく、コンフォメーショナルエピトープであることを強く示唆する。
実施例１４：本発明のＡＮＧＰＴＬ４抗体の、ヒトＡＮＧＰＴＬ４トランスジェニックマウスにおける血漿トリグリセリド濃度に対する効果
マウスにおいてトランスジェニックヒトＡＮＧＰＴＬ４を発現させる構築物は、全長ヒトＡＮＧＰＴＬ４ ｃＤＮＡ配列を、ヒトアポリポタンパク質Ｅ遺伝子プロモーターと、その肝臓における制御領域とを含有する、ｐＬＩＶＬＥ６ベクターのポリリンカー領域へと挿入することにより制作した。ＡＮＧＰＴＬ４トランスジェニックマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド上で作り出し、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）において繁殖させた。７日齢のトランスジェニックマウスの尾を切除し、ＲＥＤＥｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ Ｔｉｓｓｕｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；型番ＸＮＡＴＲ）を使用して、ＤＮＡを、尾から抽出した。ヒトＡＮＧＰＴＬ４導入遺伝子は、ｐＬＩＶＬＥ６ベクターを標的とするプライマー対と、ＡＮＧＰＴＬ４ ｃＤＮＡを標的とするプライマー対とを使用することにより検出した。マウスは、底部の堅固なケージ内の、不断に自動給水するように装備されたラック上で飼育し、１２時間の明暗周期（午前６時〜午後６時）で維持し、標準的な齧歯動物用食餌（Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ；型番８６０４）を施した。動物施設は、３０〜７０％の湿度を伴う、６８〜７６°Ｆの間で維持した。マウスは、同腹仔と共に飼育され、研究期間中、試料回収の前の４時間にわたる空腹時間を除き、食料および水を不断に施された。
ベースラインの血漿トリグリセリド濃度を測定する、顎下腺からの血液回収のために、動物を、４時間にわたり空腹にさせ、短時間にわたり麻酔をかけた。次いで、マウスに、ＰＢＳ（１ｋｇ当たり１０ｍＬの注射容量）中で希釈された、１ｋｇ当たり３０ｍｇの抗体を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。血液は、投与後１、２、および５日目における、４時間にわたる空腹時間の後で回収して、血漿トリグリセリドおよび総ヒトＩｇＧ濃度を測定した。血液は、ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ／ｓｅｐａｒａｔｏｒ ｔｕｂｅｓ ｗｉｔｈ ＥＤＴＡ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、型番３６５９７３）内に回収した。試料を、２０，８１７×ｇで１０分間にわたり遠心分離し、血漿を、０．２ｍＬのＴｈｅｒｍｏ−ｓｔｒｉｐ ｔｕｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ；型番ＡＢ ０４５１）へと移し、−８０℃で凍結させ、保存した。
血漿トリグリセリド濃度は、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＧＰＯ）Ｌｉｑｕｉｄ Ｒｅａｇｅｎｔ ｓｅｔ（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＩ、型番Ｔ７５３２−５００）を使用して測定した。略述すると、３７℃まであらかじめ加熱された、３００μＬのアッセイ試薬を、透明平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、型番２６９６２０）内の５μＬの血漿へと添加した。プレートを、プレートシェーカー上で３０秒間にわたり混合し、次いで、３７℃のインキュベーター内に、５分間にわたり静置した。２０秒間にわたる混合に続き、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＰＬＵＳプレートリーダーを使用して、５００ｎｍにおける吸光度を測定した。トリグリセリド濃度は、既知量のトリグリセリド基準物質（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、型番Ｔ７５３１−ＳＴＤ）を使用して作成した、検量線を使用することにより計算した。
抗体ＮＥＧ２７６およびＮＥＧ３１８はいずれも、ヒトＡＮＧＰＴＬ４トランスジェニックマウスへと投与されると、血漿トリグリセリドレベルを低減した（図３）。
実施例１５：本発明のＡＮＧＰＴＬ４抗体のうちの１つを、肥満した糖尿病で高トリグリセリド血症のカニクイザルへと投与することの効果
ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡの薬物動態プロファイルおよび薬理学的効果を査定するために、本発明者らは、単回、１ｋｇ当たり３ｍｇの皮下投与を、４匹の高トリグリセリド血症のカニクイザルに施した。この研究で使用されるサルの、ベースラインの血漿トリグリセリドレベルは、２０７ｍｇ／ｄＬ〜２４３８ｍｇ／ｄＬであった。ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡの投与後５週間にわたる多様な時点において、血漿試料を回収した（血液試料は、動物から、午前中の給餌の前に取り出し、動物を一晩にわたり空腹させることはしなかった）。
総ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ血漿濃度は、標準的な方法により決定した。ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡは、投与の３日後において、１５，５３６±２２８１ｎｇ／ｍＬの平均最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）に達した。投与後２１日目に、平均ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡ血漿濃度は、２６６３ｎｇ／ｍＬであった（図４）。
血漿ＴＧ、総コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、総アポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）、およびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ａｐｏＣＩＩＩ）濃度は、市販のアッセイキット（ＴＧ：Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＧＰＯ）Ｌｉｑｕｉｄ Ｒｅａｇｅｎｔ ｓｅｔ、Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、型番Ｔ７５３２−５００；総コレステロール：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ、Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、型番Ｃ７５１０−５００；ＨＤＬ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｒｏｍ ｍａｎｕａｌ ＨＤＬ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ、和光純薬工業株式会社、型番４３１−５２５０１；総ＡｐｏＢ：Ｋ−Ａｓｓａｙ Ａｐｏ Ｂ、Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、型番ＫＡＩ−００４；ＡｐｏＣ−ＩＩＩ：ＡｐｏＣ−ＩＩＩ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｒａｎｄｏｘ、型番ＬＰ−３８６５）を使用して決定した。
ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡの投与は、血漿トリグリセリド（ＴＧ）レベルの顕著な低下を結果としてもたらした。ピーク血漿ＴＧの低下は、投与後７日目に観察され、この時点において、血漿ＴＧ濃度は、ベースラインの血漿ＴＧレベルより５８％低かった。投与後７日目にピークＴＧの低下が生じた後で、血漿ＴＧ濃度は、投与後２１日目まで、ベースラインの濃度と比べた、４０％を超える抑制を保ち、次いで、ベースラインへと戻った（図５）。血漿ＴＧに対するその効果に加えて、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡの投与は、血漿総コレステロール濃度を、ベースラインと比べて約３０％低減し（図６）、投与後７〜２１日目において、ＨＤＬコレステロール濃度を、ベースラインから２０％を超えて増大させた（図７）。加えて、投与後７〜２１日目において、血漿総ａｐｏＢ濃度の、約３０％の減少も観察され（図８）、７〜２１日目において、血漿ａｐｏＣ−ＩＩＩ濃度の、ベースラインと比べた約２５％の減少も観察された（図９）。本発明者らはまた、標準的なサイズ除外クロマトグラフィー法を使用してリポタンパク質成分を分離することにより、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡの投与の、リポタンパク質関連トリグリセリドレベルおよびコレステロールレベルに対する効果も査定した。投与前（０日目）の試料と投与後７日目の試料とについての、リポタンパク質プロファイリングデータの比較は、ＮＥＧ２７６−ＬＡＬＡの投与が、トリグリセリドに富むリポタンパク質（ＴＲＬ）と関連するコレステロール濃度、およびトリグリセリド濃度の顕著な減少（１匹のサルからの結果を、図１０および図１１に示す）を結果としてもたらすことを示した。
参照による組込み
本明細書で引用される全ての参考文献であって、特許、特許出願、論文、教科書などを含む参考文献、およびそれらにおいて引用された参考文献は、それらについて既に言及した程度において（to the extent that they are not already）、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
同等物
前出の明細書は、当業者が、本発明を実施することを可能とするのに十分であると考えられる。前出の記載および実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態について詳述し、本発明者らにより企図される最良の方式について記載する。しかし、前出の記載および実施例が、本文中でいかに詳述されているように見えるとしても、本発明は、多くの様式で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の同等物に従うとみなされるべきであることが察知されるであろう。

本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその断片。
［２］
前記抗体または断片が、ＬＰＬの、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質への結合を遮断する、上記項目のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［３］
ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態結合アッセイにより測定される４５ｐＭ以下のＫＤ、または溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定される２４ｐＭ以下のＫＤで、ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に結合する、単離抗体またはその断片。
［４］
前記抗体または断片が、表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、上記項目のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［５］
前記抗体または断片が、表１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、上記項目のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［６］
前記抗体または断片が、表１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、変異体が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちの１つにおいて、少なくとも１〜４カ所のアミノ酸変化を有する、上記項目のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［７］
ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその断片であって、配列番号９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１３４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［８］
ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する単離抗体またはその断片であって、配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択されるＶＨ；ならびに配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択されるＶＬまたはその９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその断片。
［９］
配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む、単離抗体またはその断片。
［１０］
配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含む、単離抗体またはその断片。
［１１］
配列番号１３、３８、５８、７８、９８、１１８、および１３８からなる群から選択される重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２３、４８、６８、８８、１０８、１２８、および１４８からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含む、単離抗体またはその断片。
［１２］
配列番号７、３２、５２、７２、９２、１１２、および１３２からなる群から選択される重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８、３３、５３、７３、９３、１１３、および１３３からなる群から選択されるＣＤＲ２；９、３４、５４、７４、９４、１１４、および１３４からなる群から選択されるＣＤＲ３；配列番号１７、４２、６２、８２、１０２、１２２、および１４２からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１８、４３、６３、８３、１０３、１２３、および１４３からなる群から選択されるＣＤＲ２；ならびに配列番号１９、４４、６４、８４、１０４、１２４、および１４４からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１３］
配列番号１０、３５、５５、７５、９５、１１５、および１３５からなる群から選択される重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１、３６、５６、７６、９６、１１６、および１３６からなる群から選択されるＣＤＲ２；１２、３７、５７、７７、９７、１１７、および１３７からなる群から選択されるＣＤＲ３；配列番号２０、４５、６５、８５、１０５、１２５、および１４５からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２１、４６、６６、８６、１０６、１２６、および１４６からなる群から選択されるＣＤＲ２；ならびに配列番号２２、４７、６７、８７、１０７、１２７、および１４７からなる群から選択されるＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１４］
配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８のＣＤＲ２；配列番号９のＣＤＲ３；配列番号１７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１８のＣＤＲ２；および配列番号１９のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１５］
配列番号３２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号３３のＣＤＲ２；配列番号３４のＣＤＲ３；配列番号４２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号４３のＣＤＲ２；および配列番号４４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１６］
配列番号５２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号５３のＣＤＲ２；配列番号５４のＣＤＲ３；配列番号６２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号６３のＣＤＲ２；および配列番号６４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１７］
配列番号７２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号７３のＣＤＲ２；配列番号７４のＣＤＲ３；配列番号８２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８３のＣＤＲ２；および配列番号８４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１８］
配列番号９２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号９３のＣＤＲ２；配列番号９４のＣＤＲ３；配列番号１０２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１０３のＣＤＲ２；および配列番号１０４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１９］
配列番号１１２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１３のＣＤＲ２；配列番号１１４のＣＤＲ３；配列番号１２２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１２３のＣＤＲ２；および配列番号１２４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２０］
配列番号１３２の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１３３のＣＤＲ２；配列番号１３４のＣＤＲ３；配列番号１４２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１４３のＣＤＲ２；および配列番号１４４のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２１］
配列番号１０の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１のＣＤＲ２；配列番号１２のＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２１のＣＤＲ２；および配列番号２２のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２２］
配列番号３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号３６のＣＤＲ２；配列番号３７のＣＤＲ３；配列番号４５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号４６のＣＤＲ２；および配列番号４７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２３］
配列番号５５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号５６のＣＤＲ２；配列番号５７のＣＤＲ３；配列番号６５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号６６のＣＤＲ２；および配列番号６７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２４］
配列番号７５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号７６のＣＤＲ２；配列番号７７のＣＤＲ３；配列番号８５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号８６のＣＤＲ２；および配列番号８７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２５］
配列番号９５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号９６のＣＤＲ２；配列番号９７のＣＤＲ３；配列番号１０５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１０６のＣＤＲ２；および配列番号１０７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２６］
配列番号１１５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１１６のＣＤＲ２；配列番号１１７のＣＤＲ３；配列番号１２５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１２６のＣＤＲ２；および配列番号１２７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２７］
配列番号１３５の重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１３６のＣＤＲ２；配列番号１３７のＣＤＲ３；配列番号１４５の軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１４６のＣＤＲ２；および配列番号１４７のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２８］
上記項目の一項に記載の抗体またはその断片と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
［２９］
ＡＮＧＰＴＬ４障害を処置する方法であって、有効量の、上記項目のいずれかに記載の抗体または断片を含む医薬組成物を、ＡＮＧＰＴＬ４障害に罹患している患者へ投与するステップを含む、方法。
［３０］
前記患者が、重度の高トリグリセリド血症（例えば、血漿トリグリセリド濃度が＞５００ｍｇ／ｄＬである）、肥満と関連する高トリグリセリド血症、Ｖ型高トリグリセリド血症、およびカイロミクロン血症のうちの１つまたは複数に罹患している、上記［２９］に記載の方法。
［３１］
前記患者が、原発性脂質異常症、メタボリックシンドローム、および２型糖尿病のうちの１つまたは複数に罹患している、上記［２９］に記載の方法。
［３２］
上記項目のいずれかに記載の単離抗体または断片と同じエピトープに結合する、単離抗体またはその断片。
［３３］
ヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に結合し、上記項目のいずれかに記載の単離抗体または断片と交差競合する、単離抗体またはその断片。

Claims (14)

  1. 単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合性断片であって、
    （ｉ）重鎖可変領域の配列番号７の相補性決定領域（ＣＤＲ）１；配列番号８のＣＤＲ２；および配列番号９のＣＤＲ３；ならびに軽鎖可変領域の配列番号１７のＣＤＲ１；配列番号１８のＣＤＲ２；および配列番号１９のＣＤＲ３、または
    （ｉｉ）重鎖可変領域の配列番号１０のＣＤＲ１；配列番号１１のＣＤＲ２；および配列番号１２のＣＤＲ３；ならびに軽鎖可変領域の配列番号２０のＣＤＲ１；配列番号２１のＣＤＲ２；および配列番号２２のＣＤＲ３
    を含む、単離抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合性断片。
  2. 配列番号１３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２３と少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  3. 配列番号１３の配列を有する重鎖可変領域および配列番号２３の配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  4. 配列番号２８と少なくとも９０％同一である配列を有する重鎖および配列番号２５と少なくとも９０％同一である配列を有する軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  5. 配列番号２８の配列を有する重鎖および配列番号２５の配列を有する軽鎖を含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  6. 配列番号１５と少なくとも９０％同一である配列を有する重鎖および配列番号２５と少なくとも９０％同一である配列を有する軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  7. 配列番号１５の配列を有する重鎖および配列番号２５の配列を有する軽鎖を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  8. モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片またはｓｃＦｖ断片である、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  9. ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  10. 請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  11. ＡＮＧＰＴＬ４障害を処置するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 前記障害が、重度の高トリグリセリド血症、肥満と関連する高トリグリセリド血症、Ｖ型高トリグリセリド血症、およびカイロミクロン血症のうちの１つまたは複数を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 前記重度の高トリグリセリド血症が、血漿トリグリセリド濃度が＞５００ｍｇ／ｄＬである重度の高トリグリセリド血症である、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 前記障害が、原発性脂質異常症、メタボリックシンドローム、および２型糖尿病のうちの１つまたは複数を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
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